CN103421698B

CN103421698B - 木糖醇高温高产工程菌株的构建及应用

Info

Publication number: CN103421698B
Application number: CN201310399915.XA
Authority: CN
Inventors: 洪泂; 张佳
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2013-09-05
Filing date: 2013-09-05
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-09-05
Also published as: CN103421698A

Abstract

本发明通过基因工程的方法将不同来源的木糖还原酶基因在耐热酵母Kluyveromyces marxianus中高效表达，使该菌株通过木糖还原酶代谢路径在较高温度(＞42℃)下，能够高效地利用和发酵木糖大量生产木糖醇。本发明构建了能够利用木糖发酵的耐热工程酵母菌株YZJ015和YZJ017，其保藏号分别为CGMCC No.7819和7820。所述酵母菌株可以用于在42-45℃的温度下，利用不同的木糖浓度发酵以较高的产量和生产速率产生木糖醇。并且，本发明的YZJ017菌株(CGMCC No.7820)还可以利用甘油和木糖发酵产生木糖醇。

Description

木糖醇高温高产工程菌株的构建及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及通过工程菌改造来提高高温下利用木糖发酵生产木糖醇的领域。本发明构建了能够在较高温度下利用木糖发酵生产木糖醇且木糖醇生产速率大幅度提高的耐热工程酵母菌株。

背景技术

木糖醇是一种五碳多元醇，是木糖代谢的正常中间产物(Vandeska etal.，1996)。它被人体利用时不需要胰岛素的促进作用，在体内可促进胰岛素的少量分泌；用于静脉滴注时，血液中的丙酮酸、乳酸以及葡萄糖的含量会有所下降，肝糖元则有增加；无细胞毒性，可透过细胞膜成为组织的营养等。这些特性使得木糖醇具有重要的应用价值。另外，木糖醇作为甜味剂，口感清凉，而且可以预防龋齿；作为食品添加剂，可延长食品的保鲜期；木糖醇是糖尿病患者的理想的辅助治疗剂和营养甜味剂(Ahmad etal.，2011；Ghindea et al.，2010；Jeon et al.，2011；Ko et al.，2011；Kumar et al.，2009；Sasaki et al.，2010)。目前木糖醇的工业生产主要是化学加氢法，但该法工艺复杂、收率低、生产成本高，限制了木糖醇的大规模生产，并且对于食用来说不安全(Cheng et al.，2010)。通过微生物发酵法生产木糖醇则可以克服上述不足，因而受到重视。

木糖是半纤维素生物质水解的主要产物，是世界上第二富集的发酵原料(Zhang et al.，2011)。作为木质半纤维素水解产物中含量最多的五碳糖，木糖无疑是从可再生生物质中生产高附加值产品的关键(Sasaki et al.，2010)。

甘油是普遍的微生物代谢和石油化工的副产物(Chatzifragkou et al.，2011)。因此，甘油的生产过剩和处理在未来将变成很严重的环境问题(Andre et al.，2010)。另外，纯净的甘油具有很多用处，但是工业上从含有甘油的工业废水中纯化甘油成本很高(Chatzifragkou et al.，2011)。因此，利用未经纯化的甘油生产高附加值的产品将是一种环境友好型和经济型的策略(Chatzifragkou et al.，2011)。

采用耐热酵母K.marxianus(马克思克鲁维酵母)在高温下发酵有以下几个优点：1.高温下发酵可以降低发酵中的冷却费用；2.纤维素酶等的最适催化温度较高，高温会提高以淀粉、纤维素等生物质为原料的同步糖化发酵(SSF)效率，促进糖化，减少在酶上的费用(Fonseca et al.，2008)Zhang et al.，2013)；3.能在耐热范围内生存的微生物较少，因此，高温会降低污染的风险。(Kumar et al.，2009；Zhang et al.，2013)。除此之外，K.marxianus是一种GRAS(general regarding as safe)酵母，广泛的在乳制品、葡萄酒发酵制造中存在，对环境、动物及人类是安全的微生物。它能够在较高的温度下生长，最高达52℃，具有很高的生长速率(0.86-0.99h-1，40℃)(Banat and Marchant，1995)。K.marxianus有很高的代谢多样性，能利用多种工业上的底物糖类生长发酵。能利用多种廉价底物、耐热、高生长率等特点，使其被认为是替代酿酒酵母用来进行工业发酵和外源蛋白表达的候选者。由于K.marxianus有很多比酿酒酵母优秀的品质，K.marxianus被越来越多的用于生物能源的生产(Fonseca et al.，2008)。所以利用K.marxianus发展成木糖醇生产菌株有非常重要的应用价值。

已经有一些关于利用耐热酵母发酵木糖生产木糖醇的研究，其中，Mueller等利用K.marxianus IMB4菌株可以在40℃利用50g/L木糖生产34.64g/L木糖醇，但是需要144个小时，生产速率只有0.24g/L/h(Muelleret al.，2011)。Prakash等利用分离的耐热酵母Debaryomyces hansenii菌株，可以在40℃发酵100g/L木糖发酵产生68.6g/L木糖醇，发酵效率为0.69g/g，但是速率较低，仅为0.44g/L/h(Prakash et al.，2011)。另外，还有一些利用木糖在高温下发酵生产乙醇的研究，并且会产生木糖醇作为副产物，这些发酵中产生的木糖醇的浓度和效率更低一些(Kumar et al.，2009；Zhang et al.，2013)。以上的这些研究还没有充分发挥耐热酵母在高温下发酵木糖生产木糖醇的潜力，我们的研究大幅度提高了耐热酵母在高温下发酵木糖生产木糖醇，在生物转化木糖醇工业上有很巨大的应用前景。

发明内容

本发明通过在耐热酵母中高效表达木糖还原酶，构建了在较高温度(＞42℃)下能够利用和发酵木糖的高效生产木糖醇耐热酵母K.marxianus菌株；本发明对K.marxianus中的木糖还原酶基因(Xyl1)或者木糖醇脱氢酶基因(Xyl2)分别敲除，构建两个工程菌株，再将各种木糖还原酶在上述基因敲除的耐热酵母中表达，构建了对利用木糖生产木糖醇的能力大幅度改良，能够在较高温度下利用木糖大量生产木糖醇的耐热工程酵母菌株。

本发明最后用于通过木糖发酵产生木糖醇的应用菌株为YZJ015和YZJ017。其中，YZJ015菌株可直接利用木糖发酵生产木糖醇，YZJ017用于利用木糖和协同底物甘油或者葡萄糖发酵生产木糖醇。除此之外，本发明中的YZJ015还进行了不同接种OD梯度的发酵，以证明一定范围内高OD接种会提高木糖醇的生产速率；而YZJ015的菌体循环利用木糖生产木糖醇的发酵策略，有很高的生产速率，这样可重复利用菌体的发酵技术使本专利在应用到工业生产中后能节省大量的发酵时间，并且在短时间内具有很高的生产量，避免了准备发酵种子的时间与费用。上述两株耐热工程酵母菌株已于2013年06月25日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其对应的保藏号分别为CGMCCNo.7819(YZJ015菌株)和7820(YZJ017菌株)。

具体地，本发明包括以下内容：

1).一种能利用木糖发酵的耐热工程酵母菌株，所述菌株通过下述方法得到：以敲除了木糖还原酶基因或木糖醇脱氢酶基因的耐热酵母K.marxianus菌株作为宿主，并将各种不同的木糖还原酶在所述宿主中重组表达，筛选得到能够利用木糖在37℃到45℃温度下发酵产生木糖醇的耐热工程酵母菌株，所述能利用木糖发酵的耐热工程酵母菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7819和7820。

2).第一项所述的耐热工程酵母菌株，其中各种木糖还原酶的重组表达的出发载体为yEUGAP或yELGAP(由日本鹿儿岛大学的玉置尚德教授惠赠，目前保存在本发明人所在的实验室)。yEUGAP或yELGAP载体也可以按照下述方法制备。本发明中的各种质粒的构建方法如下：

(1)yEUGAP的构建：将P_ScGAPDH-T_ScGAPDH(SEQ ID No.25)用引物GAPDH-HIND-F(SEQ ID No.26)和TER-HIND-R(SEQ ID No.27)PCR扩增出来，用Hind III酶切，连接到YEplac195质粒(美国ATCC87589)的HindIII位点。

