CN103160444B

CN103160444B - 一种酿酒酵母菌株及其在制备耐热超氧化物歧化酶中的应用

Info

Publication number: CN103160444B
Application number: CN201310103919.9A
Authority: CN
Inventors: 左德全; 姜广; 董亮; 蒋峰臣
Original assignee: Beijing Qihuamei Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Qi Mei Mei Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2033-03-28
Also published as: CN103160444A

Abstract

本发明公开了一种酿酒酵母菌株及其在制备耐热超氧化物歧化酶中的应用。本发明提供了酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株TY-SC-2-2013.1.1，其保藏号为CGMCC No.7249。本发明还提供了一种制备SOD的方法，包括如下步骤：发酵上述的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株TY-SC-2-2013.1.1，收集发酵产物，即得到SOD。本发明的实验证明，本发明具有如下优点：本发明筛选出一种酿酒酵母，其可直接表达出食品级的耐热超氧化物歧化酶产物，弥补了耐高温酵母菌能减少发酵生产中由于降温所带来的麻烦和费用。

Description

一种酿酒酵母菌株及其在制备耐热超氧化物歧化酶中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种酿酒酵母菌株及其在制备耐热超氧化物歧化酶中的应用。

背景技术

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）广泛存在于各类生物体中，是机体内超氧阴离子自由基的天然消除剂，对机体细胞起保护作用。因此，SOD在抗衰老以及预防肿瘤和抗炎等方面起着重要的生理作用，收到国内外医药日用化工，食品及生化界的极大关注。

根据SOD所含金属辅基的不同，一般可将其分为Cu、Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种类型。

SOD在临床上有较广泛的应用，如用于骨关节炎、急性肝与慢性肝的炎症反应，SOD可去除由炎症反应产生的大量的超氧化自由基，对消除炎症，恢复肝功能起到一定的作用：用于治疗因超氧阴离子伤害引起的疾病，如心肌缺血及缺血再灌注综合症，类风湿关节炎，放射性膀胱炎，红斑狼疮等。

SOD在食品工业主要应用四方面：1）作为保健食品的功效因子或食品营养强化剂，添加到各种食品中。2）制成多种剂型的SOD或复合型食品。3）用作食品的天然抗氧化剂。4）以富含SOD的原料加工制成保健食品。此外，SOD添加于化妆品中可起到防晒，防止脂褐素的形成，防治皮肤病以及防治瘢痕形成等作用。

我国自上世纪八十年代以来，对SOD的应用研究主要侧重于动植物SOD的提取和纯化，国内产品大部分是从动物血液中制备的，但由于原材料有限及卫生安全性等原因，导致制品产量有限，且血液制品的安全性风险加大，这种方法慢慢的被淘汰。利用基因工程是广开SOD酶源，降低成本和获得具有天然活性的SOD有效途径。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又叫面包酵母，在酿酒业和面包业中的使用也有数千年历史，被认识是GARS生物（generally recognized as safe）,已被美国FDA认定为安全性的生物，其表达产物不需经过大量宿主安全性实验。酿酒酵母作为一种模式生物，是亦今了解最完全的真核生物，上千个基因已被分析，自从酿酒酵母表达人干扰素成功以后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白。作为一种单细胞真核生物，它表达外源基因时具有一定的翻译后加工能力，具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，有利于保护生物产品的活性和稳定性。但是酿酒酵母本身含有耐热SOD的野生菌株还未被筛选。

耐高温酵母菌能减少发酵生产中由于降温所带来的麻烦和费用,保证工业发酵能在高温下正常进行,因此,围绕耐高温酵母菌的筛选成为研究热点。近年来,已有多株人工选育的耐高温酵母菌投入到生产中,并取得了良好的经济效益。目前,耐高温酵母菌的选育主要集中在自然筛选和高温驯化,使耐高温酵母菌的研究取得了显著进展。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株。

本发明提供的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株TY-SC-2-2013.1.1，其保藏号为CGMCC No.7249。

