CN105420122A - 可高密度培养的裂殖壶菌及其生产富含dha的油脂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及可高密度培养的裂殖壶菌及其生产富含DHA油脂的方法，该裂殖壶菌适合高密度培养并生产富含DHA的油脂，其生产方法成本低，所得生物量及DHA产量高。可高密度培养的裂殖壶菌，其分类命名为裂殖壶菌(Schizochytrium？sp.)SLTW3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？No：M2015591。一种利用裂殖壶菌生产富含DHA油脂的方法，以该裂殖壶菌为出发菌株，经高密度发酵收集菌体，提取富含DHA的油脂。以该裂殖壶菌为出发菌株，经高密度发酵培养后，最终生物量可达170-190g/L，其中DHA产量可达25g/L。

Description

可高密度培养的裂殖壶菌及其生产富含DHA的油脂的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及可高密度培养的裂殖壶菌及其生产富含DHA的油脂的方法。
背景技术
DHA是人类大脑和视网膜组织中细胞膜的重要组成成分，是人体自身发育必需的n-3系列多不饱和脂肪酸系，其对婴幼儿大脑及视力的发育有至关重要的作用，同时它在预防高血压、动脉硬化、关节炎以及癌症等疾病方面具有显著功效。另外，n-3系列不饱和脂肪酸也是鱼虾生长所必需，而其本身不能合成，养殖时必须依靠饲料提供，尤其是仔幼阶段，DHA缺乏会导致死亡率升高以及体表白化等疾病。传统的DHA生产途径主要来源于鱼油的提取纯化，但提取得率低、资源有限、易氧化、有鱼腥味，而且生产工艺复杂、产品成本高。随着渔业资源萎缩以及海洋污染的加剧，鱼油来源的DHA面临着发展乏力的困境，难以满足市场需求。
目前，已发现一些低等海洋细菌、海洋真菌和微藻类，如希瓦氏菌(Shewanella)、破囊壶菌(Thraustochytrium)、裂殖壶菌(Schizochytrium)、寇氏隐甲藻(Crythecodiniumcohnii)等都能合成DHA。其中裂殖壶菌，也叫裂殖壶藻，属真菌门、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，单细胞、球形。且生长周期短，可异养发酵，生物量及油脂含量高，油脂可达细胞干重50％，其中DHA可达40-50％。国家已批准裂殖壶藻为新资源食品，其DHA油脂可用于婴幼儿配方食品。其安全性也早已得到美国食品药品管理局(FDA)认可，批准为GRAS级营养添加物。欧盟也于2014年7月16日公布批准微藻裂殖壶菌油脂作为新型食品配料投放市场，欧盟食品安全局并于同年10月9日宣布扩大新型食品配料，当中EPA和DHA的每日摄入量总和不超过5g时不会对成人构成安全风险。
CN104312929A“一株高产DHA裂殖壶菌菌株及其培养方法与应用”，公开了一株高产DHA裂殖壶菌菌株，发酵后裂殖壶菌的生物量为30～45g/L，DHA含量为8.6～12.5g/L。其生物量和DHA含量较低，限制其生产应用。CN104031843A“一种裂殖壶菌及其应用”公开了一种裂殖壶菌，发酵后获得生物量为180～200g/L，DHA产量为50～65g/L。然而这只是在3L和5L的发酵罐中高密度发酵培养的结果，无法大规模生产。并且其发酵培养过程中，需长时间流加50％(w/v)的玉米浆溶液，整个发酵过程中采用了补糖操作，玉米浆溶液用量大，生产成本过高，不适合量产。
发明内容
本发明提供可高密度培养的裂殖壶菌及其生产富含DHA的油脂的方法，该裂殖壶菌适合高密度培养并生产富含DHA的油脂，其生产方法成本低，所得生物量及DHA产量高。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：可高密度培养的裂殖壶菌，其分类命名为裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)SLTW3，已于2015年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCCNo：M2015591。该裂殖壶菌生长速度快，适合高密度发酵。其主要长链不饱和脂肪酸的代谢产物为DHA，基因序列如SEQIDNO：1所示。
所述的可高密度培养的裂殖壶菌，是以SR21作为出发菌株，通过多次紫外诱变及筛选后，得到所述的裂殖壶菌；所述筛选包括裂殖壶菌的初筛和复筛；所述裂殖壶菌的初筛为培养诱变的菌液，筛选出细胞直径大、生长快的裂殖壶菌菌株；所述裂殖壶菌的复筛为，将初筛得到的裂殖壶菌菌株进行挡板摇瓶培养，并检测脂肪酸成分，筛选出生物量、总脂肪酸含量以及DHA含量高的菌株。
本发明筛选所得裂殖壶菌的形态特征如图1、图2所示，细胞直径为5-15μm。进行挡板摇瓶培养后，检测结果为：总脂肪酸含量为细胞干重的51.7％，其中DHA含量占45.53％。
