CN105121637B

CN105121637B - 酿酒酵母中替代甘油形成的消耗电子的乙醇生产途径

Info

Publication number: CN105121637B
Application number: CN201380070930.8A
Authority: CN
Inventors: A·J·肖四世; A·阿吉罗斯; T·巴雷特
Original assignee: Mascoma Corp
Current assignee: Mascoma Corp
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2013-11-20
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2033-11-20
Also published as: EP2922950A1; CA2891455A1; US20200157579A1; EP2922950B1; WO2014081803A1; US11655484B2; US20160273004A1; IN2015DN04302A; BR112015011544B1; BR112015011544A2; US20210147882A1; DK2922950T3; CN105121637A; US10465208B2; CA2891455C; US20180142267A1; US9988650B2

Abstract

本发明提供了用乙醇形成的供选择的途径完全代替甘油形成的电子接受功能的机制，从而减少甘油产生和增加乙醇产生。在一些实施方案中，本发明提供了重组微生物，其包括下调甘油生产途径中的一种或多种天然酶。在一些实施方案中，本发明提供了重组微生物，其包括上调乙醇‑生产途径中的一种或多种酶。

Description

酿酒酵母中替代甘油形成的消耗电子的乙醇生产途径

参考序列表

将与本申请一起提交的电子形式提交的序列表(“2608.069PC02_PCT序列表_ascii.txt”，356,130字节，创建于2013年11月19日)的内容全部引入本文作为参考。

发明背景

能量转化、利用和获取成为我们时代的许多重大挑战的根本原因，包括与可持续性、环境质量、安全和生活质量相关的那些。需要新兴技术的新应用以对这些挑战作出响应。生物技术，一种最有力的新兴技术，可产生重要的新能量转化工艺。植物生物质和其衍生物是将能量生物转化成对人类有用形式的资源。

在植物生物质的形式中，基于颗粒的生物质和木质纤维素生物质(统称为“生物质”)非常适于能源应用。每种原料具有优势和劣势。例如，因为其大规模可用性、低成本，和环境友好地生产，木质纤维素生物质作为生物燃料生产的可行的进料(feed)来源受到关注。特别地，基于纤维素生物质的许多能源生产和利用循环在生命周期的基础上具有接近零的温室气体排放。

然而，基于颗粒的原料更容易通过现有的微生物转化成燃料，但是基于颗粒的原料比木质纤维素原料更昂贵并且转化成燃料与颗粒的供选择的用途竞争。

涉及酶或微生物水解的生物质加工方案通常涉及四种生物介导的转化：(1)产生糖解酶(纤维素酶和半纤维素酶)；(2)将预处理的生物质中存在的碳水化合物组分水解成糖；(3)己糖(例如葡萄糖、甘露糖和半乳糖)发酵；和(4)戊糖(例如，木糖和阿拉伯糖)发酵。这四种转化可发生在被称为联合生物加工(“CBP”)的工艺配置的单个步骤中，所述工艺配置与其他较不高度整合的配置的区别在于其不涉及用于纤维素酶和/或半纤维素酶生产的专用处理步骤。

CBP提供比特征在于专用的纤维素酶生产的过程成本更低和效率更高的潜力。这些益处部分源自避免了与纤维素酶生产相关的资本成本、底物和其他原料和设备。另外，数个因素支持使用CBP实现更高的水解速率，并且因此实现减小的反应器体积和资本投资，所述因素包括酶-微生物协同作用和使用嗜热生物体和/或复杂的纤维素酶体系。而且，纤维素粘附性分解纤维素的微生物可能与非粘附性微生物成功地竞争纤维素水解的产物，例如污染物。期望的微生物的成功竞争增加基于微生物纤维素利用的工业过程的稳定性。开发实现CBP的微生物的进展通过下述两个策略来进行：工程化天然存在的分解纤维素的微生物，以改善产物相关的特性，如产率和效价；和工程化显示高产物产率和效价的非分解纤维素的生物体，以表达能够利用纤维素和半纤维素的异源纤维素酶和半纤维素酶体系。

符合乙醇生产需求的一种方式是转化生物质中存在的糖以产生乙醇，所述生物质即比如农业废物、玉米外壳、玉米芯、纤维素材料等的材料。大规模工业应用中有效的生物质转化需要能够耐受高浓度糖和乙醇的微生物，并且其能够同时发酵多于一种糖。

烘焙酵母(酿酒酵母)是用于生产乙醇的优选微生物(B.等，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.73：53–84(2001))。用于酿酒酵母中乙醇产生的途径可见图1-3。有利于该微生物的属性是(i)接近理论产率的高产率(0.51g产生的乙醇/g使用的葡萄糖)，(ii)高渗透和乙醇耐受，(iii)工业过程中的天然稳健性，还有(iv)由于其与葡萄酒和面包制作以及啤酒酿造的长期关联而通常被视为安全的(GRAS)。此外，酿酒酵母显示对源自生物质预处理的水解产物中常见的抑制剂的耐受。产生乙醇的示例性代谢途径描绘在图1-4中。

然而，甘油是天然酵母乙醇发酵的必要的代谢终产物(图5A)。在碳水化合物上的厌氧生长期间，乙醇和二氧化碳的产生是氧化还原中性的，而产生细胞生物质和相关的二氧化碳的反应相对于碳水化合物更多是氧化的。相对于碳水化合物，甘油的产生更多是还原的，其用作电子冷阱，以抵消细胞生物质形成，以使总体氧化还原中性是守恒的。基于物质守恒的理论考虑这是必要的，并且在实践中不能产生甘油的菌株不能(或仅仅非常差的能够)在厌氧条件下生长。

有强的商业动机不产生甘油，因为其代表乙醇产率的损失。在工业玉米乙醇发酵中，对于～140亿加仑/年的市场，该产率损失可高达理论值的6％。以$2.50/加仑的销售价格，总市值为$2B/年。

解决该问题的来自文献的策略包括通过上调编码谷氨酰胺合酶的GLN1或编码谷氨酸合酶的GLT1，同时删除编码NADPH-依赖性谷氨酸脱氢酶的GDH1，通过工程化固定氨以与NADH而不是NADPH作用来减少甘油形成。(Nissen，T.L.等，Metabolic Engineering 2：69-77(2000))工程化细胞以在糖酵解期间通过表达NADPH产生过量NADPH的另一策略与甘油醛-3-磷酸脱氢酶相关。(Bro，C.等Metabolic Engineering 8：102-111(2006))。

然而，大部分甘油还原策略或者仅仅部分减少对甘油形成的需要，或产生乙醇之外的副产物。本发明通过将通常位于甘油上的电子重定向到乙醇形成中从而减少甘油产生和增加乙醇产生，来克服这些其他策略的缺陷(图5B，图6)。

发明概述

本发明多方面涉及重组微生物，其包括编码磷酸转酮酶的异源核酸；至少一种编码乙酰辅酶A生产途径中的酶的异源核酸；编码双功能醛-醇脱氢酶的异源核酸；和导致甘油生产途径中的酶下调的至少一种基因修饰。在一些实施方案中，磷酸转酮酶是具有酶学委员会编号4.1.2.9的单特异性磷酸转酮酶。在一些实施方案中，磷酸转酮酶是具有酶委员会编号4.1.2.22的双特异性磷酸转酮酶。本发明多方面涉及重组微生物，其包括至少一种编码乙酰辅酶A生产途径中的酶的异源核酸；编码双功能醛-醇脱氢酶的异源核酸；和任选地，至少一种导致甘油生产途径中的酶下调的基因修饰。在一些实施方案中，乙酰辅酶A生产途径中的酶是具有酶学委员会编号2.3.1.8的磷酸转乙酰酶。在一些实施方案中，乙酰辅酶A生产途径中的酶是具有酶学委员会编号2.7.2.12的乙酸激酶。在一些实施方案中，双功能醛-醇脱氢酶选自具有以下两个酶学委员会编号的酶：EC 1.2.1.10和1.1.1.1。在一些实施方案中，双功能醛-醇脱氢酶是NADPH依赖性双功能醛-醇脱氢酶，其选自具有以下酶学委员会编号的酶：EC 1.2.1.10和1.1.1.2。在一些实施方案中，甘油生产途径中的酶是具有酶学委员会编号1.1.1.8的甘油-3-磷酸脱氢酶。在一些实施方案中，甘油生产途径中的酶是具有酶学委员会编号3.1.3.21的甘油-3-磷酸磷酸酶。

