CN102618479B - 一种能耐受高浓度丁醇的梭菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
一种能耐受高浓度丁醇的梭菌及其构建方法与应用,所述能耐受高浓度丁醇的梭菌含有htrA基因，所述htrA基因的序列为SEQ ID NO.1。所述能耐受高浓度丁醇的梭菌的构建方法，包括以下步骤：（1）pIMPI-Thl质粒的构建；（2）htrA基因过量表达重组质粒的构建；（3）htrA基因过量表达重组菌株的构建；（4）重组菌的丁醇耐受性检测。本发明还包括所述能耐受高浓度丁醇的梭菌在生产丁醇中的应用。本发明的将htrA基因在C.acetobutylicum ATCC 824中过量表达能显著提高菌株的丁醇耐受性。
Description
技术领域
本发明涉及一种梭菌及其构建方法与应用，尤其是涉及一种可用于生产丁醇的梭菌及其构建方法与应用。
背景技术
能源是国民经济发展的动力。随着石油资源的大量消耗和价格的节节攀升，能源问题已经成为制约我国经济持续稳定发展的重要因素。2011年，我国原油进口依存度高达55.3%，预计到2015年，我国原油进口依存度将超过65.0%。随着石油资源的耗竭和温室效应等环境问题的日益突出，高效利用可再生原料生产能源和化学品已成为全球关注的重点之一。醇类是一类重要的平台化学品，其中大部分醇可以通过微生物发酵转化，因此醇类被认为是极具发展潜力的生物燃料和生物基化学品。
丁醇是一种重要的平台化学品，主要用于制造增塑剂或用作溶剂、萃取剂等；近年来，研究人员发现丁醇的热值、辛烷值与汽油相当；其含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不会腐蚀管道、不易吸水，便于管道输送；蒸汽压低，安全性高，且能与汽油以任意比混合。所以，丁醇已成为一种世界各国企业和研究机构强烈关注的极具潜力的新型生物燃料[Durre,
P., Biobutanol: an attractive biofuel. Biotechnol. J. 2007, 2, (12), 1525-34.]。
目前，利用微生物发酵生产丁醇面临的主要问题是发酵后期高浓度丁醇对细胞的毒性，丁醇毒性是其工业化大规模生产所面临的最关键的问题[Liu,
S., Qureshi, N., How microbes tolerate ethanol and butanol. N Biotechnol. 2009,
26, 117-121.]。
针对丁醇毒性问题，国内外研究人员提出了固定化细胞发酵、反渗透、全蒸发、膜蒸发，液液萃取、吸附及气提技术等解决方案，但这些技术在生产工艺中的应用不可避免的增加了丁醇生产成本，且其本身对丁醇产量提高程度有限[Ezeji,
T. C., Qureshi, N., Blaschek, H. P., Bioproduction of butanol from biomass:
from genes to bioreactors. Curr. Opin. Biotechnol. 2007, 18, 220-227.]。
进一步提高生产菌株的丁醇产量，最有效的办法是提高菌株本身对丁醇的耐受性，才有可能满足工业化需求[Ezeji, T.,
Milne, C., Price, N. D., Blaschek, H. P., Achievements and perspectives to
overcome the poor solvent resistance in acetone and butanol-producing
microorganisms. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 85, 1697-1712.]。
然而，采用传统诱变育种方法，已难以大幅度提高菌株对丁醇的耐受性。主要原因是，基于诱变的随机筛选，盲目性大，工作量大，产生的正向突变体频率低，难以有效地控制变异的方向和性质，而且经过过去长期诱变筛选，其提升丁醇耐受性能力的空间已经很小[董红军, 张延平, 李寅, 丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统. 生物工程学报. 2010, 26, 1372-1378.]。
2001年，丙酮丁醇梭菌基因组的测序完成，为研究者们对丁醇生产进行系统生物学的研究提供了可能。现在转录组学、蛋白组学、代谢网络模型等方面都有广泛的研究报道。
虽然目前对丙酮丁醇梭菌生理代谢及调控的认识已经有了很大的进步，但是通过菌株改造来提高丁醇耐受性的研究却进展不大，主要原因是缺少有效的靶蛋白进行代谢工程的菌株改造。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种能耐受高浓度丁醇的梭菌。
本发明的另一个目的是，提供一种能耐受高浓度丁醇的梭菌的构建方法。
本发明进一步的目的是，提供一种利用所述能耐受高浓度丁醇的梭菌生产丁醇的方法。
本发明解决所述技术问题所采用的技术方案是，一种能耐受高浓度丁醇的梭菌，通过在梭菌内过量表达htrA基因来提高重组菌对丁醇的耐受性。
所述htrA基因，其序列为SEQ ID NO.1：
atgatggacg atttaaacaa taataacgtg aataataatg atacagataa tacaactgaa 60
atgaataata ataacaatga taataccgtt aatatgaata tgccaattga atataaaaaa 120
gaaagcaata aaaatagaaa acctttcaac aaaaaaatag catcatatat agcagtaggt 180
