CN114164122A - 一种高产epa的裂殖壶菌及其应用 - Google Patents

一种高产epa的裂殖壶菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种高产EPA的裂殖壶菌及其应用。本发明通过离子束注入和紫外‑氯化锂复合诱变等方式，筛选得到一种高产EPA的裂殖壶菌，其保藏编号为CCTCC NO:M 2021565。该裂殖壶菌具备较高的产EPA性能，且该裂殖壶菌快速生长，相较于现有需要在低温条件下才能合成含量较高的EPA的裂殖壶菌而言，具备更高的EPA产量和效率，此外在该裂殖壶菌的产物中还发现了一定含量的角鲨烯。

Description

一种高产EPA的裂殖壶菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种高产EPA的裂殖壶菌及其应用。
背景技术
裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)是Ω-3PUFAs生产的代表性菌株，目前在针对裂殖壶菌的研究中，多数研究中主要关注DHA的发酵生产，而同样具有重要生理功能的EPA却极少被关注。现阶段裂殖壶菌中EPA的含量处于较低水平，也有研究通过进一步驯化或高效的菌种诱变方法以及高通量菌种筛选技术获得高产菌株，但仍存在EPA产量较低，或必须在低温(22℃)下才具备较高的EPA生产效率等问题，然而低温同时会造成细胞生长缓慢，致使EPA生产效率仍然不高。
现有技术中，专利CN 108707630 A、CN 104011217 B通过添加某种有机试剂及特殊工艺条件如控制环境中的CO2，使裂殖壶菌中EPA的含量得到提高；其中专利CN104011217 B通过分离筛选获得产生具有至少3％EPA的生物质的裂殖壶菌。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明提供一种高产EPA的裂殖壶菌及其应用，并且发明人在分析诱变裂殖壶菌株的脂质产物组成时，意外发现该裂殖壶菌产物中还存在大量的角鲨烯。
本发明提供一种高产EPA的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-IV，其保藏信息如下：
保藏编号为CCTCC NO:M 2021565；分类命名为：Shchizochytri um sp.CABIO-A-2-IV；保藏单位为中国典型培养物保藏中心；保藏地址中国武汉武汉大学，邮编：430072；保藏日期为2021年5月19日。
本发明采用离子束注入，以及紫外-氯化锂复合等诱变方式，经过诱变筛选获得了一种裂殖壶菌突变株，通过培养特征、显微形态特征、生理生化特征和遗传特征，确定裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-IV符合裂殖壶菌株的特征。
该菌株在具备较高EPA产量的同时，还含有大量的角鲨烯，角鲨烯在干菌体中占3％以上的比重。
角鲨烯是一种三萜类化合物，分子结构为三十碳五十氢的异戊二烯，其分子式为：2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22二十四碳六烯。广泛应用于食品、化妆品和医药等行业。在食品领域，通常被制成胶囊或油制品；在化妆品领域，其分子可作为保湿霜里面的抗氧化剂，抗静电剂和润肤保湿剂成分，迅速渗透进入皮肤，不留下痕迹，没有油腻感，与其它油和维生素混合使用效果良好；在制药领域，角鲨烯常被用作疫苗辅助佐剂。
本发明进一步提供包含所述裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-IV的菌剂。
本发明进一步提供包含所述裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-IV或所述菌剂的产品，所述产品为食品、饲料、化妆品或药物。
本发明进一步提供所述裂殖壶菌(Schizochyrim sp.)CABIO-A-2-IV或所述菌剂在制备功能性脂类化合物中的应用。
进一步地，所述功能性脂类化合物中，EPA的含量不低于10％，角鲨烯的含量不低于10％。
本发明所述的功能性脂类化合物指的是，裂殖壶细胞裂解之后，采用正己烷提取出的包含多不饱和脂肪酸、角鲨烯的原油，也可以是经过一定精炼步骤的成品油。
进一步地，所述功能性脂类化合物中，EPA的含量不低于12％。
进一步地，所述功能性脂类化合物中，角鲨烯的含量不低于15％本发明进一步提供一种生产多不饱和脂肪酸油脂的方法，所述方法包括：
使用所述裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-IV或所述菌剂进行发酵。
进一步地，所述发酵的条件为：
发酵温度在28℃以上。
在此条件下发酵，EPA在功能性脂类化合物的含量不低于10％。
更进一步地，当所述发酵温度在30℃以上时，EPA在功能性脂类化合物的含量不低于12％。
进一步地，在所述发酵过程中，使用的发酵培养基包括葡萄糖、谷氨酸钠、酵母浸膏、KH2PO4、MgSO4、Na2SO4、(NH4)2SO4、KCl和微量元素。
