CN113481143A - 一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法，通过细胞系选择、刺葡萄细胞悬浮培养、细胞固体轮回培养、细胞液体轮回悬浮培养等步骤得以实现的；将在固体培养基中进行对数细胞同步增殖培养的刺葡萄愈伤组织接种到液体培养基中，于摇床振荡培养，获得悬浮细胞，或直接利用已建立的刺葡萄悬浮细胞，将刺葡萄悬浮细胞进一步培养，建立细胞高度分散、生长状态一致、紫红色均匀的刺葡萄悬浮培养细胞系，在此基础上进行轮回固体培养。本发明结合了固体培养与液体培养的优点，可保持刺葡萄细胞遗传的稳定性和细胞旺盛生长的能力，可在短时间内获取大量、含花青素丰富的刺葡萄细胞，花色苷产量高；可快速规模化生产花青素。
Description
【技术领域】
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法。
【背景技术】
花青素是一种天然的食用色素，具有安全，无毒的特点。花青素虽然广泛地存在于天然植物中，但依赖天然植物提取花青素具有局限性。目前花青素植物提取的主要来源于葡萄酒行业的葡萄皮。原花青素可作为天然的食源性防腐剂主要来源是松树皮和葡萄籽。在食品加工和保健品等行业对花青素和原花青素的需求日益增加，原有的来源途径不足以满足市场需求。因此，在“低碳经济”的条件下，必须寻求更广泛的材料来生产葡萄生物活性物质。利用植物细胞培养技术离体培养植物细胞，获得次生代谢产物高产细胞系；改进培养条件和技术；设计适合植物细胞培养的发酵罐等的研究是目前植物生物技术领域工业化生产次生代谢产物的研究热点。但目前植物细胞培养还存在生长缓慢、增殖效率低，次生代谢产物产量低、不稳定等诸多问题。利用本实验室已建立的高产花青素和原花青素的刺葡萄松散型红色愈伤组织细胞系，进一步研究刺葡萄细胞增殖与花青素合成的调控方法，为进行葡萄细胞工业化生产花青素提供理论基础和技术平台。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法。
本发明是这样实现的：
一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法，包括如下步骤：
(1)刺葡萄细胞系选择：以长期在固体培养基中或液体培养基中继代保持的、具有花青素合成能力的、紫红色的刺葡萄细胞系为培养材料；
(2)刺葡萄细胞同步化培养：在固体培养基中培养的刺葡萄细胞，挑选紫红色均匀的、生长状态一致且旺盛生长的刺葡萄细胞，于同一继代固体培养基中进行对数细胞同步增殖培养3～4代，使刺葡萄细胞生长状态达到同步化，细胞松散、紫红色均匀、绝大部分呈圆形；
在液体培养基中培养的刺葡萄细胞，则直接进入步骤(5)；
(3)刺葡萄悬浮细胞系建立：将达到同步化生长的刺葡萄细胞，培养至18天，于超净工作台中，取新鲜、松散易碎的红色愈伤组织，放入液体培养基中，用镊子轻轻夹散细胞团，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，摇床转速120rpm～130rpm，振荡培养，建立刺葡萄细胞悬浮培养；
(4)旺盛刺葡萄悬浮细胞获取：刺葡萄细胞进入液体悬浮培养后，重复4～5代培养，以获得细胞高度分散、生长状态一致、紫红色均匀的刺葡萄悬浮培养细胞，悬浮细胞小且呈圆形、细胞质浓密、细胞生长旺盛；
(5)刺葡萄悬浮细胞增殖：刺葡萄悬浮细胞每隔10天，按悬浮细胞液体积：新鲜的液体培养基体积＝1:8的比例，进行继代增殖培养；
(6)刺葡萄细胞固体轮回培养：取适量刺葡萄液体悬浮细胞，平铺到新鲜的固体培养基上，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，进行固体轮回培养，即可获得大量刺葡萄细胞。
(7)刺葡萄细胞液体轮回培养：取适量在固体培养基中轮回培养的刺葡萄细胞，转接到新鲜的液体培养基中进行培养，即可重新形成高度分散的悬浮细胞系。
进一步地，步骤(2)所述对数细胞同步增殖培养方式，即将刺葡萄愈伤组织接种后培养至18天，固体培养基中培养18天时刺葡萄愈伤组织细胞生长正处于对数生长起始阶段，细胞生长同步化高，于超净工作台中，取适量的愈伤组织接种到新鲜的固体培养基中，能使刺葡萄愈伤组织细胞在较短的时间内进入高度的生长同步化，有利于刺葡萄细胞悬浮培养的启动和悬浮细胞系的建立。
进一步地，步骤(5)所述继代增殖培养，具体为：将刺葡萄悬浮细胞培养至指数生长期中期即培养至10天，于超净工作台内，用力振摇三角瓶，使细胞悬浮液均匀分散，按悬浮细胞液体积：新鲜的液体培养基体积＝1:8的比例，用灭菌过的移液器移取刺葡萄细胞悬浮液，转入装有液体培养基的三角瓶中，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，摇床转速120rpm～130rpm，振荡培养。