(2)yELGAP的构建：将P_ScGAPDH-T_ScGAPDH(SEQ ID No.25)用引物GAPDH-HIND-F(SEQ ID No.26)和TER-HIND-R(序歹27)PCR扩增出来，用Hind III酶切，连接到YEplac181(美国ATCC87588)质粒的Hind III位点。

(3)以脉孢霉74-OR23-1VA(Fungal Genetics Stock Center2489，美国密苏里大学卡萨斯分校生命科学学院)的基因组DNA为模板，使用PrimeSTARHS DNA聚合酶(大连宝生物)和NCXR-F1(SEQ ID No.1)和NCXR-R2(SEQ ID No.4)引物进行PCR扩增，得到的产物即为NcXR基因，并将基因转入pMD18-T载体(大连宝生物)中。由于NcXR基因具有内含子，因此，以pMD18-T-NcXR载体为模板，采用PrimeSTAR HS DNA聚合酶和NCXR-F1(SEQ ID No.1)，NCXR-R1(SEQ ID No.2)，NCXR-F2(SEQ IDNo.3)，NCXR-R2(SEQ ID No.4)引物将外显子基因分别PCR扩增，然后融合，得到NcXR的外显子基因融合片段，克隆到pMD18-T载体(大连宝生物)。以pMD18-T-NcXR-ORF质粒载体为模板扩增NcXR编码序列(SEQ ID No.20)，扩增产物NcXR编码序列与载体yEUGAP分别利用EcoR I和Not I进行双酶切，连接，将NcXR编码序列(SEQ ID No.20)插入到yEUGAP载体中，获得质粒pZJ002(即由启动子P_ScGAPDH(SEQ IDNo.23)(Hong et al.，2007)控制的NcXR表达质粒)(图2A)。

将启动子P_KmGAPDH(SEQ ID No.22)(Hong et al.，2007)从K.marxiarnusYHJ010的基因组DNA(Hong et al.，2007)中扩增出来，插入pMD18-T载体得到pMD18-T-P_KmGAPDH载体。然后，分别以pMD18-T-P_KmGAPDH载体和pZJ002质粒为模板对P_KmGAPDH基因与NcXR-T_ScGAPDH基因[T_ScGAPDH(SEQID No.24)(Hong et al.，2007)为酿酒酵母来源的终止子，载体白带基因]分别进行PCR扩增，融合，融合产物P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH(SEQ ID No.29)【NcXR的表达框(SEQ ID No.20)】与yEUGAP载体分别利用Hind III进行单酶切，连接，从而构建质粒pZJ005(即启动子P_KmGAPDH控制的NcXR表达质粒)(图2A)。

以质粒pPsXRPTUM1(由本发明人实验室构建，目前保存在本发明人所在的实验室，构建方法参见Zhang et al.，2013)(表达PsXRN272D突变体的质粒)为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)和PsXR-STUI-F(SEQ ID No.12)，PsXRUF-R(SEQ ID No.11)引物进行PCR扩增，得到的产物即为包含PsXR基因(SEQ ID No.19)但不包含P_ScGAPDH的pPsXRPTUM1质粒DNA。将P_KmGAPDH基因以pMD18-T-P_KmGAPDH载体为模板进行扩增，再将上面扩增的pPsXRPTUM1(不包括P_ScGAPDH)质粒DNA与P_KmGAPDH(SEQ ID No.22)基因连接，从而获得包含P_KmGAPDH(SEQID No.22)和PsXRN272D(SEQ ID No.19)基因的质粒，命名pZJ007(即P_KmGAPDH控制的PsXR表达质粒)(图2B)。

将终止子T_ScGAPDH，启动子P_KmGAPDH和NcXR基因分别以yEGAP载体(SEQ ID No.28)，pMD18-T-P_KmGAPDH载体，pMD18-T-NcXR载体为模板进行PCR扩增，融合，然后将融合产物T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR基因与pZJ002质粒分别利用Not I进行酶切，连接，从而构建质粒pZJ011(两个拷贝的NcXR基因表达质粒)(图2A)。

将P_ScGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因以pZJ011质粒为模板通过PCR扩增出来，然后将扩增产物P_ScGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因和yELGAP载体分别利用Hind III进行单酶切，连接，从而构建质粒pZJ012(另一个两个拷贝的NcXR基因表达质粒)(图2A)。

3).第一项所述的耐热工程酵母菌株，其中重组表达的各种木糖还原酶分别为树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木糖还原酶突变体(PsXRN272D)和脉孢霉木糖还原酶(NcXR)，其中脉孢霉的木糖还原酶又分为一个拷贝的，两个拷贝的和四个拷贝的。

4).第一项所述的耐热工程酵母菌株，其宿主为将K.marxiarnus YHJ010的XR基因(木糖还原酶基因，木糖代谢路径中的一个关键酶，敲除后菌株将丧失木糖还原的能力)或者XDH基因(木糖醇脱氢酶基因，木糖代谢路径中的另一个关键酶，敲除后菌株将丧失木糖醇利用的能力)分别敲除得到的菌株，所述宿主分别命名为YZB001和YUA005。

5).第1-4项中任一项所述的耐热工程酵母菌株，其中除了转入不同的木糖还原酶基因外，还尝试了采用不同启动子，即P_KmGAPDH和P_ScGAPDH启动子。

6).构建第1-4项中任一项所述的耐热工程酵母菌株的方法，所述方法包括以下步骤：

将含有酿酒酵母来源的启动子(P_ScGAPDH)(SEQ ID No.23)控制的脉孢霉的木糖还原酶基因(NcXR)的pZJ002重组载体，含有K.marxianus来源的启动子(P_KmGAPDH)控制的脉孢霉的木糖还原酶基因(NcXR)的pZJ005重组载体，含有K.marxianus来源的启动子(P_KmGAPDH)(SEQ ID No.22)毕赤酵母的木糖还原酶基因(PsXRN272D)的pZJ007重组载体，分别转化进K.marxianus酵母的XR基因敲除株(YZB001)中。所得到的转化菌株分别命名为：YZJ001，YZJ003，YZJ005；

将含有酿酒酵母来源的启动子(P_ScGAPDH)(SEQ ID No.23)控制的脉孢霉的木糖还原酶基因(NcXR)的pZJ002重组载体，含有K.marxianus来源的启动子(P_KmGAPDH)控制的脉孢霉的木糖还原酶基因(NcXR)的pZJ005重组载体，含有K.marxianus来源的启动子(P_KmGAPDH)毕赤酵母的木糖还原酶基因(PsXRN272D)的pZJ007，分别转化进K.marxianus酵母的XDH基因敲除株(YLUA005)中。分别命名为：YZJ006，YZJ007，YZJ008；

这样通过将含有木糖还原酶基因的耐热酵母表达载体转化到对应的宿主中，从而获得耐热工程酵母菌株(一个拷贝的XR基因)。

将这些菌株经过发酵，筛选出效果好的菌株，分别为YZJ003和YZJ007。然后对这两个菌株进行进一步的改造，改造的方法是构建分别将YZJ003，YZJ007一个拷贝的NcXR基因换成有两个拷贝的，四个拷贝的NcXR基因的菌株。具体操作：将含有两个拷贝的NcXR的质粒pZJ011分别转入YZB001和YLUA005宿主菌株，分别得到耐热工程酵母菌株：YZJ012，YZJ014。再将含有两个拷贝的NcXR的质粒pZJ012分别转入YZJ012，YZJ014，分别得到耐热工程酵母菌株：YZJ015，YZJ017。

7).第六项中的菌株YZJ015和YZJ017用于通过木糖发酵产生木糖醇的应用，其中，YZJ015菌株可直接利用木糖发酵生产木糖醇，YZJ017用于利用木糖和协同底物甘油或者葡萄糖发酵生产木糖醇。

另外，对YZJ015和YZJ017分别进行不同糖浓度条件下发酵和不同培养温度条件下发酵。

除此之外，本发明中的YZJ015还进行了不同接种OD梯度的发酵，以证明一定范围高OD接种会提高木糖醇的生产速率；菌体循环利用木糖生产木糖醇的发酵，重复利用菌体发酵的应用可以使本发明的菌株在应用到工业中后节省大量的发酵时间，并且在短时间内具有很高的生产量。