上述的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株TY-SC-2-2013.1.1在制备SOD中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述SOD为耐高温酶，具体可耐100℃，即在100℃水浴保温1h，仍保留77.89%的酶活性。

本发明的另一个目的是提供一种制备SOD的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的酿酒酵母Saccharomycescerevisiae菌株TY-SC-2-2013.1.1，收集发酵产物，即得到SOD。

上述方法中，所述发酵中使用的培养基为酵母培养基，其中酵母培养基中的碳源为葡萄糖、麦芽糖、棉籽糖、蔗糖或淀粉；所述碳源在所述酵母培养基中的质量百分含量为2%；

上述方法中，所述碳源为棉籽糖。

上述碳源为棉籽糖的酵母培养基按照如下方法制备：向浓度为8g/L的不含碳源的酵母培养基中加入Ura和棉籽糖，用水补足体积，得到碳源为棉籽糖的酵母培养基，其中Ura在碳源为棉籽糖的酵母培养基中的终浓度为0.01%（质量百分含量），棉籽糖在碳源为棉籽糖的酵母培养基的终浓度为2%（质量百分含量）。

上述方法中，所述发酵方式如下：30℃培养8-48h、且每隔12h，补加一次所述碳源，使所述碳源在发酵体系中的质量百分含量为1%-2%。

在本发明的实施例中，所述发酵方式如下：30℃培养48h、且每隔12h，补加一次碳源，使碳源在发酵体系中的质量百分含量为2%。

在本发明的实施例中，碳源为棉籽糖。

上述方法中，在收集发酵产物后，还包括如下步骤：将所述发酵产物依次经离心收集菌体沉淀、悬浮所述菌体沉淀得到悬浮液、破碎所述悬浮液、再次离心悬浮液收集上清液，得到SOD。

具体为810g的速度离心收集菌体、以pH7.0浓度为50mmol/L的磷酸缓冲液重悬菌体、用超声波破碎仪破碎（功率162.5W、超声时间30min；间接超声，间接超声是超2s，停3s，总共超声的时间为30min。）,2260g离心25min,收集上清液得到SOD。

由上述方法制备的SOD也是本发明保护的范围。

上述SOD为耐高温酶。

TY-SC-2-2013.1.1菌株，分类命名为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae），于2013年2月1日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），菌种保藏号为：CGMCC No.7249。

本发明的实验证明，本发明具有如下优点：1）本发明筛选出一种酿酒酵母，其可直接表达出食品级的耐热超氧化物歧化酶产物，弥补了耐高温酵母菌能减少发酵生产中由于降温所带来的麻烦和费用,保证工业发酵能在高温下正常进行和酿酒酵母本身含有耐热SOD的野生菌株还未被筛选的不足；2）若将本发明应用于工业化SOD生产，产物可不经过传统的纯化工艺而直接应用于食品，保健品以及化妆品等领域，也可直接应用于食品发酵，用于生产功能食品；3）本发明通过该酿酒酵母获得的SOD酶是一种高耐温酶，具有化学催化剂无法比拟的优点,尤其是在高温条件下保持极好的稳定性,克服了中温酶(20℃～5℃)及低温酶(2℃～20℃)在应用过程中出现的化学性质不稳定现象,从而使很多高温化学反应得以实现,从而将极大地促进生物技术产业的发展；4）本发明的方法还具有原料生物体生长周期短，生产规模大，成本低廉，稳定性好等优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。

