CN102816806A - 一种灰树花多糖硒复合物的生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种灰树花多糖硒复合物的生产方法，涉及食品微生物应用技术领域。按照下述步骤进行：米糠、麸皮常压下90-98℃水浸提2.5-3h后，去渣取汁；将得到处理液作为培养基用于发酵，按照米糠使用量为30-120g/L培养基，麸皮的使用量为30-120g/L培养基，硒的添加量为5-10mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.0-1.5g/L培养基，硫酸镁0.5-0.80g/L培养基，pH自然，将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，用蒸馏水洗涤，干燥至恒重得菌丝体；将上述菌丝体经常规水提取、脱蛋白、乙醇沉淀及冷冻干燥后即可得胞内多糖硒复合物。该方法更好实现了使用廉价原料生产灰树花多糖硒复合物。
Description
技术领域
本发明涉及食品微生物应用技术领域，尤其涉及使用一株适合在米糠和麸皮复合物为碳源和氮源的培养基上生长的灰树花诱变菌株，发酵并高产灰树花多糖硒复合物的生产方法。
背景技术
国内外科学研究和国内市场表明：食用菌多糖能增强人体免疫力，辅助治疗肿瘤等疾病，已成为肿瘤生物疗法选用的辅助用品。国内由食用菌子实体制成的药字号产品有安徽芜湖的灵芝胶囊、浙江庆元的灰树花胶囊等，由食用菌提取物制成的非药字号保健品也有销售。国际上新西兰产有“GanoPoly”（甘诺宝力）多糖提取物系列产品，销往美国、澳大利亚、中国（包括香港和台湾）等地方。该产品的发明人高益槐是国际知名食用菌产品开发专家，曾经获得爱因斯坦发明奖。高益槐发明的“GanoPoly”系列产品主要由灵芝、云芝、猴头等提取的多糖与壳聚糖一道复合构成，用于提高免疫力、辅助抗肿瘤治疗等。新西兰安发保健品有限公司现在中国福建泉州建有食用菌多糖的生产基地。在各种食用菌多糖的研究中，现在已有研究说明，药食两用食用菌灰树花的多糖也具有较好的提高免疫力、辅助抗肿瘤治疗等的功效，值得引起足够的重视，例如Ohno Naohito 、Suzuki Iwao等从灰树花菌体中提取灰树花多糖的药效试验表明，灰树花多糖具有抗肿瘤作用和免疫调节作用（参考文献见① Ohno N,Lino K,Suzuki I et al. Neutral and acidic antitumor polysaccharides extracted from cultured fruit bodies of Grifola Frondosa[J]. Chem. Pharm. Bull,1985,33(3):1181-1186；② Naohito Ohno,Yoshiyuki Adachi,Iwao Suzuki,et al.Characterization of the antiumor glucan obtained from liquid-cultured Grifola frondosa[J].Chem.pharm.Bull.1986,34(4):1709；③Iwao Suzuki,Koichi Hashimoto,Shozo Oikawa,et al.Antiumor and immunmodulating activity of a β-glucan obtained from liquid-cultureed Grifola frondosa[J].chem.Pharm Bull,1986,37(2):410.）。
灰树花(Grifola frondosa) 为担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科，树花属，又名奇果菌、贝叶多孔菌、千佛菌、莲花菌等，是一种珍稀的食药两用真菌，其子实体肉质，柄短且呈珊瑚状，外观形似菊，气味清香四溢，肉质脆嫩可口。野生灰树花分布于日本、欧洲等，在我国黑龙江、吉林、广西、河北、四川、云南、福建等省区也有分布。河北省迁西人工栽培的灰树花，其营养和口味超过了“菇中之王”的香菇，能烹调成多种美味佳肴。1834年，日本本坂浩然的《菌谱》中记载了灰树花具有“味甘、平、无毒、可治痔疮” 的药用价值，而我国中医认为其具有“扶正固本”之功效。近年来国内外的研究表明，灰树花多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗HIV病毒和保肝护肝等作用。灰树花提取物作为一种高级保健食品，已经风行于日本、新加坡等市场。传统的灰树花固态培养生产周期长，劳动强度大，易受到病虫害的侵害，且原材料利用率低。研究发现液体深层发酵得到的灰树花菌丝体营养价值及药用效果与固态栽培得到的子实体相当，因此，人们对灰树花液态发酵越来越重视并取得了一定的研究成果。1986年Ohno N等首次报道了灰树花液体培养情况，随后Suzukil等也用类似的方法成功培养出灰树花菌丝体。