CN106318879B - 丙酮酸高温高产工程菌株及其应用 - Google Patents

丙酮酸高温高产工程菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明以耐热性马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)为平台，利用基因工程、代谢工程、分子生物学以及合成生物学的方法，构建一株丙酮酸脱羧酶和甘油‑3‑磷酸脱氢酶敲除的菌株，通过代谢调控恢复其生长从而提高丙酮酸的产率和生产速率，然后进一步提高菌株的木糖代谢能力，使其具备利用木糖生产丙酮酸的能力。最终解除工程菌株的葡萄糖效应，从而使工程菌株具备在高温下同时糖化木质纤维素和共利用葡萄糖和木糖并且共发酵生产丙酮酸。本发明获得的马克思克鲁维酵母菌株YZB058可以同时共利用葡萄糖和木糖在较高温度(42℃)下，生产丙酮酸。在42℃条件下，YZB058能够同时共利用40.97g/l葡萄糖和20.37g/l木糖在36h生产29.21g/l丙酮酸，其生产速率为0.81g/l/h，总得率为0.48g/g。

Description

丙酮酸高温高产工程菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物代谢工程，糖代谢和共利用以及微生物发酵生产丙酮酸的领域。具体地说，本发明提供了能够在较高温度下(42℃)同时共利用葡萄糖和木糖共发酵生产丙酮酸的耐热工程酵母。
背景技术
丙酮酸的合成方法主要包括化学合成法、酶转化法和发酵法。化学合成法通过在液相或气相中将乳酸酯(或酒石酸)氧化为丙酮酸酯，然后水解成丙酮酸，是目前丙酮酸生产的主要方法，已实现了工业化生产。但是化学合成法存在污染严重、成本高等比较明显的缺点(Causey et al.,2004)。
酶法合成丙酮酸由于具有反应混合物组成简单、高底物转化率、产品纯度高、后续分离提取费用低廉和操作简单等优点而成为生物技术法生产丙酮酸研究中的另一个热点。可用于酶法生产丙酮酸的底物有乳酸、酒石酸、富马酸、丙二醇等。酶法虽然具有较高的转化率，但底物成本比较高、来源较窄，限制了其进一步推广应用(Causey et al.,2004；Xuet al.,2008)。
发酵法生产丙酮酸包括直接利用微生物中的一系列酶(如EMP途径酶系)完成由底物(如葡萄糖)积累丙酮酸的直接发酵法(fermentative method)和利用微生物中某一种特定功能的酶完成由底物向丙酮酸的转化(即微生物先生长，再转化底物为丙酮酸)的休止细胞法(resting cell method)。采用休止细胞法生产丙酮酸的主要优点是可缩短发酵时间。但丙酮酸产量略低于直接发酵法，且操作繁琐，容易染菌，因此不太可能在工业生产中得到应用(Causey et al.,2004；Xu et al.,2008)。
发酵法是生物技术法生产丙酮酸中开展得最早的、也是研究得最多最深入的生产方法。但发酵法生产丙酮酸的问题是转化率比较低，这是因为丙酮酸作为糖酵解途径的最终产物，处于代谢途径中的关键代谢支点，在细胞中很容易代谢为其它产物，难以积累。只有切断或弱化丙酮酸的进一步代谢，才能达到使其在细胞中积累并分泌到胞外的目的(Causey et al.,2004；Wang et al.,2005)。
比较丙酮酸的各种生产方法可以发现，发酵法生产丙酮酸无疑是扩大丙酮酸应用领域的根本途径。
能够以糖质原料发酵生产丙酮酸的微生物包括细菌、放线菌和酵母。在酵母中研究的菌株有假丝酵母(Candida)、球拟酵母(Torulopsis)、德巴利酵母(Debaryomyces)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。Torulopsis是研究得最多的、也是目前工业化生产上所用的菌株。从耐高渗环境中筛选出来的Torulopsis在一般培养条件下，对葡萄糖的丙酮酸产率比较低(0.41g/g)。对该菌株进行诱变，增加一系列遗传标记如L-缬氨酸和L-异亮氨酸营养缺陷型、丙酮酸脱羧酶活性降低菌株等，丙酮酸产率提高到了0.54g/g。除了Torulopsis之外，Debaryomyces(42g/L)和Saccharomyces cerevisiae(36.9g/L)积累丙酮酸的能力也不弱，其产率(0.37-0.44g/g)虽然不及Torulopsis，但这些酵母能以无机铵盐为唯一氮源，这点是大多数Torulopsis不具备的。在已有的文献报道中，酵母积累丙酮酸一般都以葡萄糖为底物。相对而言，细菌积累丙酮酸时所能利用的底物种类相对更多一些(如葡萄糖、葡萄糖醛酸、丙二醇和丙酸)。这些细菌生产丙酮酸的产率虽然不是很低，但产量不高(Causey et al.,2004；Wang et al.,2005；Xu et al.,2008)。
这些筛选出来的菌株对于发酵的条件要求较高，需要调节发酵液中各种营养元素的比例、温度以及供氧条件，增加了工业发酵中的费用。其次，筛选过程中筛选出的细胞的表型变化和细胞的遗传变化难以对应，为进一步的分析和改造这些菌株带来了困难。再次，这些菌株生产丙酮酸的底物都是葡萄糖，目前还未有以木糖为底物进行丙酮酸生产的报道。