附图说明

图1为菌株TY-SC-2-2013.1.1的生物量的结果

图2为菌株TY-SC-2-2013.1.1的SOD酶活结果

图3为TY-SC-2-2013.1.1提取的SOD酶纯化后的温度稳定性

图4为TY-SC-2-2013.1.1提取的SOD酶纯化后常温保存酶活变化趋势

图5为TY-SC-2-2013.1.1提取的SOD酶纯化后pH值对其酶活性的影响

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、耐热超氧化物歧化酶酿酒酵母菌株的分离、筛选及鉴定

一、耐热超氧化物歧化酶酿酒酵母菌株TY-SC-2-2013.1.1的分离、筛选

1、耐热超氧化物歧化酶酿酒酵母菌株的分离

1）土壤的采集处理

从河北保定酒厂采集酒曲、窖泥和酒醅样品共18个,置于无菌纸袋,并标明采取地点、日期。将其运回实验室后至于冰箱中保存，备用。

将采回的样品用四分法获取样品20-30g，将其置于研钵中研磨均匀。

2）菌种的分离：

分别称取1g采集的样品，加入到已灭菌的装有50mL富集培养基的三角烧瓶中,于30℃恒温、摇床160r/min条件下培养24h,再取培养液2mL进行同条件的传代培养,每24h接种传代一次,3次后,可供平板分离。

富集后的酵母菌液连续用无菌水稀释为10^-1、10^-2、……、10^-7,分别取稀释度为10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的菌液各0.5mL(每个稀释度取样两个),用无菌涂布棒分别涂于8个分离培养基平板上,置于30℃恒温箱中培养24h，分离得到酵母菌。

为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml的链霉素或者100mg/L的氯霉素。

观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。

选取菌落形态如下的酵母菌：酵母菌的菌落较湿润透明,表面光滑,容易挑取,菌落质地均匀,正反面以及边缘与中间的颜色较一致；菌落颜色比较单调,多以乳白色或矿烛色为主。

上述富集培养基可以为如下PDA培养基或YEPD培养基：

（1）PDA培养基：去皮马铃薯300g，加水煮沸10～20min，过滤加入葡萄糖200g，加水至1L。灭菌。

（2）YEPD培养基：葡萄糖20g、蛋白胨20g、牛肉膏10g、琼脂20g、水1000ml。

YEPD液体培养基：酵母浸粉10g/L,胰蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L,琼脂15g/L,固体培养基可加入2%琼脂。

2、酿酒酵母筛选

1）酿酒酵母的无性繁殖方式筛选

将上述1分离得到的酵母菌观察形态特征：酵母菌为卵圆形，以单端出芽方式进行繁殖；然后在25℃产孢子培养基上培养5天，选取有子囊孢子产生，孢子呈卵圆形的酵母菌。

2）酿酒酵母初筛

初筛培养基由下层培养基和上层培养基构成；下层培养基(g/L):葡萄糖10.1、KH₂PO₄1.0、牛肉膏蛋白胨2.0、酵母粉1.5、无水MgSO₄0.4、柠檬酸0.27、琼脂20.0；上层培养基(g/L):2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.3、葡萄糖30.0、琼脂20.0。

在初筛培养基上培养上述1）筛选的酵母菌，在菌落上覆盖一层TTC显色剂,TTC显现不同的颜色,产乙醇能力强的酵母会显现深红色,次之显粉红色,微红色的或者不显色的为野生酵母。

选取显现深红色的酵母菌。

3）WL琼脂培养基复筛酿酒酵母

WL琼脂培养基(%质量分数)：酵母浸粉0.5，胰蛋白胨0.5，葡萄糖5，琼脂2，磷酸二氢钾0.055，氯化钾0.0425，氯化钙0.0125，氯化铁0.00025，硫酸镁0.0125，硫酸锰0.00025，溴甲酚绿0.0022，pH6.5，121℃灭菌20min；

将上述2）筛选得到的酵母菌接种液体培养基活化24h后接种到WL琼脂培养基，27℃培养5d后观察，筛选出具有如下形态的酵母菌：菌落颜色为奶油色（浅黄色）至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株。