进一步地，以质量比计，所述发酵培养基包括：
5％～15％葡萄糖、0.5％～3％酵母浸膏、0.25％～0.75％KH2PO4、0.25％～0.5％MgSO4、1％～4％Na2SO4、0.4％～0.6％(NH4)2SO4、0.05％～0.15％KCl和0.1％～0.3％微量元素混合液。
本发明具备如下有益效果：
本发明通过离子束注入，以及紫外-氯化锂复合等诱变方式得到一种高产EPA的裂殖壶菌，该裂殖壶菌具备较高的产EPA性能，占菌株产生的功能性脂类化合物总量的10％以上，进而可以达到16％；同时还具有角鲨烯的生产性能。具体的，诱变以后的裂殖壶菌在相同条件下功能性脂类化合物中EPA的含量提升了46.7％，并且功能性脂类物质中还出现含量不低于10％的角鲨烯。本发明提供的裂殖壶菌可以在高温环境下快速生长，相较于现有需要在低温条件下才能合成含量较高的EPA的裂殖壶菌而言，具备更高的EPA产量和效率。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的裂殖壶菌发酵产物与角鲨烯标样的气相色谱对比图，其中19.578处峰为EPA，20.792处峰为角鲨烯。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种菌种诱变和筛选方法
1、诱变
(1)以从海水中筛选分离得到的裂殖壶菌为出发菌株。
(2)将菌种接到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养48h至对数生长期。
a、离子束注入：取1ml上述步骤(2)的活化种子培养液经无菌风风干，成为菌斑。将含菌斑的培养皿无菌移入高能粒子束注入机中，经过能量为20KeV的高能N+离子束注入诱变，N+离子束注入剂量1017ions/cm2。
b、紫外-氯化锂：取上述步骤(2)的活化种子培养液(OD＝10～15)稀释103倍后取100μl涂布于含4％～6％氯化锂的固体培养基，并用30W紫外灯，35cm处照射20min，避光，28℃培养4d。
(5)将上述诱变处理后的菌膜用无菌水洗脱，接种到低氮低糖裂殖壶菌培养基中，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养60h至稳定期。
2、筛选
利用流式细胞仪结合尼罗红染色法筛选荧光信号最强的单菌落，流式细胞仪效率高，大大减少人工操作，可以在海量的突变株中筛选得到油脂含量高及细胞直径大的菌株。
进一步对筛选的菌落得到的油脂进行分析，将扩培后的发酵液收获菌体烘干后研磨，用石油醚提取油脂，经甲酯化后进行气相色谱分析，选取EPA含量高的菌株。
进行反复多次诱变筛选，完成高产EPA菌株的筛选，同时在气相色谱中发现该菌株还生产大量的其他脂质化合物(如图1所示)，其中保留时间为20.792的峰与角鲨烯标样重合，说明产物中含有角鲨烯。
经过上述流程，本实施例得到一株高产EPA的裂殖壶菌(Schizoc hytrium sp.)，并对其进行保藏，具体保藏信息如下：
保藏编号为CCTCC NO:M 2021565；分类命名为：Shchizochytrium sp.CABIO-A-2-IV；保藏单位为中国典型培养物保藏中心；保藏地址中国武汉武汉大学，邮编：430072；保藏日期为2021年5月19日。
实施例2
本实施例采用实施例1得到的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-IV进行发酵，具体流程如下：
(1)种子活化培养：取本发明实施例1得到的裂殖壶菌突变株接种到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养时间48h，所述活化培养基为：葡萄糖4％，谷氨酸钠3％，酵母浸膏0.6％，KH2PO4 0.6％，MgSO4 0.8％，NaCl 2％，CaC12 0.03％，pH自然。
(2)种子扩大培养：将上述步骤(1)振摇培养的活化种子培养液按照5％(体积比)接种量接种到扩大培养基中进行培养，培养温度28℃，培养时间48h，摇床振摇转速为200转/分钟，所述摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖4％，谷氨酸钠3％，酵母浸膏0.6％，KH2PO40.6％，MgSO4 0.8％，NaCl 2％，CaC12 0.03％，pH自然。
(3)1L发酵瓶培养：将上述步骤(2)振摇培养的扩大种子培养液按照5％(体积比)接种量接种到装有发酵培养基(装液量1/4)的发酵瓶中发酵培养，培养温度28℃，培养时间120h，摇床振摇转速为220转/分钟，所述发酵培养基为：葡萄糖5％，谷氨酸钠2％，酵母浸膏0.5％，KH2PO4 0.3％，MgSO4 0.5％，Na2SO4 2％，(NH4)2SO40.5％，KCl 0.1％，微量元素混合液0.2％，pH自然。发酵48h补5％的葡萄糖。微量元素混合液的组成如表1所示
表1微量元素混合液组成
微量元素母液 g/L
乙二胺四乙酸二钠 6
七水硫酸锌 0.8
四水氯化锰 0.86
发酵生物量为46g/L，EPA占功能性脂类物质的10.8％，占干菌体的2.2％；角鲨烯占功能性脂类物质的16％，占干菌体的3.25％。