ttaacctgcg ctatacttgg aggaggtata tcaacagcat cagccttata tcttcttcct 240
aaatcaaact ttttcaaaag tacaccatta tacaaaacta tggctaatgg tggaagttct 300
tctctaggct atattaatgc ttcaccaacc tcaacaaaga cgtctagtgc aactggaagt 360
ggtttaactg tatcgcaaat agtaaaaaaa gttagccctg cagtagttgg tgtatcaaca 420
aaaacgactg taacccaaaa cgattttgat tccttctttg gctcaagtaa tggtaatgga
480
agctctacac aggaaggaat gggatccgga ataatattca ataatgatgg ttatatacta 540
acaaattacc atgttataaa aggtgcagat aaaatagcag taatcctaaa caacaaaaaa 600
gaagtttcag ctaaagttgt aaattatgat gaagctaatg atatagccgt aataaagatg 660
acaggaagct ttactgttcc tggtgttgca gaacttggaa gctcagcttc attaaatgtt 720
ggtgattcag tcgttgcaat tggaaatcct ttaggaaaag aattcttagg aacagttaca 780
actggagttg tcagtgctgt taatcgtgaa gtagccgtaa gcgaaggtca aaaacaaact 840
tatatccaaa cagatgcagc tataaatcct ggaaacagcg gaggtcctct agtaaattca 900
ttcggacaag tagttggtat aaattctgct aagataagtg aaaacggcgt agaaggaata 960
ggcttctcaa ttccaattga tactgtaaaa agcaaaattc aaaatctttc taagcctata 1020
ctaatgcttg gaataagtgg tgaagctgta gataaaagta ccgctgaaca gcataatata 1080
cctcaaggtg tatatattga acaaattcaa gactttagtt ctgctcaaaa agcaggtatg 1140
caggttggag atgtaataac aaagtttgat ggtaaaaaag taacttctac tagcgatatc 1200
gattctataa agtcaaaaca taactcaggt gatactgtac aagtagaagt ttacagggac 1260
gatgcttata aaaccctttc tttaaaacta tcagacaaat aa 1302
所述htrA基因编码的蛋白质HtrA的氨基酸序列为SEQ ID NO.2：
Met Met Asp Asp Leu Asn Asn Asn Asn Val Asn Asn Asn Asp Thr
Asp
1
5 10 15
Asn Thr Thr Glu Met Asn Asn Asn Asn Asn Asp Asn Thr Val Asn
MET
20
25 30
Asn MET Pro Ile Glu Tyr Lys Lys Glu Ser Asn Lys Asn Arg Lys
Pro
35
40 45
Phe Asn Lys Lys Ile Ala Ser Tyr Ile Ala Val Gly Leu Thr Cys
Ala
50
55 60
Ile Leu Gly Gly Gly Ile Ser Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Leu Leu
Pro
65
70 75 80
Lys Ser Asn Phe Phe Lys Ser Thr Pro Leu Tyr Lys Thr Met Ala
Asn
85 90 95
Gly Gly Ser Ser Ser Leu Gly Tyr Ile Asn Ala Ser Pro Thr Ser
Thr
100
105 110
Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Ser Gly Leu Thr Val Ser Gln Ile
Val
115
120 125
Lys Lys Val Ser Pro Ala Val Val Gly Val Ser Thr Lys Thr Thr
Val
130
135 140
Thr Gln Asn Asp Phe Asp Ser Phe Phe Gly Ser Ser Asn Gly Asn
Gly
145
150 155 160
Ser Ser Thr Gln Glu Gly Met Gly Ser Gly Ile Ile Phe Asn Asn
Asp
165 170 175
Gly Tyr Ile Leu Thr Asn Tyr His Val Ile Lys Gly Ala Asp Lys
Ile
180 185 190
Ala Val Ile Leu Asn Asn Lys Lys Glu Val Ser Ala Lys Val Val
Asn
195 200 205
Tyr Asp Glu Ala Asn Asp Ile Ala Val Ile Lys Met Thr Gly Ser
Phe
210 215 220
Thr Val Pro Gly Val Ala Glu Leu Gly Ser Ser Ala Ser Leu Asn