一种利用裂殖壶菌生产富含DHA的油脂的方法，以上述的裂殖壶菌为出发菌株，经高密度发酵收集菌体，提取富含DHA的油脂。
所述的高密度发酵包括以下步骤：
(1)菌株活化培养：将保存在甘油管的菌株经划线培养于平板培养中，经过40-48h培养，得到单菌落；
(2)一级种子培养：将平板中的单菌落接入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，在20-30℃、150-220rpm条件下摇床培养20-24h，获得一级种子；
(3)二级种子培养：将一级种子接入装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，接种量为5-10％(V/V)，在20-30℃、150-220rpm条件下摇床培养20-24h，获得二级种子；
(4)发酵罐放大培养：将二级种子接入装有发酵培养基的发酵罐中进行培养，接种量为5-10％(V/V)，搅拌转速200-400rpm，通气量上限3m3/h，培养温度25-30℃，通过通气量和转速控制溶氧10％-20％，通过自动流加40％磷酸或40％氢氧化钠维持发酵液pH为6.0，发酵周期为70-96h。
发酵过程中，当还原糖含量低于10g/L，且发酵液中溶解氧开始升高时，添加适量的培养液，维持发酵液中碳氮的质量比为3-2:1，并使发酵液中还原糖的含量为10-20g/L；如果还原糖含量较低，但溶解氧变化不明显时，无需添加葡萄糖。
优选的：所述发酵罐放大培养中添加的培养液为无菌玉米浆干粉溶液和无菌葡萄糖溶液。
优选的：所述发酵罐放大培养的发酵培养基包含以下组分：葡萄糖60-90g/L，酵母膏10-20g/L，玉米浆干粉20-30g/L，蛋白胨1-5g/L，海水素10-15g/L，MgSO4·7H2O1.5-2.5g/L，KH2PO31.5-2.5g/L，KCl0.5-0.7g/L，CaCl20.1-0.2g/L。
优选的：所述一级种子培养和二级种子培养的种子培养基包含以下组分：葡萄糖20-60g/L，酵母粉5-15g/L，蛋白胨1-5g/L，海水素10-15g/L，且PH为6.0。
当进行大规模高密度培养时，优选的，所述发酵罐放大培养为多联发酵培养。
优选的：高密度发酵结束后，离心收集湿菌体喷雾干燥，通过酸热法提取并旋转蒸发得到富含DHA的油脂。
本发明具有以下有益效果：本发明以SR21作为出发菌株，通过紫外诱变并筛选获得一种裂殖壶菌，该裂殖壶菌生长速度快，适合高密度发酵。并且提供了一种利用该裂殖壶菌生产富含DHA的油脂的方法，经高密度发酵培养，最终生物量可达170-190g/L，其中DHA产量可达25g/L。所述高密度发酵的发酵罐放大培养中，仅当还原糖含量低于10g/L，且发酵液中溶解氧开始升高时，需添加适量的培养液。在实现高生物量和DHA产量的同时，降低了生产成本，适合工业化发酵生产。
附图说明
图1为裂殖壶菌菌落形态图；
图2为裂殖壶菌在光学显微镜下的形态图。
具体实施方式
实施例一
1、裂殖壶菌的诱变及筛选
1.1紫外诱变
出发菌株为(Schizochytriumsp.)SR21(购自美国ATCC)，具体步骤为：
(1)取保藏菌株(1.0ml融化菌液)接种于50ml种子培养基中，于20-30℃、150-220rpm条件下摇床培养20-24h，得到对数期菌液；然后按5-10％(V/V)转接到新鲜的种子培养基中，在相同条件下培养至对数期。
(2)将上述得到的对数期菌液经无菌蒸馏水洗涤离心，并制成菌悬液，菌悬液的菌液浓度OD650为0.3-0.8；取适量菌悬液倒入培养皿，使该菌液成为厚度1-5mm的薄层菌膜；于15-30W紫外灯下，20-30cm距离处照射20-100s，得到诱变的菌液。
1.2裂殖壶菌的筛选
1.2.1裂殖壶菌的初筛
(1)在无菌条件下，取1-2ml上述诱变的菌液接种到新鲜的种子培养基中，于20-30℃、150-220rpm的黑暗条件下摇床培养12-20h。
(2)培养后的菌液适当稀释后涂布于固体培养基(葡萄糖5g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨1g/L，海盐15g/L，琼脂粉17g/L，pH为6.0)平板上，在20-30℃下培养至长出单菌落。
(3)从单菌落中，筛选出生长较快、细胞直径较大的裂殖壶菌菌株，在进行纯化后转接于固体培养基斜面，在20-30℃下培养后于4℃下保藏。
1.2.2裂殖壶菌的复筛
(1)将初筛保藏的裂殖壶菌菌株进行挡板摇瓶培养，挡板摇瓶培养的具体步骤如下：
a、菌株活化培养：将保存在斜面的菌株经划线培养于平板培养基(葡萄糖5g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨1g/L，海盐15g/L，琼脂粉17g/L，pH为6.0)中，经过40h培养，得到单菌落。
b、种子培养：将平板中的单菌落接入装有50mL种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，海水素15g/L，pH为6.0)的250mL摇瓶中，在28℃、200rpm条件下摇床培养20h，获得一级种子。
