CN102763593A

CN102763593A - 快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法

Info

Publication number: CN102763593A
Application number: CN2012102461179A
Authority: CN
Inventors: 赖呈纯; 范丽华; 谢鸿根; 余亚白
Original assignee: Institute of Agricultural Engineering Technology of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Agricultural Engineering Technology of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-07-16
Filing date: 2012-07-16
Publication date: 2012-11-07

Abstract

本发明提供快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法，依次通过制备葡萄无菌株系、启动培养、制备葡萄松散型愈伤组织来获得葡萄松散型愈伤组织，并将获得的葡萄松散型愈伤组织接于第一种培养基中继代保持至少2代后，转接到第二种培养基中继代保持1代，反复交替即可长期继代保持葡萄松散型愈伤组织，且继代保持时的该第一种培养基、第二种培养基均置于培养室中进行。本发明的优点在于：所获得的葡萄愈伤组织具有高诱导效率及高质量的特点，同时可长期继代保持获得的葡萄松散型愈伤组织，从而为葡萄细胞培养生产次生代谢产物和生物技术等研究奠定了良好的基础。

Description

快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法

【技术领域】

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法。

【背景技术】

葡萄(Vitis vinifera L.)，葡萄属（Vitis）落叶藤本植物，几乎占全世界水果产量的四分之一，其营养价值很高，可制成葡萄汁、葡萄干和葡萄酒。近年来，“法国悖论”的科学发现引起人们对葡萄中生物活性物质的广泛关注。研究表明，葡萄中富含白藜芦醇、儿茶素、表儿茶素和鞣花酸等酚类和类酚类生物活性物质，具有重要药理功能和生物活性，具有良好的保健作用，尤其是白藜芦醇具有抗癌的活性而受到市场的青睐。

随着市场需求的不断扩大，原有的从葡萄或其他替代植物中来源的生物活性物质已不能满足需要。植物细胞培养是生物技术领域里的一个重要分支，因其具有生长速度快、周期短、不受季节影响、产物均一可控、药效成分高于天然植物等优点，采用大规模植物细胞培养是解决药用植物资源匮乏及药效成分低的药用植物满足需求的重要途径。近年来，植物细胞培养进行有效成分的生产已经取得了令人瞩目的成就，而葡萄细胞培养生产次生代谢产物（如白藜芦醇）的研究还处在实验室的研究阶段，进入中试和大规模培养还亟待解决如细胞株的筛选、细胞系的长期继代保持、悬浮细胞系的建立和诱导子调控效率等诸多问题。为了解决这些问题，目前最关键的技术是建立快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法，但目前葡萄自然来源的外植体由于容易受到污染率和消毒剂的影响，存在愈伤组织诱导效率低，形成愈伤组织质量差，不能长期继代保持等问题，导致葡萄细胞培养生产次生代谢产物的研究进行缓慢。直至目前，以葡萄叶片、叶柄、茎段等为外植体进行愈伤组织诱导取得了一定的进展，但以无菌株系小苗茎段和叶片诱导愈伤组织，并进行继代增殖以获得松散型愈伤组织、及对该松散型愈伤组织长期继代保持的方法还鲜有报道。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速获得葡萄松散型愈伤组织的方法，并揭露了将所获得的葡萄松散型愈伤组织进行保持的方法。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种快速获得葡萄松散型愈伤组织的方法，其包括如下步骤：

（1）葡萄无菌株系的获得：选取经预处理后的当年生无病葡萄枝条的带节茎段，之后将所选取的带节茎段接种到附加0.1mg/L NAA的1/2MS培养基上诱导产生葡萄无菌株系；其中预处理包含清洗、风干表面水分，并杀菌消毒；

（2）启动培养：取步骤（1）所获得的葡萄无菌株系的小苗，切取0.5cm茎段或切取0.5cm×0.5cm见方大小的叶片作为外植体，接着将该外植体接种至诱导愈伤组织的培养基中，并将该培养基置于培养室中培养，7天后可见愈伤组织形成，25~30天后长成初代愈伤组织；

（3）制备葡萄松散型愈伤组织：将步骤（2）培养得到的初代愈伤组织转接到继代增殖培养基中，并将该继代增殖培养基置于培养室中进行继代增殖培养，以获得葡萄松散型愈伤组织；

其中，步骤（2）与步骤（3）中所述培养室中的条件均为：温度设置23~25℃，光照强度1500~2000lx，每天光照12h。

进一步地，步骤（2）中所述诱导愈伤组织的培养基为：MS+BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。