综上所述，本发明提供下述各项：

1.能够利用木糖发酵的耐热工程酵母菌株，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7819和7820。

2.根据第1项所述的耐热工程酵母菌株，其生长温度为37℃-45℃，优选42℃。

3.根据第1项所述的耐热工程酵母菌株，其中保藏号为CGMCC No.7819的耐热工程酵母菌株利用木糖发酵产生木糖醇，保藏号为CGMCC No.7820的耐热工程酵母菌株利用木糖与甘油的组合或木糖与葡萄糖的组合发酵产生木糖醇。

4.根据第1项所述的耐热工程酵母菌株，其中保藏号为CGMCC No.7819的耐热工程酵母菌株能够循环利用菌体对木糖发酵产生木糖醇。

5.根据第1项所述的耐热工程酵母菌株用于利用木糖发酵产生木糖醇的应用。

6.一种生产木糖醇的生物方法，所述方法包括：将保藏号为CGMCCNo.7819的耐热工程酵母菌种接种在含有木糖的培养基中，或将保藏号为CGMCC No.7820的耐热工程酵母菌种接种在含有木糖与甘油的组合或木糖与葡萄糖的组合的培养基中，在37℃-45℃温度下培养24h-180h。

7.根据第6项所述的方法，其中接种量为初始OD₆₀₀为0.5。

8.根据第6项所述的方法，其中保藏号为CGMCC No.7819的耐热工程酵母菌株的培养基中木糖的浓度为50g/L-200g/L。

9.根据第6项所述的方法，其中保藏号为CGMCC No.7820的耐热工程酵母菌株的培养基中木糖的浓度为50g/L-200g/L，并且还包含浓度为20g/L-40g/L的甘油或浓度为15g/L-20g/L的葡萄糖。

10.根据第6项所述的方法，其中所述耐热工程酵母菌的培养温度为37℃-45℃，优选42℃。

优点和积极效果

本发明中所得到的菌株YZJ015和YZJ017在高温条件下，可以很好的利用木糖生产木糖醇，有着比野生型耐热菌株更强的利用木糖生产木糖醇的能力。而酿酒酵母等在这个温度，已经不能正常生长和发酵。

同时，与目前现有的耐热酵母生产木糖醇的最好水平相比，如Prakash等利用分离的耐热酵母Debaryomyces hansenii菌株，仅可以在40℃条件下，发酵100g/L木糖发酵产生68.6g/L木糖醇，速率很低，仅为0.44g/L/h(Prakash et al.，2011)。Mueller等利用K.marxianus IMB4菌株仅在40℃条件下，利用50g/L木糖生产34.64g/L木糖醇，需要144个小时，生产率只有0.24g/L/h(Mueller et al.，2011)。本发明的YZJ015菌株，在42℃条件下，能在48h利用100g/L木糖生产71.46g/L木糖醇，生产速率为1.49g/L/h，生产率为0.83g/g；即使在45℃条件下，仍然可以在24h利用50g/L木糖生产35.59g/L木糖醇，生产速率为0.99g/L/h，生产率为0.78g/g。这比已报道的耐热酵母产量、速率都高很多。除此之外，本发明的菌株YZJ015，可以利用重复菌体发酵100g/L木糖，每16个小时可以生产平均71.35g/L的木糖醇，并且可以至少重复20次，生产速率高达4.43g/L/h，产率0.89g/g。本发明的YZJ017菌株，包含四个拷贝的NcXR基因和一个拷贝的KmXR基因，KmXDH基因被敲除。在42℃条件下，利用100g/L木糖和40g/L协同底物甘油发酵，在108h内可以生产100.02g/L木糖醇，可以达到98.70％的转化率。即使在高温45℃条件下，也可以利用50g/L木糖和20g/L协同底物甘油发酵，在48h内生产42.68g/L的木糖醇。

所以本发明的YZJ015和YZJ017菌株不仅在较高温度(＞42℃)条件下有利用木糖生产木糖醇的能力，而且比现有的耐热酵母生产木糖醇速率要快，产率要高。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1.本发明构建能利用木糖发酵的耐热工程酵母菌株的流程图；

图2.各种质粒的构建。NcXyll即NcXR的基因名称。pZJ011和pZJ012的差别是采用不同的营养缺陷型筛选标记，一个是ura3，一个是leu2；

图2A.质粒pZJ002，pZJ005，pZJ011，pZJ012的构建过程图；

图2B.质粒pZJ007的构建过程图；

图3.不同拷贝数的NcXR基因菌株的发酵结果比较(42℃，250rpm)。A图：YZJ003，YZJ012和YZJ015在42℃利用50g/L木糖发酵的结果(▲，木糖醇；●，木糖;...，YZJ003；---YZJ012；-YZJ015)；B图：YZJ006，YZJ014和YZJ017在42℃利用50g／L木糖和15g/L甘油发酵的结果(▲，木糖醇；●，木糖；◆，甘油；...，YZJ006；--YZJ014；-YZJ017)；

图4.出发菌株和工程菌株在50g/L木糖以及20g/L甘油加50g/L木糖的发酵生长曲线；

图4A.菌株YHJ010，YZB001，YLUA005，YZJ015，YZJ017在含有50g／L木糖的发酵培养基中的生长曲线；

图4B.菌株YHJ010，YZB001，YLUA005，YZJ015，YZJ017在含有20g/L甘油和50g/L木糖的发酵培养基中的生长曲线；

图5.YZJ017在42℃条件下，利用15g/L(A)和20g/L(B)葡萄糖做共培养底物发50g/L木糖的结果(▲，木糖醇；●，木糖；■，葡萄糖)；

图6.YZJ017在不同温度条件下，利用20g/L或40g/L甘油作为共发酵底物发酵50g/L或100g/L木糖的比较(▲，木糖醇；●，木糖；◆，甘油)；

A：YZJ017在37℃条件下，利用20g／L甘油作为共发酵底物发酵50g/L木糖；

B：YZJ017在42℃条件下，利用20g/L甘油作为共发酵底物发酵50g/L木糖；

C：YZJ017在45℃条件下，利用20g/L甘油作为共发酵底物发酵50g/L木糖；

D：YZJ017在42℃条件下，利用40g／L甘油作为共发酵底物发酵100g/L木糖；

图7.YZJ015在不同的接种浓度下的发酵情况(42℃，250rpm)。YZJ015在42℃以接种量为OD₆₀₀=0.5(A)，OD₆₀₀=1(B)，OD₆₀₀=2(C)和OD₆₀₀=3(D)，发酵50g/L木糖的结果(▲，木糖醇；●，木糖)；

图8.YZJ015在42℃利用不同糖浓度的生产木糖醇的发酵情况。YZJ015在42℃发酵100g/L木糖(A)，150g/L木糖(B)和200g/L木糖(C)的结果(▲，木糖醇；●，木糖)。

图9.YZJ015在37℃和45℃利用不同浓度木糖生产木糖醇的发酵情况。YZJ015在37℃，发酵50g／L木糖(A)，100g/L木糖(B)和150g/木糖(C)以及在45℃发酵50g／L木糖(D)，100g／L木糖(E)和150g／木糖(F)的结果(▲，木糖醇；●，木糖)；

图10.菌体循环利用木糖生产木糖醇的发酵结果(42℃，250rpm)。YZJ015在42℃用100g/L木糖回收细胞循环发酵的结果(▲，木糖醇；●，木糖)。

序列表说明

SEQ IDNos.1-18，26和27本发明所用的引物序列，序列参见表2和序列表

保藏说明

本发明的能利用木糖发酵的耐热工程酵母菌株马克思克鲁维酵母(K1uyveromyces marxianus)YZJ015和YZJ017已经于2013年06月25日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其对应的保藏号分别为CGMCC No.7819(YZJ015菌株)和7820(YZJ017菌株)。