c、按10％的接种量接入到装有100mL发酵培养基(葡萄糖50g/L，酵母浸膏30g/L，蛋白胨5g/L，海盐15g/L，pH6.0)的500mL挡板摇瓶中，28℃、200r/min摇瓶培养56h，直至葡萄糖消耗完毕。
(2)取一定量的发酵液，通过酸热法提取，三氟化硼甲酯化-气相色谱法(Agilent7890A气相色谱仪，SupelcoSPTM-2560石英毛细管柱)进行检测，筛选出生物量、总脂肪酸含量以及DHA含量高的菌株。
经过多次诱变及筛选后，得到本发明所提供的裂殖壶菌。该裂殖壶菌的形态特征如图1、图2所示，细胞直径为5-15μm。检测结果为：总脂肪酸含量为细胞干重的51.7％，其中DHA含量占45.53％，其脂肪酸的组成成分分析如下表所示：
脂肪酸 质量百分组成(％)
C14:0 2.17
C15:0 1.23
C16:0 41.04
C17:0 0.89
C18:0 1.13
C18:1 0.13
C18:2 0.24
C20:3n-6 0.36
C20:4n-6 0.45
C22:2 0.55
C24:1 6.28
C22:6n-3 45.53
上述的裂殖壶菌分类命名为裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)SLTW3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M2015591，经检测基因序列如SEQIDNO：1所示。
实施例二
裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)SLTW3的20L高密度发酵生产
具体步骤如下：
(1)菌株活化培养：将保存在甘油管的菌株经划线培养于平板培养基(葡萄糖5g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨1g/L，海盐15g/L，琼脂粉17g/L，pH为6.0)中，经过40h培养，得到单菌落。
(2)一级种子培养：将平板中的单菌落接入装有50mL种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，海水素15g/L，pH为6.0)的250mL摇瓶中，在28℃、200rpm条件下摇床培养20h，获得一级种子。
(3)二级种子培养：将一级种子接入装有100mL种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，海水素15g/L，pH为6.0)的500mL摇瓶中，接种量为10％(V/V)，在28℃、200rpm条件下摇床培养20h，获得二级种子。
(4)发酵罐放大培养：按5％接种量将二级种子接入装有12L发酵培养基(葡萄糖70g/L，酵母膏10g/L，玉米浆干粉30g/L，蛋白胨5g/L，海水素15g/L，MgSO4·7H2O2g/L，KH2PO32g/L，KCl0.7g/L，CaCl20.2g/L)的20L发酵罐中进行培养。
培养温度为28℃，初始搅拌转速200rpm，初始通气量1m3/h，通过自动流加40％磷酸或40％氢氧化钠维持发酵液pH为6.0。发酵过程中通过通气量和转速控制溶氧在10％-20％，通气量上限3m3/h，转速上限400rpm。当发酵液中还原糖含量低于10g/L，且发酵液中溶解氧开始升高时，流加适量无菌玉米浆干粉溶液和无菌葡萄糖溶液，维持发酵液中碳氮的质量比为3-2:1，控制发酵液中还原糖的含量为10-20g/L；如果还原糖含量较低，但溶解氧变化不明显时，无需添加葡萄糖。当溶氧对流加的培养液响应较低时，停止流加，经过96h发酵结束。
(5)检测分析：发酵液经8000rpm离心5min，弃上清液，湿菌体经-60℃真空冷冻干燥后，检测得到细胞干重为181g/L；将干细胞通过酸热法提取-三氟化硼甲酯化-气相色谱法(Agilent7890A气相色谱仪，SupelcoSPTM-2560石英毛细管柱)检测分析得到总脂肪酸含量为细胞干重的40％，其中DHA含量占37％，发酵液中DHA的含量为26.79g/L。所得脂肪酸的组成成分分析如下表所示：
以本发明所提供的裂殖壶菌为出发菌株，在20L发酵罐中高密度发酵后，所得发酵液最终生物量可达170-190g/L，其中DHA产量可达25g/L，发酵产量高；且发酵过程中，仅当还原糖含量低于10g/L，且发酵液中溶解氧开始升高时，需添加适量的培养液，生产成本低；可以规模化生产。
实施例三
裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)SLTW3的1000L高密度发酵生产
当进行大规模高密度培养时，可以采用摇瓶作为大发酵罐的种子培养容器，但也需要摇瓶数量较多，染菌的可能性较高。优选的，采用多个发酵罐联合培养，能有效避免染菌。本实施例为1000L高密度发酵生产，采用20L-100L-1000L三联发酵培养，具体步骤如下：