进一步地，步骤(6)所述平铺培养，具体为：将刺葡萄悬浮细胞培养10天，至指数生长期中期，于超净工作台内，按细胞悬浮液体积：固体培养基表面积＝1:30～35的比例，用灭菌移液器将均匀悬浮的细胞悬浮液转移到固体培养基上，并迅速轻盈的振摇培养瓶，使悬浮液细胞均匀的贴合在固体培养基表面上，也可以采用分点式将细胞悬浮液点滴在固体培养基上，然后立即振摇培养瓶，以均匀分散细胞，防止细胞成团附着在培养基上。
进一步地，步骤(7)所述重新形成高度分散的悬浮细胞系，具体操作为：将固体培养基轮回培养20天的刺葡萄细胞，于超净工作台中，用灭菌的药勺轻轻刮去表层0.01～0.05cm的细胞，然后刮取里层细胞，转接到液体培养基中，接种量为细胞质量：液体培养基体积＝1:10～15，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，摇床转速120rpm～130rpm，振荡培养，重新形成刺葡萄悬浮细胞系，以利于形成刺葡萄细胞快速增殖的良性的固液轮回培养体系。
进一步地，所述固体培养基为MS基本培养基添加了1.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂粉的培养基，pH调整至6.0；
所述液体培养基为MS基本培养基添加了1.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖的培养基，pH调整至6.0。
本发明具有如下优点：
1.本发明所采用的紫红色刺葡萄愈伤组织稳定性好、生长旺盛，能够很快的建立起优质高效的悬浮细胞系。
2.结合了固体培养和液体培养的优势，细胞生长周期缩短(全固体培养基培养20天继代一次，液体培养10天继代一次)、增殖系数放大。
3、平铺培养的刺葡萄细胞，与培养基充分接触，营养吸收充分，细胞增殖率为49.46％，生长量最高是全固体培养细胞的2.25倍；同时平铺培养，细胞受光面积大，细胞能合成更多的花色苷，细胞中花色苷含量平均可达到151.34μg/g(FW)，花色苷合成效率最高是全固体培养细胞的18倍；固液轮回交替培养，会使细胞含水量低，含水量由原来固体培养的95％以上，降至85％～90％；与液体培养相比，效果还会进一步放大。
4.本发明能够为工厂化快速生产花青素等葡萄天然活性物质提供一个新的途径。
【具体实施方式】
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
1、培养材料：以长期在固体培养基中继代保持的、具有花青素合成能力的、紫红色的刺葡萄细胞系为培养材料。
2、在固体培养基中培养的刺葡萄细胞，挑选紫红色均匀的、生长状态一致且旺盛生长的刺葡萄细胞。
3、对数细胞同步增殖培养：将刺葡萄愈伤组织原有的常规继代时间20天，缩短为18天，即将刺葡萄愈伤组织接种后培养至18天(固体培养基中培养18天时刺葡萄愈伤组织细胞生长正处于对数生长起始阶段，细胞生长同步化高，)，于超净工作台中，取适量的愈伤组织接种到新鲜的固体培养基中，能使刺葡萄愈伤组织细胞在较短的时间内进入高度的生长同步化。
4、进行对数细胞同步增殖培养3～4代，使刺葡萄细胞生长状态达到同步化，细胞松散、紫红色均匀、绝大部分呈圆形，有利于刺葡萄细胞悬浮培养的启动和悬浮细胞系的建立。
5、将达到同步化生长的刺葡萄细胞，培养至18天，于超净工作台中，取新鲜、松散易碎的红色愈伤组织2团(4～5g)，放入装有40mL液体培养基的150mL三角瓶中，用镊子轻轻夹散细胞团，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，摇床转速120rpm～130rpm，振荡培养，建立刺葡萄细胞悬浮培养。
6、刺葡萄细胞进入液体悬浮培养后，重复4～5代培养，以获得细胞高度分散、生长状态一致、紫红色均匀的刺葡萄悬浮培养细胞，悬浮细胞小且呈圆形、细胞质浓密、细胞生长旺盛。
7、将刺葡萄悬浮细胞培养至指数生长期中期(培养至10天)，于超净工作台内，用力振摇三角瓶，使细胞悬浮液均匀分散，按细胞悬浮液体积：新鲜的液体培养基＝1:8的比例，用灭菌过的移液器移取5mL刺葡萄细胞悬浮液，转入装有40mL液体培养基的150mL三角瓶中，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，摇床转速120rpm～130rpm，振荡培养。
8、将刺葡萄悬浮细胞培养10天，至指数生长期中期，于超净工作台内，按细胞悬浮液体积：固体培养基表面积＝1:30～35的比例，用灭菌移液器将均匀悬浮的细胞悬浮液转移到固体培养基上，并迅速轻盈的振摇培养瓶，使悬浮液细胞均匀的贴合在固体培养基表面上，也可以采用分点式将细胞悬浮液点滴在固体培养基上，然后立即振摇培养瓶，以均匀分散细胞，该操作要求动作迅速、力道轻盈，防止细胞成团附着在培养基上。于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，进行固体轮回培养，即可获得大量刺葡萄细胞，细胞增殖率是全固体培养细胞的2.0～2.5倍，细胞增殖率平均可达到49.46％；花色苷合成效率是全固体培养细胞的1.5～2.0倍，细胞中花色苷含量平均可达到151.34μg/g(FW)；细胞含水量下降，为85％～90％(全固体培养细胞的含水量一般为92％以上)。