进一步地，步骤（3）中所述继代增殖培养基为：MS+2,4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。

进一步地，揭露了上述所获得的葡萄松散型愈伤组织长期继代保持的方法，其操作如下：取上述步骤（3）所获得的葡萄松散型愈伤组织，并接于第一种培养基中继代保持至少2代后，转接到第二种培养基中继代保持1代，如此反复交替继代培养，即可长期继代保持葡萄松散型愈伤组织，且继代保持时的该第一种培养基、第二种培养基均置于培养室中进行；其中，所述第一种培养基为：MS+2,4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L；所述第二种培养基为：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.5mg/L+AgNO₃ 5.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L；所述培养室中的条件为：温度设置23~25℃，光照强度1500~2000lx，每天光照12h。

本发明快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法的有益效果在于：通过本发明所揭露的方法不仅能够快速获得大量松散型葡萄愈伤组织，且过程中所获得的葡萄愈伤组织具有高诱导效率及高质量的优点，同时可长期继代保持获得的葡萄松散型愈伤组织，即具有旺盛的生长能力，从而为葡萄细胞培养生产次生代谢产物和生物技术等研究奠定了良好的基础。

【具体实施方式】

一、葡萄松散型愈伤组织的制备

1．实验材料的选取与预处理

从福建省戴云山脉采集当年生无病的野生葡萄枝条，并将其带回实验室用自来水加洗涤剂（一般用洗衣粉）浸泡30min，然后流水冲洗1-2h，取出后风干枝条表面水分，之后枝条置于无菌条件下并加入适量的75%乙醇（v/v）浸泡30s，倒去乙醇后加入适量的0.1% HgCl₂（w/v）消毒8min，接着用无菌水浸洗5次，最后切取0.5cm带节茎段备用。

2．葡萄无菌株系的建立

取备用的0.5cm带节茎段并将其接种到附加0.1mg/L NAA的1/2MS培养基上诱导产生葡萄无菌株系。

3．启动培养：取步骤2所获得的葡萄无菌株系的小苗，切取0.5cm茎段或0.5cm×0.5cm见方大小的叶片作为外植体，接着将该外植体接种至诱导愈伤组织的培养基中，并将该培养基置于培养室中培养，7天后可见愈伤组织形成，25~30天后长成初代愈伤组织；

4.制备葡萄松散型愈伤组织：将步骤3培养得到的初代愈伤组织转接到继代增殖培养基中，并将该继代增殖培养基置于培养室中进行继代增殖培养，以获得葡萄松散型愈伤组织。

二、葡萄愈伤组织诱导中各影响因素的筛选

1.不同外植体类型对愈伤组织诱导的影响

取制备葡萄松散型愈伤组织过程中所获得的葡萄无菌株系的小苗，切取0.5cm茎段与0.5cm×0.5cm见方大小的叶片并分别接种到下表1中的G1培养基（即MS+BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L）中，且在光照下培养，接种7d后，茎段、及叶片切口处均可观察到愈伤组织形成，以后愈伤组织块会不断膨大，25~30d后长成初代愈伤组织。从产生愈伤组织的能力上看，茎段或叶片的差别不大，但从愈伤组织的长势上，初代培养时，茎段产生的愈伤组织长势较强；而叶片产生的愈伤组织，长势比较弱，要及时继代，否则会变褐死亡。因此，取0.5cm茎段作为启动培养的外植体为佳。

2.不同培养条件对愈伤组织诱导的影响

将野生葡萄茎段接种在下表1中的G1培养基中，比较光照和黑暗对野生葡萄茎段愈伤组织诱导的影响。结果发现，在光照条件下愈伤组织诱导率为100％，产生4种类型的愈伤组织，GC1类型是淡黄色、浅黄绿色或无色的松散状愈伤组织，GC2是绿色或淡黄绿色硬块状的愈伤组织，GC3类型是GC1和GC2的混合类型，GC4型愈伤组织呈无色粉状或水渍状；在黑暗中培养诱导产生的愈伤组织，为无色或浅褐色水渍状或粉状，这种愈伤组织继代后会褐变死亡，也定为GC4型愈伤组织。以上试验分析表明，野生葡萄愈伤组织的诱导适合在光照的条件下进行，虽然产生了4种类型愈伤组织，但在后期的筛选中，可以得到松散的、生长状态良好的愈伤组织；而黑暗条件不利于野生葡萄愈伤组织的诱导。由于GC1、GC2、GC3类型的愈伤组织可以继代增殖，为有效愈伤组织；而GC4类型愈伤组织不能继代保持，为无效愈伤组织。因此，为了获得松散型愈伤组织，需在光照条件下进行愈伤组织诱导。