1992年Zhuang C等研制出一套液体培养装置，可同时收获菌丝体及发酵液多糖。陈石良的研究表明，灰树花发酵菌丝体中的粗多糖含量大大高于子实体多糖，同时发酵液的胞外多糖也是活性多糖。这些研究涉及到优良菌种选育和培养基及培养工艺的探索等，主要目的是降低生产成本并在此基础上提高菌丝活性多糖产量。多数工艺采用葡萄糖、粮食类原料如淀粉、马铃薯等作为培养基的主要碳源和氮源，即使用到农产品加工的副产品如米糠或麸皮，也是作为次要成分加入，一般还需要大量使用葡萄糖或其他粮食类原料。现有的灰树花菌种难以在不添加葡萄糖或其他粮食类原料的米糠或麸皮的培养基上生长。本专利设计人刘伟民等曾对原有的灰树花菌种在米糠培养基上液体发酵产灰树花多糖的可能性进行过研究，发现尽管对菌株也进行过初步紫外诱变的处理，如不添加较大量的葡萄糖，灰树花在米糠培养基上发酵不理想，所以在刘伟民指导的杨锁华和顾慧敏的硕士论文的研究，仍添加了较多的葡萄糖，故而只以农产品加工副产品为原料生产灰树花多糖以降低成本的设想并没有能得到真正的实现（参考文献见：杨锁华.灰树花发酵米糠制备多糖[D].硕士学位论文.镇江：江苏大学.2006；顾慧敏.灰树花在米糠培养基中液态培养产多糖和富集有机硒的研究[D].硕士学位论文.镇江：江苏大学.2009.）。后刘伟民又指导硕士研究生也是本专利的发明人张建对原有灰树花菌种进行过初步微波-紫外复合诱变的处理，其诱变菌株在米糠、麸皮培养基上（不添加葡萄糖）液体发酵产灰树花多糖效果较好，菌丝干重和多糖较原有菌株分别提高39.24%和42.58%，并提交了中国发明专利申请，申请专利的名称是：用于米糠和麸皮复合原料生产多糖的灰树花菌株，申请号为201010579078.5。尽管该菌株生产的多糖较实验室原有的菌株生产的多糖有较大的提高，但诱变菌种会退化，从稳定诱变菌种，提高生产效率的角度而言，不断诱变菌种，获得更高的多糖产量仍是需要不断研究的问题和更高的发明创造的目标。另外，申请号为201010579078.5的灰树花菌株比较适合的发酵工艺是需要对米糠和麸皮先进行植物纤维酶的酶解，提供发酵所需的碳源，但引入酶解工艺会增加生产成本。如果诱变出高效灰树花菌株，在没有先期酶解的情况下，也能高效转化米糠和麸皮，则将达到创新的效果。申请人与本发明同时提交了另一个发明专利申请，题目是：用于高效发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株，瞄准上述目标，进行灰树花菌种的新诱变，以求获得新的生产灰树花多糖的高效菌株。但《用于高效发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株》的发明专利并没有涉及用所得菌株生产灰树花多糖硒复合物的方法。这一方法由本发明专利描述。
硒是人体必需的微量元素，是一些抗氧化酶（如谷胱甘肽过氧化物酶）和硒-P蛋白的重要组成部分，在体内起着平衡氧化还原氛围的作用，但我国2/3地区硒摄入量低于最低推荐值。因此，仅靠天然食品中的硒含量一般不足以满足人体的正常需要，所以人体需要适当补硒。在人体对硒的吸收利用方面, 天然有机硒的生物利用率高于无机硒，而食用蕈菌是富集微量元素硒的良好载体，硒多糖作为一种有机硒化合物兼具硒和多糖的生物活性，因此可以采用食用蕈菌富集硒来作为将无机硒转化为有机硒化合物的有效途径。目前国内外对这方面有相关的报道。尚德静等研究了在金针菇、香菇、猴头菇和灵芝这四种食用菌富硒能力，沈恒胜等研究了秀珍菇生物富硒及富集水平，陈石良等对灰树花富硒培养进行了研究，沈霞的研究表明灰树花有较强的耐硒和富硒能力。由于作为保健食品，成人每人每日摄取的硒的最高耐受量为400μg，推荐摄入量为50μg，所以，在多糖中再富集硒需要对硒的添加量作限制。
我国是以稻谷和小麦为主的产粮大国，其加工副产品米糠、麸皮来源丰富，且价格低廉。米糠中富含淀粉、纤维素等物质，而麸皮富含蛋白、纤维素等物质。从理论上讲，米糠和麸皮复合已经具备了灰树花生长所需要的碳源和氮源的原始物质。在灰树花自身纤维素酶及其他酶的作用下，灰树花可将米糠和麸皮转化成自身的营养物质进行生长，生产灰树花多糖。因此，运用米糠、麸皮等廉价农副产品，作为完全的碳源和氮源，而不添加其他碳源和氮源，提供灰树花液体发酵所需的碳源和氮源营养物质，生产具有辅助肿瘤治疗的灰树花硒多糖，将具有经济价值。本发明将得到实现这一目标的一种有效方法。特别说明：本发明所述的米糠麸皮培养基特指只以米糠和麸皮复合物为碳源和氮源物质的培养基，培养基中不再添加其他碳源和氮源物质。尽管有机硒产品在市场上有所销售，如北大富硒康采用酵母富集有机硒，但还可以发明其他富集有机硒的方法。将有机硒和食用菌多糖复合，可以发挥两类物质的作用，为组合创新方法。用灰树花富集硒，汪维云、刘伟民、胡祥国、顾慧敏等之前也有研究，但所用培养基不是以米糠和麸皮复合提取物为主要碳源和氮源，一般以采用葡萄糖、粮食类等为主的碳源。为了降低原料成本，高效利用农产品加工副产品米糠和麸皮，得到高价值的保健食品，有必要研究新的技术。由于灰树花菌株在米糠麸皮提取物为主要碳源氮源而不加其他碳源氮源的培养基中生长受到限制，有必要通过诱变的手段得到高效生长菌株，并使用新的菌株发酵添加硒的米糠麸皮培养基，生产灰树花多糖硒复合物作为新型保健食品。
