MX2011000716A - Produccion de etanol incrementada en bacterias recombinantes. - Google Patents

Abstract

La invención concierne a una bacteria recombinante con características de producción de etanol potenciadas cuando se cultiva en un medio de crecimiento que comprende glicerol. La bacteria recombinante comprende un gen heterólogo insertado que codifica la glicerol deshidrogenasa, y/o un gen nativo sobre-regulado que codifica la glicerol deshidrogenasa. Particularmente se proporciona la bacteria recombinante BG1G1 de la especie Thermoanaerobacter mathranii con un gen heterólogo insertado que codifica el tipo E.C. 1.1.1.6, una glicerol deshidrogenasa dependiente de NAD obtenida de Thermotoga maritima.

Description

ÜCCION DE ETANOL INCREMENTADA EN BACTERIAS RECOMB Campo de la Invención La presente invención se refiere a b binantes con capacidades de producción de mentadas cuando se cultivan en medio que c rol . Las bacterias recombinantes comprenden ólogo insertado que codifica la glicerol deshidr un gen nativo sobre-regulado que codifica la drogenasa .

Antecedentes de la Invención La producción de etanol en el mundo totaliza nes de litros en el 2005 y se incrementa ráp sión en EUA, 2006) . La producción de etanol pued de almidón o azúcar, que principalmente cons ntación diferentes. Para producir etan ntación se requiere un microorganismo capaz de c azucares en etanol rápidamente y con rendimie l muy altos. Tradicionalmente , los organismos ta vadura Saccharomyces cerevisiae o la bacteria Z is se han usado, pero estos organismos aciones especialmente cuando viene la ferment azucares de pentosa de hemicelulosa y el rí minación.

El material lignocelulósico es la fuente más al arbohidrato en la tierra, y la segunda azú tante en esta biomasa es xilosa - un azúcar de producción de etanol de biomasa lignocelulosica económicamente favorable, entonces todas las usarse, inc^yendo pentosas.

Las bacterias anaeróbicas termofílicas han prob La WO 2007/053600A describe que tan cerca mientos estequiométricos de etanol de glucosa n obtenerse al eliminar los genes codificad to deshidrogenasa, fosfotransacetilasa y acetat her oanaerobacterium saccharolyticu . Sin embarg ue no puede ser aplicable en organismos termofíl n genes de fosfotransacetilasa y acetato ples y no facilita la utilización de glicerol.

El rendimiento de etanol es de gran importancia, mía de la producción de bioetanol, ya que los mentados pueden obtenerse sin un incremento en e a biomasa o costos de la producción. Para Esc se ha mostrado que una vez que los niveles de ato ya no se limitan, la disponibilidad del co lación de la forma reducida hasta oxidada del volverse limitante para el rendimiento de ndiol (Berrios-Rivera et al . , 2003) y en Clo butylicum para promover la producción de 1,3-pr alez-Pajuelo et al., 2006). En ambos casos la drogenasa está en la trayectoria directa al pr cido, y no ocurre la producción de propandiol ncia del gen. La función principal día drogenasa no es cambiar el balance reducción-o a célula, pero al contrario proporciona un ctoria .

Es por lo tanto un objetivo de la presente i rcionar bacterias recombinantes , en particular h óbicas termofílicas , con capacidades de produc l incrementadas que son capaces de supe culos mencionados arriba.

Breve Descripción de la Invención o comprende las etapas de cultivar una bact do a la invención en un medio de crecimie ende glicerol y una fuente de polisacári ciones adecuadas.

Finalmente, se proporciona un método para prod ria recombinante que tiene características de pr tanol potenciadas cuando se cultiva en un m miento que comprende glicerol, en donde el ende transformar una bacteria precursora ción de un gen heterólogo que codifica drogenasa, y/o sobre-regular un gen nativo que rol deshidrogenasa; y obtener la bacteria recomb Breve Descripción de las Figuras Figura 1. El modelo de metabolismo anaeróbico e óbico termofílico que produce bacterias y el ato-ferredoxin oxidoreductasa, PTA= Fosfotransac cetato cinasa, ALDH= Acetaldehído deshidrogenas ato descarboxilasa , ADH= Alcohol deshidrogenasa.