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

试剂和菌株：本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上的试剂。其中，木糖，葡萄糖，甘油，酵母基本氮源，酪氨酸，亮氨酸，尿嘧啶，胶回收试剂盒以及所有的限制性内切酶均来源于上海生工生物工程公司。PrimeSTAR HS DNA聚合酶，Solution I连接酶以及pMD18-T载体购自于大连宝生物公司。大肠杆菌Escherichia coli XL10-gold菌株作为DNA操作时使用的宿主菌(美国加利福利亚Stratagene公司)，包含100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用作培养E.coli。木糖合成培养基(YNB木糖20g／L，酵母基本氮源6.7g／L，亮氨酸30mg／ml，尿嘧啶20mg／ml，酪氨酸20mg／ml)主要用于转化。质粒yEGAP(SEQ ID No.28)，yELGAP，yEUGAP由日本鹿儿岛大学的玉置尚德教授惠赠，目前保存在本发明人所在的实验室。YPD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)用于酵母的前培养。YPX(10g/L酵母提取物，20g／L细菌学蛋白胨，50g／L(或更高)木糖)用于发酵培养基。

实施例1.菌株的制备：

1.各种XR基因的获得：

1).NcXR基因(Woodyer et al.，2005)的获得：

提取脉孢霉74-OR23-1VA(购自Fungal Genetics Stock Center2489，美国密苏里大学生物科学学院，堪萨斯城)的基因组，并将提取的脉孢霉的基因组稀释100倍作为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)和NCXR-F1(SEQ ID No.1)，NCXR-R2(SEQ ID No.4)引物进行PCR，得到的产物即为含有内含子的NcXR基因(SEQ ID No.21)，并将该基因插入pMD18-T载体(大连宝生物)中。由于NcXR基因具有内含子，因此，以插入NcXR的T载体为模板，采用PrimeSTAR HS DNA聚合酶和NCXR-F1(SEQ ID No.1)，NCXR-R1(SEQ ID No.2)，NCXR-F2(SEQID No.3)，NCXR-R2(SEQ ID No.4)引物将外显子基因分别PCR，然后融合，得到NcXR的外显子基因融合片段，再次克隆到pMD18-T载体(大连宝生物)。

具体操作步骤为：

(1)首先，提取脉孢霉的基因组，其提取步骤为：

①.挑取单克隆，接入5ml液体YPD中，37℃，250rpm，培养24h。

②.常温下12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。

③.500μl蒸馏水重悬菌体，12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。

④.取200μl实验室自配的1x breaking缓冲液(TritonX-100(2％(w／v))，SDS(1％(w／v))，NaCl(100mM)，Tris-Cl(10mM，pH8.0)，EDTA(1mM))重悬菌体，并将菌液转入到含有0.3g玻璃珠(425-600um，sigma，美国)的EP管内。

⑤.加入200μl酚氯仿溶液后，高速震荡3min，加入200μl1x TE(10mMTris-Cl，pH8.0，1mM EDTA)。轻微震荡。

⑥.12000rpm，离心5min，取最上层清液转入新的EP管内，加入1ml预冷的无水乙醇。

⑦.12000rpm，4℃，离心10min，弃上清，室温下干燥沉淀，并用400μl1x TE重悬沉淀。

⑧.加入2μl RNase(RNA水解酶，中国上海生工生物)，2mg／ml)到EP管内，混匀，37℃，酶切1h。

⑨.取40μl3M醋酸钠(pH5.2)加入到管内，混匀并加入1ml预冷的无水乙醇。

⑩.12000rpm，4℃，离心30min，弃上清室温下干燥。用100μl无菌水重悬沉淀，此即酵母基因组DNA。

(2)从脉孢霉基因组DNA中扩增NcXR基因。将提取的脉孢霉的基因组DNA稀释100倍作为模板。使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)和NCXR-F1(SEQ ID No.1)，NCXR-R2(SEQ ID No.4)引物进行PCR扩增，得到的产物即为NcXR基因。

NcXR基因的PCR体系：

PCR程序

(3)得到NcXR基因后，在DNA末端加上“A”碱基后，将NcXR基因插入pMD18-T载体(购自大连宝生物)中。

①加A体系：

②TA克隆连接体系：

NcXR基因 0.3pmol

pMD18-T载体 0.03pmol

Solution I连接酶(大连宝生物) 5μl

16℃16h

(4)连接获得pMD18-T-NcXR质粒后，以此质粒为模板，采用PrimeSTARHS DNA聚合酶和NCXR-F1(SEQ ID No.1)，NCXR-R1(SEQ ID No.2)，NCXR-F2(SEQ ID No.3)，NCXR-R2(SEQ ID No.4)引物将NcXR外显子分别PCR，然后通过融合PCR进行融合。

①NcXR的外显子基因片段1的PCR体系：

PCR程序

②NcXR的外显子基因片段2的PCR体系：

PCR程序

③NcXR的外显子基因融合PCR体系：

PCR程序

(5)得到NcXR的外显子即编码序列(SEQ ID No.20)DNA融合片段后，将此NcXR的编码序列DNA的末端加“A”碱基后，插入pMD18-T载体(大连宝生物)中得到质粒pMD18-T-NcXR-ORF。

①加A体系：

②TA克隆连接体系：

NcXR基因 0.3pmol

pMD18-T载体 0.03pmol

Solution I连接酶(大连宝生物) 5μi

16℃16h

2)PsXR(SEQ ID No.19)基因的获得：

质粒pPSXRPTUM1(由本发明人实验室构建，目前保存在发明人实验室，具体构建方法参见Zhang et al.，2013)是将PsXR(SEQ ID No.19)基因通过EcoR I和Not I双酶切，然后插入YEGAP中，为PsXR(SEQ ID No.19)基因加上了启动子P_ScGAPDH和终止子T_ScGAPDH.然后将P_ScGAPDH-Psxyll-T_ScGAPDH部分扩增出来，插入到pKmURA3质粒的Stu I位点，得到质粒pPSXRPTU。再通过质粒pPSXRPTU做定点突变PCR，将Psxyll部分突变成Psxyl1(N272D)得到质粒pPSXRPTUM1。以质粒pPSXRPTUM1(构建方法参见Zhang et al.，2013)为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)和PSXR-STUI-F(SEQ ID No.12)，PSXRUF-R(SEQ ID No.11)引物进行PCR，得到的产物即为包含PsXR基因的pPSXRPTUM1片段(不包含P_ScGAPDH)。

pPSXRPTUM1片段(不包含P_ScGAPDH)的PCR体系：

PCR程序

2.构建本发明中的各种质粒载体：

1).以质粒pMD18-T-NcXR-ORF为模板扩增NcXR编码序列(SEQ ID No.20)，扩增产物NcXR编码序列与yEUGAP载体分别利用EcoR I和Not I进行双酶切，连接，将NcXR编码序列插入到yEUGAP载体中，获得质粒pZJ002。具体操作如下：

(1)以pMD18-T-NcXR-ORF质粒为模板扩增NcXR编码序列(SEQ ID No.20)的PCR体系：

PCR程序

(2)将扩增产物NcXR编码序列与yEUGAP载体分别利用EcoR I和Not I进行双酶切，连接，从而构建质粒pZJ002。

①NcXR基因的酶切体系：

②yEUGAP载体的酶切体系：

④将获得的插入了NcXR编码序列的yEUGAP质粒，命名为pZJ002(图2A)。

2).K.marxianus YHJ010(由本发明人构建，目前保存在本发明人所在的实验室，具体构建方法参见Hong et al.，2007)是耐热菌株K.marxianusNBRC1777的尿嘧啶、亮氨酸以及色氨酸的营养缺陷性菌株，通过将卡那霉素抗性基因插入到pKmURA3质粒的Hind III和Spe I位点，破坏ura3基因的序列。然后将质粒线性化后转化K.marxianus NBRC1777菌株，在含有卡那霉素的平板上筛选得到K.marxianus NBRC1777的ura3缺陷性菌株YHJ006。将HisG-KmURA3-HisG序列插入到质粒pKmLEU2质粒的Xbal I和BglII位点，然后线性化转化YHJ006在不含尿嘧啶的SD平板上筛选得到YHJ007。将YHJ007涂布到含有0.1％的5-氟-乳清酸的平板上筛选得到尿嘧啶和亮氨酸双缺陷的YHJ008菌株。将HisG-KmURA3-HisG序列插入到质粒pKmTRP1质粒的BglII和BspE I位点，然后线性化转化YHJ008在不含尿嘧啶的SD平板上筛选得到YHJ009。将YHJ009涂布到含有0.1％的5-氟-乳清酸的平板上筛选得到尿嘧啶，亮氨酸和色氨酸三缺陷的YHJ010菌株。