要实现上述设想的关键问题之一为必须得到适宜在米糠和麸皮复合培养基上生长的灰树花菌株，所以必须对已有菌株不断进行诱变筛选，因为现有的灰树花菌株在米糠麸皮培养基上生长仍希望得到大幅度提高，如能筛选出适宜的灰树花菌株，则研究和生产将有可能取得突破。与本发明同时提交的另一个发明专利通过原生质体激光诱变的方法，以高产多糖为指标，定向高效转化米糠麸皮提取液为基础，选育得到高产、低成本的灰树花菌株。本发明的关键问题则是：利用与本发明同时提交的另一个发明专利所得到的新的诱变菌株，在添加硒的未用植物纤维素酶解的米糠麸皮复合培养基上，发酵生产灰树花多糖硒复合物，由此得到一种新的灰树花多糖硒复合物生产方法。因变异菌株是新菌株，在所产多糖物质上有所变化，所得的灰树花多糖硒也为一种新的灰树花多糖硒复合物。新的生产方法必须由新的工艺支撑，使用本发明采用的诱变菌株，在未经植物纤维酶解的米糠麸皮加硒复合培养基上进行发酵，高产灰树花多糖硒复合物的工艺是全新的工艺，这种研究未见公开报道。所以，本发明在采用新诱变菌株、以未经植物纤维素酶解的米糠麸皮加硒复合物作为培养基、新的灰树花多糖硒复合物（诱变后的菌株可产生分子量有所不同的多糖）、新的灰树花多糖硒复合物生产工艺四个方面具有创新性，奠定了本发明专利的基础。
发明内容
本发明解决前述现有灰树花多糖硒研究和生产技术中的不足，为了降低生产成本，考虑采用大宗农产品稻谷和小麦等加工的副产品米糠和麸皮作为培养基的碳源和氮源，不再添加其他碳源如葡萄糖和氮源，加入无机亚硒酸钠，进行液体发酵，以节约原料成本、减少使用土地和降低生产周期，提高产品附加值，但这需要诱变筛选出在米糠麸皮复合培养基上适宜生长的灰树花菌株和选择适宜的生产工艺方法。因此，为实现上述目的，需要在自然选育之外，通过生物技术手段对灰树花菌株进行诱变，筛选出适宜在米糠麸皮培养基上高产多糖的灰树花菌株，研究该诱变菌株富集有机硒的适宜发酵工艺方法，以得到灰树花多糖硒复合物，作为保健食品。
本发明所采取的技术方案如下：利用新诱变得到的灰树花菌株，发酵培养基只以米糠和麸皮复合原料为碳源和氮源，生产灰树花多糖硒复合物，按照下述步骤进行：（1）米糠、麸皮常压下90-98℃水浸提2.5-3h后，去渣取汁；（2）将得到处理液作为培养基用于发酵，按照米糠使用量为30-120 g/L培养基，麸皮的使用量为30-120 g/L培养基，硒的添加量为5-10mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.0-1.5g/L培养基，硫酸镁0.5-0.80 g/L培养基，pH自然，所用菌株为新诱变得到的灰树花菌株；（3）将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，用蒸馏水洗涤，干燥至恒重得菌丝体；（4）将上述菌丝体经常规水提取、脱蛋白、乙醇沉淀及冷冻干燥后即可得胞内多糖硒复合物。
本发明步骤（2）中使用的新诱变得到的灰树花菌株Grifola sp. JSU 10-2已经于2011年4月7日保藏在中国武汉的武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC ），保藏菌株编号为 CCTCC M2011113，名称Grifola sp. JSU 10-2 。
本发明步骤（2）中所述的硒添加物为亚硒酸钠，添加量由所要求的硒量进行换算。
本发明步骤（2）中摇瓶时的装样量为摇瓶容积的40%，接种量为装样体积的10%，摇瓶培养时间为7-9d。
本发明步骤（2）中上罐发酵时装样量为发酵罐容积的80%，上罐时通风量为装罐液体体积/min，培养温度26℃-28℃，转速或搅拌速率150-180r/min，上罐发酵4-6天。
本发明的有益效果
本发明采用发明人得到的灰树花诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2，（已经同时另行申请发明专利），在不加其他碳源和氮源的未经植物纤维酶酶解的米糠麸皮复合培养基上培养生产灰树花多糖硒复合物，与原始菌株相比灰树花粗多糖产量更高，菌丝干重和菌丝多糖分别提高了31.7%和32.6%。本发明融合四种创新：（1）不加其他碳源和氮源的未经植物纤维素酶酶解的米糠麸皮复合培养基技术；（2）采用新获得的在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基上生长速度更快、多糖产量更高的诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2作为发酵菌株；（3）诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2在未经植物纤维素酶酶解米糠麸皮复合培养基上生长，并生产灰树花多糖硒的工艺方法；（4）成分有变化的灰树花粗多糖硒复合物。