Figura 2. Presentación esquemática del fragmento l usado para reemplazo del lactato deshidroge oanaeroJbacter BG1 con un cásete de resiste icina y la glicerol deshidrogenasa de Th ima, ldh cadena arriba y ldh cadena abajo rep egiones 725 pb y 630 pb cadena arriba y cadena a to deshidrogenasa de BG1. Pxyl es el promo cribe el gen gldh.

Figuras 3A-3B. El análisis PC de dos clone endientes. Figura 3A: PCR en ADN cromosomal , y dos clones BG1G1 usando cebadores de re to deshidrogenasa externos. Figura 3B: Anál icción de los fragmentos mostrados en A usando zaron fermentaciones en lote.

Figura 6. Relación de etanol sobre acetato produ clones independientes de BG1G1 como una fun ntración de glicerol en el medio de crecimiento .

Figura 7. Concentraciones de compuestos diferent nte (símbolos abiertos) y dentro del reactor ( dos) de una fermentación continua de mezclas de rol en un reactor de flujo ascendente.

La Figura 8 ilustra la conversión de azúca miento de etanol (g/g) en la fermentación contin Descripción Detallada de la Invención La presente invención concierne a b binantes con características de producción de ciadas. Más específicamente se ha encontrado terísticas de producción de etanol para ba notación alternativa usada a menudo para etanol H, que ndica que el carbono de un grupo metil nlaza al carbono de un grupo metileno (-CH2-), a al oxígeno de un grupo hidroxilo (-0H) . Un amente usado para etanol es EtOH.

El glicerol es un compuesto químico que está di ? mercado mundial a un costo razonable. En el l el término "glicerol" se pretende que signi esto químico con la fórmula general H0CH2CH (OH) C rol es un líquido incoloro, inodoro, viscoso y amente en formulaciones farmacéuticas. El mente también se nombra glicerina, es un alc r, y es de sabor dulce y de baja toxicidad. El sub-producto al 10% de producción biodiesel y e licerol ha disminuido dramáticamente durante los debido a la producción incrementada de biodies nativo sobre-regulado que codifica una drogenasa. Un número de enzimas útiles que idad de glicerol deshidrogenasa se conocen ca. En modalidades actualmente preferidas la drogenasa se selecciona de glicerol deshidrogena .6); Glicerol deshidrogenasa (NADP(+)) (E. C. 1. rol 2 -deshidrogenasa (NADP(+)) (E. C. 1.1.1. rol deshidrogenasa (aceptador) (E. C. 1.1.99.22).

Los genes útiles que codifican las drogenasas mencionadas pueden derivarse de un n es diferentes tales como microorganismos, in s y bacterias, y células de animal, tales como mífero y células de insecto.

En una modalidad preferida actualmente la drogenasa es, como se menciona arriba, del tip .6, esto es una glicerol deshidrogenasa depend én se contempla que los genes de glicerol deshid s puedan derivarse de otras bacterias tal richia coli, Salmonella typhimurium, Clo inum, Vibrio vulnificus, Clorobium ferro cter Lovleyi, Ruminococcus gnavus, Bacillus co iella pneumoniae, Citrobacter koseri, Shigella iella pneumoniae, Clostridium butyricum, Vibrio tia proteamaculans. Los genes útiles que codi o de glicerol deshidrogenasas tipo E. C. 1.1 ran en el listado de secuencias acompañante (SE .

En consecuencia, el gen heterólogo que codif rol deshidrogenasa tipo E. C. 1.1.1.6 p idades útiles seleccionarse del grupo que consis D NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, lo herramientas de manipulación del gen ade dimientos de ingeniería genética.

La integración cromosomal de los genes externo er diversas ventajas sobre construcciones con ido. En consecuencia, el gen heterólogo de drogenasa puede de acuerdo con la invención inco i cromosoma de la bacteria. En ciertas modalid eterólogo de glicerol deshidrogenasa se inserta n que codifica el lactato deshidrogenasa de la b dalidades adicionales el gen heterólogo que codi rol deshidrogenasa se inserta en una región que osfotransacetilasa de la bacteria de acuerdo ción. Aún en modalidades adicionales, el gen he licerol deshidrogenasa se inserta en una reg ica el acetato cinasa de la bacteria.

