CN104099287A - 高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法 - Google Patents
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Abstract
一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，包括无菌幼胚的获取、启动培养、增殖培养、刺葡萄愈伤组织高产原花青素细胞系的筛选，以及长期继代保持所筛选的高产原花青素的愈伤组织等内容。本发明不仅能够快速获得大量刺葡萄愈伤组织，且所获得的刺葡萄愈伤组织具有高诱导效率、生长旺盛和高产原花青素的优点，同时可长期继代保持刺葡萄愈伤组织，即具有旺盛的生长能力，从而为刺葡萄生物技术和细胞培养生产次生代谢产物等研究奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法。
背景技术
刺葡萄(Vitis davidii)是葡萄科葡萄属东亚种群的一个野生种，为落叶强大藤本植物，在我国南方广泛分布，向北分布至陕西南部。刺葡萄果实紫黑色，营养极为丰富，含有具保健功能的黄酮类化合物(主要是花青素和原花青素)、白黎芦醇、齐墩果酸、蹂质、超氧化物歧化酶(SOD)和维生素C等天然活性成分。刺葡萄果皮厚，种子多，在加工制汁和酿酒，以及从果皮、种子提取天然活性物质具有很好的应用前景。研究表明，刺葡萄果实中富含的花青素和原花青素(oligomeric proanthocyanidins，OPCs)有很强的清除自由基的能力，具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、保护心血管等方面的功能，尤其是原花青素，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。目前，天然的原花青素还主要来源于松树皮和葡萄籽，随着市场需求的不断扩大，原有的从葡萄、松树皮或其他替代植物中来源的生物活性物质已不能满足需要，必须寻求更多更可靠的材料来源。生物技术领域里一个重要分支的植物细胞培养，具有不受季节影响、生长周期短、产物均一可控、活性物质成分高于天然植物等优点，因此采用规模化的植物细胞培养是解决药用植物资源匮乏和药效成分低的药用植物以满足需求的重要途径。
近年来，植物细胞培养进行天然有效成分的生产已经取得了令人瞩目的成就。然而，刺葡萄的细胞培养还处在愈伤组织诱导和培养阶段，鲜见长期继代保持的报道；刺葡萄细胞培养还亟待解决细胞系的筛选、长期继代保持和悬浮细胞系建立等诸多问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，包括如下步骤：
(1)无菌幼胚的获取：剪取花后20～30天的整串刺葡萄幼果，去除果穗和果柄，置入加有洗涤剂的自来水中浸泡30min，冲洗干净，自然晾干；将幼果用75％酒精浸泡30s，接着用0.1％升汞溶液灭菌15min，再用无菌水冲洗5次，最后将灭菌好的刺葡萄幼果，小心切开，取出完整的幼胚；
(2)启动培养：取所述幼胚，将该幼胚以平放的方式接种至诱导愈伤组织的诱导培养基中，然后于培养室中黑暗条件下培养35天，得到初代愈伤组织；
(3)增殖培养：将初代愈伤组织转接到继代增殖培养基中，并于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下进行继代增殖培养，直至获得生长一致且生长旺盛的刺葡萄愈伤组织；
(4)筛选：从步骤(3)所获得的刺葡萄愈伤组织中，选取质地松脆、颜色为紫红色的刺葡萄愈伤组织，剥去紫红色表层，选取里层的愈伤组织接种至附加1.5mg/L2,4-D的MS固体培养基中，于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下培养20～25天，获得高产原花青素的愈伤组织；
(5)长期继代保持：以培养20～25天的高产原花青素的愈伤组织为材料，于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下，采用两种继代保持培养基交替继代培养，并采用剥去所述愈伤组织紫红色表层细胞，选里层愈伤组织接种的方式，能长期继代保持高产原花青素的紫红色刺葡萄愈伤组织。