在一些实施方案中，微生物进一步包括至少一种另外的上调的酶。在一些实施方案中，具有酶学委员会编号2.2.1.2的转醛醇酶被上调。在一些实施方案中，具有酶委员会编号2.2.1.1的转酮酶被上调。在一些实施方案中，具有酶学委员会编号5.3.1.6的核糖-5-P异构酶被上调。在一些实施方案中，具有酶学委员会编号5.1.3.1的核酮糖-5-P 3-差向异构酶被上调。

在一些实施方案中，糖酵解途径中的至少一种酶在微生物中被上调。在一些实施方案中，糖酵解途径中的酶是具有酶学委员会编号4.1.1.1的丙酮酸脱羧酶。在一些实施方案中，糖酵解途径中的酶是醇脱氢酶，其选自具有下述酶学委员会编号的酶：1.1.1.1和1.1.1.2。

在一些实施方案中，微生物另外包括至少一种基因修饰，其使得醛脱氢酶下调，所述醛脱氢酶选自具有以下酶学委员会编号的酶：1.2.1.3、1.2.1.4和1.2.1.10。在一些实施方案中，微生物另外包括至少一种基因修饰，其使得醛脱氢酶上调，所述醛脱氢酶选自具有以下酶学委员会编号的酶：1.2.1.3、1.2.1.4和1.2.1.10。在一些实施方案中，醛脱氢酶是乙醛脱氢酶。

在一些实施方案中，微生物另外包括至少一种基因修饰，其使得甲酸脱氢酶下调，所述甲酸脱氢酶选自具有以下酶学委员会编号的酶：1.2.1.43和1.2.1.2。

在一些实施方案中，微生物另外包括至少一种基因修饰，其使得具有酶学委员会编号2.3.1.54的丙酮酸甲酸裂解酶上调。在一些实施方案中，微生物另外包括至少一种基因修饰，其使得具有酶学委员会编号1.97.1.4的丙酮酸甲酸裂解酶活化酶上调。

在一些实施方案中，微生物是酵母。在一些实施方案中，微生物来自酵母属(Saccharomyces)。在一些实施方案中，微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

在一些实施方案中，本文所述的重组微生物以比缺少所述基因修饰的在其他方面相同的微生物更高的产率产生乙醇。在一些实施方案中，微生物产生比缺少所述基因修饰的在其他方面相同的微生物高1％-10％的乙醇效价。

在一些实施方案中，本文所述的重组微生物以比缺少所述基因修饰的在其他方面相同的微生物更低的产率产生甘油。在一些实施方案中，微生物产生的甘油效价比缺少所述基因修饰的在其他方面相同的微生物低10-100％。

在一些实施方案中，本发明涉及本文所述的宿主细胞和含碳原料。在一些实施方案中，原料选自木质生物质、草、糖加工残渣、市政废物、农业废物或其任何组合。在一些实施方案中，原料包括回收的木浆纤维、锯屑、硬木、软木、稻秸、稻壳、大麦秸秆、玉米芯、谷类秸秆、小麦秸秆、油菜秸秆、燕麦秸秆、燕麦外壳、玉米纤维、秸秆、肉质植物、龙舌兰、甘蔗渣、柳枝稷、芒草、造纸污泥、市政废物或其任何组合。

在一些实施方案中，本发明涉及使用本文所述的组合物生产发酵产品的方法，其中组合物的宿主细胞能够发酵含碳原料，生产发酵产品。

在一些实施方案中，本发明涉及生产乙醇的方法，其包括提供本文所述的任何宿主细胞；在存在含碳原料的情况下培养宿主细胞足够的时间以生产乙醇；和任选地，提取乙醇。

在一些实施方案中，本发明涉及减少甘油产生的方法，其包括提供本文所述的任何宿主细胞，其中所述甘油产生比缺少所述基因修饰的在其他方面相同的微生物少10-100％。在一些实施方案中，宿主细胞的甘油产生与缺少所述基因修饰的在其他方面相同的微生物相比减少，并且其中当宿主细胞在存在含碳原料的情况下培养足够的时间以生产乙醇时，乙醇效价增加至少1-10％。

在一些实施方案中，本发明涉及包括至少两种宿主细胞的共培养物，其中一种宿主细胞包括本文所述的宿主细胞和基因上与本发明的宿主细胞不同的另一种宿主细胞。在一些实施方案中，共培养物的基因上不同的宿主细胞是酵母或细菌。在一些实施方案中，基因上不同的宿主细胞是来自以下属的任何生物体：酵母属、伊萨酵母属(Issatchenkia)、毕赤酵母属(Pichia)、棒孢酵母属(Clavispora)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、木霉属(Trichoderma)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、埃希氏菌属(Escherichia)、梭菌属(Clostridium)、热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)和嗜热厌氧菌属(Thermoanaerobacterium)。

附图/图简述

图1描绘了利用单特异性磷酸转酮酶从葡萄糖到乙醇的简化代谢途径。催化可适于本发明步骤的酶的名字以斜体显示。

图2描绘了利用双特异性磷酸转酮酶从葡萄糖到乙醇的简化代谢途径。催化可适于本发明步骤的酶的名字以斜体显示。

图3描绘了不使用磷酸转酮酶从葡萄糖到乙醇的简化代谢途径。催化可适于本发明步骤的酶的名字以斜体显示。

图4描绘了乙酰-磷酸(“乙酰-P”)到乙醇的供选择的转化。

图5描绘了(A)野生型酿酒酵母在厌氧生长期间利用的简化的碳和氧化还原途径。乙醇形成是氧化还原中性的，而细胞生物质形成产生净NADH，其通过甘油形成平衡；和(B)用PHK-PTA-ADHE途径工程化的酿酒酵母用乙醇的产生平衡在细胞生物质形成期间产生的NADH。

图6描绘了通过其在总代谢途径的背景下可消除或下调甘油形成的机制。

图7描绘了使用单特异性和双特异性磷酸转酮酶的等价代谢相互转化。

图8描绘了PCR构建和在给定的靶基因座将KT-MX和NT-MX整合盒整合进入每个染色体的两个拷贝的示意图。(A)转化的PCR装配体包含四种PCR产物，与靶位点的上游序列同源的5’侧翼(p1)，KT-MX盒(p2)，NT-MX盒(p3)，和与靶位点的下游序列同源的3’侧翼(p4)。使用产生每个PCR产物的同源重叠延伸的引物，独立扩增每个组分。弯曲虚线表示KT/NT-MX盒和5’侧翼之间的同源性，以及弯曲实线表示与3’侧翼的同源性。(B)用KT-MX和NT-MX替换靶位点之后的染色体的示意图。

图9描绘了用于用“Mascoma装配体”在两条染色体上在靶基因座处替换整合的KT-MX和NT-MX选择盒的策略的示意图。Mascoma装配体(“MA”)用于确定当它们在生物体内重组时形成期望的构造的一系列重叠PCR产物。在该文件中，给出MA数以表示待通过重组来装配的分子组分的组合。(A)转化的Mascoma装配体包含一定量的PCR产物，其取决于期望的工程化事件(pX)、与靶位点的上游序列同源的5’侧翼(p1)和与靶位点的下游序列同源的3’侧翼(p4)。使用产生同源重叠延伸的引物独立扩增每种组分。重叠弯曲线表示在那些PCR产物末端的同源性。(B)在FUDR上选择和用Mascoma装配体替换遗传标志物之后的染色体的示意图。

图10描绘了青春双歧杆菌(B.adolescentis)PTA的整合方案和(A)青春双歧杆菌PHK、(B)植物乳杆菌(L.plantarum)PHK1，和(C)在酿酒酵母FCY1位点的黑曲霉(A.niger)PHK。

图11描绘了与不包含整合的PTA和PHK的菌株M3293相比，包含整合的PTA和PHK的酿酒酵母菌株M4008、M4409和M4410的改善的厌氧生长速率。

图12描绘了与不包含整合的PTA和PHK的菌株M3293相比，包含整合的PTA和PHK的酿酒酵母菌株M4008、M4409和M4410的需氧生长速率。

图13描绘了对于使用31％固体玉米醪液的发酵，与不包含整合的PTA和PHK的菌株M3293相比，包含整合的PTA和PHK的酿酒酵母菌株M4008、M4409和M4410的乙醇产生。M2390是野生型对照。

图14描绘了在使用31％固体玉米醪液发酵期间，与不包含整合的PTA和PHK的菌株M3293相比，在包含整合的PTA和PHK的酿酒酵母菌株M4008、M4409和M4410中乙酸的产生。M2390是野生型对照。