El gen heterólogo que codifica glicerol deshid a bacteria recombinante puede obtenerse al tra bacteria precursora al sobre-regular un gen na nte en la bacteria precursora que codifica una drogenasa. Un número de métodos y sistemas -regulación de genes son bien conocidos en la fecto sistemas inducibles en los cuales el sist do a menos que exista la presencia de una tora que se permite para la expresión del ma bien conocido es el operón Lac que consiste estructurales adyacentes, un promotor, un termi perador. El operón lac se regula por varios yendo la disponibilidad de glucosa y de lactosa.

En una modalidad específica, el gen heteról ica glicerol deshidrogenasa, y/o el gen nativ ado que codifica glicerol deshidrogenasa sobre-e plásmido de copia múltiple. miento relativamente bajo. Los aislados pu idades útiles seleccionarse por su capacidad par zucares de hexosa y/o pentosa, y oligómeros s, a temperaturas termofílicas .

Las bacterias de tipo natural seleccionadas rias recombinantes resultantes de la invención, varse bajo condiciones de cultivo convenc diendo . de las bacterias elegidas. La elección atos, temperatura, pH y otras condiciones de cre n seleccionarse con base en requerimientos de idos .

Sin embargo, como se apreciará de los si íos, la presente invención es particular bien- mejorar los rendimientos etanol en b binantes termofílicas . De esta manera, la rianas recombinantes de acuerdo a la invenc so de fermentación de levadura convencional que Posteriormente, una planta de producción más pe ere para una productividad volumétrica dada, p e los costos de construcción de la planta. Como nciona previamente, a alta temperatura, existe u ido de contaminación de otros microorg tando en menos tiempo de inactividad, producti a incrementada y un requerimiento de energía esterilización de la carga de alimentaci ratura de operación alta también puede facil eración posterior de los productos de ferm tantes .

Por lo tanto, en modalidades preferidas la binante es capaz de crecer a una temperatur valo de alrededor de ¼0-95°C, tal como el inte edor de 50-90°C, incluyendo el intervalo de aire aparente de los siguientes ejemplos, particular rias termofílicas que son bacterias anaeróbicas , rias que no requieren oxígeno para su crecimie manera, las bacterias pueden en modalidades út obios obligados que son bacterias que morirán c gan a niveles atmosféricos de oxígeno. Tambié naerobios facultativos que pueden usar oxígeno c ntan, o bacterias aerotolerantes que pueden so presencia de oxígeno, pero son anaeróbicas debi an oxígeno como un aceptador de electrones termi En particular se prefiere si la bacteria es de Clostridia, en particular las bacterias ana fílicas de la orden de Thermoanaerobacteriale de la familia de Thermoanaerobacteri ceae, inclu o de T ermoan erojbacter.

De esta manera, de acuerdo con la invención, la ophilus, Thermoanaerobacter subte oanaerobacter sulfurophi1us, Thermoanae ongensis, Thermoanaerobacter thermo oanaerobacter thermohydrosulfuricus, Thermoanae lii, Thermoanaerobacter yonseiensis .

En ciertas modalidades, y como será aparente entes ej emplos , la bacteria deriva oanaeroJbacter mathranii puede seleccionarse de B o de Acceso 18280) y mutantes de la misma. BG ito previamente en WO 2007/134607 y se conoce idades de producción de etanol excelentes. Se d O 2007/134607, que la BG1 de cepa base en mod josas puede modificarse con objeto de obtener mu ados de BG1, con características mejoradas. a, en una modalidad las bacterias recombina do a la invención es una variante o mutante d tante se terminó BGIBGI .

De esta manera, en una modalidad actualmente p cteria recombinante es Ther oanaerobacter mathra que se ha depositado de acuerdo con los térm do de Budapest el 23 de marzo de 2007 con che Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur eroder Weg Ib, 38124 Braunschweig, Alemania b o de Acceso 19229.

Como se muestra en los ejemplos acompañan ción de glicerol deshidrogenasa lleva a una acti^ rol deshidrogenasa específica NAD+ importa ctos de BGIBGI que crece en glucosa, en contrast cteria tipo natural donde no se detecta activida Se encontró que no sólo BGIBGI se produce cerc mientos teóricos de etanol, también cons rción importante del glicerol agregado, por ello glicerol puede tolerarse.