进一步地，所述步骤(2)中的诱导培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.0mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
进一步地，所述步骤(3)中的继代增殖培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
进一步地，所述步骤(5)中的两种继代保持培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，以及MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
本发明的有益效果在于：不仅能够快速获得大量刺葡萄愈伤组织，且所获得的刺葡萄愈伤组织具有高诱导效率、生长旺盛和高产原花青素的优点，同时可长期继代保持刺葡萄愈伤组织，即具有旺盛的生长能力，从而为刺葡萄生物技术和细胞培养生产次生代谢产物等研究奠定了良好的基础。
具体实施方式
一、高产原花青素刺葡萄愈伤组织的制备
1、实验材料的选取与预处理
取花后20天左右的刺葡萄幼果，剪取整串刺葡萄，装入自封袋，带回实验室贮于4℃冰箱，备用。从冰箱中取出刺葡萄幼果，去除果穗和果柄，置入加有洗涤剂的自来水中浸泡30min，后用自来水冲洗干净，自然晾干备用。将幼果转入超净工作台内，用75％酒精(v/v)浸泡30s内，再用0.1％升汞(w/v)溶液灭菌15min，最后用无菌水冲洗5次；将灭菌好的刺葡萄幼果，小心切开，取出完整的幼胚。
2、启动培养：取所述幼胚接种至诱导培养基中，并将该诱导培养基置于培养室中黑暗条件下培养，7天后可见愈伤组织形成，30天左右长成初代愈伤组织。所述诱导培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.0mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
3、愈伤组织增殖培养：将初代愈伤组织转接到继代增殖培养基中，并将该继代增殖培养基置于培养室中光照条件下进行，以获得生长一致且生长旺盛的刺葡萄愈伤组织，获得的刺葡萄愈伤组织有白色、淡黄色、黄色、浅紫红色、紫红色等颜色；所述继代增殖培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
4、高产原花青素愈伤组织的筛选：将步骤3得到的刺葡萄愈伤组织，选取质地松脆的、颜色紫红色的刺葡萄愈伤组织，接种时剥去表层紫红色的愈伤组织，选取较里层的愈伤组织进行接种，于光照条件下培养，可获得生长一致且生长旺盛的、保持紫红色的高产原花青素的刺葡萄愈伤组织细胞系，培养35天时原花青素含量可达1671.16μg/g鲜样；
5、愈伤组织的长期继代保持：以培养20～25天的高产原花青素的愈伤组织为材料，于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下，采用两种继代保持培养基交替继代培养，能长期继代保持高产原花青素的紫红色刺葡萄愈伤组织。所述两种继代保持培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，以及MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
二、刺葡萄幼胚诱导刺葡萄愈伤组织过程的影响因素
1、不同培养基对刺葡萄幼胚诱导愈伤组织的影响