(1)菌株活化培养：将保存在甘油管的菌株经划线培养于平板培养基(葡萄糖5g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨1g/L，海盐15g/L，琼脂粉17g/L，pH为6.0)中，经过40h培养，得到单菌落。
(2)一级种子培养：将平板中的单菌落接入装有50mL种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，海水素15g/L，pH为6.0)的250mL摇瓶中，在28℃、200rpm条件下摇床培养20h，获得一级种子。
(3)二级种子培养：将一级种子接入装有100mL种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，海水素15g/L，pH为6.0)的500mL摇瓶中，接种量为10％(V/V)，在28℃、200rpm条件下摇床培养20h，获得二级种子。
(4)发酵罐放大培养
a、按10％的接种量将摇瓶二级种子接入装有12L发酵培养基(葡萄糖90g/L，酵母膏20g/L，玉米浆干粉30g/L，蛋白胨5g/L，海水素15g/L，MgSO4·7H2O2g/L，KH2PO32g/L，KCl0.7g/L，CaCl20.2g/L)的20L发酵罐中进行一级种子罐培养。
培养温度28℃，初始搅拌转速200rpm，初始通气量为1m3/h，通过自动流加40％磷酸或40％氢氧化钠维持发酵液pH为6.0。发酵过程中通过通气量和转速控制溶氧在20％左右，通气量上限为3m3/h，转速上限400rpm，经过24h发酵后，还原糖含量低于10g/L时，停止发酵。
b、按10％的接种量将一级种子罐中的种子液转接到装有60L发酵培养基(葡萄糖90g/L，酵母膏20g/L，玉米浆干粉30g/L，蛋白胨5g/L，海水素15g/L，MgSO4·7H2O2g/L，KH2PO32g/L，KCl0.7g/L，CaCl20.2g/L)的100L发酵罐中进行二级种子罐培养。
培养温度28℃，初始搅拌转速200rpm，初始通气量为4m3/h，通过自动流加40％磷酸或40％氢氧化钠维持发酵液pH为6.0。发酵过程中通过通气量和转速控制溶氧在20％左右，通气量上限为8m3/h，转速上限400rpm，经过20h发酵后，还原糖含量低于10g/L，停止发酵。
c、按10％的接种量将二级种子罐中的种子液转接到装有600L发酵培养基(葡萄糖90g/L，酵母膏20g/L，玉米浆干粉30g/L，蛋白胨5g/L，海水素15g/L，MgSO4·7H2O2g/L，KH2PO32g/L，KCl0.7g/L，CaCl20.2g/L)的1000L发酵罐中进行扩大发酵培养。
培养温度28℃，初始搅拌转速200rpm，初始通气量为40m3/h，通过自动流加40％磷酸或40％氢氧化钠维持发酵液pH为6.0。发酵过程中通过通气量和转速控制溶氧在10％-20％，通气量上限为70m3/h，转速上限为400rpm。当发酵液中还原糖含量低于10g/L，且发酵液中溶氧开始升高时，流加适量无菌玉米浆干粉溶液和无菌葡萄糖溶液，维持发酵液中碳氮的质量比为3-2:1，控制发酵液中还原糖的含量为10-20g/L；如果还原糖含量较低，但溶解氧变化不明显时，无需添加葡萄糖。当溶氧对流加的培养液响应较低时，停止流加，经过90h发酵结束。
(5)检测分析：发酵液经8000rpm离心5min，弃上清液，湿菌体经-60℃真空冷冻干燥后，检测得到细胞干重为118g/L；将干细胞通过酸热法提取-三氟化硼甲酯化-气相色谱法(Agilent7890A气相色谱仪，SupelcoSPTM-2560石英毛细管柱)检测分析得到总脂肪酸含量为细胞干重的41％，其中DHA含量占42.65％，发酵液中DHA的含量为20.64g/L。所得脂肪酸的组成成分分析如下表所示：
以本发明所提供的裂殖壶菌为出发菌株，1000L高密度发酵生产后，所得发酵液最终生物量可达110-130g/L，其中DHA的含量可达20.64g/L，产量高适宜大规模工业生产。

Claims (10)

1.可高密度培养的裂殖壶菌，其特征在于：其分类命名为裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)SLTW3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M2015591。
2.可高密度培养的裂殖壶菌，其特征在于：其分类命名为裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)SLTW3，基因序列如SEQIDNO：1所示。
3.根据权利要求1或2所述的可高密度培养的裂殖壶菌的选育方法，其特征在于：以SR21作为出发菌株，通过多次紫外诱变及筛选后，得到所述的裂殖壶菌；所述筛选包括裂殖壶菌的初筛和复筛；所述裂殖壶菌的初筛为培养诱变的菌液，筛选出细胞直径大、生长快的裂殖壶菌菌株；所述裂殖壶菌的复筛为，将初筛得到的裂殖壶菌菌株进行挡板摇瓶培养，并检测脂肪酸成分，筛选出生物量、总脂肪酸含量以及DHA含量高的菌株。