图15描绘了在限定的培养基中发酵期间，与不包含整合的PTA和PHK的菌株M3293相比，在包含整合的PTA和PHK的酿酒酵母菌株M4008、M4409和M4410中改善的生长。M2390是野生型对照。

图16描绘了在限定的培养基中发酵期间，与不包含整合的PTA和PHK的菌株M3293相比，在包含整合的PTA和PHK的酿酒酵母菌株M4008、M4409和M4410的限定的培养基中的乙醇产生。M2390是野生型对照。

图17描绘了在限定的培养基中发酵期间，与不包含整合的PTA和PHK的菌株M3293相比，在包含整合的PTA和PHK的酿酒酵母菌株M4008、M4409和M4410的限定的培养基中的甘油产生。M2390是野生型对照。

图18描绘了植物乳杆菌PHK1表达质粒。

图19描绘了植物乳杆菌PHK2表达质粒。

图20描绘了黑曲霉PHK表达质粒。

图21描绘了干酪乳杆菌(L.casei)PHK表达质粒。

图22描绘了粗糙脉孢菌(N.crassa)PHK表达质粒。

图23描绘了青春双歧杆菌PHK表达质粒。

图24描绘了青春双歧杆菌PTA表达质粒。

图25描绘了包含M3293背景中的途径组分的酿酒酵母菌株M4408、M4579、M4581、M4582、M4584、M4788、M4789、M4790、M4791、M4792、M4793、M4794和M4795的乙醇产生。

图26描绘了MA0281插入盒的示意图。

图27描绘了MA0449.2插入盒的示意图。

图28描绘了MA0449.3插入盒的示意图。

图29描绘了MA0449.1插入盒的示意图。

图30描绘了MA0467.6插入盒的示意图。

图31描绘了MA0435.1插入盒的示意图。

图32描绘了MA0415.4插入盒的示意图。

图33描绘了MA0415.3插入盒的示意图。

图34描绘了MA0434.6插入盒的示意图。

发明详述

定义

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有如微生物代谢工程领域的普通技术人员一般理解的相同含义。尽管与本文所述的那些类似或相同的方法和材料可用于公开的方法和组合物的实施，但是本文描述了示例性方法、设备和材料。

描述的实施方案和在说明书中提及的“一种实施方案”、“实施方案”、“示例性实施方案”等，表明描述的实施方案可包括具体的特征、结构或特性，但是未必每个实施方案都包括具体的特征、结构或特性。而且，这样的短语未必指相同的实施方案。此外，当结合实施方案描述具体的特征、结构或特性时，应理解，结合其他实施方案实现这样的特征、结构或特性在本领域技术人员的知识范围内，无论是否明确描述。

本文中的描述“一个(a)”或“一个(an)”物品可指单个物品或多个物品。应理解，在本文各处用语言“包括”描述实施方案时，也另外提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的类似实施方案。因此，例如，提及的“多核苷酸”包括多个这样的多核苷酸和提及的“微生物”包括提及的一种或多种微生物等等。

术语“异源的”用于指通常不出现在宿主生物体中的多核苷酸或基因。“异源的”包括上调的或下调的内源基因。“异源”也包括天然编码区域或其部分，其以不同于相应的天然基因的形式，例如，不在其生物体基因组的天然位置中被重新引入原始生物体中。“异源的”也包括已经被修饰并且放入生物体中的任何基因。异源基因可包括是嵌合基因的一部分的天然编码区域，所述嵌合基因包括重新引入天然宿主中的非天然调节区域或对影响基因表达水平的天然调节序列的修饰。外源基因可包括插入非天然生物体中的天然基因，或嵌合基因。异源多核苷酸、基因、多肽或酶可源自或分离自任何来源，例如，真核生物、原核生物、病毒或合成的多核苷酸片段，并且包括上调的内源基因。

术语“基因(或多个基因)”或“多核苷酸”或“核酸”或“多核苷酸序列(或多个多核苷酸序列)”旨在包括核酸分子，例如，包括编码多肽的开放阅读框架的多核苷酸，并且可进一步包括非编码调节序列和内含子。另外，该术语旨在包括定位至功能基因座的一个或多个基因。而且，该术语旨在包括用于选择目的的特定基因。基因可以对宿主细胞是内源性的或可被重组地引入宿主细胞中，例如，作为附加型保持的质粒或稳定整合至基因组中的质粒(或其片段)。除了质粒形式外，基因可以例如为线性DNA或RNA的形式。术语“基因”也旨在包括具体基因的多拷贝，例如，细胞中编码具体基因产物的所有DNA序列。

术语“表达”旨在包括至少在一般随后翻译成蛋白质产物的mRNA产生水平的基因表达。

如本文所使用，“表达载体”是能够引导与其可操作地连接的基因的表达的载体。

在一些实施方案中，微生物包含参与纤维素消化、代谢和/或水解的酶。“纤维素分解酶”可以是参与纤维素消化、代谢和/或水解的任何酶。术语“纤维素酶”指主要通过真菌、细菌和原生动物产生的一类酶，其催化纤维素的溶纤作用(即水解)。但是，也存在由其他类型的生物体，如植物和动物产生的纤维素酶。已知结构上和机制上不同的数个不同种类的纤维素酶。基于催化反应的类型有多个大类的纤维素酶：内切纤维素酶使内部键断裂以破坏纤维素的晶体结构并且暴露单个纤维素多糖链；外切纤维素酶从内切纤维素酶产生的暴露链的末端切割2-4单位，产生四糖或二糖，如纤维二糖。有两个主要类型的外切纤维素酶(或纤维二糖水解酶，简称为CBH)—一类从纤维素的还原端向前作用，和一类从纤维素的非还原端向前作用；纤维二糖酶或β-葡糖苷酶将外切纤维素酶产物水解成单个单糖；氧化纤维素酶，其通过自由基反应使纤维素解聚，例如纤维二糖脱氢酶(受体)；纤维素磷酸化酶，其使用磷酸盐代替水使纤维素解聚。在最常见的纤维素酶活性的情况下，酶复合物将纤维素分解成β-葡萄糖。“纤维素酶”可以是参与纤维素消化、代谢和/或水解的任何酶，包括，例如，内切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、木糖苷酶、木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、纤维二糖磷酸化酶、纤维糊精磷酸化酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木葡聚糖酶、内切木聚糖酶、葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷水解酶、膨胀素(swollenin)、葡糖醛酸酯酶、扩张蛋白(expansin)、果胶酶和阿魏酸酯酶蛋白。

“质粒”或“载体”指染色体外的元件，其通常携带一个或多个基因，并且通常为环形双链DNA分子的形式。质粒和载体也可包含另外的遗传元件，比如自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列。它们也可以是源自任何来源的线性、环形或超螺旋的单链或双链DNA或RNA。可通过已知的技术构建质粒和载体，其中许多核苷酸序列已经结合或重组成独特的构造。质粒和载体一般也包括用于选择的基因产物的启动子片段和DNA序列，以及适当的3’非翻译序列。一般而言，本发明的质粒是稳定的和自复制的。

如本文所使用，术语“厌氧的”指在没有气态O₂的条件下是活性的或存在的生物体、生物化学反应或过程。

“厌氧条件”被定义为其中发酵培养基中氧浓度对于微生物过低而不能用作最终电子受体的条件。厌氧条件可通过用惰性气体，如氮吹扫发酵培养基直到氧不再作为最终电子受体为微生物所用来实现。供选择地，厌氧条件可通过微生物消耗发酵可用的氧直到氧不能作为最终电子受体为微生物所用来实现。

“需氧代谢”指生物化学过程，其中氧用作最终电子受体，以从碳水化合物转化能量，通常为ATP的形式。例如，需氧代谢通常经真核生物的线粒体中的电子传递链发生，其中单个葡萄糖分子在存在氧的情况下完全代谢成二氧化碳。

相反，“厌氧代谢”指其中氧不是产生的电子的最终受体的生物化学过程。厌氧代谢可分成：厌氧呼吸，其中氧之外的化合物用作最终电子受体；和底物水平磷酸化，其中不使用外源性电子受体并且经“发酵途径”产生中间氧化态的产物。

在“发酵途径”中，通过糖酵解产生的NAD(P)H量通过在随后步骤中消耗相同量的NAD(P)H平衡。例如，在某些酵母菌株的一个发酵途径中，通过糖酵解产生的NAD(P)H提供其电子至乙醛，产生乙醇。发酵途径通常在厌氧条件下是活跃的，但是也可在需氧条件下，在其中NADH经呼吸链未充分氧化的条件下发生。