将刺葡萄幼胚接种到表1中的F1～F5等5种培养基中诱导愈伤组织。从诱导效果可见，F1和F5两种培养基诱导的效果最好，诱导30天后会形成大量的愈伤组织，诱导率可达到80％以上，刺葡萄愈伤组织有4种状态：松软状(用DF1指代)、松脆状(用DF2指代)、棉絮状(用DF3指代)、坚硬状(用DF4指代)，颜色有白色、淡黄色、浅红紫色、紫红色等。在F2培养基中，诱导率只有30％左右，并且愈伤组织的生长量很小，呈黄褐色，质地较坚硬，培养一段时间后，愈伤组织会褐变死亡，如果及时转接，愈伤组织可以继代保持，但要得到松脆状的愈伤组织，需要较长的在不加AgNO3培养基上培养，说明不利于刺葡萄愈伤组织的诱导。在F3、F4培养基中，未见刺葡萄幼胚的胚轴伸出，幼胚会慢慢的褐变死亡，这表明在MS培养基中附加BA+IBA或BA+NAA的组合，不适于作为刺葡萄幼胚诱导愈伤组织。由实验结果可知：刺葡萄幼胚诱导愈伤组织的较佳培养基是MS培养基中附加1.0mg/L2,4-D，或MS附加1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT。
表1中的F1、F2、F3、F4、F5培养基均指在MS培养基中附加了各成分及其含量的培养基，且各培养基中均含有6g/L琼脂粉，30g/L蔗糖，pH为5.8～6.0。其中，2,4-D为：2,4-二氯苯氧基乙酸；NAA为：α-萘乙酸；IBA为：(请填写IBA的中文名称)；BA为：6-苄氨基腺嘌呤；KT为：6-糠氨基嘌呤。
表1 不同培养基对刺葡萄愈伤组织诱导的影响
2、不同接种方式对刺葡萄愈伤组织诱导的影响
刺葡萄幼胚诱导愈伤组织时，采用两种方式接种，一种是将胚轴端插入表1的培养基F1中，另一种是将幼胚平放在培养基F1上，胚轴端略微下压，于黑暗下培养。培养30天后观察两种接种方式对刺葡萄幼胚愈伤组织诱导的影响。结果表明，平放在培养基F1的幼胚，诱导愈伤组织时，胚轴会伸出种皮，并形成愈伤组织；将胚轴端插入培养基F1的接种方式，形成的愈伤组织数量极少，培养一段时间后会褐变死亡，其原因可能是长期浸没在培养基F1中，细胞在生长的过程中容易受到MS固体培养基的挤压，生长量受到限制，同时细胞生长产生的次生有害物质容易累积，对细胞的生长产生毒害作用，而进一步影响愈伤组织的生长。采用平放的接种方式，下胚轴冲破种皮后产生愈伤组织，愈伤组织不断膨大，最终会长到约1.5cm，刺葡萄愈伤组织有松软状(用DF1指代)、松脆状(用DF2指代)、棉絮状(用DF3指代)、坚硬状(用DF4指代)等4种状态，颜色有白色、淡黄色、浅红紫色、紫红色等。培养时发现，若幼胚受伤，培养过程比较容易褐变，但在切口处可见少量愈伤组织产生。
3、不同培养条件对刺葡萄愈伤组织诱导的影响
将刺葡萄幼胚接种到F1培养基上，置于光照(1000～1500lx)和黑暗两种条件下培养。培养30天后观察愈伤组织的诱导情况，结果表明在光照下培养的幼胚，会逐渐转变成绿色，愈伤组织的诱导率30％左右，但愈伤组织一般呈现白色或浅黄色松软状，容易发生褐变，继代保持一段时间后褐变加重，直至死亡。于黑暗下培养的刺葡萄幼胚，愈伤组织诱导率也可达到80％以上，下胚轴冲破种皮后产生愈伤组织，或是有切口的地方长处愈伤组织，愈伤组织不断膨大，最终会长到约1.5cm，愈伤组织有松软状、松脆状、坚硬状、棉絮状等4种状态，颜色有白色、淡黄色、浅红紫色、红紫色等。
三、刺葡萄愈伤组织的继代增殖与保持
1、刺葡萄愈伤组织继代培养基正交试验的分析
在刺葡萄愈伤组织继代培养基正交试验的结果分析中，将愈伤组织的颜色、生长状态和生长量等指标最佳的处理记为9分，依此类推，最差的记为1分，9个处理3次重复的分数，将其用DPS软件进行极差和方差分析。方差分析结果可以看出，培养基中2,4-D、KT和AgNO3浓度对刺葡萄愈伤组织增殖都存在极显著影响，同时极差R反映了每个因素对刺葡萄愈伤组织增殖的影响程度，R值越大，表明该因素对试验结果的影响越显著，3个因素对反应体系影响从大到小的顺序依次为AgNO3>2,4-D>KT。通过试验处理因素各水平间差异显著性SSR检验分析，得出的刺葡萄愈伤组织增殖培养基中3个因素最佳理论反应水平组合为：1.5mg/L的2,4-D、0mg/L的KT和0mg/L的AgNO3，该组合没有在正交表中体现出来，但最接近分值最高的第6个处理(即1.5mg/L2,4-D、0.5mg/L KT和0mg/L AgNO3)，只是KT使用的浓度不同，前者培养基中不含有KT，而后者培养基中含有0.5mg/L KT。这个分析结果说明，在进行正交试验设计时，可不经直观分析，而根据试验组合中各培养物的生长情况直接对刺葡萄愈伤组织的增殖培养基进行选择，也能获得较佳的培养基配方。
2、刺葡萄愈伤组织继代增殖培养基优化试验