4.一种利用权利要求1或2或3所述裂殖壶菌生产富含DHA的油脂的方法，其特征在于：以权利要求1中所述的裂殖壶菌为出发菌株，经高密度发酵收集菌体，提取富含DHA的油脂。
5.根据权利要求4所述的裂殖壶菌生产富含DHA的油脂的方法，其特征在于：所述的高密度发酵包括以下步骤：
(1)菌株活化培养；
(2)一级种子培养；
(3)二级种子培养；
(4)发酵罐放大培养：将二级种子接入装有发酵培养基的发酵罐中进行培养，发酵过程中，当还原糖含量低于10g/L，且发酵液中溶解氧开始升高时，添加培养液，维持发酵液中碳氮的质量比为3-2:1，控制发酵液中还原糖的含量为10-20g/L。
6.根据权利要求5所述的裂殖壶菌生产富含DHA的油脂的方法，其特征在于：所述发酵罐放大培养中添加的培养液为无菌玉米浆干粉溶液和无菌葡萄糖溶液。
7.根据权利要求5所述的裂殖壶菌生产富含DHA的油脂的方法，其特征在于：所述发酵罐放大培养的发酵培养基包含以下组分：葡萄糖60-90g/L，酵母膏10-20g/L，玉米浆干粉20-30g/L，蛋白胨1-5g/L，海水素10-15g/L。
8.根据权利要求5所述的所述的裂殖壶菌生产富含DHA的油脂的方法，其特征在于：所述一级种子培养和二级种子培养的种子培养基包含以下组分：葡萄糖20-60g/L，酵母粉5-15g/L，蛋白胨1-5g/L，海水素10-15g/L，且PH为6.0。
9.根据权利要求5所述的所述的裂殖壶菌生产富含DHA的油脂的方法，其特征在于：所述发酵罐放大培养为多联发酵培养。
10.根据权利要求4-9中任意一项中所述的裂殖壶菌生产富含DHA的油脂的方法，其特征在于：高密度发酵结束后，离心收集湿菌体喷雾干燥，通过酸热法提取并旋转蒸发得到富含DHA的油脂。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106676041A (zh) * 2016-12-23 2017-05-17 广州富诺健康科技股份有限公司 一种裂殖弧菌株及利用其生产dha的方法
CN106987528A (zh) * 2017-05-31 2017-07-28 厦门汇盛生物有限公司 一株生产二十二碳六烯酸的细菌及其应用
CN110923271A (zh) * 2019-12-16 2020-03-27 宁波浮田生物技术有限公司 裂殖壶菌的发酵生产方法
CN110982705A (zh) * 2019-12-19 2020-04-10 通威股份有限公司 一种裂殖壶藻的发酵工艺
EP3628679A4 (en) * 2017-05-31 2020-06-24 Xiamen Huison Biotech Co., Ltd. BACTERIA PRODUCING DHA AND EPA, 6 FRAGMENTS OF GENE OF A BACTERIAL GENOME AND THE USE THEREOF
CN114164122A (zh) * 2021-12-02 2022-03-11 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 一种高产epa的裂殖壶菌及其应用
CN114940947A (zh) * 2022-04-29 2022-08-26 深圳古他生物科技有限公司 一株产dha的裂壶藻gt-d1及其应用、富含dha油脂及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6607900B2 (en) * 2000-01-28 2003-08-19 Martek Biosciences Boulder Corporation Enhanced production of lipids containing polyenoic fatty acid by very high density cultures of eukaryotic microbes in fermentors
CN102888348A (zh) * 2012-07-12 2013-01-23 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种裂殖壶菌及利用其高密度发酵生产dha油脂的方法
CN104031843A (zh) * 2014-05-14 2014-09-10 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种裂殖壶菌及其应用
CN104313068A (zh) * 2014-09-03 2015-01-28 江苏天凯生物科技有限公司 一种磷脂型dha的发酵制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6607900B2 (en) * 2000-01-28 2003-08-19 Martek Biosciences Boulder Corporation Enhanced production of lipids containing polyenoic fatty acid by very high density cultures of eukaryotic microbes in fermentors