3、赖氨酸培养基筛选鉴定

赖氨酸培养基成分（L^-1）：D-葡萄糖10g，L-组氨酸1mg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg，对－氨基苯甲酸200μg，生物素20μg，叶酸2μg，肌醇10mg，烟酸400μg，泛酸2mg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素200μg，盐酸硫胺素400μg，硼酸500μg，结晶氯化铜40μg，碘化钾100μg，结晶氯化铁200μg，结晶硫酸锰400μg，结晶钼酸钠200μg，结晶硫酸锌400μg，磷酸二氢钾850mg，磷酸氢二钾150mg，结晶硫酸镁500mg，氯化钠100mg，结晶氯化钙100mg，赖氨酸盐酸盐2.5g，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌20min；

酿酒酵母不能采用赖氨酸作为酵母氮源，因而在赖氨酸培养基上不能生长。

将上述2的3）得到的酵母菌（经过初筛和复筛的菌株）接种于YPD液体培养基活化24h后，按照1%接种量接种到5mL无菌水中进行饥饿处理，7d后接种到赖氨酸培养基，27℃培养5d后观察是否有酵母生长，培养48h后没有菌落出现的继续培养，直到15d后仍无菌落生长说明是酿酒酵母。

经赖氨酸培养基筛选鉴定，得到了25株具有典型酿酒酵母特征的菌株编号TY-SC-1～25。

4、耐高温酒精酵母菌的筛选

将分离得到的25株酿酒酵母菌涂布于固体培养基（配方见初筛培养基）上,于38℃下培养。待长出菌落后,倒入一层TTC上层培养基（配方见初筛培养基）,继续培养3h。

培养结束后挑选16株长势好、红色较深的菌落备用。TTC可以和细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应,生成红色的甲月赞,由此可判断酵母细胞中呼吸酶活力的大小,即酵母产酒精能力的高低。

利用产酒精能力强的酵母菌能还原三苯基四氮唑盐酸盐(TTC)变为深红色这一特性,筛选深红色酿酒酵母菌落。

将深红色酿酒酵母菌落接种至YEPD液体培养基,分别于34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、46℃下培养,根据其生长情况选出9株耐高温特性较强的菌株进行下一步实验：TY-SC-1、TY-SC-2-2013.1.1、TY-SC-5、TY-SC-8、TY-SC-12、TY-SC-13、TY-SC-15、TY-SC-18、TY-SC-22。

表1为酵母菌在不同温度下的生长情况

注：++生长良好+生长﹣不生长

经过耐高温驯化分离筛选,共获得9株酿酒酵母菌。

将上述9株酿酒酵母菌在YEPD培养基中培养在30℃，检测生物量（湿重）和SOD产量（检测方法具体见实施例2）；经初步试验,发现其中5株酿酒酵母菌细胞生物量（湿重）和SOD产量均较高，见表2。

表2为细胞生物量（湿重）和SOD产量

将从上述5株酿酒酵母菌的发酵产物中提取的SOD酶（提取方法见实施例2），酶液浓缩到一定体积后，经过70℃加热处理后，酶液的剩余酶活（检测方法见实施例2），结果如表3所示。表3为SOD酶活

可以看出，TY-SC-2-2013.1.1剩余酶活最高，说明其耐高温。

二、耐热超氧化物歧化酶酿酒酵母菌株TY-SC-2-2013.1.1的鉴定

1、形态鉴定

上述一得到的TY-SC-2-2013.1.1在麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，细胞球形或卵形，大小为（3.6-7.2）×（3.6-7.2）μm。麦芽汁琼脂斜面25℃培养一个月，菌落奶酪状，乳白色，表面光滑，凸起明显，反光，边缘整齐。

2、生理生化鉴定

参照Barnett JA.的《酵母菌的特征与鉴定手册》，对上述一得到的TY-SC-2-2013.1.1进行生理生化鉴定结果如下：

表4TY-SC-2-2013.1.1对糖类的发酵情况：

注：“+”可以发酵，“-”不能发酵

表5TY-SC-2-2013.1.1碳源同化情况：

注:“+”利用，“-”不利用

表6TY-SC-2-2013.1.1氮源同化情况：

注:“+”利用，“-”不利用

由表4、5、6可知，所选菌株均可利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、棉籽糖和麦芽糖，均不利用鼠李糖、乳糖和核糖；碳、氮源同化结果也基本符合酿酒酵母的特征。