根据上述刺葡萄愈伤组织继代增殖培养基正交试验的结果，选出2个培养基配方进行优化培养试验，2个培养基配方分别为附加1.5mg/L2,4-D的MS固体培养基和附加1.5mg/L2,4-D、0.5mg/L KT的MS固体培养基。将松脆状(DF2)类型愈伤组织接种到上述两种培养基配方中，于光照条件下培养。培养25天后观察愈伤组织的生长情况，结果表明，在上述两种培养基中培养的愈伤组织，生长状态基本一致，只是在后一种培养基中，愈伤组织生长更为迅速，生长量会略大于在前一种培养基培养的愈伤组织，同时愈伤组织有趋向松软状或棉絮状的情况。如果长期将刺葡萄愈伤组织继代培养在前一种培养基上，愈伤组织会慢慢转为颗粒状，并且颜色比较深黄；长期培养在后一种培养基中的愈伤组织，生长量会很大，慢慢的转为松软状或棉絮状；而采用两种培养基交替继代培养，可以长期使刺葡萄愈伤组织保持松脆状的生长状态，颜色黄色或淡黄色。因此，长期继代增殖刺葡萄愈伤组织的最佳培养基配方和培养方案为：采用附加1.5mg/L2,4-D的MS固体培养基，和附加1.5mg/L2,4-D、0.5mg/L KT的MS固体培养基交替继代培养。
3、不同状态愈伤组织对愈伤组织继代增殖的影响
将上述诱导得到的不同类型愈伤组织接种到附加1.5mg/L2,4-D的MS固体培养基中培养。培养25天后观察不同类型愈伤组织的生长情况，结果表明，松软状类型的愈伤组织(DF1)接种培养后，生长量很小，并且会慢慢的褐变，最后出现水渍状不能再次继代；松脆状愈伤组织(DF2)一般呈浅黄绿色、浅紫红色或紫红色，这类愈伤组织接种继代后能旺盛的生长，培养到25天后生长量是接种时的10倍左右，并且可以长期继代保持；棉絮状愈伤组织(DF3)接种到培养基后，能快速生长，愈伤组织还是呈棉絮状，并且十分蓬松，愈伤组织体积会增大到接种时的10～15倍，这类愈伤组织也可长期继代保持；坚硬状愈伤组织(DF4)，在接种时要用解剖刀切成小块，这类愈伤组织接种后在切口处容易褐变，新长出的愈伤组织有松软状、松脆状和棉絮状。从后期培养的情况和次生代谢产物研究出发，以松脆状的愈伤组织为最佳的细胞系。
4、不同培养条件对愈伤组织继代增殖的影响
将DF2类型愈伤组织接种到F1培养基上，分别于光照(1000～1500lx)和黑暗两种条件下培养。在光照条件下培养的DF2类型愈伤组织，基本与上述的生长状态一致，在颜色和质地上没有发生大的改变，一般呈浅黄绿色、浅紫红色或紫红色，并可长期继代保持。在黑暗条件下培养的DF2愈伤组织，生长状态也比较良好，但生长量明显小于在光照条件下培养的愈伤组织，并且经多代培养后，愈伤组织颜色会渐渐的淡化，尤其是紫红色会逐渐变成白色或黄白色，但愈伤组织可长期继代保持。从以上可以看出，刺葡萄愈伤组织颜色的保持，要在光照的条件下培养，同时光照条件下，愈伤组织的生长量会优于黑暗中培养的。
四、刺葡萄愈伤组织高产原花青素细胞系筛选与保持
在刺葡萄愈伤组织诱导中，从获得的愈伤组织颜色来看，有白色、淡黄色、黄色、浅紫红色、紫红色等颜色。在继代培养的过程中，浅紫红色或紫红色的愈伤组织颜色的保留很不稳定，尤其是浅紫红色的愈伤组织，很容易发生颜色退去的现象，这对于进行刺葡萄细胞培养次生代谢产物生产、生物技术等方面的后继研究很不利。通过观察发现，刺葡萄紫红色愈伤组织有类似葡萄果实的特性，只是表面一层的细胞呈紫红色，犹如葡萄果实的果皮，而越往里颜色越浅直至无色。
根据上述继代增殖培养基筛选和培养条件优化的结果，结合紫红色愈伤组织的特性，在进行刺葡萄愈伤组织高产原花青素细胞系筛选时，选取质地松脆的、颜色紫红色的愈伤组织进行继代保持，接种时剥去表层紫红色的愈伤组织，选取较里层的愈伤组织进行接种，于光照1000～1500lx条件下培养，同时采用两种培养基交替继代培养，能长期继代保持紫红色的刺葡萄愈伤组织。筛选过程中发现，如果选取外层的紫红色愈伤组织作为接种材料继代，愈伤组织生长量很小，并有水渍化、褐变的现象出现，多次继代保持后，愈伤组织最终死亡。因此，选用合适的接种材料，采用合适的培养条件是获得刺葡萄愈伤组织高产原花青素细胞系的关键。
五、刺葡萄愈伤组织原花青素含量变化分析