采用耐热性酵母K.marxianus(马克思克鲁维酵母)在高温下发酵有以下几个优点：1.高温下发酵可以降低发酵中的冷却费用；2.纤维素酶等的最适催化温度较高，高温会提高以淀粉、纤维素等生物质为原料的同步糖化发酵(SSF)效率，促进糖化，减少在酶上的费用(Fonseca et al.,2008)；3.能在耐热范围内生存的微生物较少，因此，高温会降低污染的风险(Kumar et al.,2013；Kumar et al.,2009)。除此之外，马克思克鲁维酵母是一种GRAS(general regarding as safe)酵母，广泛的在乳制品、葡萄酒发酵制造中存在，对环境、动物及人类是安全的微生物。它能够在较高的温度下生长，最高达52℃，具有很高的生长速率(0.86–0.99h-1,40℃)(Banat and Marchant,1995)。马克思克鲁维酵母有很高的代谢多样性，能利用多种工业上的底物糖类生长发酵。能利用多种廉价底物、耐热、高生长率等特点，使其被认为是替代酿酒酵母用来进行工业发酵和外源蛋白表达的候选者(Zhanget al.,2013；Zhang et al.,2011)。由于马克思克鲁维酵母有很多比酿酒酵母优秀的品质，马克思克鲁维酵母被越来越多的用于生物能源的生产(Fonseca et al.,2008)。马克思克鲁维酵母已经有多个菌株基因组信息公布(Jeong et al.,2012)，其代谢通路较为清楚，同时申请人有构建成熟的可以利用木糖的马克思克鲁维酵母菌株(YZJ051)(Zhang etal.,2015a；Zhang et al.,2015b)。所以利用马克思克鲁维酵母发展成丙酮酸生产菌株有非常重要的应用价值。
木质纤维素生物质(如农业废物玉米秸秆等)是丰富的可再生材料，同时木质纤维素可以从农业废物如玉米秸秆等中获得，不会与粮食造成竞争。因此，利用生物从可再生资源中生产有价值的产物木糖醇具有极大的经济和环境意义。葡萄糖和木糖是其水解液的主要两个单糖成份，要建立经济的工业利用过程，需要对两种糖的高效利用和发酵(Ha etal.,2011)，但目前的方法都不够高效，尤其是葡萄糖和木糖同时存在时，由于葡萄糖抑制效应，微生物利用木糖的能力常常被葡萄糖抑制而导致效率低下。各种工程菌株的构建，使利用木糖发酵生产木糖醇的能力不断提高，但是葡萄糖的抑制效应常常难以解除。在构建的马克思克鲁维酵母菌株葡萄糖的抑制效应非常明显，因此利用葡萄糖和木糖共同发酵一直是一个瓶颈。
综上所述，丙酮酸是重要的化工产品，广泛用于制药、日用化工、农用化学品等工业及科学研究中，但其应用受限于工业生产的安全性与成本。
发明内容
本发明通过基因工程的方法，首先以耐热酵母YZJ057为基础，敲除其丙酮酸脱羧酶基因，构建了能利用葡萄糖生产丙酮酸的菌株，并通过过表达KmMTH1-ΔT基因，敲除KmGPD1基因以及过表达KmGLN1基因增加重组菌株生产丙酮酸的产量和速率。然后，重组表达了酵母的木糖代谢通路，使酵母具备利用木糖生产丙酮酸的能力。最后，通过表达木糖特异性的转运蛋白ScGAL2-N376F，构建了在较高温度(42℃)下能够同时共利用和发酵葡萄糖和木糖的高效生产乙醇和木糖醇的耐热酵母K.marxianus菌株YZB058(参见图1)。
本发明通过基因工程改造获得的菌株YZB058可以同时利用葡萄糖和木糖共发酵，在高温下同时利用葡萄糖和木糖的混合糖溶液生产丙酮酸，因此在利用木质纤维素生物质水解产物高效生物转化生产高附加值产品上有很巨大的应用前景。
本发明以能利用木糖高效生产乙醇的K.marxianus YZJ051菌株作为宿主，构建丙酮酸积累的代谢通路，从而提供一种能利用葡萄糖和木糖共发酵生产丙酮酸的耐热工程酵母菌株。
用于本发明的代谢工程改造的载体有pMD18T-ΔScURA3，pZJ022，pZJ026，pZJ027，pZJ034，pZJ036，pZJ042，pZJ061和YEUGAP(参见，Zhang et al.,2015b；Zhang et al.,2016)以及以这些质粒为基础构建而成的质粒。本发明中进一步构建的质粒为：⑴以K.marxianus酵母的基因组DNA为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)进行PCR扩增，得到的产物即为KmPDC1,并将基因连接进入pMD18-T载体中，从而构建质粒pMD18-T-KmPDC1。然后以YEUGAP为模板进行PCR扩增，得到ScURA3完整表达框。利用Sma I对ScURA3完整基因进行酶切，设计引物扩增出pMD18-T-KmGPD1的整个质粒，将这两个片段用平末端连接，从而获得质粒pZJ056。⑵以马克思克鲁维酵母YHJ010(来源于NBRC1777)基因组为模板，PCR扩增得到基因KmMTH1，然后将基因KmMTH1用EcoR I和Not I酶切后连接pZJ042载体，从而获得质粒pZB013。⑶以pZJ022作为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)进行PCR扩增，得到的产物即为ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段并用Xbal I酶切，将PZJ027用Xbal I酶切后与ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段连接，从而构建质粒pZB022。