实施例3
本实施例采用实施例1得到的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-IV进行发酵，具体流程如下：
(1)种子活化培养：取本发明所述裂殖壶菌突变株接种到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养时间48h，所述活化培养基为：葡萄糖4％，谷氨酸钠3％，酵母浸膏0.6％，KH2PO4 0.6％，MgSO4 0.8％，NaCl 2％，CaC12 0.03％，pH自然。
(2)种子扩大培养：将上述步骤(1)振摇培养的活化种子培养液按照5％(体积比)接种量接种到扩大培养基中进行培养，培养温度28℃，培养时间48h，摇床振摇转速为200转/分钟，所述摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖4％，谷氨酸钠3％，酵母浸膏0.6％，KH2PO40.6％，MgSO4 0.8％，NaCl 2％，CaC12 0.03％，pH自然。
(3)1L发酵罐培养：将上述步骤(2)振摇培养的扩大种子培养液按照5％(体积比)接种量接种到装有发酵培养基(装液量1/4)的发酵瓶中发酵培养，培养温度30℃，培养时间120h，搅拌转速为220转/分钟，所述发酵培养基为：葡萄糖5％，谷氨酸钠2％，酵母浸膏0.5％，KH2PO4 0.3％，MgSO4 0.5％，Na2SO4 2％，(NH4)2SO4 0.5％，KCl0.1％，微量元素混合液0.2％，pH自然。发酵48h补5％的葡萄糖。
生物量为45g/L，EPA占功能性脂类物质的12.5％，占干菌体的2.8％，EPA产量为1.26g/L，角鲨烯占功能性脂类物质的18％，占干菌体的4.04％，角鲨烯产量为1.82g/L。
实施例4
本实施例采用实施例1得到的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-IV进行发酵，具体流程如下：
(1)种子活化培养：取本发明所述裂殖壶菌突变株接种到活化培养基中培养，培养温度30℃，摇床振摇转速为200r/min，培养时间48h，所述活化培养基为：葡萄糖4％，谷氨酸钠3％，酵母浸膏0.6％，KH2PO4 0.6％，MgSO4 0.8％，NaCl 2％，CaC12 0.03％，pH自然。
(2)种子扩大培养：将上述步骤(1)振摇培养的活化种子培养液按照5％(体积比)接种量接种到扩大培养基中进行培养，培养温度28℃，培养时间48h，摇床振摇转速为200转/分钟，所述摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖4％，谷氨酸钠3％，酵母浸膏0.6％，KH2PO40.6％，MgSO4 0.8％，NaCl 2％，CaC12 0.03％，pH自然。
(3)1L发酵罐培养：将上述步骤(2)振摇培养的扩大种子培养液按照5％(体积比)接种量接种到装有发酵培养基(装液量1/4)的发酵瓶中发酵培养，培养温度33℃，培养时间120h，搅拌转速为220转/分钟，所述发酵培养基为：葡萄糖5％，谷氨酸钠2％，酵母浸膏0.5％，KH2PO4 0.3％，MgSO4 0.5％，Na2SO4 2％，(NH4)2SO4 0.5％，KCl 0.1％，微量元素混合液0.2％，pH自然，发酵48h补5％的葡萄糖。
生物量为39g/L，EPA占功能性脂类物质的16％，占干菌体的3.7％；角鲨烯占功能性脂类物质的18％，占干菌体的4.0％。
实施例5
本实施例采用实施例1得到的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-IV进行发酵，具体流程如下：
(1)种子活化培养：取本发明所述裂殖壶菌突变株接种到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养时间48h，所述活化培养基为：葡萄糖4％，谷氨酸钠3％，酵母浸膏0.6％，KH2PO4 0.6％，MgSO4 0.8％，NaCl 2％，CaC12 0.03％，pH自然。
(2)种子扩大培养：将上述步骤(1)振摇培养的活化种子培养液按照5％(体积比)接种量接种到扩大培养基中进行培养，培养温度28℃，培养时间48h，摇床振摇转速为200转/分钟，所述摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖4％，谷氨酸钠3％，酵母浸膏0.6％，KH2PO40.6％，MgSO4 0.8％，NaCl 2％，CaC12 0.03％，pH自然。
(3)1m3发酵罐培养：将上述步骤(2)振摇培养的扩大种子培养液按照5％(体积比)接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵培养(装液量1/3)，培养温度30℃，培养时间120h，搅拌转速为220转/分钟，所述发酵培养基为：葡萄糖5％，谷氨酸钠2％，酵母浸膏2％，KH2PO4 0.3％，MgSO4 0.5％，Na2SO4 2％，(NH4)2SO4 0.5％，KCl0.1％，微量元素混合液0.2％，pH自然，过程流加葡萄糖控制残糖不超过5g/L。
