CN104087512B

CN104087512B - 产多不饱和脂肪酸的高山被孢霉及其应用

Info

Publication number: CN104087512B
Application number: CN201410222240.6A
Authority: CN
Inventors: 崔球; 谭延振; 宋晓金; 冯银刚
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2014-05-23
Publication date: 2016-06-01
Anticipated expiration: 2034-05-23
Also published as: CN104087512A

Abstract

本发明涉及微生物发酵工程领域，具体涉及一种产多不饱和脂肪酸的高山被孢霉及其应用。高山被孢霉，其分类命名为高山被孢霉(Mortierella？alpina)SD003,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年07月19日，保藏编号为CGMCC？No：7960。所述高山被孢霉应用于制备多不饱和脂肪酸油脂中。本发明提供的高产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，利用该菌株进行发酵，其主要代谢产物为花生四烯酸，同时积累一定量的二十碳五烯酸等多不饱和脂肪酸，菌丝内ARA含量可达总脂肪酸的41％，EPA含量可达总脂肪酸的20％，可以利用该菌发酵生产同时含有ARA和EPA多不饱和脂肪酸油脂。

Description

产多不饱和脂肪酸的高山被孢霉及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程领域，具体涉及一种产多不饱和脂肪酸的高山被孢霉及其应用。

背景技术

高山被孢霉(Mortierellaalpina)是结合菌纲毛霉目被孢霉科被孢霉属丝状真菌，广泛分布于土壤、粪便及其他腐败的有机物质中。由于能积累相当比例的花生四烯酸(ArachidonicAcid,简称ARA或AA)，与同属于被孢霉属(Mortierella)的深黄被孢霉受到广泛关注。高山被孢霉是目前产花生四烯酸真菌中唯一具有正式安全性评估的菌种(GRAS)，其菌丝体中花生四烯酸含量高、提取方便，是公认的花生四烯酸生产优良菌株。应用不同菌株的高山被孢霉生产ARA已经在欧洲、中国和日本实现。

高山被孢霉除能积累花生四烯酸外，还能积累亚油酸(LA)、亚麻酸(GLA)、二十碳五烯酸(EPA)等多饱和脂肪酸。由于利用高山被孢霉生产的花生四烯酸主要用于婴幼儿食品添加，所以研究者主要关注于不能产生EPA的菌株，而对于产生EPA的菌株弃之不用。实际上，二十碳四烯酸也是一种重要的必需多不饱和脂肪酸。

花生四烯酸(ArachidonicAcid,简称ARA或AA)是一种人体必需的Ω-6长链多不饱和脂肪酸，必须从膳食中获取。花生四烯酸是构成神经组织的重要结构脂成分，具有帮助神经系统信息传递、提高记忆力和视力等功能，尤其是可以促进婴幼儿神经发育和视力发育等；也是人体内众多二十碳衍生物如：白三烯、前列腺素和前列环素等的前体物质。花生四烯酸的代谢产物在预防和治疗肿瘤方面也具有广泛应用前景。

二十碳五烯酸(EicosapentaenoicAcid，简称EPA)，是人体必需的Ω-3脂肪酸之一。适量摄取EPA已经证实对治疗冠状动脉心脏病、高血压和炎症(例如风湿性关节炎)有效。EPA主要来源是深海鱼油等，同时一些微生物如希瓦氏菌属(Shewanella)等也可以积累相当量的EPA。

鉴于花生四烯酸和二十碳五烯酸对人的神经和心血管方面等的重要作用，成年人尤其是中老年人适量补充将大有益处。含有ARA和EPA的非鱼油来源的多不饱和脂肪酸油脂保健品将拥有广阔的市场。能够同时积累AA和EPA的工业生产菌株的筛选，成为工业发酵生产多不饱和脂肪酸油脂的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种产多不饱和脂肪酸的高山被孢霉及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种产多不饱和脂肪酸的高山被孢霉，高山被孢霉，其分类命名为高山被孢霉(Mortierellaalpina)SD003,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年07月19日，保藏编号为CGMCCNo.7960。