Val
225
230 235 240
Gly Asp Ser Val Val Ala Ile Gly Asn Pro Leu Gly Lys Glu Phe
Leu
245 250 255
Gly Thr Val Thr Thr Gly Val Val Ser Ala Val Asn Arg Glu Val
Ala
260 265 270
Val Ser Glu Gly Gln Lys Gln Thr Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ala
Ile
275 280 285
Asn Pro Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Ser Phe Gly Gln
Val
290 295 300
Val Gly Ile Asn Ser Ala Lys Ile Ser Glu Asn Gly Val Glu Gly
Ile
305
310 315 320
Gly Phe Ser Ile Pro Ile Asp Thr Val Lys Ser Lys Ile Gln Asn
Leu
325 330 335
Ser Lys Pro Ile Leu Met Leu Gly Ile Ser Gly Glu Ala Val Asp
Lys
340 345 350
Ser Thr Ala Glu Gln His Asn Ile Pro Gln Gly Val Tyr Ile Glu
Gln
355 360 365
Ile Gln Asp Phe Ser Ser Ala Gln Lys Ala Gly Met Gln Val Gly
Asp
370 375 380
Val Ile Thr Lys Phe Asp Gly Lys Lys Val Thr Ser Thr Ser Asp
Ile
385
390 395 400
Asp Ser Ile Lys Ser Lys His Asn Ser Gly Asp Thr Val Gln Val
Glu
405 410 415
Val Tyr Arg Asp Asp Ala Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu Ser
Asp
420 425 430
Lys*
其中，该HtrA蛋白质全长433个氨基酸，其理论分子量为45.5 kDa。
本发明之能耐受高浓度丁醇的梭菌的构建方法，包括以下步骤：
（1）pIMPI-Thl质粒的构建：以丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC
824（购自美国标准生物品收藏中心）基因组作为模板，利用PCR扩增141 bp的乙酰CoA酰基转移酶的启动子序列（具体序列见SEQ ID NO.3），将乙酰CoA酰基转移酶的启动子序列经Sal I和BamH I酶切后与pIMPI质粒[Mermelstein, L. D., Welker, N. E., Bennett, G. N., et
al. Expression of cloned homologous fermentative genes in Clostridium
acetobutylicum ATCC 824[J]. Nature Biotechnology, 1992, 10(2): 190-195.]连接，得到pIMPI-Thl质粒；
（2）htrA基因过量表达重组质粒的构建：以丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC
824（购自美国标准生物品收藏中心）基因组作为模板，利用PCR扩增1302 bp的htrA基因，将htrA基因与步骤（1）所得pIMPI-Thl质粒进行连接，从而构建pITHtrA质粒；将重组质粒转入E. coli TOP10(pAN1)[Mermelstein, L.;
Papoutsakis, E., In vivo methylation in Escherichia coli by the Bacillus
subtilis phage phi 3T I methyltransferase to protect plasmids from restriction
upon transformation of Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Appl. Environ. Microbiol.
1993, 59, (4), 1077.]中进行甲基化，得到甲基化质粒pITHtrA；
（3）htrA基因过量表达重组菌株的构建：厌氧条件下，取60-120mL梭菌强化培养基(RCM)培养的对数中后期的丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC
824细胞液，4℃、3000rmp离心10分钟，去除上清液，加入60-120mL预冷的电转缓冲液（270mmol/L蔗糖，5mmol/L NaH2PO4
pH 7.4），洗涤两次，并重悬至1.5mL的电转缓冲液中，然后取30-50
L转入0.4cm的电转杯中，放置冰浴中用于电转化，加入100-300
g步骤（2）所得甲基化质粒pITHtrA，置于冰浴中2-3分钟，采用2000v脉冲电压和25
F的电容进行电转化，随后将电转液加入到梭菌强化培养基RCM中，37℃培养4-6小时，2000-3000rmp离心10分钟收集细胞，将收集的细胞涂布于含有红霉素抗性的RCM琼脂培养基上，培养36-40小时后，获得含有htrA基因过量表达质粒pITHtrA的丙酮丁醇梭菌，命名为酮丁醇梭菌C.