CN101003821A (zh) * 2000-01-28 2007-07-25 马泰克生物科学公司 通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生
CN102888348A (zh) * 2012-07-12 2013-01-23 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种裂殖壶菌及利用其高密度发酵生产dha油脂的方法
CN104031843A (zh) * 2014-05-14 2014-09-10 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种裂殖壶菌及其应用
CN104313068A (zh) * 2014-09-03 2015-01-28 江苏天凯生物科技有限公司 一种磷脂型dha的发酵制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZENG，J.,ET AL: "Schizochytrium sp.SLTW3 gene for 18S rRNA,partial sequence，Genbank：LC017745.1", 《NCBI》 *
常桂芳: "氧对裂殖壶藻利用甘油产DHA影响机制及其高密度发酵控制策略的研究", 《中国博士学位论文全文数据库》 *
谢辰: "裂殖壶菌高产DHA的发酵技术研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106676041B (zh) * 2016-12-23 2020-01-14 广州富诺健康科技股份有限公司 一种裂殖弧菌株及利用其生产dha的方法
CN106676041A (zh) * 2016-12-23 2017-05-17 广州富诺健康科技股份有限公司 一种裂殖弧菌株及利用其生产dha的方法
EP3628679A4 (en) * 2017-05-31 2020-06-24 Xiamen Huison Biotech Co., Ltd. BACTERIA PRODUCING DHA AND EPA, 6 FRAGMENTS OF GENE OF A BACTERIAL GENOME AND THE USE THEREOF
CN106987528A (zh) * 2017-05-31 2017-07-28 厦门汇盛生物有限公司 一株生产二十二碳六烯酸的细菌及其应用
US10941185B2 (en) 2017-05-31 2021-03-09 Xiamen Huison Biotech Co., Ltd. Strain of bacteria producing DHA and EPA, six gene fragments in the bacterial genome and their applications
CN106987528B (zh) * 2017-05-31 2020-05-05 厦门汇盛生物有限公司 一株生产二十二碳六烯酸的细菌及其应用
CN110923271A (zh) * 2019-12-16 2020-03-27 宁波浮田生物技术有限公司 裂殖壶菌的发酵生产方法
CN110923271B (zh) * 2019-12-16 2023-04-18 宁波浮田生物技术有限公司 裂殖壶菌的发酵生产方法
CN110982705A (zh) * 2019-12-19 2020-04-10 通威股份有限公司 一种裂殖壶藻的发酵工艺
CN110982705B (zh) * 2019-12-19 2024-05-28 通威股份有限公司 一种裂殖壶藻的发酵工艺
CN114164122A (zh) * 2021-12-02 2022-03-11 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 一种高产epa的裂殖壶菌及其应用
CN114164122B (zh) * 2021-12-02 2023-06-20 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 一种高产epa的裂殖壶菌及其应用
CN114940947A (zh) * 2022-04-29 2022-08-26 深圳古他生物科技有限公司 一株产dha的裂壶藻gt-d1及其应用、富含dha油脂及其制备方法
CN114940947B (zh) * 2022-04-29 2024-03-29 深圳古他生物科技有限公司 一株产dha的裂壶藻gt-d1及其应用、富含dha油脂及其制备方法

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