这四种创新组合使得本发明具有明显的有益效果，可以降低生产成本，节约原料成本、减少使用土地和降低生产周期，生产出高价值的具有辅助抗肿瘤治疗效果的灰树花多糖硒复合物保健食品。本发明使用了经原生质体激光诱变法诱变并筛选出的灰树花新菌株，即具有高生长速率和高多糖产量的突变菌株Grifola sp. JSU 10-2，所得菌株适合在未经植物纤维酶酶解的米糠和麸皮复合培养基上快速生长并高产灰树花多糖硒复合物。灰树花多糖具有辅助抗肿瘤治疗的价值，使得灰树花已经成为一种重要的药用真菌，但灰树花多糖大规模生产依然要面对成本高、产量低等一系列问题。基于此，本发明解决的技术问题是：提供在不加其他碳源和氮源的未经植物纤维酶酶解的米糠麸皮复合培养基上生长速度更快、多糖产量更高的灰树花诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2发酵生产灰树花多糖硒复合物的生产方法。所述方法为灰树花诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2在未经植物纤维酶酶解的米糠麸皮加硒复合培养基上发酵生产灰树花多糖硒复合物的生产方法，该方法与现有的其他灰树花多糖硒复合物的生产方法相比，产生了产量更高、高效低成本使用了廉价原料、灰树花多糖硒复合物适合作为保健食品使用的有益效果。
具体实施方式
本发明提供一种灰树花菌株Grifola sp. JSU 10-2（已经同时另行申请专利），可以在不加其他碳源和氮源的未经植物纤维素酶酶解的米糠麸皮复合培养基上相对于原有的灰树花菌株具有高生长速率和高多糖产量；该灰树花菌株Grifola sp. JSU 10-2已经于2011年4月15日保藏在中国武汉的武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC ），保藏菌株编号为 CCTCC M2011113，名称为Grifola sp. JSU 10-2。本发明提供了采用诱变得到的菌株Grifola sp. JSU 10-2生产灰树花多糖硒复合物作为保健食品的生产方法。
在具体实施方式中， 对米糠和麸皮进行95oC左右浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵。
实施例一
灰树花菌株采用诱变得到的Grifola sp. JSU 10-2菌株。对米糠和麸皮进行90℃浸提2.5h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠使用量为30g/L培养基，麸皮的使用量为30g/L培养基，硒的添加量为5mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.0g/L培养基，硫酸镁0.5g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度26℃，转速150r/min，培养时间7d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定菌丝胞内多糖含量。得到菌丝干重为3.718g/L培养液，菌丝胞内多糖为0.368g/L培养液。将干燥的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取0.500g分别微波消解，采用3,3二氨基联苯比色法测定含硒量，得到含多糖的菌丝含硒及菌丝多糖提取物中含硒分别为0.605mg/g干菌丝和0.272mg/g粗菌丝多糖，其中所述的微波消解程序设置如附表1所示。
实施例二
灰树花菌株采用诱变得到的Grifola sp. JSU 10-2菌株。对米糠和麸皮进行98℃浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠使用量为120g/L培养基，麸皮的使用量为120g/L培养基，硒的添加量为10mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.5g/L培养基，硫酸镁0.8g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度28℃，转速180r/min，培养时间9d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为15.58g/L培养液，菌丝胞内多糖为1.56 g/L培养液。将干燥的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取0.500g分别微波消解，采用3,3二氨基联苯比色法测定含硒量，得到含多糖的菌丝含硒及菌丝多糖提取物中含硒分别为0.289mg/g干菌丝和0.179mg/g粗菌丝多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表1所示。
实施例三