También se observa que el rendimiento de et 1 incrementa por al menos 36% como se compara co po natural y 15% como se compara con un mutante to deshidrogenasa se ha eliminado sin inserción rol deshidrogenasa. Se muestra que la expresió rol deshidrogenasa es instrumental en este incre endimiento de etanol , ya que no se observa ren mentado o actividad de enzima de glicerol deshid o la cepa se hace crecer en la ausencia de xilos promotor no está activo y el gen de drogenasa por lo tanto no se expresa.

Los siguientes ejemplos también ilustran que en idades una concentración mínima de 40% (p/p) de elación a xilosa es necesaria para obtener el e un incremento de hasta 400% (p/p) no cian por al menos 5%, tal como al menos 10%, tal 15%, tal como al menos 20%, tal como al menos al menos 30%, tal como al menos 35%, tal como tal como al menos 45%, tal como al menos 50%, nos 55%, tal como al menos 60%, tal como al me como al menos 70%, tal como al menos 75%, tal 80%, tal como al menos 85%, tal como al menos al menos 95%, tal como al menos 100%, tal como y tal como al menos 200%, como se compara ria de tipo natural correspondiente (bact binante precursora) .

Las bacterias recombinantes de la invención son, onan arriba, cultivan en un medio de crecimi ende glicerol. La concentración o cantidad e rol puede variar significativamente, y está bie capacidad de la persona experimentada para opti En modalidades adicionales de la invención, el miento comprende glicerol en una cantidad valo de 1 hasta 10 g/L, tal como el intervalo tal como el intervalo de 1-5 g/L, tal como el i 4 g/L.

En algunas variantes, el medio de crecimiento c hidratos seleccionados del grupo que cons acáridos, oligosacáridos y polisacáridos .

En algunas modalidades de interés, uno o má onales se han insertado y/o eliminado en la bact Puede para ciertas modalidades desearse inserta genes adicionales en las bacterias recombina do con la invención. De esta manera, con ob ar el rendimiento de etanol o el rendimiento cto de fermentación específico, puede ser tar uno o más genes que codifican una polisacara .15) ; alfa-glucuronidasa, alfa-L-arabinofuranosi .55), acetilesterasa (EC 3.1.1.-), acetilxilan .1.1.72), alfa amilasa (EC 3.2.1.1), beta-amil .2), glucoamilasa (EC 3.2.1.3), pululana .41), beta-glucanasa (EC 3.2.1.73), hemic nosidasa, mananasas incluyendo manan endo-1 idasa (EC 3.2.1.78) y manan endo- 1 , 6-alfa-manosi .101), pectin hidrolasa, poligalacturonas .15), exopoligalacturonasa (EC 3.2.1.67) y pecta .2.2.2) .

Dependiendo del producto de fermentación dese mpla que en ciertas modalidades es útil para heterólogos que codifican un piruvato descar como EC 4.1.1.1) o para insertar un gen heteró ica un alcohol deshidrogenasa (tal como EC 1.1. .2, EC 1.1.1.71, o EC 1.1.99.8) o para sobre nado. Todavía en otra variante de la bacteri ción, uno o más genes que codifican un acetato c liminado. Todavía en otra variante de la bacter ción, uno o más genes adicionales se han sobre- ub-regulado .

Debe entenderse que las modificaciones mencionad n combinarse .

La presente invención también se proporciona o efectivo para producir etanol, que comprende bacteria de acuerdo a la invención en un m miento que comprende glicerol y una fu hidrato bajo condiciones adecuadas.

La fuente de carbohidrato sirve como el sustr bacterias recombinantes de acuerdo con la inven ontexto actual el término "fuente de carbohid nde para incluir compuestos químicos que ti oatómicos similares. También se incluyen deriv compuestos.

El término genérico "monosacárido" (a difere sacárido o polisacárido) significa una unidad s conexión glicosídica a otras tales unidades, as, dialdosas, aldocetosas, cetosas y dicetos azucares desoxi y azucares amino, y sus deriva ondición de que el compuesto precursor tenga nilo (potencial) . El término "azúcar" se entemente a monosacáridos y oligosacáridos inf ejemplos típicos son glucosa, fructosa, nosa, galactosa y mañosa.