3、分子鉴定

提取TY-SC-2-2013.1.1的基因组DNA作为模板,以引物NL1(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')；NL4(5’-GGTCCGTGTTTCAAAGACGG-3')为引物，PCR扩增26SrDNA近5’端的D1/D2区域。

扩增反应条件：94°C:5min；94°C：45s;50°C：1min,72°C:1min：30个循环。72℃，lOmin延伸；用试剂盒纯化PCR产物，连接载体pMD19-T载体，转化到TRANS1大肠杆菌感受态细胞中，委托上海生物工程技术服务有限公司测序。该菌株26SrDNA近5’端的D1/D2区域的核苷酸序列为序列表中的序列1。

在GenBank数据库中进行Blast比对分析.该菌株26SrDNA近5’端的D1/D2区域测序结果在NCBI网站上进行序列同源性比对,比较得到该菌株的26SrDNA近5’端的D1/D2区域片段与酿酒酵母同源性最高,达到100%,结合上述形态特征和生理生化鉴定，最终确定该菌株为酿酒酵母。

TY-SC-2-2013.1.1菌株，分类命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），于2013年2月1日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），菌种保藏号为：CGMCCNo.7249。实施例2、耐热超氧化物歧化酶酿酒酵母菌株TY-SC-2-2013.1.1的应用

一、发酵条件研究单因子试验

1、发酵

分别进行不同碳源对菌株细胞生物量及产SOD的影响试验：

A、试剂如下：（1）、不含碳源的酵母培养基；（2）、不同碳源包括葡萄糖、麦芽糖、棉籽糖、蔗糖和淀粉。

备注：以上培养基成分均能够从商业途径获得。

B、发酵培养基配置

（1）将表4所示的不同的碳源均配置成40%的母液（溶剂为水，为质量百分含量），无菌虑灭，4℃冰箱储存备用。

（2）将不含碳源的酵母培养基（北京泛基诺科技有限公司，货号：YGM003A-3，产品名称为:Ura Minus Media）按8g/L配制（用水溶解），再加入Ura使体系中的终浓度为0.01%（质量百分含量），分别再添加上述（1）得到的不同碳源的40%的母液进行补加碳源，得到不同碳源的发酵培养基（酵母培养基），使不同碳源在对应的发酵培养基中的终浓度均为2%（质量百分含量）。

C、发酵

挑取实施例1分离到的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）TY-SC-2-2013.1.1菌株CGMCC No.7249单菌落，分别接种于5ml含有不同碳源的培养基中，30度培养24h，得到种子液；

再分别将种子液按1%的接种量转接于200ml的对应的含有不同碳源的培养基中，30℃培养48h，期间每隔12h补加一次对应碳源2%（使碳源在发酵体系中的质量百分含量终浓度为2%）；得到发酵产物。

2、生物量的测定、SOD的提取及酶活测定

1）生物量的测定

将1得到的发酵产物以810g的速度离心20min,收集菌体，蒸馏水洗涤2次,再次离心10min,收集沉淀酿酒酵母细胞，称量即为生物量。

2）SOD的提取及酶活测定

母液配制：

Na₂HPO₄·2H₂O Mr=178.05;0.2mol/L溶液为35.61g/L；

NaH₂PO₄·2H₂O Mr=156.03;0.2mol/L溶液为31.21g/L。

配置pH7.0浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲溶液：

A、先配置0.2mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，取61ml的0.2mol/L的Na₂HPO₄·2H₂O于39.0ml的0.2mol/L的NaH₂PO₄·2H₂O混合。配好后调整pH值pH7.0。

B、将配置好的0.2mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，取根据需求量稀释成50mmol/L的工作液。