灰树花菌株采用诱变得到的Grifola sp. JSU 10-2菌株。对米糠和麸皮进行95℃浸提2.8h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠使用量为120g/L培养基，麸皮的使用量为50g/L培养基，硒的添加量为10mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.5g/L培养基，硫酸镁0.8 g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度28℃，转速150r/min，培养时间7d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为9.43g/L培养液，菌丝胞内胞内多糖为0.91g/L培养液。将干燥的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取0.500g分别微波消解，采用3,3二氨基联苯比色法测定含硒量，得到含多糖的菌丝含硒及菌丝多糖提取物中含硒分别为0.498mg/g干菌丝和0.209 mg/g粗菌丝多糖，其中所述的微波消解程序设置如附表1所示。
实施例四
灰树花菌株采用诱变得到的Grifola sp. JSU 10-2菌株。对米糠和麸皮进行90℃浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠使用量为50g/L培养基，麸皮的使用量为120g/L培养基，硒的添加量为9mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.25g/L培养基，硫酸镁0.6g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度28℃，转速150r/min，培养时间8d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为7.97g/L培养液，菌丝胞内胞内多糖为0.89 g/L培养液。将干燥的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取0.500g分别微波消解，采用3,3二氨基联苯比色法测定含硒量，得到含多糖的菌丝含硒及菌丝多糖提取物中含硒分别为0.542mg/g干菌丝和0.222 mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表1所示。
实施例五
灰树花菌株采用诱变得到的Grifola sp. JSU 10-2菌株。对米糠和麸皮进行94℃浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为80g/L培养基，麸皮的使用量为90g/L培养基，硒的添加量为8mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.4g/L培养基，硫酸镁0.7 g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度28℃，转速150r/min，培养时间8d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为11.65g/L培养液，胞内多糖为1.19g/L培养液。将干燥的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取0.500g分别微波消解，采用3,3二氨基联苯比色法测定含硒量，得到含多糖的菌丝含硒及菌丝多糖提取物中含硒分别为0.295mg/g干菌丝和0.134mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表1所示。
实施例六
灰树花菌株采用诱变得到的Grifola sp. JSU 10-2菌株。对米糠和麸皮进行96℃浸提2.6h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为70g/L培养基，麸皮的使用量为80g/L培养基，硒的添加量为7mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.1g/L培养基，硫酸镁0.7g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度28℃，转速150r/min，培养时间7d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为8.85g/L培养液，胞内多糖为0.96g/L培养液。将干燥的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取0.500g分别微波消解，采用3,3二氨基联苯比色法测定含硒量，得到含多糖的菌丝含硒及菌丝多糖提取物中含硒分别为0.364mg/g干菌丝和0.168mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表1所示。