"Oligosacáridos" son compuestos en los cua des de monosacárido se unen por ligaduras glico cuerdo al número de unidades, se nombran disa cáridos, tetrasacáridos , pentasacáridos etc. binante de acuerdo a la invención se cultiva ncía de una fuente de polisacárido selecció on, glucosa, lignocelulosa, celulosa, hemic geno, xilano, glucuronoxilano, arabin nogalactano, glucomanan, xiloglucano, y galactom La producción de etanol de biomasa lignocelulósi ateriales de planta) han atraído la atención e una fuente renovable de bajo costo no limi ía para los combustibles de transporte. Debido a as en costo del material crudo para más de 30% s de producción, económicamente, es esencial q azucares principales presentes en la celulósica se fermenten en etanol. Las ntadas principales derivadas de hidrólisis de iales lignocelulósicos son glucosa y xilo organismos actualmente usados para producción d esión de glucosa" esto es utilización de ncial, la conversión de xilosa inicia sólo despu nación de glucosa, resultando en "conserva a" esto es fermentación de xilosa incompleta, ntación de glucosa y xilosa es por lo tanto u al al reducir el costo en producción de et íales crudo lignocelulósicos . Las bacterias ana fílicas tienen la característica única de ser ca ntar la diversidad completa de azucares mon ntes en hidrolisados lignocelulósicos. Además, trial de microorganismos termofílicos para produ l de combustible ofrece muchas ventajas pot yendo velocidades de bioconversion altas, bajo r minación, ahorros en costo por medio de m amiento y recuperación del producto facilitad organismos son, sin embargo, sensibles a concent celulósico ha sido al menos parcialmente sepa osa, hemicelulosa y lignina por ello tiene incr área de superficie del material. El celulósico útil puede, de acuerdo con la in arse de material de planta, tal como paja úos de jardín, residuos domésticos, madera, va , vainas de semilla, vainas de maíz, vainas d s de soya, fibras de maíz, rastrojo, va oncillo, hojas, semillas, fruta, pasto, madera, , algodón, cáñamo, lino, yute, ramio, capoc, do, granos destiladores, aceite de palma, maíz, r y betabel .

En algunas modalidades, el material de celulósica se presente en el medio de cre do en un contenido de materia seca de al menos omo al menos 15% p/p, incluyendo al menos 20% elulosa de polímeros de azúcar parcialm etamente se hidrolizan a sus monómeros de ituyentes. Otro tipo de hidrólisis de lignocel sion de vapor, un proceso que comprende calen material lignocelulósico por inyección de vapo ratura de 190-230°C. Un tercer método es o a en donde el material se trata con oxígeno a 15 pre-tratamientos pueden seguirse por hi ática para completar la liberación de monóm r . Esta etapa de pre-tratamiento resulta lisis de celulosa en glucosa mientras elulosa se transforma en las pentosas xilosa y a S hexosas glucosa, galactosa y mañosa. La etapa miento puede en ciertas modalidades complement miento resultando en hidrólisis adicionales osa y hemicelulosa . El propósito de tal tratam ntervalo de alrededor de 100-150°C. La hi ática se realiza típicamente por tratamiento co nzimas de carbohidrasa apropiadas tales como ce sidasas y hemicelulasas incluyendo xilanasas .

Se encontró de manera sorprendente que la BG1BG1 riana recombinante de acuerdo con la invención recer en un medio que comprende un material de celulósica hidrolizado que tiene un contenido de de al menos 10% p/p, tal como al menos 1 yendo al menos 20% p/p, y aún tan alto como al m Este tiene la ventaja mayor que no puede ser n diluir el hidrolizado antes del proceso de ferme r ello es posible obtener concentraciones más l , y por ello los costos para recu riormente del etanol pueden disminuirse (eo lación para etanol incrementarán con concent al menos 6 g/L, tal como al menos 7 g/L, tal 8 g/L, tal como al menos 9 g/L, tal como al tal como al menos 15 g/L, y tal como al menos 20 idades adicionales de la invención, el m miento comprende glicerol en una cantidad valo de 1 hasta 10 g/L, tal como el intervalo tal como el intervalo de 1-5 g/L, tal como el i 4 g/L.