本发明的耐热工程酵母菌株的制备方法主要包括以下步骤：将K.marxianus工程酵母YZJ057(敲除了YZJ051中ScURA3获得)的PDC1基因敲除，得到可以积累丙酮酸的菌株，命名为YZJ093；将含有K.marxianus来源的启动子(KmPGKp)控制的K.marxianus酵母的MTH1基因(KmMTH1)的pZB013转化进酵母YZJ094(敲除了YZJ093中ScURA3获得)中，得到YZB024；将YZB043(敲除了YZJ024中ScURA3获得)中的GPD1基因敲除，得到YZB044；将含有耐热酵母来源的启动子(KmPGKp)控制的谷氨酰胺合成酶基因(GLN1)的pZJ043转化进酵母YZB046(敲除了YZB044中ScURA3获得)中，得到YZB047；将含有戊糖磷酸途径中的基因TAL1和TKL1的质粒pZJ026转化进酵母YZB048中(敲除了YZB047中ScURA3获得)，得到YZB049；将含有酿酒酵母来源的启动子(ScGAPDHp)控制的戊糖磷酸途径中的基因RKI1和RPE1的质粒pZB022转化进酵母YZB050中(敲除了YZB049中ScURA3获得)，得到YZB051；将含有树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶基因突变体(PsXYL2-ARS)的质粒pZJ036转化进酵母YZB052中(敲除了YZB051中ScURA3获得)，得到YZB053；将含有酿酒酵母来源的启动子(ScGAPDHp)控制的酿酒酵母来源的半乳糖通透酶基因突变体(ScGAL2-N376F)的质粒pZJ61转化进酵母YZB054中(敲除了YZB053中ScURA3获得)，得到YZB056；将含有酿酒酵母来源的启动子(ScGAPDHp)控制的酿酒酵母来源的半乳糖通透酶基因突变体(ScGAL2-N376F)的质粒pZJ61转化进酵母YZB057中(敲除了YZB056中ScURA3获得)，得到YZB058。
本发明还提供本发明的菌株(YZB058)用于通过利用葡萄糖和木糖共发酵生产丙酮酸的用途。
本发明的优点和积极效果：本发明利用基因工程、代谢工程、分子生物学以及合成生物学的技术和方法，理性设计丙酮酸生产路径，结合生物合成法高效无污染的特色和自然界发酵原料可持续获得的优势，以马克思克鲁维酵母为平台，通过优化与耦合代谢过程分析和逆向工程等关键技术环节，构建出有效的丙酮酸生产工程菌株，同时利用葡萄糖和木糖代谢并生产丙酮酸，并且高温下的发酵可以减少冷却能耗，降低杂菌污染，并为在高温季节和热带地区发酵带来方便。本发明获得的菌株YZB058可以在42℃条件下，同时共利用40.97g/l葡萄糖和20.37g/l木糖在36h生产29.21g/l丙酮酸，其生产速率为0.81g/l/h，总得率为0.48g/g。此菌株对于应用木质纤维素水解液发酵生产高附加值的丙酮酸具有重要的意义。
更具体地，本发明提供以下各项：
1.一种丙酮酸高温高产工程菌株，其特征在于，所述菌株通过在双敲除木糖还原酶基因KmXYL1和木糖醇脱氢酶基因KmXYL2并且重组入粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的木糖还原酶基因NcXYL1和树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)的木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS以及马克思克鲁维酵母的木酮糖激酶基因KmXYL3的马克思克鲁维酵母(K.marxianus)中敲除马克思克鲁维酵母的丙酮酸脱羧酶基因KmPDC1和甘油-3-磷酸脱氢酶基因KmGPD1，并且重组入马克思克鲁维酵母的葡萄糖信号感受的负调控因子MTH1的ΔT突变体基因KmMTH1-ΔT和酿酒酵母的半乳糖通透酶基因突变体ScGAL2-N376F获得。
2.根据1所述的丙酮酸高温高产工程菌株，其特征在于，所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的谷氨酰胺合成酶基因KmGLN1。
3.根据1所述的丙酮酸高温高产工程菌株，其特征在于，所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的转醛酶基因KmTAL1和马克思克鲁维酵母的转酮酶基因KmTKL1。
4.根据1所述的丙酮酸高温高产工程菌株，其特征在于，所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶基因KmRPE1和马克思克鲁维酵母的核糖-5-磷酸酮醇异构酶基因KmRKI1。
5.根据1所述的丙酮酸高温高产工程菌株，其特征在于，所述菌株中进一步转入所述树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS。
6.根据1所述的丙酮酸高温高产工程菌株，其特征在于，所述菌株含有两个拷贝的所述酿酒酵母的半乳糖通透酶基因突变体ScGAL2-N376F。