如本文所使用，术语“终产物”指不被细胞或不能被细胞使用的化学化合物，因此其被排泄或允许扩散至细胞外环境。来自厌氧发酵的终产物的常见实例包括但不限于乙醇、乙酸、甲酸、乳酸、氢和二氧化碳。

如本文所使用，“辅助因子”是参与生物化学反应的化合物，其在细胞中循环并且保持在大概稳态水平。参与厌氧发酵的辅助因子的常见实例包括但不限于NAD⁺和NADP⁺。在代谢中，辅助因子可在氧化-还原反应中作用，以接受或提供电子。当有机化合物在代谢中通过氧化降解时，它们的能量可通过其还原成NADH而转移至NAD⁺，通过其还原成NADPH而转移至NADP⁺，或通过其还原成FADH₂转移至另一辅助因子FAD⁺。还原的辅助因子随后可以用作还原酶底物。

如本文所使用，“途径”是一组生物化学反应，其在按步骤的过程中，可一起将一种化合物转化成另一化合物。途径中第一步的产物可以是第二步的底物，和第二步的产物可以是第三步的底物等等。本发明的途径包括但不限于丙酮酸代谢途径、乳酸生产途径、乙醇生产途径，和甘油生产途径。

术语“重组”或“重组体”指两个相同的(同源的)，或几乎相同的DNA分子之间的DNA的物理交换。重组可用于靶向基因删除或修饰基因的序列。术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”在本文中互换使用并且指已经被基因修饰以表达或过表达内源多核苷酸，或表达异源多核苷酸，如载体中包括的那些的微生物，或在内源基因的表达中有修饰的微生物。

“表达修饰”意思是基因的表达，或编码一个或多个多肽或多肽亚单位的RNA分子或等价RNA分子的水平，或一个或多个多肽或多肽亚单元的活性被上调或下调，使得表达、水平或活性大于或小于在缺少该修饰下观察到的。

在本发明的一个方面中，基因或具体的多核苷酸序列是部分、基本上或完全删除、沉默、失活或下调的，以便使它们编码的酶活性失活。完全的缺失提供最大稳定性，因为没有回复突变以恢复功能的机会。供选择地，可通过插入、删除、去除或替换破坏基因功能和/或表达的核酸序列而部分、基本上或完全删除、沉默、失活或下调基因。

如本文所使用，术语“下调”包括遗传序列的删除或突变，或插入编码或非编码的扰乱遗传元件，使得基因产物的产生通过删除、突变或插入而减弱。其包括mRNA或蛋白质的表达水平(即，分子数量)的降低。如本文所使用，“删除(delete)”或“删除(deletion)”指去除遗传元件使得相应的基因完全不被表达。在一些实施方案中，删除指完全的基因删除。也可通过化学或其他环境手段，例如通过工程化化学应答启动子元件(或其他类型的条件启动子)以控制期望的基因产物的表达来使遗传元件抑制，从而产生下调。可也通过使用弱启动子来发生下调。

如本文所使用，术语“上调”包括插入、再引入、突变或增加遗传序列的表达，使得基因产物的产生通过插入、再引入或突变而增加。如本文所使用，“插入(insert)”或“插入(insertion)”指引入遗传元件，使得表达相应的基因。可也通过改变相关的调节序列来使遗传元件表达的增加，从而发生上调。

如本文所使用，术语“甘油生产途径”指由DHAP产生甘油的生物化学途径的集合。途径的组分由途径中的所有底物、辅助因子、副产物、中间体、终产物和酶组成。

如本文所使用，术语“乙醇生产途径”指由丙酮酸盐产生乙醇的生物化学途径的集合。途径的组分由途径中的所有底物、辅助因子、副产物、中间体、终产物和酶组成。

如本文所使用，术语“乙酰辅酶A生产途径”指由乙酰磷酸产生乙酰辅酶A的生物化学途径的集合。途径的组分由途径中的所有底物、辅助因子、副产物、中间体、最终产物和酶组成。

如本文所使用，术语“丙酮酸代谢途径”指将丙酮酸盐转化成任何产物，包括但不限于乙醇、乳酸、乙酸和甲酸盐的生物化学途径的集合。其也包括导致丙酮酸盐产生的途径的集合，如糖酵解。途径的组分由途径中的所有底物、辅助因子、副产物、中间体、终产物和酶组成。

如本文所使用，术语“糖酵解”或“糖分解途径”指基础代谢的标准途径，其中糖如葡萄糖分解成氧化程度更高的产物，转化成细胞生长需要的能量和化合物。途径的组分由途径中的所有底物、辅助因子、副产物、中间体、终产物和酶组成。

如本文所使用，术语“磷酸转酮酶”、“单特异性磷酸转酮酶”或“双特异性磷酸转酮酶”旨在包括催化D-木酮糖5-磷酸转化成D-甘油醛3-磷酸的酶。双特异性磷酸转酮酶另外包括催化D-果糖6-磷酸转化成D-赤藓糖4-磷酸的酶。磷酸转酮酶、单特异性磷酸转酮酶和双特异性磷酸转酮酶共同被称为“PHK”或“磷酸转酮酶”(图7)。PHK包括对应酶学委员会编号(EC)4.1.2.9和4.1.2.22的那些酶。在一些实施方案中，PHK来自黑曲霉(SEQ ID NO：3和13)、粗糙脉孢菌(SEQ ID NO：4和14)、干酪乳杆菌PHK(SEQ ID NO：5和11)、植物乳杆菌PHK1(SEQ ID NO：7和9)、植物乳杆菌PHK2(SEQ ID NO：6和15)、青春双歧杆菌(SEQ ID NO：8和12)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)(SEQ ID NO：61和62)、高卢双歧杆菌(B.gallicum)(SEQ IDNO：63和64)、动物双歧杆菌(B.animalis)(SEQ ID NO：65和66)、戊糖乳杆菌(L.pentosum)(SEQ ID NO：67和68)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)(SEQ ID NO：69和70)、产黄青霉菌(P.chrysogenum)(SEQ ID NO：71和72)、构巢曲霉(A.nidulans)(SEQ ID NO：73和74)、棒曲霉(A.clavatus)(SEQ ID NO：77和78)、肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)(SEQ ID NO：93和94)或酒类酒球菌(O.oenii)(SEQ ID NO：101和102)。

如本文所使用，术语“醇脱氢酶”或“ADH”旨在包括催化乙醇转化成乙醛的酶。非常常见地，相同的酶催化从乙醛至乙醇的逆反应，其是与发酵更相关的方向。醇脱氢酶包括对应EC 1.1.1.1和1.1.1.2的那些酶，例如GenBank登录号为U49975的公开的酶。

如本文所使用，术语“醛脱氢酶”、“ALD”或“ALDH”旨在包括催化醛氧化的酶。醛脱氢酶包括“乙醛脱氢酶”，其催化乙醛转化成乙酰辅酶A。非常常见地，相同的酶催化从乙酰辅酶A至乙醛的逆反应，其是与发酵更相关的方向。醛脱氢酶包括对应EC 1.2.1.3、1.2.1.4和1.2.1.10的那些酶。在一些实施方案中，乙醛脱氢酶来自酿酒酵母(ALD2：SEQ ID NO：17和18；ALD3：SEQ ID NO：19和20；ALD4：SEQ ID NO：21和22；ALD5：SEQ ID NO：23和24；或ALD6SEQ ID NO：25和26)。

如本文所使用，术语“磷酸转乙酰酶”或“PTA”旨在包括能够将乙酰辅酶A转化成乙酰磷酸的酶。PTA包括对应EC 2.3.1.8的那些酶。在一些实施方案中，PTA来自青春双歧杆菌(SEQ ID NO：1和10)、解纤维素梭菌(C.cellulolyticum)(SEQ ID NO：79和80)、植物发酵梭菌(C.pthtofermentans)(SEQ ID NO：81和82)、两歧双歧杆菌(SEQ ID NO：83和84)、动物双歧杆菌(SEQ ID NO：85和86)、肠膜明串珠菌(SEQ ID NO：95和96)或酒类酒球菌(SEQ IDNO：103和34)。

如本文所使用，术语“乙酸激酶”或“ACK”旨在包括能够将乙酰磷酸转化成乙酸盐的酶。ACK包括对应EC 2.7.2.12的那些酶。在一些实施方案中，ACK来自青春双歧杆菌(SEQID NO：2和16)、解纤维素梭菌(SEQ ID NO：87和88)、植物发酵梭菌(SEQ ID NO：75和76)、肠膜明串珠菌(SEQ ID NO：91和92)或酒类酒球菌(SEQ ID NO：99和100)。