Como se muestra en los ejemplos, el método de a invención puede en ciertas modalidades ser un fermentación realizado bajo condiciones ana as, esto es condiciones donde no se presenta oxí El proceso de fermentación puede en modalidade cirse en un bioreactor que se opera usando un n diferentes de operación, tal como fermentación ntación de lote de alimentación o fermentación c ato (xilosa y glicerol) correspondiente a miento máximo teórico con base en las tray ólicas de Clostridia . Si en cambio el rendimient únicamente en la xilosa y glicerol de sustrato d nsidera una adición, el rendimiento máximo es 0. l por g de xilosa correspondiente a 108%. Esto otencial mayor de usar bacterias recombinante ción para la producción de etanol si una abie de etanol se presenta.

Como se menciona previamente la cepa ba binante de acuerdo a la invención puede en mod s ser una bacteria termofílica. Como se muestr los acompañantes las bacterias recombinantes BG rias anaeróbicas termofílicas y severas que son recer a altas temperaturas aún en o arriba de de que la cepa es capaz de operar a es los costos de construcción de la planta. Como nciona previamente, a alta temperatura, existe u ido de contaminación de otros microorg tando en menos tiempo de inactividad, producti a incrementada y un requerimiento de energía esterilización de la carga de alimentaci ratura de operación alta también puede facil eración posterior de los productos de ferm tantes .

En consecuencia, el método de producción de e do a la invención se opera preferiblemente ratura en el intervalo de alrededor de 40-95°C, tervalo de alrededor de 50-90°C, incluyendo el i lrededor de 60-85°C, tal como el intervalo de a -75°C.

El método de acuerdo con la invención puede cot ción puede comprender además una etapa en d ente de glicerol se convierte a biogas (por o generado) que puede posteriormente usarse para ía tal como calentamiento y electricidad.

De acuerdo con la invención, también se propor o para producir una bacteria recombinante qu terísticas de producción de etanol potenciadas c va en un medio de crecimiento que comprende glic o para producir la bacteria recombinante compr s de transformar un tipo natural (bacteria precurs nserción de un gen heterologo que codifica la drogenasa o al sobre-regular y el gen nativo ya e glicerol deshidrogenasa que codifica la bacteria al. También está dentro del alcance de la invenci tar un gen heterologo como sobre-regular un gen n isma bacteria. El método comprende además las e slandia á 70°C. Todas las cepas se cultivaron óbicamente en medio mínimo (BA) con 2 g/L de ext ura como en (Larsen et al., 1997) a menos lezca de otra manera. Para medio sólido, los (Hungate RE, 1969; Bryant MP, 1972) que contie n 11 g/L de fitagel y 3.8 g/L MgCl2 6H20 adic Para propósitos de clonación, Escherichia col trogen, EUA) se usó.. ToplO se cultivó de aria a 37 °C en medio Luria-Bertani (Ausubel complementado con 100 g/mL de ampicilina cu ario .

El material de paja oxidado húmedo se preparó u o de pretratamiento de oxidación húmedo desc e et al. (Bjerre et al., 1996) a una concentr os secos al 20%. Al material se agregó metales e taminas como en medio BA y diluyó en agu ectarón después de 48 h de crecimiento.

Para fermentación continua en reactores de dente, el medio se preparó y complementó con lo ales, metales en trazas, y extracto de levadura ibe arriba a menos que se establezca de otra ma nicial del medio se ajustó a 7.4-7.7 y se co lave a 120 °C durante 30 min. Para asegu ciones anaeróbicas, el medio se enjuagó dur os con una mezcla de N2/C02 (4:1), y finalmente tó en la botella para dar una concentración f g/L.