9、将固体培养基轮回培养20天的刺葡萄细胞，于超净工作台中，用灭菌的药勺轻轻刮去表层0.01～0.05cm的细胞，然后刮取里层细胞，转接到液体培养基中，接种量为1:10～15(细胞质量：液体培养基体积)，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，摇床转速120rpm～130rpm，振荡培养，重新形成刺葡萄悬浮细胞系。
所述固体培养基为MS基本培养基添加了1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂粉的培养基，pH调整至6.0；
所述液体培养基为MS基本培养基添加了1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖的培养基，pH调整至6.0。
实施例2：
1、培养材料：以长期在液体培养基中继代保持的、具有花青素合成能力的、紫红色的刺葡萄悬浮细胞系为培养材料。
2、将刺葡萄悬浮细胞培养至指数生长期中期(培养至10天)，于超净工作台内，用力振摇三角瓶，使细胞悬浮液均匀分散，按体积比1:8(细胞悬浮液体积：新鲜的液体培养基)的比例，用灭菌过的移液器移取5mL刺葡萄细胞悬浮液，转入装有40mL液体培养基的150mL三角瓶中，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，摇床转速120rpm～130rpm，振荡培养。
3、将刺葡萄悬浮细胞培养10天，至指数生长期中期，于超净工作台内，按体积面积比1:30～35(细胞悬浮液体积：固体培养基表面积)的比例，用灭菌移液器将均匀悬浮的细胞悬浮液转移到固体培养基上，并迅速轻盈的振摇培养瓶，使悬浮液细胞均匀的贴合在固体培养基表面上，也可以采用分点式将细胞悬浮液点滴在固体培养基上，然后立即振摇培养瓶，以均匀分散细胞，该操作要求动作迅速、力道轻盈，防止细胞成团附着在培养基上。于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，进行固体轮回培养，即可获得大量刺葡萄细胞，细胞增殖率是全固体培养细胞的2.0～2.5倍，花色苷合成效率是全固体培养细胞的1.5～2.0倍，细胞含水量下降，为85％～90％(全固体培养细胞的含水量一般为92％以上)。
4、将固体培养基轮回培养20天的刺葡萄细胞，于超净工作台中，用灭菌的药勺轻轻刮去表层0.01～0.05cm的细胞，然后刮取里层细胞，转接到液体培养基中，接种量为1:10～15(细胞质量：液体培养基体积)，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，摇床转速120rpm～130rpm，振荡培养，重新形成刺葡萄悬浮细胞系。
所述固体培养基为MS基本培养基添加了1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂粉的培养基，pH调整至6.0；
所述液体培养基为MS基本培养基添加了1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖的培养基，pH调整至6.0。
本发明将在固体培养基中进行对数细胞同步增殖培养的刺葡萄愈伤组织接种到液体培养基中，于摇床振荡培养，获得悬浮细胞，或直接利用已建立的刺葡萄悬浮细胞，将刺葡萄悬浮细胞进一步培养，建立细胞高度分散、生长状态一致、紫红色均匀的刺葡萄悬浮培养细胞系，在此基础上再进行轮回固体培养。刺葡萄细胞固体培养细胞质浓密、遗传稳定性好，液体培养增殖效率高、细胞生长旺盛，本法结合了固体培养与液体培养的优点，可保持刺葡萄细胞遗传的稳定性和细胞旺盛生长的能力，可在短时间内获取大量、含花青素丰富的刺葡萄细胞，刺葡萄生长量是原来固体培养的2.0～2.5倍；含水量低，由原来固体培养的95％以上，降至85％～90％；与液体培养相比，效果还会进一步放大；细胞受光面积大，细胞能合成更多的花色苷，花色苷合成效率是原有固体培养的1.5～2.0倍左右。本法为通过刺葡萄细胞培养进行规模化天然花青素的提取提供技术支撑。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (6)
1.一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)刺葡萄细胞系选择：以长期在固体培养基中或液体培养基中继代保持的、具有花青素合成能力的、紫红色的刺葡萄细胞系为培养材料；