以pH7.0浓度为50mmol/L的磷酸缓冲液重悬经过1）得到的酿酒酵母细胞，采用超声波破碎仪破碎（功率162.5W、超声时间30min；间接超声,间接超声是超2s，停3s，总共超声时间为30min。），2260g离心25min,收集上清液，即得到SOD酶。

SOD酶活测定的方法参考GB/T5009.171-2003中的超氧化物歧化酶活性的测定中的第一法，SOD酶活定义：25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需的SOD量为一个活力单位。

生物量和酶活结果如表7所示。

表7为不同碳源生物量和酶活结果

由表7可知,以棉籽糖为碳源时,菌株TY-SC-2-2013.1.1细胞生物量不是最大,但是其SOD总量最高,分别为5.7g/L和75.53U/L；其次为葡萄糖。以麦芽糖和淀粉为碳源时,细胞生物量和SOD总量都较小；菌株TY-SC-2-2013.1.1利用淀粉的能力最差,其SOD总量只有12.06U/L（上述酶活都是收集细胞破碎后，检测的酶活单位数，然后根据不同要求换算到每升发酵产物的含量）。

选择棉籽糖为菌株TY-SC-2-2013.1.1产SOD的适宜碳源。

二、菌株TY-SC-2-2013.1.1在制备超氧化物歧化酶中的应用

1、发酵

发酵培养基为棉籽糖为C源的发酵培养基，按照如下方法制备：向浓度为8g/L的不含碳源的酵母培养基中加入Ura和棉籽糖，用水补足体积，得到含有棉籽糖的发酵培养基，其中Ura在含有棉籽糖的发酵培养基中的终浓度为0.01%（质量百分含量），棉籽糖在含有棉籽糖的发酵培养基的终浓度为2%（质量百分含量）。

具体配置如下：

（1）将棉籽糖溶于水配置成40%（质量百分含量）的母液，无菌虑灭，4℃冰箱储存备用；（2）将不含碳源的酵母培养基按8g/L配制，得到基础培养基，再加入Ura使其终浓度为0.01%（质量百分含量），再加入40%的棉籽糖母液，得到发酵培养基（酵母培养基），使棉籽糖在发酵培养基中的终浓度为2%（质量百分含量）。

挑取实施例1分离到的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）TY-SC-2-2013.1.1菌株CGMCC No.7249接种于5ml棉籽糖为C源的发酵培养基中，30℃培养24h，得到种子液；

再将种子液按1%的接种量转接于200ml的棉籽糖为C源的发酵培养基中，30℃培养48h，期间每隔12h，补加一次棉籽糖（使棉籽糖在发酵体系中的质量百分含量终浓度为2%），收集发酵产物。

2、生物量的测定、SOD的提取及酶活测定

在上述发酵过程中，从8h开始,每隔2h取样,进行细胞生物量检测、SOD提取及酶活测定，方法同上述一的2。

结果如图1和图2所示，图1为菌株TY-SC-2-2013.1.1的生物量的结果，图2为菌株TY-SC-2-2013.1.1的SOD酶活结果；从图中看出，菌株TY-SC-2-2013.1.1在发酵36h后,进入对数生长末期,其细胞生物量基本稳定,SOD含量也基本达到顶峰；在发酵40h时,细胞生物量基本稳定为6.6g/L，SOD总量达到最大87.45U/L（发酵产物）；随着时间的延长,SOD总量在逐步减少。因此，以SOD总量为主要考虑因素,选定发酵时间为40h,以此时培养物来提取SOD。

三、菌株TY-SC-2-2013.1.1发酵得到的超氧化物歧化酶的部分酶学性质试验

1、发酵

将实施例1分离到的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）TY-SC-2-2013.1.1菌株CGMCC No.7249进行发酵，方法与上述二的1的方法基本相同，不同的是发酵时间为40小时，收集发酵产物。