3．启动培养中附加成份的不同对愈伤组织诱导的影响

取制备葡萄松散型愈伤组织过程中所获得的葡萄无菌株系的小苗，切取0.5cm茎段并分别接种到已灭菌且编号分别为G1、G2、G3、G4、G5及G6的6个培养基中，这6个培养基中均包含基本培养基及附加成份，该基本培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L、且pH值为5.8~6.0，各培养基中的附加成份及其含量如表1所示；之后将各培养基置于培养室中诱导愈伤组织，30天后比较不同附加成份对愈伤组织诱导的影响，结果见表2。

表1 各培养基中的附加成份及其含量

表2 不同培养基对野生葡萄愈伤组织诱导的影响

从表2可以看出，接种于6种培养基中的茎段都能成功诱导出愈伤组织，诱导率均为100%，但6种培养基中产生愈伤组织的类型差异很大，G1、G2和G3培养基中能形成GC1、GC2、GC3、GC4类型愈伤组织，G4、G5、G6培养基中诱导产生的愈伤组织全部为GC4类型，表现为无色或淡褐色水渍状；且通过测定分析发现，G2培养基产生的有效愈伤组织诱导率最高，为80%，邓肯氏新复极差测验表明，其与G1培养基存在显著差异（P＜0.05），而与G3培养基存在极显著差异（P＜0.01）；从产生松散型愈伤组织的比例看，以G1培养基中诱导出的愈伤组织占有率最高，为48.8%；邓肯氏新复极差测验表明，其与G2培养基有显著差异，与G3培养基存在极显著差异。以上试验结果分析说明，在野生葡萄愈伤组织诱导时，附加2,4-D的培养基虽然可以成功诱导出愈伤组织，但不能继代增殖，因此不适合作为野生葡萄愈伤组织诱导的培养基。

从表2还可以看出，不同浓度配比的BA、NAA、IBA都可以用来诱导野生葡萄愈伤组织，但采用较高浓度的NAA不利于松散型愈伤组织的诱导，而采用IBA有效愈伤组织和松散型愈伤组织诱导比例都比较低，而G1培养基有效愈伤组织和松散型愈伤组织比例都比较高。

综合考虑有效愈伤组织诱导率和松散型愈伤组织诱导率等两个因素，以G1培养基（即MS+BA2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L）用于诱导野生葡萄愈伤组织为佳。

三、葡萄松散型愈伤组织继代增殖各影响因素的筛选

1.不同类型愈伤组织对其继代保持的影响

分别挑选生长状态良好的GC1、GC2、GC3和GC4等4种类型的愈伤组织接种在表1中的G4培养基（MS+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L）中，于光照条件下进行继代培养试验。试验结果发现，GC1类型愈伤组织继代培养后虽然小部分发生褐变，但大部分可以增殖，一般培养25~30d后愈伤组织团会增大到原来的6~8倍，并可长期继代保持；GC3类型愈伤组织继代培养后会出现类型分化的情况，继代培养1代后会产生GC1、GC3和GC4类型的愈伤组织，并随继代次数的增加而趋向于GC1类型，最终可筛选出一致的GC1类型愈伤组织；GC2类型愈伤组织继代培养时，类型也会出现分化，分化的结果是，产生GC1、GC2、GC3和GC4类型的愈伤组织，但刚开始时以GC2类型的居多，随继代次数的增加，也会趋向于产生GC1类型愈伤组织，最终也可获得一致的GC1类型愈伤组织，只是继代次数要比GC3多；GC4类型愈伤组织继代培养数天后开始褐化并呈现水渍状，且没有增殖，随培养时间的延长，褐化不断加重，直至最终死亡。