acetobutylicum ATCC 824(pITHtrA)；
（4）重组菌的丁醇耐受性检测：培养步骤（3）所得htrA基因的过表达重组菌至对数生长初期（OD600nm=1.0±0.2），厌氧条件下分别分转至含有不同浓度丁醇的培养基中，以含有pIMPI
空质粒[Mermelstein, L. D., Welker, N. E.,
Bennett, G. N., et al. Expression of cloned homologous fermentative genes in
Clostridium acetobutylicum ATCC 824[J]. Nature Biotechnology, 1992, 10(2):
190-195.]的梭菌作为对照，37℃条件下继续培养，于不同时间测定培养基OD600nm的变化；
反应细胞生长的OD600nm值能够灵敏、直接的反应菌株丁醇耐受性的变化。
所述梭菌为可产丁醇的梭菌，优选为产丁醇的丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）或拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），也可为Clostridium saccharoperbutylacetonicum和Clostridium saccharobutylicum两大类梭菌。
产丁醇梭菌可以是野生型菌株，也可以是经过诱变或遗传改造后的菌株。
本发明之能耐受高浓度丁醇的梭菌的应用：
发酵生产丁醇：将含有htrA基因过量表达质粒pITHtrA的丙酮丁醇梭菌接种至培养基中，于BioFlo
110 发酵罐 (NBS公司)中进行厌氧发酵，发酵温度控制在35-40℃，发酵50-72小时，通过补加氨水来控制菌体发酵pH维持在5.0；
每1L所述发酵培养基按照如下方法制备：葡萄糖70-90g，硫酸镁0.01-0.02g，硫酸锰0.01-0.02g，硫酸亚铁1.0-2.0g，氯化钠5.0-7.0g，酵母粉2.0-4.0g，硫酸铵2.0-4.0g，磷酸二氢钾1.0-2.0g，磷酸氢二钾1.0-2.0g，天冬氨酸2.0-4.0g和水混合，用水补至1L；
所述厌氧发酵，是指在转速150-180 rpm以下，通过充氮气 (流速50-80 mL/min) 维持发酵罐中厌氧环境。
实验证明，本发明将htrA基因在丙酮丁醇梭菌C.
acetobutylicum ATCC 824中过量表达能显著提高菌株的丁醇耐受性。
附图说明
图 1 为重组质粒pIMPI-Thl的结构示意图；
图 2 为重组表达质粒pITHtrA结构示意图；
图3为野生型菌株C.
acetobutylicum ATCC 824、空质粒菌株C.
acetobutylicum (pIMPI)、htrA基因过表达重组菌在0 g/L丁醇中的生长曲线；
图4为野生型菌株C.
acetobutylicum ATCC 824、空质粒菌株C.
acetobutylicum (pIMPI)、htrA基因过表达重组菌在2 g/L丁醇中的生长曲线；
图5为野生型菌株C.
acetobutylicum ATCC 824、空质粒菌株C.
acetobutylicum (pIMPI)、htrA基因过表达重组菌在8 g/L丁醇中的生长曲线；
图6为野生型菌株C.
acetobutylicum ATCC 824、空质粒菌株C.
acetobutylicum (pIMPI)、htrA基因过表达重组菌在16 g/L丁醇中的生长曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例包括以下步骤：
（1）pIMPI-Thl质粒的构建
采用OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒(货号：D1600)提取丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC 824（购自美国标准生物品收藏中心）基因组DNA，利用引物：Pthl1：AGT GTCGAC TATATTGATAAA AATAATAATAGTG（划线部分为SalI酶切位点）和Pthl2：CGT GGATCC TTCTTTCATTCTAACT AACCTC（划线部分为BamHI酶切位点）从基因组DNA中扩增乙酰CoA酰基转移酶启动子序列（具体序列见序列表SEQ
ID NO.3），将PCR扩增的乙酰CoA酰基转移酶启动子DNA用Sal I和BamHI进行双酶切，与使用Sal I和BamHI双酶切后的pIMPI
质粒[Mermelstein, L. D., Welker, N. E.,
Bennett, G. N., et al. Expression of cloned homologous fermentative genes in
Clostridium acetobutylicum ATCC 824[J]. Nature Biotechnology, 1992, 10(2):
190-195.]载体进行连接，从而构建载体pIMPI-Thl质粒；
（2）htrA基因过量表达重组质粒的构建
采用OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒(货号：D1600)提取丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC 824（购自美国标准生物品收藏中心）基因组DNA，以丙酮丁醇梭菌C.