所述高山被孢霉其内转录间隔序列(ITS)为SEQIDNO：1。

产多不饱和脂肪酸的高山被孢霉的应用，所述高山被孢霉应用于制备多不饱和脂肪酸油脂中。

进一步的说，所述高山被孢霉用于同时代谢生成花生四烯酸和二十碳五烯酸中的应用。

具体为：以所述高山被孢霉为出发菌株，在发酵培养基中发酵获得制备多不饱和脂肪酸油脂。

所述发酵温度为20-28℃，发酵过程中控制pH在6.0-7.0之间，发酵周期7-10天。发酵过程中补充300g/L的糖液保持发酵罐内糖浓度在5-10g/L之间。

所述发酵培养基按重量百分比计，葡萄糖4-10％，酵母粉0.2-0.5％，玉米浆0.2-0.6％，磷酸二氢钾0.2-0.4％，七水合硫酸镁0.02-0.04％，硫酸铵6-8％，其余为水。

一种制备生产多不饱和脂肪酸的方法，以所述高山被孢霉为出发菌株，在发酵培养基中高密度发酵获得制备多不饱和脂肪酸油脂。

本发明与已有技术相比具有以下显著特点和积极效果：

本发明提供的高产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，利用该菌株进行发酵，其主要代谢产物为花生四烯酸，同时积累一定量的二十碳五烯酸等多不饱和脂肪酸，菌丝内ARA含量可达总脂肪酸的41％，EPA含量可达总脂肪酸的20％，可以利用该菌发酵生产同时含有ARA和EPA多不饱和脂肪酸油脂。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1

高山被孢霉，其分类命名为高山被孢霉(Mortierellaalpina)，命名为高山被孢霉SD003菌株，已保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCCNo.7960，保藏日期2013年07月19日。

所述高山被孢霉菌株是从山东省青岛市崂山选取落叶覆盖较为密集处，去除表层土，采集10cm左右深处土壤。将采集与崂山不同位置的土样进行混合，称取混合样品2g左右于玻璃试管中加入9mL无菌水溶解，取100微升上清液体涂布于分离筛选平板，放置在4℃的生化培养箱中倒置培养半月。分离筛选用培养基为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL、氯霉素30mg，卡那霉素50mg，pH自然。待长出菌落后，使用分离筛选培养基在25℃下进行单菌落分离。单菌落长出后，使用尼罗红进行染色，含油脂菌丝体在荧光下显黄色，颜色与含量呈正相关性。挑选染色较深的菌株进行摇瓶复筛。将摇瓶中菌丝体进行回收，60℃烘干至恒重，研磨法粉碎菌丝体，用酸热法提取油脂，对油脂进行甲酯化后通过气质联用分析脂肪酸组成，通过气相色谱法分析花生四烯酸的相对含量。最终筛选得到一株高产花生四烯酸和二十碳五烯酸的菌株MortierellaalpinaSD003。胞内脂肪酸组成主要为软脂酸(16：0)、硬脂酸(18：0)、油酸(18：1)、亚油酸(18：2)、亚麻酸(18：3)和花生四烯酸(ARA)和二十碳五烯酸(EPA)，其中ARA含量可达总脂肪酸的41％，EPA含量可达总脂肪酸的20％。用分子生物学手段对其内转录间隔序列进行分析比对，发现该菌株与高山被孢霉的内转录间隔序列的同源性大于99％，因此判定本菌株属于高山被孢霉，该序列记作SEQIDNO.1。

本发明所述的高山被孢霉，菌株代号SD003，保藏编号为CGMCCNo.7960。在固体斜面培养基形态为白色菌丝体，产生孢子。在PDA培养基上，形成圆形菌落。该菌株在4-34℃均能生长，最适宜生长温度是23-28℃；菌株在培养基pH在2-9范围内均可生长，最适生长pH为5-7。在摇瓶发酵中，5-7天多不饱和脂肪酸产量达到最大。