El reactor fue una columna de vidrio enchaque con 4.2 cm de diámetro interno y 20 cm de al en de trabajo del reactor fue 200 mL. El sado del fondo del reactor y la alimentación se na bomba peristáltica (Modelo 503S-10rpm, Watson yendo la tubería y el reservorio de recirculac ó en autoclave a 120°C durante 30 min. Antes de istema de reactor se gasificó durante 15 minu 2 (4:1) para asegurar las condiciones anaeró nar con medio BA con concentraciones de x rol iniciales de 17.5 g/L y 9.7 g/L. El rea o en modo de lote por inoculación con 10 nsión celular con una densidad óptica (OD578) d odo de lote de operación se mantuvo durante 4 tiendo que las células se enlacen e inmovilice z portadora. Después de la corrida del lote, el mbió a modo continuo aplicando un HRT de 24 hor idad de flujo ascendente de 1 m/h. os analíticos Las cepas se hicieron crecer en medio KO) a 80 °C con agua como eluyente. La mañosa y a eclen distinguirse usando este sistema y por lo ron en cultivos separados. El hidrógeno se midi omatograma de Gas GC82 (MikroLab Aarhus, Dinamar as y reactivos Si no se establece de otra manera las enz istraron por BI Fermentas (Alemania) y us do a las recomendaciones de los proveedor iones PCR se realizaron con una mezcla de 1 d de Taq polimerasa y Pfu polimerasa. Los n de grado molecular y se adquirieron de Sigma a AB. trucción del cásete de inserción del gen gldh El fragmento de ADN usado para inserción del ki et al . , 1999) , 3) un cásete de expresión compuesto de un prom ctura de lectura abierta gldh completa de Th ime y un terminador independiente rho, y 4) un fragmento ADN cadena abajo del gen 1-ldh ficado usando cebadores ldhdown3F (SEQ ID NO: AAAAGTCACAGTGTGAA) y ldhdown4 (SEQ ID NO: ATTTTGCACTTTTTTTC) . El p3CH plásmido se lmente y electropora en BG1. o de glicerol deshidrogenasa La actividad Gldh de la cepa probada se determ scribe a continuación. Las cepas probadas se cu 0 mL de medio BA con 5 g/L de glucosa/xilosa y rol como sustrato de crecimiento a 70 °C bajo con óbicas . Los cultivos en un OD578 de -0.5 se eo usando el método de determinación de v trofotométrica continua como se describe pre on, R. M. ; 1955) . Una unidad se definió como la zima que produce 1 pmol de NADH por minuto a 7 La concentración total en los extractos celul de manera rutinaria por el método Bradford (B , 1976) usando albúmina de suero de bovino (BSA) dar . los Una pérdida importante de etanol se observó cu ntaciones se realizan a 70 °C sin condensación de as. Para tomar esta pérdida en cuenta, la s la se usó ft , . 3(CEtON IMEIOH + Cáce / Máce)+ CBM IMBM %) =— ¿ x 100 : SCxyl I Mxyl+ 3Cdy iAÍGfy oduce por mol de etanol o acetato (Desai et al. et al., 2001). También se asume que no se form ctos. Esta suposición es razonable, ya eración de carbono de cerca de 100% (SD±2%) se ermentaciones de lote cerradas, donde no oc da de etanol .

LO 1 rucción de BG1G1 La lactato deshidrogenasa de BGl se reemplazó po sistencia de canamicina y una glicerol deshidrog otoga marítima usando el fragmento mostrado en l os clones resultantes se verificaron por PC ores alineados en sus pares base fuera de l para la recombinación homologa. De esta ma ción ldh en la cual la recombinación no ha teni Para confirmar que una glicerol deshidrogenasa ivamente insertada bajo el control del Pxyl pro a isomerasa, los estudios de la actividad de drogenasa en cultivos crecidos en glucosa y xi zaron. Los resultados se muestran en la Tab nuación . 1. Actividad Gldh dependiente de NAD+ especí T. BGl de tipo natural y mutantes de Ll y Gl Actividad (U/mg) Glucosa Xilosa ND ND ND ND ND 0.438 + 0.04 Una unidad se define como la cantidad de enz ce 1 µt??? de NADH por minuto a 70°C y pH 8 drogenasa se detectó mostrando que el gen rtado correctamente y que fue bajo el cont tor Pxyl .

BG1 , BG1L1 y BG1G1 se hicieron crecer en medio e xilosa y 5 g/L de glicerol en lote. Cuando x nta en el medio, el promotor Pxyl que transcrib se activará, y la enzima Gldh se producirá. el glicerol presente en el medio a glicer ción concomitante de NAD+ a NADH + H+. Com iarse de la Figura 4, BG1G1 tiene un ren ficativamente superior de etanol bajo estas con se compara con el BG1 de tipo natural o el drogenasa deficiente de BG1L1 mutante. resión incrementada es dependiente de la expré ldh mentado .