将启动子P_KmGAPDH(Hong et al.，2007)以K.marxianus YHJ010的基因组(Hong et al.，2007)为模板进行扩增，插入pMD18-T载体，获得pMD18-T-P_KmGAPDH质粒。然后分别以质粒pMD18-T-P_KmGAPDH和质粒pZJ002为模板对P_KmGAPDH基因与NcXR-T_ScGAPDH基因分别进行PCR扩增和融合，融合产物P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因与yEUGAP载体分别利用Hind III进行单酶切和连接，最后将连接产物P_KmGAPDH-NcXR-T_SCGAPDH基因转入yEUGAP载体中，从而构建质粒pZJ005。具体操作如下：

(1)将P_KmGAPDH(SEQ ID No.22)以YHJ010的基因组DNA为模板进行扩增，然后插入pMD18-T载体。

①P_KmGAPDH(SEQ ID No.22)基因的PCR体系：

PCR程序

②得到P_KmGAPDH基因后，将此P_KmGAPDH基因的末端加“A”碱基后，将P_KmGAPDH基因插入pMD18-T载体中。

加A体系：

(2)分别以pMD18-T-P_KmGAPDH载体和pZJ002质粒为模板对P_KmGAPDH基因与NcXR-T_ScGAPDH基因分别进行PCR扩增，融合。

①以pMD18-T-P_KmGAPDH载体为模板扩增P_KmGAPDH启动子的PCR体系：

PCR程序

②以pZJ002质粒为模板扩增NcXR-T_ScGAPDH基因的PCR体系：

PCR程序

③P_KmGAPDH与NcXR-T_ScGAPDH基因的融合体系：

PCR程序

(3)融合产物P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因与yEUGAP载体分别利用HindIII进行单酶切，连接，最后将连接产物P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因插入yEUGAP载体中，从而构建质粒pZJ005。

①P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因酶切体系：

②yEUGAP载体的酶切体系：

③P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因和yEUGAP载体的连接体系：

④将获得的插入了P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因的yEUGAP质粒，命名为pZJ005(图2A)。

3).将P_KmGAPDH以P_KmGAPDH-T载体为模板进行扩增，再将pPsXRPTUM1(不包括P_ScGAPDH)片段与P_KmGAPDH基因连接，从而获得包含P_KmGAPDH和PsXRN272D基因的质粒，命名质粒pZJ007。

①pPsXRPTUM1(不包括P_ScGAPDH)质粒与P_KmGAPDH基因的连接体系：

②将获得的插入了P_KmGAPDH基因而敲除了P_ScGAPDH基因的pPSXRPTUM1质粒，命名为pZJ007(图2B)。

4).将T_ScGAPDH基因，P_KmGAPDH基因，NcXR基因分别以yEGAP载体(SEQ IDNo.28)，pMD18-T-P_KmGAPDH载体，pMD18-T-NcXR-ORF载体为模板进行PCR扩增，融合，然后将融合产物T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR基因与pZJ002质粒分别利用Not I进行酶切，连接，最后将连接产物T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR基因转入pZJ002质粒中，从而构建质粒pZJ011。(1)将T_ScGAPDH基因，P_KmGAPDH基因，NcXR基因分别以yEGAP载体，pMD18-T-P_KmGAPDH载体，pMD18-T-NcXR-ORF载体为模板进行PCR扩增，融合。

①T_ScGAPDH基因(Hong et al.，2007)的PCR体系：

PCR程序

②P_KmGAPDH基因的PCR体系：

PCR程序

③NcXR基因的PCR体系：

PCR程序

④T_ScGAPDH基因，P_KmGAPDH基因与NcXR基因融合的PCR体系：

PCR程序

(2)将融合产物T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR基因与pZJ002质粒分别利用Not I进行酶切，连接，最后将连接产物T_ScGAPDH-P_KmGApDH-NCXR基因转入pZJ002质粒中，从而构建质粒pZJ011。

①T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR基因酶切体系：

②pZJ002质粒酶切体系：

③T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR基因和pZJ002质粒的连接体系：

④将获得的插入了T_ScGAPDH-P_KmGApDH-NCXR基因的pZJ002质粒，命名为pZJ011(图2A)。

5)将P_ScGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因以pZJ011质粒为模板通过PCR扩增出来，然后将扩增产物P_ScGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因和yELGAP载体分别利用Hind III进行单酶切，连接，最后将连接产物P_ScGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因转入yELGAP载体中，从而构建质pZJ012。

(1)将P_ScGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因以pZJ011质粒为模板通过PCR扩增出来。

P_ScGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因的PCR体系：

PCR程序

(2)将P_ScGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因和载体yELGAP分别利用Hind III进行单酶切酶切后，连接，最后将连接产物P_ScGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因转入yELGAP载体中，从而构建质粒pZJ012。

①P_ScGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因酶切体系：

②yELGAP酶切体系：

③P_ScGmDH-NcXR-T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因和yELGAP载体的连接体系：

④将获得的插入了P_ScGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH-P_KmGAPDH-NcXR-T_ScGAPDH基因的yELGAP质粒，命名为pZJ012(图2A)。

3.将构建的载体转入改造后的耐热酵母：

分别敲除了木糖还原酶基因(XR)或木糖醇脱氢酶(XDH)基因的YZB001和YLUA005宿主菌株的制备：

①YZB001菌株的构建：将trpl基因的完整表达框从yEGAP里PCR扩增出来，插入pET21XR的Sal I位点得到pET21XR-TRP。然后将包含trpl基因的整个XR基因片段用PCR扩增出来，转化YHJ010菌株，用含有尿嘧啶和亮氨酸的合成培养基平板筛选获得XR敲除的菌株(具体可参见Zhang et a1.，2011)。

②YLUA005菌株的构建：

将trpl基因的完整表达框从yEGAP里PCR扩增出来，插入XDH基因的EcoR I位点。然后将包含trpl基因的整个XDH基因片段用PCR扩增出来，转化YHJ010菌株，用含有尿嘧啶和亮氨酸的合成培养基平板筛选XDH敲除的菌株(具体可参见Lulu et al.，2013)。

1)酵母化学转化步骤：

①.各种改造菌株在YPD平板上划线，37℃培养24h。

②.取5ml液体YPD，并分别在YPD平板上挑取单克隆，37℃，250rpm，培养18h。

③.取1ml培养物转接与装入9ml液体YPD的50ml三角瓶内，37℃，250rpm，摇床培养5h。

④.取出培养物，常温下离心5000rpm，3min，弃上清液，保留菌体。

⑤.配制1ml转化缓冲液：800μl50％PEG4000；50μl4M醋酸锂；50μlddH2O；100μl1M DTT(溶于10mM醋酸钠，pH5.2)。

⑥.使用200μl转化缓冲液重悬菌体，5000rpm，离心3min，去上清。

⑦.用100μl转化缓冲液重悬浮菌体，加入5μl(1-10μg)线性化的质粒，轻微震荡30sec。

⑧.在47℃条件下水浴15min。

⑨.将菌体涂布于含有亮氨酸(Leu)或尿嘧啶(Ura)的合成培养基，37℃培养2天。

⑩.挑取板上克隆在液体YPD中培养，提取基因组，并通过PCR鉴定转化结果。

2)构建耐热酵母XR表达菌株的具体过程：

用Sma I酶切pZJ002载体。将酶切产物转化至YZB001和YLUA005宿主菌株中，同源重组后，使菌株获得ura3基因，恢复尿嘧啶的合成的能力，同时获得NcXR基因。在仅含有亮氨酸的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，亮氨酸30mg/ml，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，获得的菌株分别命名为YZJ001，YZJ006。

用Sma I酶切pZJ005载体。将酶切产物转化至YZB001和YLUA005宿主菌株中，同源重组后，使菌株获得ura3基因，恢复尿嘧啶的合成的能力，同时获得NcXR基因。在仅含有亮氨酸的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，亮氨酸30mg/ml，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，分别命名为YZJ003，YZJ007。