高山被孢霉MortierellaalpinaSD003发酵温度为20-28℃，培养基中需要包含碳源、氮源无机盐等成分。所述培养基中氮源可以是无机或是有机氮源，其中无机氮源为尿素、乙酸铵、硫酸铵、硝酸铵等一种或是多种，有机氮源为酵母抽提物、蛋白胨、玉米浆、豆粕等含氮有机化合物中的一种或多种；碳源是葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖、甘油等中的一种或几种。

该菌株通过液态发酵方法扩大培养，产生多不饱和脂肪酸。该菌可以同时积累花生四烯酸和二十碳五烯酸，油脂组成简单，后续分离提纯简单，发酵生产过程易于大规模化，应用前景良好。

SEQIDNO.1

cgggctgtctacttgatttgagatcgagtttacaaagtcggccgaagcctgtctttgtga60

atcctgcatcagtcagcacaagaactaatctcctttatgttagctgcagcaaaggtaata120

atctgttttttaggcagactaaatagatatgcttatagctcagagaaaagtccagctgca180

cctgcatttcaagtaacccgccacttttcggtgaggaaaagcgttgggatcactcaagtc240

caactcccatttcaaaaaagatatggaagttgaggtgtttactgatactcaaacaagcat300

gctctccggaataccagagagcgcaatatgcgttcaaagattcgatgattcactgaattc360

tgcaattcacattacgtatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgcgagagccaagaga420

tccgttgttgaaagttgtattttgaattaagtattcataatatgtttcagacaaaatcac480

taaagttctgagtagatataaatcccaaaggtgaccacacggcttttgacagccggcagc540

ccccagagagatgacattgcacacaaggtggatatggatttttgaaagtgccataaaaac600

acttgattatgaatgatccttccgcaggttcacctacggaaaccttgttacgctttt657

实施例2

利用SD003菌株进行摇瓶发酵

将高山被孢霉SD003接种于PDA斜面培养基，25℃培养一周。用无菌水将斜面菌丝体和孢子洗下，接入摇瓶。所述培养基按照质量比例包含以下成分：葡萄糖2％，酵母抽提物1％，其余为水，pH自然，装液量：250ml摇瓶装入50ml培养基，摇床转速为100rpm，25℃培养3天，形成种子培养液。将种子培养液按照10％接入发酵培养基中。发酵培养基按照质量比例含有以下成分：葡萄糖10％，酵母粉0.3％，玉米浆0.6％，磷酸二氢钾0.3％，七水合硫酸镁0.02％，硫酸铵5％，其余为水。初始pH6.0，25℃，120rpm发酵7天，发酵过程中添加2mol/L氢氧化钠溶液使pH在6.0到7.0之间。发酵后产物参见表1。

表1发酵后高山被孢霉SD003胞内脂肪酸组成情况

实施例3

利用SD003菌株进行发酵罐发酵

将高山被孢霉SD003接种于PDA斜面培养基，25℃培养一周。用无菌水将斜面菌丝体和孢子洗下，接入摇瓶。所述培养基按照质量比例包含以下成分：葡萄糖2％，酵母抽提物1％，其余为水，pH自然，装液量：1000ml摇瓶装入300ml培养基，摇床转速为100rpm，25℃培养3天，形成种子培养液。将种子培养液按照10％接入含有3L发酵培养基发酵罐中。发酵培养基按照质量比例含有以下成分：葡萄糖4％，酵母粉0.5％，玉米浆0.6％，磷酸二氢钾0.4％，七水合硫酸镁0.04％，硫酸铵8％，其余为水。pH6.0，28℃，200rpm发酵7天。发酵过程中补充300g/L的糖液保持发酵罐内糖浓度在5-10g/L之间。