(2)刺葡萄细胞同步化培养：在固体培养基中培养的刺葡萄细胞，挑选紫红色均匀的、生长状态一致且旺盛生长的刺葡萄细胞，于同一继代固体培养基中进行对数细胞同步增殖培养3～4代，使刺葡萄细胞生长状态达到同步化，细胞松散、紫红色均匀、绝大部分呈圆形；
在液体培养基中培养的刺葡萄细胞，则直接进入步骤(5)；
(3)刺葡萄悬浮细胞系建立：将达到同步化生长的刺葡萄细胞，培养至18天，于超净工作台中，取新鲜、松散易碎的红色愈伤组织，放入液体培养基中，用镊子轻轻夹散细胞团，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，摇床转速120rpm～130rpm，振荡培养，建立刺葡萄细胞悬浮培养；
(4)旺盛刺葡萄悬浮细胞获取：刺葡萄细胞进入液体悬浮培养后，重复4～5代培养，以获得细胞高度分散、生长状态一致、紫红色均匀的刺葡萄悬浮培养细胞，悬浮细胞小且呈圆形、细胞质浓密、细胞生长旺盛；
(5)刺葡萄悬浮细胞增殖：刺葡萄悬浮细胞每隔10天，按悬浮细胞液体积：新鲜的液体培养基体积＝1:8的比例，进行继代增殖培养；
(6)刺葡萄细胞固体轮回培养：取适量刺葡萄液体悬浮细胞，平铺到新鲜的固体培养基上，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，进行固体轮回培养，即可获得大量刺葡萄细胞。
(7)刺葡萄细胞液体轮回培养：取适量在固体培养基中轮回培养的刺葡萄细胞，转接到新鲜的液体培养基中进行培养，即可重新形成高度分散的悬浮细胞系。
2.根据权利要求1所述的一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法，其特征在于：步骤(2)所述对数细胞同步增殖培养方式，即将刺葡萄愈伤组织接种后培养至18天，固体培养基中培养18天时刺葡萄愈伤组织细胞生长正处于对数生长起始阶段，细胞生长同步化高，于超净工作台中，取适量的愈伤组织接种到新鲜的固体培养基中，能使刺葡萄愈伤组织细胞在较短的时间内进入高度的生长同步化，有利于刺葡萄细胞悬浮培养的启动和悬浮细胞系的建立。
3.根据权利要求1所述的一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法，其特征在于：步骤(5)所述继代增殖培养，具体为：将刺葡萄悬浮细胞培养至指数生长期中期即培养至10天，于超净工作台内，用力振摇三角瓶，使细胞悬浮液均匀分散，按悬浮细胞液体积：新鲜的液体培养基体积＝1:8的比例，用灭菌过的移液器移取刺葡萄细胞悬浮液，转入装有液体培养基的三角瓶中，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，摇床转速120rpm～130rpm，振荡培养。
4.根据权利要求1所述的一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法，其特征在于：步骤(6)所述平铺培养，具体为：将刺葡萄悬浮细胞培养10天，至指数生长期中期，于超净工作台内，按细胞悬浮液体积：固体培养基表面积＝1:30～35的比例，用灭菌移液器将均匀悬浮的细胞悬浮液转移到固体培养基上，并迅速轻盈的振摇培养瓶，使悬浮液细胞均匀的贴合在固体培养基表面上，也可以采用分点式将细胞悬浮液点滴在固体培养基上，然后立即振摇培养瓶，以均匀分散细胞，防止细胞成团附着在培养基上。
5.根据权利要求1所述的一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法，其特征在于：步骤(7)所述重新形成高度分散的悬浮细胞系，具体操作为：将固体培养基轮回培养20天的刺葡萄细胞，于超净工作台中，用灭菌的药勺轻轻刮去表层0.01～0.05cm的细胞，然后刮取里层细胞，转接到液体培养基中，接种量为细胞质量：液体培养基体积＝1:10～15，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，摇床转速120rpm～130rpm，振荡培养，重新形成刺葡萄悬浮细胞系，以利于形成刺葡萄细胞快速增殖的良性的固液轮回培养体系。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法，其特征在于：所述固体培养基为MS基本培养基添加了1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂粉的培养基，pH调整至6.0；
所述液体培养基为MS基本培养基添加了1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖的培养基，pH调整至6.0。
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