用Sma I酶切pZJ007载体。将酶切产物转化至YZB001，YRLUA005，同源重组后，将使菌株恢复ura3基因的功能，并新增PsXR的功能。在仅含有亮氨酸的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，亮氨酸30mg/ml，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，分别命名为YZJ005，YZJ008。

用Sma I酶切pZJ011载体。将酶切产物转化至YZB001，YLUA005，同源重组后，将使菌株恢复ura3基因的功能，并新增NcXR的功能。在仅含有亮氨酸的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，亮氨酸30mg/ml，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，分别命名为YZJ012，YZJ014。

用Sma I酶切pZJ012载体。将酶切产物转化至YZJ012，YZJ014，同源重组后，将使菌株恢复leu2基因的功能，并新增NcXR的功能。在仅含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，分别命名为YZJ015，YZJ017。

3)提取基因组，通过PCR鉴定酵母转化的阳性菌株。

(1)耐热酵母基因组提取步骤：

①.挑取单克隆，接入5ml液体YPD中，37℃，250rpm，培养24h。

②.常温下12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。

③.500μl蒸馏水重悬菌体，12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。

④.取200μl实验室自配lxbreaking缓冲液(TritonX-100(2％(w/v))，SDS(1％(w/v))，NaCl(100mM)，Tris-Cl(10mM，pH8.0)，EDTA(1mM))重悬菌体，并将菌液转入到含有0.3g玻璃珠(425-600um，sigma，美国)的EP管内。

⑥.12000rpm，5min，离心，取最上层清液转入新的EP管内，加入1ml预冷的无水乙醇。

⑦.12000rpm，4℃，离心10min，弃上清，室温下干燥沉淀，并用400μll x TE重悬沉淀。

⑧.加入2μl RNase(RNA水解酶，2mg/ml)到EP管内，混匀，37℃，酶切1h。

⑩.12000rpm，4℃，30min，离心，弃上清室温下干燥。用合适体积重悬沉淀，此即酵母基因组DNA。

(2)鉴定酵母转化的阳性菌株的PCR体系：

①包含NcXR的基因组的PCR体系：

PCR程序

②包含PsXR的基因组的PCR体系：

PCR程序

如上所述，分别以NcXR和PsXR基因的特异性引物作为引物，以基因组为模板，PCR扩增后，能特异性的扩增出NcXR(969bp)和PsXR(957bp)基因条带的菌株，即为阳性菌株，并进行下一步实验。

实施例2.含有不同启动子和XR基因的菌株在合成培养基下的发酵情况

该实施例用于比较不同XR基因和不同启动子对于生产木糖醇的效果。结果表明NcXR基因生产木糖醇的效果比PsXR的效果好，启动子P_ScGAPDH和P_KmGAPDH影响不大，但是采用P_KmGAPDH效果稍好。

1.在YPD培养基平板上复苏菌株。对照株：YZB001，YLUA005。实验株：YZJ001，YZJ003，YZJ005，YZJ006，YZJ007，YZJ008。37℃培养1天。

2.分别挑取单克隆，接于5ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。

3.配制39瓶50ml木糖合成培养基分装于250ml锥形三角瓶。配方：50g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨，10g/L甘油。灭菌待用。

4.取适量过夜培养物接入50ml木糖合成培养基中，使他们的初始OD₆₀₀达到0.5，42℃，250rpm培养。

6.在0h，6h，12h，24h，48h，72h取样，并取上清通过HPLC检测分析(表1)。

7.从表1可知，在木糖合成培养基的培养条件下，含有P_KmGAPDH的菌株利用木糖生产木糖醇的效果会比含有P_ScGAPDH的菌株效果好一点(表1)。其中，YZJ003(包含NcXR-P_KmGAPDH)的木糖醇产量为31.17g/L，生产速率为0.87g/L／h，YZJ001(包含NcXR-P_ScGAPDH)的木糖醇产量为29.99g/L，生产速率为0.83g/L／h。YZJ007(包含NcXR-P_KmGAPDH)的木糖醇产量为26.41g/L，生产速率为0.55g/L／h，YZJ006(包含NcXR-P_ScGAPDH)的木糖醇产量为26.37g／L，生产速率为0.51g／L／h。

另外，含有NcXR的菌株利用木糖生产木糖醇的效果比含有PsXR的菌株效果好(表1)。其中，YZJ003(包含NcXR-P_KmGAPDH)的木糖醇产量为31.17g/L，生产速率为0.87g／L／h，YZJ005(包含PsXR-P_KmGAPDH)的木糖醇产量为0.31g/L，生产速率仅为0.01g／L／h。YZJ007(包含NcXR-P_KmGAPDH)的木糖醇产量为26.41g/L，生产速率为0.55g/L／h，YZJ008(包含PsXR-P_KmGAPDH)的木糖醇产量为24.45g/L，生产速率为0.55g/L／h。

表1各种单拷贝XR基因的木糖发酵比较

表1.YZB001，YZJ001，YZJ003，YZJ005在42℃条件下，利用50g／L木糖，YLUA005，YZJ006，YZJ007，YZJ008在42℃条件下，利用10g/L的甘油作为协同底物发酵50g/L木糖的结果。

实施例3.含有不同拷贝的NcXR基因的菌株在42℃下的发酵情况

该实施例用于了解含有不同拷贝的NcXR基因的菌株在高温(42℃)条件下，它的发酵情况与含有一个拷贝数的NcXR基因的菌株的发酵情况的比较，结果证明增加NcXR拷贝能够使发酵能力提高。

1.在YPD培养基平板上复苏菌株。对照株：YZJ003，YZJ007。实验株：YZJ012，YZJ014，YZJ015，YZJ017。37℃培养1天。

3.配制27瓶30ml木糖合成培养基分装于250ml锥形三角瓶。配方：50g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨，15g／L甘油50g/L木糖，15g/L甘油，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨，15g/L甘油。

4.取适量菌体接入30ml YPX培养瓶中，使他们的初始OD₆₀₀达到0.5，42℃，250rpm培养。

5.在0h，6h，12h，24h，48h，72h，96h取样通过HPLC检测分析。(图3)

6.从图3可知，在42℃营养培养基条件下，

YZJ003的木糖醇产量为32.52g／L，生产速率为1.35g／L／h，

YZJ007的木糖醇产量为34.68g／L，生产速率为0.72g／L／h，

YZJ012的木糖醇产量为34.31g／L，生产速率为1.43g／L／h，

YZJ014的木糖醇产量为37.25g／L，生产速率为0.78g／L／h，

YZJ015的木糖醇产量为35.60g／L，生产速率为1.48g／L／h，

YZJ017的木糖醇产量为42.85g／L，生产速率为0.89g／L／h。

结果说明含有四个拷贝数的NcXR基因的YZJ015和YZJ017比含有一个拷贝数的NcXR基因的YZJ003和YZJ006和含有两个拷贝数的NcXR基因的YZJ012和YZJ014利用木糖生产木糖醇的结果要好。

因此，本发明人于2013年06月25日将YZJ015和YZJ017菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其对应的保藏号分别为CGMCC No.7819(YZJ015菌株)和7820(YZJ017菌株)。在后续的实验中，进一步鉴定了这两个菌株的发酵能力和培养条件。

实施例4.原始菌株和工程菌株在42℃下利用含有50g／L木糖以及20g／L甘油或50g／L木糖的发酵培养基的生长情况

该实施例用于了解菌株YHJ010，YZB001，YLUA005，YZJ015，YZJ017在42℃条件下，它在利用木糖培养基以及甘油加木糖培养基的条件下各个菌株的生长能力。

1.在YPD培养基平板上复苏菌株YHJ010，YZB001，YLUA005，YZJ015，YZJ017，37℃培养1天。

3.配制15瓶30ml50g/L木糖培养基以及20g/L甘油加50g/L木糖培养基分装于250ml锥形三角瓶。

培养基配方如下：

木糖培养基：50g/L木糖，10g／L酵母提取物，20g／L细菌学蛋白胨；

木糖甘油培养基：50g／L木糖，10g/L酵母提取物，20g／L细菌学蛋白胨，20g／L甘油；用于培养YHJ010，YZB001，YLUA005，YZJ015，YZJ017。