实施例七
灰树花菌株采用诱变得到的Grifola sp. JSU 10-2菌株。对米糠和麸皮进行92℃浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为40g/L培养基，麸皮的使用量为40g/L培养基，硒的添加量为6mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.2g/L培养基，硫酸镁0.65g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度27℃，转速170r/min，培养时间8d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为9.63g/L培养液，胞内多糖为0.20g/L培养液。将干燥的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取0.500g分别微波消解，采用3,3二氨基联苯比色法测定含硒量，得到含多糖的菌丝含硒及菌丝多糖提取物中含硒分别为0.262mg/g干菌丝和0.276mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表1所示。
实施例八
灰树花菌株采用诱变得到的Grifola sp. JSU 10-2菌株。对米糠和麸皮进行97℃浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为110g/L培养基，麸皮的使用量为60g/L培养基，硒的添加量为10mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.2g/L培养基，硫酸镁0.65g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度27℃，转速170r/min，培养时间8d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为9.70g/L培养液，胞内多糖为0.96g/L培养液。将干燥的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取0.500g分别微波消解，采用3,3二氨基联苯比色法测定含硒量，得到含多糖的菌丝含硒及菌丝多糖提取物中含硒分别为0.412mg/g干菌丝和0.198mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表1所示。
实施例九
灰树花菌株采用诱变得到的Grifola sp. JSU 10-2菌株。对米糠和麸皮进行98℃浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为100g/L培养基，麸皮的使用量为110g/L培养基，硒的添加量为9mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.4g/L培养基，硫酸镁0.7g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度27℃，转速160r/min，培养时间7d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为10.51g/L培养液，胞内多糖为1.27g/L培养液。将干燥的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取0.500g分别微波消解，采用3,3二氨基联苯比色法测定含硒量，得到含多糖的菌丝含硒及菌丝多糖提取物中含硒分别为0.385mg/g干菌丝和0.156mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表1所示。
实施例十
灰树花菌株采用诱变得到的Grifola sp. JSU 10-2菌株。对米糠和麸皮进行98℃浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为120g/L培养基，麸皮的使用量为120g/L培养基，硒的添加量为10mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.5g/L培养基，硫酸镁0.8g/L培养基，pH自然，装样量为发酵罐容积的80%，培养温度为28℃，通风量为装罐发酵液体积/min，搅拌速度180r/min，罐表压0.05MPa，接种量10%，培养时间6d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为16.10g/L培养液，胞内多糖为1.58g/L培养液。将干燥的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取0.500g分别微波消解，采用3,3二氨基联苯比色法测定含硒量，得到含多糖的菌丝含硒及菌丝多糖提取物中含硒分别为0.311mg/g干菌丝和0.177mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表1所示。