LO 4 ízación de concentración de glicerol La Figura 6 muestra la relación de etanol a cida en los experimentos de lote con dos endientes de BG1G1 usando xilosa como fu no y con concentraciones variadas de glicero apreciarse, los rendimientos de etanol más a nen con concentraciones de glicer imadamente 1 hasta 9 g/L de glicerol en el m entraciones más altas, los rendimientos de riores se aprecian, probablemente debido a ocada por la escasez de NAD+, que es necesar LO 5 LO 6 miento de BG1G1 en cultivo continuo Las productividades de etanol más altas pueden o e usan sistemas de reactor inmovilizadas co onalmente, muchas bacterias anaeróbicas term n baja tolerancia a concentraciones de azúcar a ema que puede superarse con el uso de sist ntación continuos. BG1G1 se hizo crecer en un re ascendente continuo para mostrar que los rend de etanol pueden producirse en este tipo de rea Como la Figura 7 muestra, el estado fijo se és de 27 días en concentraciones de xilosa y gli g/L y 7.2 g/L, respectivamente. En esta etapa ca zucares se consumieron y no se detectó ácido lác miento de etanol más alto, de 0.47 g de etanol a y glicerol consumido, correspondiente a sa constitutivamente una glicerol deshidrogenas ventaja si el glicerol puede adquirirse en u abie. El glicerol no consumido en la fermentaci ablemente convertirse en biogas, por ello in s el valor del proceso. La' Figura 8 ilu rsión de azúcar y el rendimiento de etanol (g/ ntación continua.

Se hace constar que con relación a esta fecha, e o conocido por la solicitante para llevar a la p tada- invención, es el que resulta claro de la pr ipción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antec ma como propiedad lo contenido en las si ndicaciones: 1. Una bacteria recombinante termofílica carac e comprende un gen heterólogo que codifica una drogenasa, en donde el gen heterólogo que codi rol deshidrogenasa se ha incorporado en el cromo 2. La bacteria de conformidad con la reivindic terizada porque el gen heterólogo insertado icando una glicerol deshidrogenasa seleccion que consiste de Glicerol deshidrogenasa (E. C í rol deshidrogenasa (NADP{+)) (E. C. 1.1.1.72); hidrogenasa (NADP(+)) (E. C. 1.1.1.156); y drogenasa (aceptador) (E. C. 1.1.99.22) . D NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : : 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : : 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17. 5. La bacteria de conformidad con cualquiera* ndicaciones precedentes, caracterizada porque ólogo que codifica una glicerol deshidroge ta en la región que codifica el lactato deshid bacteria, o se inserta en una región que cod transacetilasa de la bacteria, o se inserta n que codifica el acetato cinasa de la bacteria. . La bacteria de conformidad con cualquiera ndicaciones precedentes, caracterizada porque ólogo que codifica la glicerol deshidrogenasa blemente a un promotor inducible, regu itutivo . 7. La bacteria de conformidad con cualquiera terizada porque tiene rendimiento de etanol incr ilosa cuando se cultiva en un medio de crecimie ende glicerol y xilosa como se compara con la rsora . 11. Un método para producir etanol-, caracterizad ende las etapas de cultivar una bacteria de con cualquiera de las reivindicaciones 1-10 en un miento que comprende glicerol y una fue hidrato bajo condiciones adecuadas, en donde l arbohidrato se selecciona del grupo que consist acárido, un oligosacárido y un polisacárido . 12. El método de conformidad con la reivindica terizado porque la fuente de carbohidrato acárido seleccionado del grupo que consiste de celulosa, celulosa, hemicelulosa, glicógeno, ronoxilano, arabinoxilano , arabinogalactan, glu miento comprende una concentración de 40% has de glicerol con relación a xilosa. 16. Un método para producir una bacteria reco terizado porque tiene rendimiento de etanol incr ilosa cuando se cultiva en un medio de crecimi ende glicerol y xilosa como se compara con la rsora, el método comprende (a) transformar una bacteria termofílica precur nserción de un gen heterologo que codifica la drogenasa en el cromosoma de la bacteria; y (b) obtener la bacteria recombinante .