4.取适量菌体接入30ml木糖合成培养基培养瓶中，使它们的初始OD₆₀₀达到0.5，42℃，250rpm培养。

5.定时取样通过分光光度计检测分析(图4)。

6.从图4可知，菌株YHJ010和YZJ015能利用50g／L木糖培养基生长，YZJ015生长的更好。YZB001，YLUA005，YZJ017则不能利用木糖培养基生长；

利用20g/L甘油和50g/L木糖共培养，YHJ010，YZB001，YLUA005，YZJ015，YZJ017均能生长，但是YZJ017生长的更好，原因是YZJ017和YHJ010能利用木糖生长，在有木糖和甘油同事存在时优先使用木糖，其他菌株只能利用甘油生长，生长情况稍差。

结果说明本发明的菌株YZJ015在木糖以及甘油和木糖的共培养基的条件下，生长情况较好，所有菌株均能利用甘油生长。

实施例5.YZJ017利用不同的糖的浓度的发酵情况

该实施例用于了解实验菌株YZJ017在42℃条件下，它在利用不同糖浓度的培养基的条件下，生产木糖醇的能力。

1.在YPD培养基平板上复苏实验菌株YZJ017，37℃培养1天。

3.配制18瓶30ml木糖合成培养基分装于250ml锥形三角瓶。配方：

50g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨，15g／L葡萄糖；

50g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨，20g／L葡萄糖；

用于培养YZJ017。

5.定时取样通过HPLC检测分析(图5)。

6.从图5可知，实验菌株YZJ017在42℃条件下，

利用15g/L葡萄糖和50g／L木糖共培养，木糖醇产量为42.85g／L，生产速率为0.89g／L／h；

利用20g/L葡萄糖和50g／L木糖共培养，木糖醇产量为50.13g／L，生产速率为1.04g／L／h。

结果说明本发明的菌株YZJ017在葡萄糖和木糖的共培养基的条件下，在尽可能降低葡萄糖的含量的情况下，利用20g／L葡萄糖和50g／L木糖共培养比利用15g/L葡萄糖和50g/L木糖共培养的效果更好。

实施例6.在37℃，42℃和45℃条件下，YZJ017利用20g／L甘油和50g／L木糖共培养的发酵情况以及在42℃条件下，YZJ017利用40g／L甘油和100g／L木糖共培养的发酵情况

该实施例用于了解实验菌株YZJ017在37℃，42℃和45℃条件下，它在20g／L甘油和50g／L木糖共培养的条件下生产木糖醇的能力。另外，在42℃条件下，YZJ017利用更高糖浓度40g/L甘油和100g/L木糖共培养生产木糖醇的能力。

1.在YPD培养基平板上复苏实验菌株YZJ017，37℃培养1天。

3.配制6瓶30ml木糖合成培养基分装于250ml锥形三角瓶。

配方：50g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨，20g/L甘油；

100g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨，40g/L甘油。

4.取适量菌体接入30ml木糖合成培养基培养瓶中，使他们的初始OD₆₀₀达到0.5，42℃，250rpm培养。

5.定时取样通过HPLC检测分析(图6)。

6.从图6可知，实验菌株YZJ017在37℃，42℃和45℃条件下，利用20g／L甘油和50g／L木糖共培养的发酵情况，在42℃条件下的发酵结果(木糖醇产量为50.13g/L，生产速率为1.04g/L／h)并没有比在37℃条件下的发酵结果(木糖醇产量为48.45g／L，生产速率为1.01g／L／h)差，反而会更好一点。实验菌株YZJ017在45℃条件下的发酵结果(木糖醇产量为42.68g/L，生产速率为0.89g/L／h)，它们在木糖培养基下也能够生产木糖醇，但结果会比42℃的发酵结果差。

上述结果证明，本发明的菌株YZJ017在42℃条件下的发酵结果最好。并且从结果可以看出，利用甘油和木糖共培养本发明的菌株YZJ017，转化率可达98.93％。另外，本发明的菌株YZJ017，可以利用更高的糖浓度40g/L甘油和100g/L木糖共培养，在42℃条件下，木糖醇产量为100.02g／L，生产速率为0.93g／L／h，转化率可达98.70％。

实施例7.利用不同的前培养接种量来发酵YZJ0155的发酵情况

该实施例用于了解YZJ015在高温(42℃)条件下，在不同的接种OD的情况下生产木糖醇的效果。

1.在YPD培养基平板上复苏实验菌株YZJ015，37℃培养1天。

2.挑取单克隆，接于5ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。

3.配制12瓶30ml木糖合成培养基分装于250ml锥形三角瓶。配方：50g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨。

4.取适量菌体接入30ml木糖合成培养基培养瓶中，使他们的初始OD₆₀₀分别达到0.5，1，2，3.然后在42℃，250rpm培养。

5.定时取样通过HPLC检测分析(图7)。

6.从图7可知，实验菌株YZJ015在高温(42℃)条件下，在接种OD₆₀₀为0.5时，YZJ015利用木糖生产木糖醇的木糖醇产量和生产速率分别为33.63g/L，1.40g/L／h。在接种OD₆₀₀为1时，YZJ015利用木糖生产木糖醇的木糖醇产量和生产速率分别为35.28g/L，1.68g／L／h。在接种OD₆₀₀为2时，YZJ015利用木糖生产木糖醇的木糖醇产量和生产速率分别为34.77g/L，1.93g/L／h。在接种OD₆₀₀为3时，YZJ015利用木糖生产木糖醇的木糖醇产量和生产速率分别为34.98g/L，2.33g/L／h。

实验结果证明，在不同的接种OD条件下，本发明中的菌株YZJ015利用木糖合成培养基能够生产木糖醇，并且随着接种OD的增加，发酵的速率有所提高。

实施例8.四个拷贝的NcXR基因的YZJ0155在42℃条件下利用不同的木糖浓度的发酵情况

该实施例用于了解YZJ015在42℃条件下利用不同的木糖浓度的发酵情况，结果表明本发明的YZJ015可以利用不同木糖浓度进行发酵，甚至可以利用高浓度木糖达到200g／L。并且在低浓度木糖的条件下具有很高的发酵速率。

1.在YPD培养基平板上复苏实验菌株YZJ015，37℃培养1天。

2.挑取单克隆，接于5ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。

3.配制9瓶30ml木糖合成培养基分装于250ml锥形三角瓶。配方：

100g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨。

150g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨。

200g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨。

4.取适量菌体接入30ml木糖合成培养基培养瓶中，使他们的初始OD₆₀₀分别达到0.5.42℃，250rpm培养。

5.定时取样通过HPLC检测分析(图8)。

6.从图8可知，实验菌株YZJ015在高温(42℃)条件下，利用100g／L的木糖合成培养基发酵生产木糖醇，木糖醇产量和生产速率分别为71.46g/L，1.49g／L／h。利用150g/L的木糖合成培养基发酵生产木糖醇，木糖醇产量和生产速率分别为103.75g/L，1.24g/L／h。利用200g/L的木糖合成培养基发酵生产木糖醇，木糖醇产量和生产速率分别为132.31g／L，0.92g/L／h。

实验结果表明本发明的YZJ015可以利用高达150g／L的木糖甚至200g/L的木糖发酵生产木糖醇。并且在木糖浓度为100g/L的条件下具有很高的发酵速率。

实施例9.含有四个拷贝的NcXR基因的YZJ015菌株在37℃和45℃条件下利用不同的糖浓度的发酵情况

该实施例用于了解YZJ015在37℃和45℃条件下利用不同的糖浓度的发酵情况，结果表明本发明的YZJ015在不同温度条件下，可以利用不同的木糖浓度进行发酵。

1.在YPD培养基平板上复苏实验菌株YZJ015，37℃培养1天。

2.挑取单克隆，接于5ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。

3.配制18瓶30ml木糖合成培养基分装于250ml锥形三角瓶。配方：

50g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨。

100g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨。150g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨。