如本文所使用，术语“甘油-3-磷酸脱氢酶”或“GPD”旨在包括能够将二羟基丙酮磷酸转化成甘油-3-磷酸的那些酶。GPD包括对应EC 1.1.1.8的那些酶。在一些实施方案中，GPD是来自酿酒酵母的GPD1和/或GPD2(GDP1：SEQ ID NO：27和28，GDP2：SEQ ID NO：29和30)。

如本文所使用，术语“甘油-3-磷酸磷酸酶”旨在包括能够将甘油-1-磷酸转化成甘油的那些酶。甘油-3-磷酸旨在包括对应EC 3.1.3.21的那些酶。

如本文所使用，术语“甲酸脱氢酶”或“FDH”旨在包括能够将甲酸盐转化成碳酸氢盐(二氧化碳)的那些酶。甲酸脱氢酶包括对应EC 1.2.1.43和EC 1.2.1.2的那些酶。在一些实施方案中，FDH来自酿酒酵母(FDH1：SEQ ID NO：31和32，FDH2：SEQ ID NO：33)。

如本文所使用，术语“转醛醇酶”旨在包括能够将甘油醛-3-磷酸转化成果糖-6-磷酸的那些酶。转醛醇酶旨在包括对应EC 2.2.1.2的那些酶。在一些实施方案中，转醛醇酶来自酿酒酵母(TAL1：SEQ ID NO：35和36)。

如本文所使用，术语“转酮酶”旨在包括能够将景天庚酮糖-7-P和甘油醛-3-P转化成D-核糖-5-P和D-木酮糖-5-P的那些酶，和能够将果糖6-磷酸和甘油醛-3-P转化成D-木酮糖-5-P和醛糖赤藓糖-4-磷酸的那些酶。转酮酶旨在包括对应EC 2.2.1.1的那些酶。在一些实施方案中，转酮酶来自酿酒酵母(TKL1：SEQ ID NO：37和38)。

如本文所使用，术语“核糖-5-P异构酶”或“核糖-5-磷酸异构酶”旨在包括能够将核糖-5-磷酸转化成核酮糖-5-磷酸的那些酶。核糖-5-P异构酶旨在包括对应EC 5.3.1.6的那些酶。在一些实施方案中，核糖-5-P异构酶来自酿酒酵母(RKI1：SEQ ID NO：39和40)。

如本文所使用，术语“核酮糖-5-P 3差向异构酶”、“核酮糖-5-磷酸3差向异构酶”或“核酮糖-磷酸3-差向异构酶”旨在包括能够将D-核酮糖5-磷酸转化成D-木酮糖5-磷酸的那些酶。核酮糖-5-P 3差向异构酶旨在包括对应EC 5.1.3.1的那些酶。在一些实施方案中，核酮糖-5-P 3差向异构酶来自酿酒酵母(RPE1：SEQ ID NO：41和42)。

如本文所使用，术语“丙酮酸脱羧酶”或“PDC”旨在包括能够将丙酮酸转化成乙醛的那些酶。PDC旨在包括对应EC 4.1.1.1的那些酶。

如本文所使用，术语“双功能”旨在包括催化多于一种生物化学反应步骤的酶。本文使用的双功能酶的具体实例是催化醇脱氢酶和乙醛脱氢酶反应的酶(adhE)，并且包括对应EC 1.2.1.10和1.1.1.1的那些酶。在一些实施方案中，双功能乙醛-醇脱氢酶来自青春双歧杆菌(adhE：SEQ ID NO：43和44)。在一些实施方案中，双功能酶是NADPH特异性双功能乙醛-醇脱氢酶，并且包括对应EC 1.2.1.10和1.1.1.2的那些酶。在一些实施方案中，NADPH特异性双功能乙醛-醇脱氢酶来自肠膜明串珠菌(SEQ ID NO：89和90)或酒类酒球菌(Oenococcus oenii)(SEQ ID NO：97和98)。

如本文所使用，术语“丙酮酸甲酸裂解酶”或“PFL”旨在包括能够将丙酮酸盐转化成甲酸盐和乙酰辅酶A的酶。PFL包括对应EC 2.3.1.54的那些酶并且实例为SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48。

如本文所使用，术语“PFL-活化酶”旨在包括能够有助于PFL的活化的那些酶。PFL-活化酶包括对应EC 1.97.1.4的那些酶并且实例为SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。

术语“原料”定义为提供给可由其制备其他产物的微生物或发酵过程的原材料或原材料的混合物。例如，碳源，如生物质或源自生物质的碳化合物是用于在发酵过程中产生产物的微生物的原料。原料可包含碳源之外的养分。

生物质可包括本领域已知的或本文所述的任何类型的生物质。术语“木质纤维素材料”、“木质纤维素底物”和“纤维素生物质”是指任何类型的含碳原料，其包括木质生物质，如回收的木浆纤维，锯屑，硬木，软木，草，糖加工残渣，农业废物，例如但不限于稻秸、稻壳、大麦秸秆、玉米芯、谷类秸秆、小麦秸秆、油菜秸秆、燕麦秸秆、燕麦外壳、玉米纤维、秸秆，肉质植物，龙舌兰或其任何组合。

术语“产率”定义为每单位重量的原料获得的产物的量并且可表达为克产物/克底物(g/g)。产率可表达为理论产率的百分比。“理论产率”定义为每给定量的底物可产生的产物的最大量，如通过用于产生产物的代谢途径的化学计量所表示。例如，葡萄糖到乙醇的一种典型转化的理论产率是0.51gEtOH/1g葡萄糖。这样，来自10g葡萄糖的4.8g乙醇的产率可表达为94％的理论值的或94％的理论产率。

术语“效价”定义为溶液的强度或溶液中物质的浓度。例如，发酵液中产物的效价被描述为每升发酵液的溶液中产物的克数(g/L)或描述为g/kg发酵液。

如本文所使用，术语“通量”是分子通过代谢途径的流动速率，与过程中材料流类似。

“细菌”或“真细菌”指原核生物体的范围。细菌包括革兰氏阳性(gram+)细菌和革兰氏阴性(gram-)细菌。

“酵母”指为单细胞真菌的真核生物体的范围。

术语“衍生物”和“类似物”指与本发明的酶不同，但是保持其基本特性的多肽。一般而言，衍生物和类似物总体上非常类似，并且，在许多区域与本发明的酶相同。当提及本发明的酶时，术语“源自”、“衍生物”和“类似物”包括保留相应的天然多肽的至少一些活性或其催化结构域活性的任何多肽。

本文公开的酶的衍生物是可能已经被改变以显示天然多肽中未出现的特征的多肽。衍生物可通过用除了天然存在的氨基酸以外的部分(例如，可检测的部分比如酶或放射性同位素)替换(例如氨基酸替换)、化学、酶或其他适当的方式共价修饰。衍生物的实例包括融合蛋白，或基于天然存在的蛋白质序列但是已经被改变的蛋白。例如，蛋白质可根据具体氨基酸序列，和/或具体二级、三级和四级结构的知识来设计。衍生物包括基于之前天然的或合成的序列的知识而修饰的蛋白质，其随后通常但是不是必须任选地被修饰，以赋予一些改善的功能。然后认为这些序列或蛋白质源自具体的蛋白质或氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，衍生物与衍生物所“源自”的序列必须保持至少约50％的同一性、至少约60％的同一性、至少约70％的同一性、至少约80％的同一性、至少约90％的同一性、至少约95％的同一性、至少约97％的同一性或至少约99％的同一性。在本发明的一些实施方案中，如果使用分子遗传技术，部分或全部的酶的DNA序列被扩增并且置入新的宿主细胞中，则认为该酶源自天然存在于具体物种中的酶。

如本领域已知的，术语“同一性百分比”是两条或更多条多肽序列或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列所测定。在现有技术中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，这根据具体情况而定，如通过这样的序列的链之间的匹配而测定。

如本领域已知的，两条多肽之间的“相似度”是通过比较多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸替换与第二多肽的序列而测定。