acetobutylicum ATCC 824基因组作为模板，设计引物：HtrA1：5'- GGA AGATCT ATGATGGACGATTTAAACAATAATAACG-3'（划线部分为Bgl II酶切位点）；HtrA2：5'-CGC CATATG TTATTTGTCTGATAGTTTTAAAGAAAGG-3'（划线部分为NdeI酶切位点）；利用PCR扩增1302bp的htrA基因（具体序列见SEQ ID NO.1），PCR产物经Bgl II（说明：因为htrA基因中存在BamH I酶切位点，所以使用同尾酶Bgl II进行酶切）和NdeI双酶切后连接至使用BamHI和NdeI双酶切的pIMPI-Thl质粒，构建质粒pITHtrA；将重组质粒转入E. coli
TOP10(pAN1)[Mermelstein, L.; Papoutsakis, E., In vivo methylation in
Escherichia coli by the Bacillus subtilis phage phi 3T I methyltransferase to
protect plasmids from restriction upon transformation of Clostridium
acetobutylicum ATCC 824. Appl. Environ. Microbiol. 1993, 59, (4), 1077.]中进行甲基化，得到甲基化质粒pITHtrA；
（3）htrA基因过量表达重组菌株的构建：厌氧条件下，取80mL梭菌强化培养基（RCM）培养的对数中后期的丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC
824细胞液，4℃、3000rmp离心10分钟，去除上清液，加入80mL 预冷的电转缓冲液（270 mmol/L蔗糖，5
mmol/L NaH2PO4 pH 7.4），洗涤两次，并重悬至1.5mL的电转缓冲液中，然后取40
L转入0.4cm的点转杯中，放置冰浴中用于电转化，加入300
g步骤（2）所得甲基化质粒pITHtrA，置于冰浴中2分钟，采用2000v脉冲电压和25
F的电容进行电转化，随后将电转液加入到梭菌强化培养基RCM中，37℃培养4小时，3000rmp离心10分钟收集细胞，将收集的细胞涂布于含有红霉素抗性的RCM琼脂培养基上，培养36小时后，获得含有htrA基因过量表达质粒pITHtrA的丙酮丁醇梭菌，命名为酮丁醇梭菌C.
acetobutylicum ATCC 824(pITHtrA)。
（4）重组菌的丁醇耐受性检测：培养步骤（3）所得htrA基因的过表达重组菌C.
acetobutylicum ATCC 824(pITHtrA)至对数生长初期（OD600nm=1.0±0.1），厌氧条件下分别分装至4个100 mL厌氧瓶中，加入0 g/L、2 g/L（低浓度）、8g/L（高浓度）和16g/L（致死浓度）（w/v）丁醇，以丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum (pIMPI) （含有pIMPI空质粒的丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum
ATCC 824菌株）及其野生型菌株丙酮丁醇梭菌C.
acetobutylicum ATCC 824作为对照；37℃，120rpm摇床培养，于不同时间测定培养基OD600nm的变化。
反应细胞生长的OD600nm值能够灵敏、直接的反应菌株丁醇耐受性的变化。
检测结果见附图 3，结果显示，在2 g/L、8 g/L丁醇中重组菌丙酮丁醇梭菌C.
acetobutylicum ATCC 824(pITHtrA)受丁醇抑制的程度最弱；当丁醇溶度达到16
g/L时，野生型菌株ATCC 824不能生长，而空质粒对照菌株丙酮丁醇梭菌ATCC
824 (pIMPI)和htrA基因过量表达突变株丙酮丁醇梭菌ATCC
824 (pITHtrA) 能生长，但是htrA基因过量表达突变株要比空质粒对照菌株丙酮丁醇梭菌ATCC
824 (pIMPI)生长更好，受丁醇抑制程度更低。这些结果清晰地展示出htrA基因过量表达菌株丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC
824 (pITHtrA) 在丁醇胁迫下具有更优的生长表现，能够耐受更高浓度的丁醇。
实施例2：重组菌发酵生产丁醇
本实施例包括以下步骤：将实施例1所得重组菌丙酮丁醇梭菌C.