4.取适量菌体接入30ml木糖合成培养基培养瓶中，使他们的初始OD₆₀₀分别达到0.5，42℃，250rpm培养。

5.定时取样通过HPLC检测分析(图9)。

6.从图9可知，实验菌株YZJ015能够在37℃和45℃条件下，利用不同木糖浓度进行发酵。其中，在37℃条件下，YZJ015利用50g／L的木糖生产木糖醇的木糖醇产量和生产速率分别34.71g／L，1.45g／L／h；利用100g/L的木糖生产木糖醇的木糖醇产量和生产速率分别69.16g/L，1.44g/L／h；利用150g／L的木糖生产木糖醇的木糖醇产量和生产速率分别108.68g／L，0.91g/L／h。在45℃条件下，YZJ015利用50g/L的木糖生产木糖醇的木糖醇产量和生产速率分别35.59g/L，0.99g/L／h；利用100g／L的木糖生产木糖醇的木糖醇产量和生产速率分别60.03g/L，1.25g/L／h；利用150g/L的木糖生产木糖醇的木糖醇产量和生产速率分别50.88g／L，1.06g／L／h。

结果表明，本发明的YZJ015在高温度42℃条件下能够获得最好的发酵，并达到很高的发酵速率(1.49g／L／h)。

实施例10.菌体循环利用木糖生产木糖醇

该实施例用于了解循环利用菌体YZJ015来利用木糖发酵生产木塘醇的效果。结果表明本发明的YZJ015可以重复回收菌体循环利用木糖生产木糖醇，并且发酵速率很高，高达4.43g／L／h。

1.在YPD培养基平板上复苏实验菌株YZJ015，37℃培养1天。

3.配制6瓶30ml木糖合成培养基分装于250ml锥形三角瓶。配方：50g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨。

100g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨。

5.每轮发酵完成后5000×g离心10min回收菌体，重悬到新的培养液中，继续发酵。

6.定时取样通过HPLC检测分析(图10)。

7.从图10可知，实验菌株YZJ015在高温(42℃)条件下，可以利用回收的菌体来利用木糖生产木糖醇。本发明的菌株YZJ015，可以利用重复菌体发酵100g／L木糖，每16个小时可以分别生产平均71.35g／L的木糖醇，并且可以至少重复20次，生产速率高达4.43g/L／h，产率0.89g/g。

实验结果表明，本发明的菌株YZJ015可以重复利用菌体发酵，发酵速率非常高，可以使本专利在应用到工业中后节省大量的发酵时间，并且在短时间内具有很高的生产量。

表2.本发明中所用的引物序列

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

参考文献：

1.Ahmad，I.，Shim，W.Y.，Jeon，W.Y.，Yoon，B.H.，Kim，J.H.，2011.Enhancement of xylitol production in Candida tropicalis by co-expression oftwo genes involved in pentose phosphate pathway.Bioprocess Biosyst Eng.

2.Andre，A.，Diamantopoulou，P.，Philippoussis，A.，Sarris，D.，Komaitis，M.，Papanikolaou，S.，2010.Biotechnological conversions of bio-diesel derivedwaste glycerol into added-value compounds by higher fungi：production ofbiomass，single cell oil and oxalic acid.Industrial Crops and Products，31，407-416.

3.Banat，I.M.，Marchant，R.，1995.Characterization and Potential IndustrialApplications of5Novel，Thermotolerant，Fermentative，Yeast Strains.WorldJournal of Microbiology&Biotechnology,11，304-306.

4.Chatzifragkou，A.，Makri，A.，Belka，A.，Bellou，S.，Mavrou，M.，Mastoridou，M.，Mystrioti，P.，Onjaro，G.，Aggelis，G.，Papanikolaou，S.，2011.Biotechnological conversions of biodiesel derived waste glycerol by yeast andfungal species.Energy,36,1097-1108.

5.Cheng，K.K.，Zhang，J.A.，Chavez，E.，Li，J.P.，2010.Integrated productionof xylitol and ethanol using corncob.Applied Microbiology and Biotechnology，87,411-417.

6.Fonseca，G.G.，Heinzle，E.，Wittmann，C.，Gombert，A.K.，2008.The yeastKluyveromyces marxianus and its biotechnological potential.AppliedMicrobiology and Biotechnology，79，339-354.

7.Ghindea，R.，Csutak，O.，Stoica，I.，Tanase，A.M.，Vassu，T.，2010.Production of xylitol by yeasts.Romanian Biotechnological Letters，15，5217-5222.

8.Hong，J.，Wang，Y.，Kumagai，H.，Tamaki，H.，2007.Construction ofthermotolerant yeast expressing thermostable cellulase genes.J Biotechnol，130,114-23.

9.Jeon，W.Y.，Yoon，B.H.，Ko，B.S.，Shim，W.Y.，Kim，J.H.，2011.Xylitolproduction is increased by expression of codon-optimized Neurospora crassaxylose reductase gene in Candida tropicalis.Bioprocess Biosyst Eng.

10.Ko，B.S.，Kim，D.M.，Yoon，B.H.，Bai，S.，Lee，H.Y.，Kim，J.H.，Kim，I.C.，2011.Enhancement of xylitol production by attenuation of intracellular xylitoldehydrogenase actiVity in Candida tropicalis.Biotechnol Lett，33，1209-13.

11.Kumar，S.，Singh，S.P.，Mishra，I.M.，Adhikari，D.K.，2009.Ethanol andxylitol production from glucose and xylose at high temperature byKluyveromyces sp IIPE453.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology，36，1483-1489.

12.Mueller，M.，Wilkins，M.，Banat，I.M.，2011.Production of Xylitol by theThermotolerant Kluyveromyces marxianus IMB Strains.Journal ofBioprocessing&Biotechniques，1，2.

13.Prakash，G.，Varma，A.J.，Prabhune，A.，Shouche，Y.，Rao，M.，2011.Microbial production of xylitol from D-xylose and sugarcane bagassehemicellulose using newly isolated thermotolerant yeast Debaryomyceshansenii.Bioresource Technology，102，3304-3308.

14.Sasaki，M.，Jojima，T.，Inui，M.，Yukawa，H.，2010.Xylitol production byrecombinant Corynebacterium glutamicum under oxygen deprivation.ApplMicrobiol Biotechno1,86,1057-66.

15.Vandeska，E.，Amartey，S.，Kuzmanova，S.，Jeffries，T.W.，1996.Fed-batchculture for xylitol production by Candida boidinii.Process Biochemistry，31，265-270.

16.Woodyer，R.，Simurdiak，M.，van der Donk，W.A.，Zhao，H.，2005.Heterologous expression，purification，and characterization of a highly activexylose reductase from Neurospora crassa.Appl Environ Microbiol，71，1642-7.

17.Zhang，B.，Zhang，L.，Wang，D.，Gao，X.，Hong，J.，2011.Identification of axylose reductase gene in the xylose metabolic pathway of Kluyveromycesmarxianus NBRC1777.J Ind Microbiol Biotechnol，38，2001-10.

18.Zhang，B.，Li，L.L.，Zhang，J.，Gao，X.L.，Wang，D.M.，Hong，J.，2013.Improving ethanol and xylitol fermentation at elevated temperature throughsubstitution of xylose reductase in Kluyveromyces marxianus.Journal ofIndustrial Microbiology&Biotechnology，40，305-316.

19.Lulu，L，Ling，Z.，Dongmei，W.，Xiaolian，G.，Hisanori，T.，Hidehiko，K.，Jiong，H.，2013.Identification of a Xylitol Dehydrogenase Gene fromKluyveromyces marxianus NBRC1777.Mol.Biotechnol.，53,159-69.

Claims

1.能够利用木糖发酵的耐热工程马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)菌株YZJ015，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7819。

2.根据权利要求1所述的耐热工程马克思克鲁维酵母菌株YZJ015用于利用木糖发酵产生木糖醇的应用。

3.一种生产木糖醇的生物方法，所述方法包括：将保藏号为CGMCCNo.7819的耐热工程马克思克鲁维酵母菌株YZJ015接种在含有木糖的培养基中，在37℃-45℃温度下培养24h-180h。

4.根据权利要求3所述的方法，其中接种量为初始OD₆₀₀为0.5。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述培养基中木糖的浓度为50g/L-200g/L。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述耐热工程酵母菌的培养温度为42℃。