“同一性”和“相似度”可容易通过已知的方法计算，包括但不限于以下描述的那些：计算分子生物学(Computational Molecular biology)(Lesk,A.M.,ed.)OxfordUniversity Press,NY(1988)；生物计算：信息学和基因组工程(Biocomputing：Informatics and Genome Projects)(Smith,D.W.，ed.)Academic Press，NY(1993)；序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data)，I部分(Griffin,A.M.，和Griffin,H.G.，eds.)Humana Press，NJ(1994)；分子生物学中的序列分析(SequenceAnalysis in Molecular Biology)(von Heinje，G.，ed.)Academic Press(1987)；和序列分析引物(Sequence Anslysis Primer)(Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.)StocktonPress，NY(1991)。测定同一性的优选方法被设计为给出测试序列之间的最佳匹配。测定同一性和相似度的方法编码在公众可用的计算机程序中。可使用LASERGENE生物信息学计算套件的Megalign程序进行序列比对和同一性百分比计算(DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)。使用比对的Clustal方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5:151-153)，使用默认参数(空隙罚分＝10、空隙长度罚分＝10)进行本文公开的序列的多重比对。使用Clustal方法的成对比对的默认参数是KTUPLE 1、空隙罚分＝3、窗口＝5和保存的对角线＝5。

适当的核酸序列或其片段(本发明的分离的多核苷酸)编码的多肽与本文公开的氨基酸序列具有至少约70％至75％的同一性，与本文公开的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％或至少约90％的同一性，或与本文公开的氨基酸序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％的同一性。适合的核酸片段与本文公开的核酸序列具有至少约70％、至少约75％或至少约80％的同一性，与本文公开的核酸序列具有至少约80％、至少约85％或至少约90％的同一性，或与本文公开的核酸序列至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％的同一性。适合的核酸片段不仅仅具有上述同一性/相似度，而且通常编码具有至少约50个氨基酸、至少约100个氨基酸、至少约150个氨基酸、至少约200个氨基酸或至少约250个氨基酸的多肽。

密码子优化

在本发明的一些实施方案中，外源性基因可以是密码子优化的，以便表达它们在宿主细胞中最有效编码的多肽。密码子优化的方法是本领域熟知的。(参见，例如Welch等“设计用于成功表达蛋白质的基因(Designing genes for successful proteinexpression)”Methods Enzymol。2011.498:43-66.)

一般而言，生物体中高度表达的基因偏向该生物体中最丰富的tRNA种类识别的密码子。该偏好的一种量度是“密码子适应指数”或“CAI”，其测量用于编码具体基因中每个氨基酸的密码子是最频繁出现在来自生物体的高度表达基因参考组中的那些的程度。密码子适应指数更详细描述在Sharp等，“密码子适应指数：方向性同义密码子使用偏好的量度，和其潜在应用(The Codon Adaptation Index:a Measure of Directional SynonymousCodon Usage Bias,and Its Potential Applications)”Nucleic Acids Research 1987。15：1281-1295，将其全部内容引入本文作为参考。

密码子优化的序列可以根据生物体的生物学限制而进一步修饰，用于在具体的生物体中表达。例如，大的“A”或“T”连续序列(例如，大于3、4、5、6、7、8、9或10个连续碱基的连续序列)可不利地影响转录。因此，例如，通过用另一核苷酸替换连续序列中的至少一个核苷酸可用于去除连续序列。此外，通过用另一核苷酸替换限制酶切位点中的至少一个核苷酸可去除特异性限制酶位点以用于分子克隆目的。这样的限制酶位点的实例包括PacI、AscI、BamHI、BglII、EcoRI和XhoI。另外，可检查DNA序列的长度为约5、6、7、8、9或10个碱基或更长的正向重复序列、反向重复序列和镜像重复序列。可通过用“第二最佳”密码子替换序列中的至少一个密码子来修饰“A”或“T”连续序列、限制酶切位点和/或重复序列，所述“第二最佳”密码子即，对于序列被优化的具体的生物体中具体的氨基酸以第二最高频率出现的密码子。

包括编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列的差异允许编码基因的序列中有变化。因为每个密码子由三个核苷酸组成，并且包括DNA的核苷酸限于四种特定碱基，有64种可能的核苷酸组合，其中61种编码氨基酸(剩下的三个密码子编码终止翻译的信号)。显示哪个密码子编码哪个氨基酸的“遗传密码”在本文再现为表1。因此，许多氨基酸由多于一种密码子指定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸各自由六种三联体编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。该简并性使得DNA碱基组成在宽范围内变化，而不改变DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。

表1：标准遗传密码

许多生物体显示使用具体密码子编码的偏好，用于在生长肽链中插入具体氨基酸。密码子偏向或密码子偏好、生物体之间密码子使用的差异由遗传密码的简并性提供，并且在许多生物体中充分记载。密码子偏好通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，转而认为其尤其取决于待翻译的密码子的特性和具体转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞中选择的tRNA的优势一般是肽合成中最频繁使用的密码子的反映。因此，基于密码子优化，基因可被调节，用于在给定生物体中的最佳基因表达。

宿主细胞

在本发明的一些实施方案中，宿主细胞是真核微生物。在一些实施方案中，宿主细胞是酵母。在一些实施方案中，宿主细胞能够消化和发酵纤维素。在一些实施方案中，宿主细胞来自酵母属。在一些实施方案中，宿主细胞是酿酒酵母。

在一些实施方案中，在约20℃以上、约25℃以上、约27℃以上、约30℃以上、约33℃以上、约35℃以上、约37℃以上、约40℃以上、约43℃以上、约45℃以上或约47℃以上的温度下培养本发明的宿主细胞。

在一些实施方案中，本发明的宿主细胞包含遗传构建体，其导致编码以下多肽的一个或多个基因下调：所述多肽与EC 1.1.1.8、3.1.3.21、1.2.1.43、1.2.1.10和/或EC1.2.1.2包括的一个或多个多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的同一性。

在一些实施方案中，本发明的宿主细胞包含遗传构建体，其导致编码下述多肽的一个或多个基因表达或上调：所述多肽与SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、24、26、34、36、38、40、42、44、46、48、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100或102编码的一个或多个多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的同一性。在一些实施方案中、本发明的宿主细胞包含遗传构建体，其导致编码与EC编号：4.1.2.9、4.1.2.22、2.3.1.8、1.2.1.10、1.2.1.3、1.2.1.4、1.1.1.1、1.1.1.2、2.7.2.12、2.2.1.2、2.2.1.1、5.3.1.6、5.1.3.1、2.3.1.54、1.97.1.4、1.2.1.3、1.2.1.4或4.1.1.1相关的活性的多肽表达或上调。

在一些实施方案中，PHK被上调。在一些实施方案中，单特异性磷酸转酮酶被上调。在一些实施方案中，双特异性磷酸转酮酶被上调。在一些实施方案中，上调的PHK来自对应选自以下EC编号的酶：EC 4.1.2.9和4.1.2.22。在一些实施方案中，PHK来自黑曲霉。在一些实施方案中，PHK来自粗糙脉孢菌。在一些实施方案中，PHK来自干酪乳杆菌(L.casei)。在一些实施方案中，PHK来自植物乳杆菌。在一些实施方案中，PHK来自青春双歧杆菌。在一些实施方案中，PHK源自选自以下的属：曲霉属(Aspergillus)、脉胞菌属(Neurospora)、乳杆菌属、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和青霉菌属。在一些实施方案中，磷酸转酮酶对应选自SEQ ID NO：9、11、12、13、14、15、62、64、66、68、70、72、74、78、94或102的多肽。

在一些实施方案中，磷酸转乙酰酶被上调。在一些实施方案中，上调的磷酸转乙酰酶来自对应EC 2.3.1.8的酶。在一些实施方案中，磷酸转乙酰酶来自青春双歧杆菌。在一些实施方案中，磷酸转乙酰酶源自选自以下的属：双歧杆菌属、乳杆菌属或梭菌属。在一些实施方案中，磷酸转乙酰酶对应选自SEQ ID NO：10、34、80、82、84、86或94的多肽。

在本发明的一些实施方案中，乙酸激酶被上调。在一些实施方案中，上调的乙酸激酶来自对应EC 2.7.2.12的酶。在一些实施方案中，乙酸激酶来自青春双歧杆菌。在一些实施方案中，乙酸激酶源自选自以下的属：双歧杆菌、乳杆菌或梭菌。在一些实施方案中，乙酸激酶对应选自SEQ ID NO：16、88、76、92或100的多肽。

在一些实施方案中，双功能乙醛-醇脱氢酶被上调。在一些实施方案中，上调的双功能乙醛-醇脱氢酶来自对应选自以下EC编号的酶：EC 1.2.1.0和1.1.1.1。在一些实施方案中，双功能乙醛-醇脱氢酶是NADPH依赖性双功能乙醛-醇脱氢酶，其选自具有以下酶学委员会编号的酶：EC 1.2.1.10和1.1.1.2。在一些实施方案中，双功能乙醛-醇脱氢酶对应选自SEQ ID NO：44、90和98的多肽。