acetobutylicum ATCC 824(pITHtrA) 和对照菌丙酮丁醇梭菌C.
acetobutylicum ATCC 824和丙酮丁醇梭菌C.
acetobutylicum (pIMPI)分别接种至培养基中，于BioFlo
110 发酵罐 (NBS公司)中进行厌氧发酵，发酵温度控制在37℃，在转速150 rpm，通过充氮气 (流速50 mL/min) 维持发酵罐中厌氧环境，发酵60小时，通过补加氨水来控制菌体发酵pH维持在5.0，定时取样检测溶剂含量（丁醇、乙醇和丙酮）。
发酵培养基按照如下方法制备：葡萄糖80g，硫酸镁0.01g，硫酸锰0.01g，硫酸亚铁1.0g，氯化钠5.0g，酵母粉2.0g，硫酸铵2.0g，磷酸二氢钾1.0g，磷酸氢二钾1.0g，天冬氨酸2.0g和水混合，用水补至1L，得到的培养基。
溶剂（丁醇、乙醇和丙酮）的含量测定：取出发酵过程中的样品，10000×g离心5 min，取上清液；上清液用Millipore Millex-GP PES（SLGP033RB）0.22
m针头式过滤器过滤；过滤后的上清液全自动进样，进入Agilent 1200 HPLC (Agilent Technologies公司) 系统，用0.05 mmol/L稀H2SO4作为流动相，流速0.5
mL/min，使用Bio-Rad Aminex HPX-87H 离子交换柱 (7.8 × 300 mm，Bio-Rad公司)，上样量5 
L，柱温控制在15°C，在30°C下使用示差折光检测器 (Refractive index (RI) detector) 进行信号检测，采用外标法进行定量分析。
结果如下表1 所示：
表1重组菌和对照菌的溶剂产量
本实施例实验结果证明，本发明将htrA基因在丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC 824中过量表达能显著提高菌株的丁醇耐受性。
序列表
<110> 中南林业科技大学
<120>一种能耐受高浓度丁醇的梭菌及其构建方法与应用
<160> 3
<210> 1
<211>1302
<212> DNA
<213>丙酮丁醇梭菌（Clostridium
acetobutylicum）
<400> 1
1 atgatggacg atttaaacaa taataacgtg aataataatg atacagataa tacaactgaa
61 atgaataata ataacaatga taataccgtt
aatatgaata tgccaattga atataaaaaa
121 gaaagcaata aaaatagaaa acctttcaac
aaaaaaatag catcatatat agcagtaggt
181 ttaacctgcg ctatacttgg aggaggtata
tcaacagcat cagccttata tcttcttcct
241 aaatcaaact ttttcaaaag tacaccatta
tacaaaacta tggctaatgg tggaagttct
301 tctctaggct atattaatgc ttcaccaacc
tcaacaaaga cgtctagtgc aactggaagt
361 ggtttaactg tatcgcaaat agtaaaaaaa
gttagccctg cagtagttgg tgtatcaaca
421 aaaacgactg taacccaaaa cgattttgat
tccttctttg gctcaagtaa tggtaatgga
481 agctctacac aggaaggaat gggatccgga
ataatattca ataatgatgg ttatatacta
541 acaaattacc atgttataaa aggtgcagat
aaaatagcag taatcctaaa caacaaaaaa
601 gaagtttcag ctaaagttgt aaattatgat
gaagctaatg atatagccgt aataaagatg
661 acaggaagct ttactgttcc tggtgttgca
gaacttggaa gctcagcttc attaaatgtt
721 ggtgattcag tcgttgcaat tggaaatcct
ttaggaaaag aattcttagg aacagttaca
781 actggagttg tcagtgctgt taatcgtgaa
gtagccgtaa gcgaaggtca aaaacaaact
841 tatatccaaa cagatgcagc tataaatcct
ggaaacagcg gaggtcctct agtaaattca
901 ttcggacaag tagttggtat aaattctgct
aagataagtg aaaacggcgt agaaggaata
961 ggcttctcaa ttccaattga tactgtaaaa
agcaaaattc aaaatctttc taagcctata
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aa
<210> 2
<211>433
<212> PRT
<213>丙酮丁醇梭菌（Clostridium
acetobutylicum）
<400> 2
Met Met Asp Asp Leu Asn Asn Asn Asn Val Asn Asn Asn Asp Thr Asp
1
5
10
15
Asn Thr Thr Glu Met Asn Asn Asn Asn Asn Asp Asn Thr Val Asn MET
20
25
30
Asn MET Pro Ile Glu Tyr Lys Lys Glu Ser Asn Lys Asn Arg Lys Pro
35
40
45
Phe Asn Lys Lys Ile Ala Ser Tyr Ile Ala Val Gly Leu Thr Cys Ala
50
55
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Ile Leu Gly Gly Gly Ile Ser Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Leu Leu Pro