发酵结果：干重为45g/L，油脂占细胞干重50.3％，花生四烯酸占总油脂的41.36％，花生四烯酸产量为9.37g/L，二十碳五烯酸占总油脂的15.22％，二十碳五烯酸产量为3.44g/L。

实施例4

利用SD003菌株进行发酵罐发酵

将高山被孢霉SD003接种于PDA斜面培养基，25℃培养一周。用无菌水将斜面菌丝体和孢子洗下，接入摇瓶。所述培养基按照质量比例包含以下成分：葡萄糖2％，酵母抽提物1％，其余为水，pH自然，装液量：1000ml摇瓶装入300ml培养基，摇床转速为100rpm，25℃培养3天，形成种子培养液。将种子培养液按照10％接入含有3L发酵培养基发酵罐中。发酵培养基按照质量比例含有以下成分：葡萄糖4％，酵母粉0.2％，玉米浆0.2％，磷酸二氢钾0.2％，七水合硫酸镁0.03％，硫酸铵6％，其余为水。pH7.0，20℃，200rpm发酵9天。发酵过程中补充300g/L的糖液保持发酵罐内糖浓度在5-10g/L之间。

发酵结果：干重为38g/L，油脂占细胞干重48.2％，花生四烯酸占总油脂的34.3％，产量为6.3g/L，二十碳五烯酸占总油脂的20.01％，产量为3.66g/L。

Claims

1.一种产多不饱和脂肪酸的高山被孢霉，其特征在于：高山被孢霉，其分类命名为高山被孢霉(Mortierellaalpina)SD003,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年07月19日，保藏编号为CGMCCNo.7960。

2.按权利要求1所述的产多不饱和脂肪酸的高山被孢霉，其特征在于：所述高山被孢霉其内转录间隔序列(ITS)为SEQIDNO：1。

3.一种权利要求1所述的产多不饱和脂肪酸的高山被孢霉的应用，其特征在于：所述高山被孢霉应用于制备多不饱和脂肪酸油脂中。

4.按权利要求3所述的产多不饱和脂肪酸的高山被孢霉的应用，其特征在于：所述高山被孢霉用于同时代谢生成花生四烯酸和二十碳五烯酸中的应用。

5.按权利要求3所述的产多不饱和脂肪酸的高山被孢霉的应用，其特征在于：以所述高山被孢霉为出发菌株，在发酵培养基中发酵获得制备多不饱和脂肪酸油脂。

6.按权利要求5所述的产多不饱和脂肪酸的高山被孢霉的应用，其特征在于：发酵温度为20-28℃，发酵过程中控制pH在6.0-7.0之间，发酵周期7-10天，发酵过程中补充300g/L的糖液保持发酵罐内糖浓度在5-10g/L之间。

7.按权利要求5所述的产多不饱和脂肪酸的高山被孢霉的应用，其特征在于：所述发酵培养基按重量百分比计，葡萄糖4-10％，酵母粉0.2-0.5％，玉米浆0.2-0.6％，磷酸二氢钾0.2-0.4％，七水合硫酸镁0.02-0.04％，硫酸铵6-8％，其余为水。

8.一种制备生产多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于：以权利要求1所述高山被孢霉为出发菌株，在发酵培养基中高密度发酵获得制备多不饱和脂肪酸油脂。

9.按权利要求8所述的制备生产多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于：所述发酵温度为20-28℃，发酵过程中控制pH在6.0-7.0之间，发酵周期7-10天，发酵过程中补充300g/L的糖液保持发酵罐内糖浓度在5-10g/L之间。

10.按权利要求8所述的制备生产多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于：所述发酵培养基按重量百分比计，葡萄糖4-10％，酵母粉0.2-0.5％，玉米浆0.2-0.6％，磷酸二氢钾0.2-0.4％，七水合硫酸镁0.02-0.04％，硫酸铵6-8％，其余为水。