在一些实施方案中，转醛醇酶被上调。在一些实施方案中，上调的转醛醇酶来自对应EC 2.2.1.2的酶。在一些实施方案中，转醛醇酶来自酿酒酵母并且对应SEQ ID NO：36编码的多肽。在一些实施方案中，转酮酶被上调。在一些实施方案中，上调的转酮酶来自对应EC 2.2.1.1的酶。在一些实施方案中，转酮酶来自酿酒酵母并且对应SEQ ID NO：38编码的多肽。在一些实施方案中，核糖-5-P异构酶被上调。在一些实施方案中，上调的核糖-5-P异构酶来自对应EC 5.3.1.6的酶。在一些实施方案中，核糖-5-P异构酶来自酿酒酵母并且对应SEQ ID NO：40编码的多肽。在一些实施方案中，核酮糖-5-P差向异构酶被上调。在一些实施方案中，上调的核酮糖-5-P差向异构酶来自对应EC5.1.3.1的酶。在一些实施方案中，核酮糖-5-P 3-差向异构酶来自酿酒酵母并且对应SEQ ID NO：42编码的多肽。在一些实施方案中，丙酮酸脱羧酶被上调。在一些实施方案中，上调的丙酮酸脱羧酶来自对应EC 4.1.1.1的酶。在一些实施方案中，醇脱氢酶被上调。在一些实施方案中，上调的醇脱氢酶来自对应EC 1.1.1.1和1.1.1.2的酶。在一些实施方案中，丙酮酸甲酸裂解酶被上调。在一些实施方案中，上调的丙酮酸甲酸裂解酶来自对应EC 2.3.1.54的酶。在一些实施方案中，丙酮酸甲酸裂解酶对应SEQ ID NO：48编码的多肽。在一些实施方案中，丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调。在一些实施方案中，上调的丙酮酸甲酸裂解酶活化酶来自对应EC 1.97.1.4的酶。在一些实施方案中，丙酮酸甲酸裂解酶活化酶对应SEQ ID NO：46编码的多肽。

在一些实施方案中，本发明的宿主细胞包含遗传构建体，其使得编码以下多肽的一个或多个基因表达或下调：所述多肽与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32编码的一条或多条多肽或SEQ ID NO：33编码的多核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％，或约100％的同一性。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞包含遗传构建体，其使得编码与EC编号：1.2.1.3、1.2.1.4、1.2.1.10、1.1.1.8和3.1.3.21相关的活性的多肽表达或下调。

在一些实施方案中，GPD被下调。在一些实施方案中，下调的GPD来自对应EC1.1.1.8的酶。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的gpd1和gpd2被下调。在一些实施方案中，甘油-3-磷酸脱氢酶选自甘油-3-磷酸脱氢酶1、甘油-3-磷酸脱氢酶2和其组合。在一些实施方案中，甘油-3-磷酸脱氢酶1来自酿酒酵母并且对应SEQ ID NO：28编码的多肽。在一些实施方案中，甘油-3-磷酸脱氢酶2来自酿酒酵母并且对应SEQ ID NO：30编码的多肽。在一些实施方案中，甲酸脱氢酶被下调。在一些实施方案中，下调的甲酸脱氢酶对应选自以下的EC编号：EC 1.2.1.43和EC 1.2.1.2。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的甲酸脱氢酶被下调。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的甲酸脱氢酶对应SEQ ID NO：32相应的多肽或SEQID NO：33相应的多核苷酸。在一些实施方案中，甘油-3-磷酸磷酸酶被下调。在一些实施方案中，下调的甘油-3-磷酸磷酸酶对应EC 3.1.3.21。

在一些实施方案中，醛脱氢酶被下调。在一些实施方案中，醛脱氢酶被上调。在一些实施方案中，醛脱氢酶是对应EC 1.2.1.10、EC 1.2.1.3或EC 1.2.1.4的酶。在一些实施方案中，醛脱氢酶是乙醛脱氢酶。在一些实施方案中，乙醛脱氢酶选自：酿酒酵母中的Ald2、Ald3、Ald4、Ald5和Ald6。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的乙醛脱氢酶对应选自以下的多肽序列：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26。

在一些实施方案中，磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶和双功能乙醛-醇脱氢酶被上调，和至少一种甘油-3-磷酸脱氢酶被下调。

在一些实施方案中，磷酸转乙酰酶、双功能乙醛-醇脱氢酶，和至少一种醛脱氢酶被上调。在一些实施方案中，磷酸转乙酰酶、双功能乙醛-醇脱氢酶、至少一种醛脱氢酶被上调，并且至少一种甘油-3-磷酸脱氢酶被下调。在一些实施方案中，磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、双功能乙醛-醇脱氢酶，和至少一种醛脱氢酶被上调。在一些实施方案中，磷酸转乙酰酶、乙酸激酶和双功能乙醛-醇脱氢酶被上调，并且至少一种甘油-3-磷酸脱氢酶被下调。在一些实施方案中，至少一种醛脱氢酶也被下调。在一些实施方案中，醛脱氢酶是乙醛脱氢酶。

在一些实施方案中，磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶、双功能乙醛-醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶和丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调，并且至少一种甘油-3-磷酸脱氢酶被下调。

在一些实施方案中，磷酸转酮酶、乙酸激酶和双功能醛-醇脱氢酶被上调，并且至少一种甘油-3-磷酸脱氢酶被下调。

在一些实施方案中，磷酸转酮酶、乙酸激酶、双功能乙醛-醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶和丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调，并且至少一种甘油-3-磷酸脱氢酶被下调。

在一些实施方案中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调。在一些实施方案中，gpd1、gpd2、fdh1和fdh2被下调，并且PHK、双功能乙醛-醇脱氢酶(AdhE)和PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和fdh2被下调，并且青春双歧杆菌PHK、AdhE和青春双歧杆菌PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和fdh2被下调，并且植物乳杆菌PHK1、AdhE，和青春双歧杆菌PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和fdh2被下调，并且植物乳杆菌PHK2、AdhE、青春双歧杆菌PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和fdh2被下调，并且黑曲霉PHK、AdhE和青春双歧杆菌PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和fdh2被下调，并且干酪乳杆菌PHK1、AdhE和青春双歧杆菌PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和fdh2被下调，并且干酪乳杆菌PHK2、AdhE和青春双歧杆菌PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，PHK、青春双歧杆菌AdhE和青春双歧杆菌PTA被上调。在一些实施方案中，上调的酶是整合的。在一些实施方案中，使用表达载体表达上调的酶。在一些实施方案中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，并且青春双歧杆菌PHK、青春双歧杆菌双功能乙醛-醇脱氢酶、青春双歧杆菌PTA、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶和青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调。在一些实施方案中，fcy被下调。

在一些实施方案中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，并且PHK、双功能醛-醇脱氢酶(AdhE)、ACK和PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，并且青春双歧杆菌PHK、AdhE、青春双歧杆菌ACK和青春双歧杆菌PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，并且植物乳杆菌PHK1、AdhE、青春双歧杆菌ACK和青春双歧杆菌PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，并且植物乳杆菌PHK2、AdhE、青春双歧杆菌ACK和青春双歧杆菌PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，并且黑曲霉PHK、AdhE、青春双歧杆菌ACK和青春双歧杆菌PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，并且干酪乳杆菌PHK1、AdhE、青春双歧杆菌ACK和青春双歧杆菌PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，并且干酪乳杆菌PHK2、AdhE、青春双歧杆菌ACK和青春双歧杆菌PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，PHK、青春双歧杆菌AdhE、青春双歧杆菌PTA和青春双歧杆菌ACK被上调。在一些实施方案中，上调的酶是整合的。在一些实施方案中，使用表达载体表达上调的酶。在一些实施方案中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，并且青春双歧杆菌PHK、青春双歧杆菌双功能乙醛-醇脱氢酶、青春双歧杆菌PTA、青春双歧杆菌ACK、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶，和青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调。

在一些实施方案中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，并且双功能乙醛-醇脱氢酶(AdhE)、ACK和PTA被上调。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，并且AdhE、青春双歧杆菌ACK和青春双歧杆菌PTA被上调。在一些实施方案中，上调的酶是整合的。在一些实施方案中，使用表达载体表达上调的酶。在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，青春双歧杆菌AdhE、青春双歧杆菌PTA和青春双歧杆菌ACK被上调。在一些实施方案中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，并且青春双歧杆菌双功能乙醛-醇脱氢酶、青春双歧杆菌PTA、青春双歧杆菌ACK、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶和青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调。在一些实施方案中，酿酒酵母ALD2、ALD3、ALD4或其组合被下调，并且酿酒酵母ALD6，ALD5或其组合被上调。