65
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Lys Ser Asn Phe Phe Lys Ser Thr Pro Leu Tyr Lys Thr Met Ala Asn
85
90
95
Gly Gly Ser Ser Ser Leu Gly Tyr Ile Asn Ala Ser Pro Thr Ser Thr
100
105
110
Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Ser Gly Leu Thr Val Ser Gln Ile Val
115
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Lys Lys Val Ser Pro Ala Val Val Gly Val Ser Thr Lys Thr Thr Val
130
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140
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200
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210
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Gly Thr Val Thr Thr Gly Val Val Ser Ala Val Asn Arg Glu Val Ala
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Lys*
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<212> DNA
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acetobutylicum）
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1 tatattgata aaaataataa tagtgggtat
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121 aaatttagga ggttagttag a
Claims (2)
1. 一种能耐受高浓度丁醇的梭菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）pIMPI-Thl质粒的构建：以丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC 824基因组作为模板，利用PCR扩增141 bp的乙酰CoA酰基转移酶的启动子序列，将乙酰CoA酰基转移酶的启动子序列经Sal I和BamH I酶切后与pIMPI质粒连接，得到pIMPI-Thl质粒；
所述乙酰CoA酰基转移酶的启动子序列为SEQ ID NO.3；
（2）htrA基因过量表达重组质粒的构建：以丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC 824基因组作为模板，利用PCR扩增1302 bp的htrA基因，所述htrA基因序列为SEQ ID NO.1，将htrA基因与步骤（1）所得pIMPІ-Thl质粒进行连接从而构建pITHtrA质粒；将重组质粒转入E. coli TOP10(pAN1)中进行甲基化，得到甲基化质粒pITHtrA；
（3）htrA基因过量表达重组菌株的构建：厌氧条件下，取60-120mL梭菌强化培养基培养的对数中后期的丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC 824细胞液，4℃、3000rmp离心10分钟，去除上清液，加入60-120mL预冷的电转缓冲液，洗涤两次，并重悬至1.5mL的电转缓冲液中，然后取30-50µL转入0.4cm的电转杯中，放置冰浴中用于电转化，加入100-300µg步骤（2）所得甲基化质粒pITHtrA，置于冰浴中2-3分钟，采用2000v脉冲电压和25µF的电容进行电转化，随后将电转液加入到梭菌强化培养基RCM中，37℃培养4-6小时，2000-3000rmp离心10分钟收集细胞，将收集的细胞涂布于含有红霉素抗性的RCM琼脂培养基上，培养36-40小时后，获得含有htrA基因过量表达质粒pITHtrA的丙酮丁醇梭菌；
（4）重组菌的丁醇耐受性检测：培养步骤（3）所得含有htrA基因过量表达质粒pITHtrA的丙酮丁醇梭菌重组菌至对数生长初期OD600nm=1.0±0.2，厌氧条件下分别分转至含有不同浓度丁醇的培养基中，以含有pIMPІ 空质粒的梭菌作为对照，37℃条件下继续培养，于不同时间测定培养基OD600nm的变化。
2.根据权利要求1所述的能耐受高浓度丁醇的梭菌的构建方法，其特征在于，所述电转缓冲液含270mmol/L蔗糖，5mmol/L NaH2PO4 ，pH为 7.4。
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| Transcriptional Analysis of Butanol Stress and Tolerance in Clostridium acetobutylicum;Christopher A. Tomas等;《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》;20040430;第186卷(第7期);2006-2018 * |
| 丙酮丁醇发酵菌的分子遗传改造;杨明 等;《中国生物工程杂志》;20091231;第29卷(第10期);109-114 * |
| 杨明 等.丙酮丁醇发酵菌的分子遗传改造.《中国生物工程杂志》.2009,第29卷(第10期),109-114. |
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