以上所得到生物量达59g/L，EPA占功能性脂类物质的14.8％，EPA产量为2.37g/L，角鲨烯占功能性脂类物质的18.4％，占干菌体的5.0％，角鲨烯产量为2.95g/L。
对比例1
本对比例采用实施例1中未经诱变的裂殖壶菌进行发酵，具体流程如下：
(1)种子活化培养：取未诱变处理的裂殖壶菌接种到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养时间48h，所述活化培养基为：葡萄糖4％，谷氨酸钠3％，酵母浸膏0.6％，KH2PO4 0.6％，MgSO4 0.8％，NaCl 2％，CaC12 0.03％，pH自然。
(2)种子扩大培养：将上述步骤(1)振摇培养的活化种子培养液按照5％(体积比)接种量接种到扩大培养基中进行培养，培养温度28℃，培养时间48h，摇床振摇转速为200转/分钟，所述摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖4％，谷氨酸钠3％，酵母浸膏0.6％，KH2PO40.6％，MgSO4 0.8％，NaCl 2％，CaC12 0.03％，pH自然。
(3)不同温度下的1L发酵瓶培养：将上述步骤(2)振摇培养的扩大种子培养液按照5％(体积比)接种量接种到装有发酵培养基的发酵瓶中发酵培养，培养温度22℃，培养时间120h，摇床振摇转速为220转/分钟，所述发酵培养基为：葡萄糖5％，谷氨酸钠2％，酵母浸膏0.5％，KH2PO4 0.3％，MgSO4 0.5％，Na2SO4 2％，(NH4)2SO40.5％，KCl 0.1％，微量元素混合液0.2％，pH自然。
以上所得到生物量达35g/L，EPA占功能脂质的8.5％，干菌体2.2％，EPA产量为0.77g/L，并未检测到角鲨烯。
(4)不同温度下的1L发酵瓶培养：将上述步骤(2)振摇培养的扩大种子培养液按照5％(体积比)接种量接种到装有发酵培养基(装液量1/4)的发酵瓶中发酵培养，培养温度28℃，培养时间120h，摇床振摇转速为220转/分钟，所述发酵培养基为：葡萄糖10％，谷氨酸钠2％，酵母浸膏0.5％，KH2PO4 0.3％，MgSO4 0.5％，Na2SO4 2％，(NH4)2SO4 0.5％，KCl 0.1％，微量元素混合液0.2％，pH自然。
以上所得到生物量达48g/L，EPA占功能脂质的5.8％，EPA占干菌体1.5％，EPA产量为0.72g/L，并未检测到角鲨烯。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种高产EPA的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-IV，其特征在于，所述裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-IV的保藏编号为CCTCC NO:M 2021565。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂含有权利要求1所述裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)CABIO-A-2-IV或其发酵产物。
3.一种产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)CABIO-A-2-IV，和/或权利要求2所述菌剂；
所述产品为食品、饲料、化妆品或药物。
4.权利要求1所述裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-IV或权利要求2所述菌剂在制备功能性脂类化合物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述功能性脂类化合物中，EPA的含量不低于10％，角鲨烯的含量不低于10％。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述功能性脂类化合物中，EPA的含量不低于12％。
7.一种生产多不饱和脂肪酸油脂的方法，其特征在于，包括：
使用权利要求1所述裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-IV或权利要求2所述菌剂进行发酵。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述发酵过程中，发酵温度在28℃以上。
9.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，在所述发酵过程中，以质量比计，使用的发酵培养基包括：5％～15％葡萄糖、0.5％～3％酵母浸膏、3～5％谷氨酸钠、0.25％～0.75％KH2PO4、0.25％～0.5％MgSO4、1％～4％Na2SO4、0.1％～0.2％(NH4)2SO4、0.05％～0.15％KCl和0.1％～0.3％微量元素混合液。
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