将紫红色愈伤组织细胞系(DLR)和浅黄色愈伤组织细胞系(DLW)分别接种到1.5mg/L2,4-D的MS固体培养基中培养，分别于10d、15d、20d、25d、30d、35d收集其培养物。利用80％甲醇水浴浸提法分别提取其原花青素，并通过其吸光值和标准曲线回归方程计算出各培养物中花青素的含量，DLR和DLW两个刺葡萄愈伤组织细胞系原花青素含量变化也存在很大差异。在整个培养过程中，DLW细胞系原花青素含量变化不大，并始终维持在一个很低的水平，最高为培养10d时，含量为47.91μg/g鲜样。DLR细胞系原花青素含量呈有规律变化，整个培养过程中，原花青素含量不断升高，培养20d后原花青素含量急剧升高，培养到35d时，原花青素含量可达1671.16μg/g鲜样。从以上分析表明，DLW细胞系没有合成原花青素的能力，或合成的量极少，而DLR细胞系(即紫红色愈伤组织细胞系)能合成含量极高的原花青素，这表明本研究中获得了高产原花青素的刺葡萄愈伤组织细胞系。
本发明以刺葡萄幼胚为材料，以期诱导出较高质量且能长期继代保持的松散型愈伤组织，从而筛选并建立葡萄高效产生生物活性物质(花青素或原花青素)的细胞系，为通过葡萄细胞培养生产生物活性物质提供实验体系，同时也可为葡萄生物技术其他方面的研究提供理想的技术平台。
Claims (4)
1.一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)无菌幼胚的获取：剪取花后20～30天的整串刺葡萄幼果，去除果穗和果柄，置入加有洗涤剂的自来水中浸泡30min，冲洗干净，自然晾干；将幼果用75％酒精浸泡30s，接着用0.1％升汞溶液灭菌15min，再用无菌水冲洗5次，最后将灭菌好的刺葡萄幼果，小心切开，取出完整的幼胚；
(2)启动培养：取所述幼胚，将该幼胚以平放的方式接种至诱导愈伤组织的诱导培养基中，然后于培养室中黑暗条件下培养35天，得到初代愈伤组织；
(3)增殖培养：将初代愈伤组织转接到继代增殖培养基中，并于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下进行继代增殖培养，直至获得生长一致且生长旺盛的刺葡萄愈伤组织；
(4)筛选：从步骤(3)所获得的刺葡萄愈伤组织中，选取质地松脆、颜色为紫红色的刺葡萄愈伤组织，剥去紫红色表层，选取里层的愈伤组织接种至附加1.5mg/L2,4-二氯苯氧基乙酸的MS固体培养基中，于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下培养20～25天，获得高产原花青素的愈伤组织；
(5)长期继代保持：以培养20～25天的高产原花青素的愈伤组织为材料，于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下，采用两种继代保持培养基交替继代培养，并采用剥去所述愈伤组织紫红色表层细胞，选里层愈伤组织接种的方式，能长期继代保持高产原花青素的紫红色刺葡萄愈伤组织。
2.如权利要求1所述的高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，其特征在于：所述步骤(2)中的诱导培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.0mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
3.如权利要求1所述的高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，其特征在于：所述步骤(3)中的继代增殖培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
4.如权利要求1所述的高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，其特征在于：所述步骤(5)中的两种继代保持培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，以及MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
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