7.一种丙酮酸高温高产工程菌株YZB058，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12755。
9. 1-8中任一项所述的丙酮酸高温高产工程菌株用于利用葡萄糖和木糖共发酵生产丙酮酸的用途。
附图说明
图1.根据本发明的耐热工程酵母菌株的构建流程图。
图2.本申请质粒的图谱。A：质粒pMD18-T-KmPDC1；B：质粒pZJ056；C：质粒pZB013；D：质粒pZB022。
图3.工程菌株YZB058利用20g/l木糖和40g/l葡萄糖混合液共发酵生产丙酮酸的结果(42℃，250rpm)。■：葡萄糖；木糖；▲：丙酮酸；甘油。
具体实施方式
保藏说明
本发明的菌株马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)YZB058已经于2016年7月11日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏号为CGMCCNo.12755。
实施例
试剂和菌株
本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上试剂。其中，木糖，葡萄糖，甘油，酵母基本氮源，尿嘧啶，胶回收试剂盒以及所有的限制性内切酶均来源于上海生工生物工程公司。PrimeSTAR HS DNA聚合酶，Solution I连接酶以及pMD18-T载体购自于大连宝生物公司。大肠杆菌Escherichia coli XL10-gold菌株作为DNA操作时使用的宿主菌(美国加利福利亚Stratagene公司)，包含100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用作培养E.coli。葡萄糖合成培养基(YNB葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，尿嘧啶20mg/ml)主要用于转化。质粒YEUGAP、pZJ042由本实验室提供(Hong et al.,2007；Zhang et al.,2015b)。YPD培养基(10g/l酵母提取物,20g/l蛋白胨,20g/l葡萄糖)用于酵母的前培养。YPX(10g/l酵母提取物，20g/l细菌学蛋白胨，40g/l木糖，80g/l葡萄糖)用于发酵培养基。马克思克鲁维酵母YZB058菌株保存在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心，菌株号CGMCC No.12755。
实施例1、菌株的制备
1.提取酵母基因组的具体操作步骤为：
①.挑取单克隆，接入5ml液体YPD中，37℃，250rpm，培养24h。
②.常温下12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。
③.500μl蒸馏水重悬菌体，12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。
④.取200μl实验室自配1x breaking缓冲液(TritonX-100(2％(w/v))，SDS(1％(w/v)),NaCl(100mM),Tris-Cl(10mM,pH8.0),EDTA(1mM))重悬菌体，并将菌液转入到含有0.3g玻璃珠(425-600um，sigma，美国)的EP管内。
⑤.加入200μl酚氯仿溶液后，高速震荡3min，加入200μl 1x TE(10mM Tris-Cl,pH8.0,1mM EDTA)。轻微震荡。
⑥.12000rpm，离心5min，取最上层清液转入新的EP管内，加入1ml预冷的无水乙醇。
⑦.12000rpm,4℃，离心10min，弃上清，室温下干燥沉淀，并用400μl 1x TE重悬沉淀。
⑧.加入2μl RNase(RNA水解酶,中国上海生工生物)，2mg/ml)到EP管内，混匀，37℃，酶切1h。
⑨.取40μl 3M醋酸钠(pH 5.2)加入到管内，混匀并加入1ml预冷的无水乙醇。
⑩.12000rpm，4℃，离心30min，弃上清室温下干燥。用100μl无菌水重悬沉淀，此即酵母基因组DNA。
2.pMD18-T-KmPDC1和pZJ056的构建：
以马克思克鲁维酵母YHJ010基因组(NBRC1777，△KmURA3::KANr,△KmLEU2::HISG，△KmTRP1::HISG，参见Hong et al.,2007)为模板，以KMPDC1-F(SEQ ID NO:1)，KMPDC1-R(SEQ ID NO:2)为引物，PCR扩增得到基因KmPDC1，然后将基因KmPDC1插入pMD18-T载体，从而得到pMD18-T-KmPDC1载体。然后以YEUGAP为模板，以SCURA3-SMAI-F(SEQ ID NO:3)，SCURA3-SMAI-R(SEQ ID NO:4)为引物，进行PCR扩增得到ScURA3完整表达框。利用Sma I对ScURA3完整基因进行酶切。然后以pMD18-T-KmPDC1为模板，以KMPDC1-MF(SEQ ID NO:5)，KMPDC1-MR(SEQ ID NO:6)为引物，进行PCR扩增得到pMD18-T-KmPDC1整个质粒。将ScURA3完整基因酶切产物和pMD18-T-KmPDC1质粒PCR产物连接，从而获得质粒pZJ056(图2)。