实施例十一
灰树花菌株采用诱变得到的Grifola sp. JSU 10-2菌株。对米糠和麸皮进行90℃浸提2.5h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为30g/L培养基，麸皮的使用量为30g/L培养基，硒的添加量为5mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.0g/L培养基，硫酸镁0.5g/L培养基，pH自然，装样量为发酵罐容积的80%，培养温度为26℃，通风量为装罐发酵液体积/min，搅拌速度150r/min，罐表压0.05MPa，接种量10%，培养时间4d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为3.82g/L培养液，胞内多糖为0.41g/L培养液。将干燥的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取0.500g分别微波消解，采用3,3二氨基联苯比色法测定含硒量，得到含多糖的菌丝含硒及菌丝多糖提取物中含硒分别为0.654mg/g干菌丝和0.244mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表1所示。
实施例十二
灰树花菌株采用诱变得到的Grifola sp. JSU 10-2菌株。对米糠和麸皮进行94℃浸提2.7h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为70g/L培养基，麸皮的使用量为80g/L培养基，硒的添加量为7.5mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.1g/L培养基，硫酸镁0.8g/L培养基，pH自然，装样量为发酵罐容积的80%，培养温度为26℃，通风量为装罐发酵液体积/min，搅拌速度170r/min，罐表压0.05MPa，接种量10%，培养时间5d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为8.96g/L培养液，胞内多糖为1.03g/L培养液。将干燥的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取0.500g分别微波消解，采用3,3二氨基联苯比色法测定含硒量，得到含多糖的菌丝含硒及菌丝多糖提取物中含硒分别为0.360mg/g干菌丝和0.175mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表1所示。
表1微波消解程序设置表
Claims (5)
1.一种灰树花多糖硒复合物的生产方法，其特征在于按照下述步骤进行：（1）米糠、麸皮常压下90-98℃水浸提2.5-3h后，去渣取汁；（2）将得到处理液作为培养基用于发酵，按照米糠使用量为30-120 g/L培养基，麸皮的使用量为30-120 g/L培养基，硒的添加量为5-10mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.0-1.5g/L培养基，硫酸镁0.5-0.80 g/L培养基，pH自然，所用菌株为新诱变得到的灰树花菌株；（3）将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，用蒸馏水洗涤，干燥至恒重得菌丝体；（4）将上述菌丝体经常规水提取、脱蛋白、乙醇沉淀及冷冻干燥后即可得胞内多糖硒复合物。
2.根据权利要求1所述的一种灰树花多糖硒复合物的生产方法，其特征在于其中所使用的新诱变得到的灰树花菌株Grifola sp，保藏菌株编号为 CCTCC M2011113。
3.根据权利要求1所述的一种灰树花多糖硒复合物的生产方法，其特征在于步骤（2）中所述的硒添加物为亚硒酸钠，添加量由所要求的硒量进行换算。
4.根据权利要求1所述的一种灰树花多糖硒复合物的生产方法，其特征在于步骤（2）中摇瓶时的装样量为摇瓶容积的40%，接种量为装样体积的10%，摇瓶培养时间为7-9d。
5.根据权利要求1所述的一种灰树花多糖硒复合物的生产方法，其特征在于步骤（2）中上罐发酵时装样量为发酵罐容积的80%，上罐时通风量为装罐液体体积/min，培养温度26℃-28℃，转速或搅拌速率150-180r/min，上罐发酵4-6天。
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