2．不同培养基对野生葡萄愈伤组织继代培养的影响

采用上述表1所列的培养基，在筛选出松散型愈伤组织（GC1类型）的基础上，选取生长状态良好的GC1类型愈伤组织并置于培养室中进行继代培养试验，结果见表3。

表3 不同培养基对野生葡萄愈伤组织继代增殖的影响

从表3可以看出，将刚诱导出来的GC1类型愈伤组织接种到继代培养基中，都会有部分发生褐变。结合表1与表3，从褐变率来看，6种培养基可大体分为两组，以BA和NAA或IBA的组合（G1、G2、G3）为一组，另一组则是添加2,4-D的培养基（G4、G5、G6），邓肯氏新复极差测验表明，添加有2,4-D的培养基的褐变率明显高于BA和NAA或IBA的组合，BA和NAA或IBA的组合之间的差别不大，随2,4-D浓度增加褐变率有增加的趋势，同时在2,4-D浓度一致的情况下，添加AgNO3的培养基褐变率也较高；从有效愈伤组织形成的情况看，在添加2,4-D的G4、G5和G6培养基中培养形成的愈伤组织，除了褐变死亡外，均为有效愈伤组织，有效率达100%。而培养在G1、G2、G3培养基中的情况比较复杂，培养在这3种培养基中的材料，最终都会形成GC1、GC2、GC3和GC4等4种类型的愈伤组织，其中在G3培养基中培养后形成的有效愈伤组织率最低，为61.9%，在G1和G2培养基中培养的有效率分别为89.0%和82.6%，邓肯氏新复极差测验表明，G1与G3所形成的有效愈伤组织率差异达到极显著水平。从产生的松散型愈伤组织（GC1）来看，添加2,4-D的G4、G5和G6培养基中培养形成的愈伤组织，均为有GC1类型的愈伤组织，占有率达100%。培养在BA和NAA或IBA组合的培养基中所产生的GC1类型愈伤组织，以G1培养基的占有率最高，为63.1%，而在G3培养产生GC1的占有率最低，为37.7%，G2培养的介于前两者之间，为47.5%。邓肯氏新复极差分析表明，三者之间都存在极显著差异。

因此，在进行野生葡萄愈伤组织继代保存时，考虑到有效愈伤组织和快速获得松散型愈伤组织的两个因素，以MS+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L作为继代增殖培养基为最佳。

需要说明的是：上述表2与表3中，有效愈伤组织为GC1、GC2和GC3类型愈伤组织的总和；表中百分率数值之后的不同字母表示邓肯氏新复极差测验差异显著性，其中大写字母为差异极显著（P<0.01），小写字母为差异显著（P<0.05）。

四、愈伤组织长期继代保持

将上述所获得的葡萄松散型愈伤组织进行长期继代保持，具体操作如下：取上述所获得的葡萄松散型愈伤组织，并接于第一种培养基中继代保持多代（通常为2-5代）后，此时观察到的愈伤组织颜色会有所淡化，成浅黄白色；将其转接到第二种培养基中继代保持1代，此时愈伤组织恢复淡黄色松散的状态，且继代保持时的该第一种培养基、第二种培养基均置于培养室中进行；其中，所述第一种培养基为：MS+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L；所述第二种培养基为：MS+2，4-D 1.0mg/L+KT0.5mg/L+AgNO₃ 5.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。因此，葡萄愈伤组织的生长是一种动态的平衡，若要维持这种平衡，一种培养基可能不能实现，必须在一种培养基的基础上辅予一种或多种培养基进行交替继代培养，以达到生长的动态平衡。

另外，本发明中所提及的培养室中的条件均为：温度设置在23~25℃，光照强度1500~2000lx，每天光照12h。

Claims

1.一种快速获得葡萄松散型愈伤组织的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

（2）启动培养：取步骤（1）所获得的葡萄无菌株系的小苗，切取0.5cm茎段或切取0.5cm×0.5cm见方大小的叶片作为外植体，接着将该外植体接种至诱导愈伤组织的培养基中，并将该培养置基于培养室中培养，7天后可见愈伤组织形成，25~30天后长成初代愈伤组织；

2.根据权利要求1所述的快速获得葡萄松散型愈伤组织的方法，其特征在于：步骤（2）中所述诱导愈伤组织的培养基为：MS+BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。

3.根据权利要求1所述的快速获得葡萄松散型愈伤组织的方法，其特征在于：步骤（3）中所述继代增殖培养基为：MS+2,4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。

4.一种葡萄松散型愈伤组织长期继代保持的方法，其特征在于：其操作如下：取权利要求1所获得的葡萄松散型愈伤组织，并接于第一种培养基中继代保持至少2代后，转接到第二种培养基中继代保持1代，如此反复交替继代培养，即可长期继代保持葡萄松散型愈伤组织，且继代保持时的该第一种培养基、第二种培养基均置于培养室中进行；其中，所述第一种培养基为：MS+2,4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L；所述第二种培养基为：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.5mg/L+AgNO₃ 5.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L；所述培养室中的条件为：温度设置23~25℃，光照强度1500~2000lx，每天光照12h。