具体操作如下：
⑴以马克思克鲁维酵母YHJ010基因组为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶进行PCR扩增得到KmGPD1。然后将KmGPD1插入pMD18-T载体，从而得到pMD18-T-KmPDC1载体。
KmPDC1的PCR体系：
PCR程序
得到KmPDC1后，在DNA末端分别加上“A”碱基后，插入pMD18-T载体(购自大连宝生物)中。
加A体系：
TA克隆连接体系：
将获得了KmPDC1的pMD18-T载体，命名为pMD18-T-KmPDC1载体。
⑵以YEUGAP为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶进行PCR扩增，得到ScURA3完整表达框。利用Sma I对ScURA3完整表达框进行酶切，PCR扩增pMD18-T-KmPDC1，然后连接，从而获得质粒pZB013。
ScURA3完整表达框的PCR体系：
对应PCR程序：
ScURA3完整表达框的酶切体系：
pMD18-T-KmPDC1完整质粒的PCR体系：
对应PCR程序：
ScURA3完整表达框和pMD18-T-KmPDC1载体的连接体系：
⑶将获得的ScURA3完整表达框-KmPDC-T载体的质粒，命名为pZJ056。
3.pZB013的构建：
提取马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)YHJ010的基因组，并将提取的基因组稀释100倍作为模板，以KMMTH1-F(SEQ ID NO:7)和KMMTH1-R为引物(SEQ ID NO:8)，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)进行PCR，得到的产物即为KmMTH1,并将KmMTH1基因和pZJ042载体利用EcoR I和Not I双酶切，连接起来，再用KMMTH1-Δ-F和KMMTH1-Δ-R扩增后转化，从而获得质粒pZB013(图2)。
具体的操作如下：
⑴KmMTH1的PCR体系：
PCR程序：
⑵将扩增产物KmMTH1与pZJ042载体分别利用EcoR I和Not I进行双酶切，连接。
KmMTH1的酶切体系：
pZJ042载体的酶切体系：
⑶KmMTH1和pZJ042载体的连接体系：
⑷KmMTH1-ΔT的PCR体系：
PCR程序：
⑸将获得的插入了KmMTH1-ΔT的pZJ042质粒，命名为pZB013。
3.pZB022的构建：
以pZJ022作为模板，SCGAP-XBALI-F(SEQ ID NO:9)和TER-XBAL-R(SEQ ID NO:10)作为引物，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)进行PCR，得到的产物即为ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段,并将ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDH片段和pZJ027载体利用Xbal I酶切，连接，从而获得质粒pZB022(图2)。
具体的操作如下：
⑴ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段的PCR体系：
PCR程序：
⑵将扩增产物ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段与pZJ027载体分别利用Xbal I进行酶切，连接，从而构建质粒pZB022。
ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段的酶切体系：
pZJ027载体的酶切体系：
ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段和pZJ027载体的连接体系：
⑶将获得的插入了ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段的pZJ027质粒，命名为pZB022(图2)。
4.pMD18T-ScURA3敲除片段质粒的构建
敲除质粒根据文献(Zhang et al.,2015b)制备，是以YEUGAP为模板，通过PCR扩增出ScURA3的前322bp片段和第487bp之后的片段，再通过融合PCR获得缺失了165bp的ScURA3敲除框，并将其插入pMD18-T载体构建而成。
5.将构建的载体转入改造后的耐热酵母：
1)酵母化学转化步骤:
①.各种改造菌株在YPD平板上划线，37℃培养24h。
②.取5ml液体YPD，并分别在YPD平板上挑取单克隆，37℃，250rpm，培养18h。
③.取1ml培养物转接与装入9ml液体YPD的50ml三角瓶内，37℃，250rpm，摇床培养5h。
④.取出培养物，常温下离心5000rpm，3min，弃上清液，保留菌体。
⑤.配制1ml转化缓冲液：800μl 50％PEG4000；50μl 4M醋酸锂；50μl ddH2O；100μl1M DTT(溶于10mM醋酸钠,pH 5.2)。