按照上述一的2的方法从发酵产物中提取SOD。

2、温度稳定性

将上述1得到的SOD于100℃加热处理1h后，在不同的处理时间下检测SOD的剩余酶活，酶活检测方法同上述一的2。

结果如图3所示，以0min处理的酶液为100%，不同加热时间的相对酶活为99.47%、96.32%、92.63%、79.82%、77.89%、77.89%；

100℃加热处理0、10、20、30、40、50、60min后，SOD的剩余酶活分别为4384.62U/ml、4361.54U/ml、4223.08U/ml、4061.51U/ml、3500U/ml、3415.38U/ml、3415.38U/ml；

说明得到的SOD酶有很好的热稳定，在100℃水浴保温1h，仍保留77.89%的酶活性。此SOD酶是一种耐高温酶，具有化学催化剂无法比拟的优点,尤其是在高温条件下保持极好的稳定性,克服了中温酶(20℃～5℃)及低温酶(2℃～20℃)在应用过程中出现的化学性质不稳定现象,从而使很多高温化学反应得以实现,从而将极大地促进生物技术产业的发展。

3、常温存放酶活

将上述1得到的SOD进行冷冻干燥成固体，在常温（25℃）存放，在不同的时间下检测SOD的剩余酶活，检测方法同上述一的2。

结果如图4所示，以初始发酵提取浓缩后的SOD酶液的活性为100%，存放0、3、20、48、95、125、190、230天后，SOD的剩余酶活分别为18261U/g、17828U/g、16798U/g、15728U/g、15906U/g、15215U/g、16147U/g、16541U/g；

说明得到的SOD酶可以在常温保存，且仍具有很好的酶活。

4、pH值稳定性

将上述1得到的SOD配置好的一定浓度的酶液作为酶母液；再用表8所示的不同pH值的缓冲溶液稀释酶母液，得到反应液，使酶在反应液中的终浓度为2000U/ml。将反应液在室温（25℃）静置3h后，检测不同pH值下残留的SOD酶活性剩余多少。在不同pH值下检测SOD酶活，检测方法同上述一的2。

表8为不同pH缓冲液配置（具体配置请参考《生化试验方法和技术》中的附录4）

结果如图5所示，在pH值为2、2.4、3、3.4、4、4.4、5、5.4、6、6.4、7、7.4、8、8.2、9、10、11、12下，SOD的酶活分别为317.69U/ml、1275.89U/ml、1906.74U/ml、1915.23U/ml、2070.5U/ml、2060.75U/ml、2080.25U/ml、2070.25U/ml、2070.5U/ml、2070.5U/ml、2070.25U/ml、2065.5U/ml、2065.5U/ml、2070.25U/ml、2070.5U/ml、2070.25U/ml、2020.5U/ml、1930.25U/ml；

说明此SOD酶在pH值3-11之间有较为稳定的酶活性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变，修饰，替代，组合，简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的范围之内。

Claims

1.酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株TY-SC-2-2013.1.1，其保藏号为CGMCC No.7249，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.权利要求1所述的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株TY-SC-2-2013.1.1在制备SOD中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述SOD为耐高温酶。

4.一种制备SOD的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株TY-SC-2-2013.1.1，收集发酵产物，即得到SOD。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵中使用的培养基为酵母培养基，其中酵母培养基中的碳源为葡萄糖、麦芽糖、棉籽糖、蔗糖或淀粉；所述碳源在所述酵母培养基中的质量百分含量为2％。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述碳源为棉籽糖。

7.根据权利要求5-6中任一所述的方法，其特征在于：

所述发酵方式如下：30℃培养8-48h、且每隔12h，补加一次所述碳源，使所述碳源在发酵体系中的质量百分含量为1％-2％。

8.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：在收集发酵产物后，还包括如下步骤：将所述发酵产物依次经离心收集菌体沉淀、悬浮所述菌体沉淀得到悬浮液、破碎所述悬浮液、再次离心悬浮液收集上清液，得到SOD。