⑥.使用200μl转化缓冲液重悬菌体，5000rpm，离心3min，去上清。
⑦.用100μl转化缓冲液重悬浮菌体，加入5μl(1-10μg)线性化的质粒,轻微震荡30sec。
⑧.在47℃条件下水浴15min。
⑨.将菌体涂布于含有亮氨酸(Leu)或尿嘧啶(Ura)的合成培养基，37℃培养2天。
⑩.挑取板上克隆在液体YPD中培养，提取基因组，并通过PCR鉴定转化结果。
2)本发明构建耐热酵母表达菌株的具体过程：
作为构建起点的马克思克鲁维酵母(K.marxianus)菌株YZJ051通过在双敲除木糖还原酶基因KmXYL1和木糖醇脱氢酶基因KmXYL2的马克思克鲁维酵母中重组入粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的木糖还原酶基因NcXYL1和树干毕赤酵母(Scheffersomycesstipitis)的木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS以及马克思克鲁维酵母的木酮糖激酶基因KmXYL3而获得(其构建可参见非专利文献Zhang et al.,2015a和Zhang et al.,2015b以及专利文献CN104164375)。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZJ051中，同源重组后，使菌株YZJ051内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZJ057。
以pZJ056敲除片段为模板，PCR扩增KmPDC1-T-ScURA3基因。将KmPDC1-T-ScURA3基因片段转化入YZJ057中，同源重组后，使菌株YZJ057内的KmPDC1被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，命名为YZJ093。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZJ093中，同源重组后，使菌株YZJ093内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZJ094。
用Sma I酶切pZB013载体。将酶切产物转化至YZJ094，使菌株获得Ura3基因，恢复Uracil的合成的能力，同时获得重组表达的KmMTH1基因。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，获得的菌株命名为YZB024。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZB024中，同源重组后，使菌株YZB024内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZB041。
以pZJ034敲除片段为模板，PCR扩增KmGPD1-T-ScURA3基因。将KmGPD1-T-ScURA3基因片段转化入YZB041中，同源重组后，使菌株YZB041内的KmGPD1被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，命名为YZB044。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZB044中，同源重组后，使菌株YZJ109内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZB046。
用Sma I酶切pZJ043载体(Zhang et al.,2015b以及CN104164375)。将酶切产物转化至YZJ046，使菌株获得Ura 3基因，恢复Uracil的合成的能力，同时获得重组表达的KmGLN1基因。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，获得的菌株命名为YZB047。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZB047中，同源重组后，使菌株YZB047内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZB048。
用Sma I酶切pZJ026载体。将酶切产物转化至YZB048，使菌株获得Ura3基因，恢复Uracil的合成的能力，同时获得重组表达的KmTAL1和KmTKL1基因。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，获得的菌株分别命名为YZB049。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZB049中，同源重组后，使菌株YZB049内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZB050。
用Sma I酶切pZB022载体。将酶切产物转化至YZB050，使菌株获得Ura3基因，恢复Uracil的合成的能力，同时获得重组表达的KmRPE1和KmRKI1基因。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，获得的菌株命名为YZB051。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZB051中，同源重组后，使菌株YZB051内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZB052。
用Sma I酶切pZJ036载体。将酶切产物转化至YZB052，使菌株获得Ura3基因，恢复Uracil的合成的能力，同时获得重组表达的PsXYL2-ARS基因。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，获得的菌株分别命名为YZB053。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZB053中，同源重组后，使菌株YZB051内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZB054。
用Sma I酶切pZJ061载体。将酶切产物转化至YZB054，使菌株获得Ura 3基因，恢复Uracil的合成的能力，同时获得重组表达的ScGAL2-N376F基因。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，获得的菌株命名为YZB056。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZB056中，同源重组后，使菌株YZB056内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZB057。
用Sma I酶切pZJ061载体。将酶切产物转化至YZB057，使菌株获得Ura 3基因，恢复Uracil的合成的能力，同时获得进一步重组表达的ScGAL2-N376F基因。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，获得的菌株命名为YZB058。
3)提取基因组，通过PCR鉴定酵母转化的阳性菌株。
鉴定酵母转化的阳性菌株的PCR体系：
对应PCR程序：
实施例2、构建的工程菌株发酵情况
该实施例用于测试工程菌株利用木糖和葡萄糖共发酵生产丙酮酸的效果。结果表明通过工程改造马克思克鲁维酵母，得到的工程菌株可以在高温下(42℃)共发酵葡萄糖和木糖产生丙酮酸。另外，由于KmGPD1的敲除使发酵过程几乎不产生副产物甘油。
1.在YPD培养基平板上复苏菌株YZB058，37℃培养1天。
2.挑取单克隆，接于5ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。
3.配制30ml木糖葡萄糖培养基于250ml锥形瓶中。配方：20g/l木糖，40g/l葡萄糖糖，10g/l酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨。灭菌待用。
4.取适量过夜培养物接入30ml木糖葡萄糖培养基中，使他们的初始OD600达到1.0,42℃,250rpm培养。
6.在0h，12h，20h，24h，28h，36h，48h取样，并取上清通过HPLC检测分析(图3)。
7.从图3可知，在葡萄糖和木糖培养基的培养条件下，结果表明工程菌株几乎可以将葡萄糖和木糖共利用完全，并且生产丙酮酸。另外，KmGPD1的敲除使副产物甘油几乎全部消失。最终，本发明中的YZB058菌株，在42℃条件下，能在36h内同时共利用40.97g/l葡萄糖和20.37g/l木糖生产29.21g/l丙酮酸，其生产速率为0.81g/l/h，得率为0.48g/g。
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Claims (2)

1.一种丙酮酸高温高产工程菌株YZB058，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12755。
2.权利要求1所述的丙酮酸高温高产工程菌株YZB058用于利用葡萄糖和木糖共发酵生产丙酮酸的用途。
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CN105062907A (zh) * 2015-07-27 2015-11-18 中国科学技术大学 木糖醇和乙醇同时高温高产工程菌株的构建及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Engineered Kluyveromyces marxianus for pyruvate production at elevated temperature with simultaneous consumption of xylose and glucose;Biao Zhang等;《Bioresource Technology》;20161130;第224卷;553–562 *

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