在一些实施方案中，在酿酒酵母细胞中，gpd1、gpd2、fdh1和/或fdh2被下调，青春双歧杆菌AdhE、青春双歧杆菌PTA和青春双歧杆菌ACK被上调。

乙醇产生

对于最经济地生产乙醇的微生物，期望以高产率生产。在一种实施方案中，产生的唯一产物是乙醇。额外的产物导致产物产率下降并且增加资本和操作成本，尤其是在额外的产物具有极少价值或没有价值的情况下。额外的产物也需要另外的资本和操作成本以将这些产物从乙醇中分离。

可使用本领域已知的任何方法测量乙醇产生。例如，可使用HPLC分析评估发酵样品中乙醇的量。另外，许多乙醇分析试剂盒是有市售的，例如，基于醇氧化酶的分析。测定乙醇产生的方法通过本文的教导在本领域技术人员的范围内。

在本发明的一些实施方案中，其中改变的碳通量的方向使得乙醇的产生增加，可通过与生长关联的选择改善乙醇输出。例如，可进行连续培养或连续稀释培养，以选择在期望的原料上生长较快和/或更有效产生乙醇(或任何期望的产物)的细胞。

本发明的一种实施方案涉及使用本文所述的微生物生产乙醇的方法，其中在存在含碳原料的情况下培养所述微生物足够的时间以生产乙醇，并且任选地，提取乙醇。

可通过本领域已知的方法提取乙醇。(参见，例如，第2011/0171709号美国公开申请，其通过引用并入本文。)

本发明的另一个实施方案涉及使用由至少两种微生物组成的共培养物生产乙醇的方法，其中至少一种生物体是本文所述的生物体，和至少一种生物体是基因不同的微生物。在一些实施方案中，基因不同的微生物是酵母或细菌。在一些实施方案中，基因不同的微生物是来自以下属的任何生物体：伊萨酵母属、毕赤酵母属、棒孢酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、酵母属、木霉属、嗜热子囊菌属、埃希氏菌属、梭菌属、热解纤维素菌属、嗜热厌氧杆菌属和嗜热厌氧菌属。

在一些实施方案中，重组微生物产生比野生型非重组生物体高约2至约3％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1至至少约2％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1至至少约5％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1至至少约7％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1至至少约10％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1至至少约15％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1至至少约20％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1至至少约30％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1至至少约50％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1至至少约75％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1至至少约100％的乙醇效价。

在一些实施方案中，在含碳原料上每孵育24小时，重组微生物产生至少约0.5g/L的乙醇至至少约2g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约3g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约5g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约7g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约10g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约15g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约20g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约30g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约40g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约50g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约75g/L的乙醇，或至少约0.5g/L的乙醇至至少约99g/L的乙醇。

在一些实施方案中，重组微生物以至少约55％至至少约75％的理论产率、至少约50％至至少约80％的理论产率、至少约45％至至少约85％的理论产率、至少约40％至至少约90％的理论产率、至少约35％至至少约95％的理论产率、至少约30％至至少约99％的理论产率或至少约25％至至少约99％的理论产率生产乙醇。

在一些实施方案中，生产乙醇的方法可包括使生物质原料接触宿主细胞或本发明的共培养物和另外使生物质原料接触外部产生的糖解酶。在一些实施方案中，宿主细胞是用编码糖解酶的多核苷酸基因工程改造的(例如，转导、转化或转染的)。

“糖解酶”可以是参与碳水化合物消化、代谢和/或水解的任何酶，包括淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、纤维素分解酶，和淀粉分解辅助酶、菊糖酶、果聚糖酶和戊糖糖利用酶。示例性的外部产生的糖解酶是有市售的并且是本领域技术人员已知的以及包括葡糖淀粉酶。

甘油产生

在本发明的一些实施方案中，其中改变碳通量方向使乙醇的产生增加，可通过生长相关的选择减少甘油输出。例如，可进行连续培养或连续稀释培养，以选择在期望的原料上产生较少甘油的细胞。可以例如通过代谢物浓度的HPLC分析测量甘油。

在一些实施方案中，重组微生物产生比野生型非重组生物体少至少约20％至至少约30％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约15％至至少约30％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约40％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约50％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约60％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约70％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约80％的甘油；比野生型，非重组生物体少至少约10％至至少约90％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约99％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约100％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约5％至至少约100％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约1％至至少约100％的甘油。

在一些实施方案中，重组微生物以至少约50％至至少约99％的理论产率、至少约45％至至少约80％的理论产率、至少约40％至至少约85％的理论产率、至少约30％至至少约80％的理论产率、至少约25％至至少约50％的理论产率、至少约20％至至少约50％的理论产率、至少约15％至至少约50％的理论产率、至少约10％至至少约50％的理论产率、至少约5％至至少约50％的理论产率、至少约4％至至少约50％的理论产率、至少约3％至至少约50％的理论产率、至少约2％至至少约50％的理论产率、至少约1％至至少约50％的理论产率、至少约1％至至少约25％的理论产率、至少约1％至至少约20％的理论产率或至少约1％至至少约10％的理论产率产生甘油。在一些实施方案中，重组微生物以小于约1％的理论产率产生甘油。在一些实施方案中，重组微生物不产生甘油。

在一些实施方案中，重组微生物的生长速率为野生型非重组生物体生长速率的至少约1/2至至少约相等，野生型非重组生物体生长速率的至少约1/4至至少约相等，野生型非重组生物体生长速率的至少约1/8至至少约相等，野生型非重组生物体生长速率的至少约1/10至至少约相等，野生型非重组生物体生长速率的至少约1/25至至少约相等，野生型非重组生物体生长速率的至少约1/50至至少约相等或野生型非重组生物体生长速率的至少约1/100至至少约相等。

在一些实施方案中，与野生型-非重组生物体相比，甘油产生减少，并且在厌氧生长过程中，生物体以至少约8-11mM甘油/克干燥细胞重量(DCW)的速率产生乙醇。

实施例

实施例1

工程化酿酒酵母以表达整合的PKA和PTA

来自青春双歧杆菌、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)或黑曲霉(Aspergillus niger)的磷酸转酮酶(PHK)酶在酿酒酵母FCY1位点处与青春双歧杆菌磷酸转乙酰酶(PTA)基因一起整合。用于开发酿酒酵母菌株的基因修饰技术依靠定向整合，以将遗传物质在酵母染色体中特定和已知的位点插入。定向整合方法产生具有稳定和容易表征的整合事件的转基因菌株。

当期望在给定染色体基因座处插入或删除遗传元件时，MX盒是最常用的工程化工具(Wach A.，等,.Yeast.10(13):1793-1808(1994))。可回收的MX盒包含能够实现显性和阴性选择的一个或多个标志物(Goldstein，A.L.，等Yeast.15：507-511(1999)；Hartzog,P.E.等，Yeast.22：789-798(2005))。显性标志物能够实现修饰的选择，并且反向选择标志物能够实现随后经Cre-Lox介导的重组的标志物体系的去除(Güldener，U.，等Nucleic AcidsResearch.24(13)：2519-2524(1996))或盒侧翼的重复的同源区域之间的重组。因为去除了标志物，它们可在随后工程化步骤中重复使用并且确保菌株中不残留非期望的外源遗传物质。

为了产生稳定的纯合子整合，开发了两个新的基于HSV-胸苷激酶(TDK)的MX盒。酿酒酵母中胸苷激酶的表达产生对化合物氟-脱氧尿嘧啶(FUDR)的敏感性。FUDR的细胞毒性依赖参与嘧啶代谢的两种酶的存在：胸苷激酶(Tdk)和胸苷酸合酶(ThyA)。Tdk将FUDR转化成氟-dUMP(F-dUMP)，其是ThyA的共价抑制剂并且是各种真核生物体中反向选择的基础(Czako,M.和Marton，L.,Plant Physiol.104:1067-1071(1994)；Gardiner,D.M.，和Howlett,B.J.,Curr Genet.45:249-255(2004)；Khang,C.H.，等，Fungal Genet Biol.42:483-492(2005)；Szybalski,W.,Bioessays.14:495-500(1992))。

HSV-TDK表达盒独立地融合至两个常用的显性选择标志物，其赋予对药物G418(Kan)或诺尔丝菌素(Nat)的抗性(Goldstein,A.L.等,Yeast.15：507-511(1999))。被称为KT-MX和NT-MX的双表达盒的转化能够实现进入两个染色体的整合的阳性选择，如图8A中所阐释。针对KT-MX和NT-MX盒，对于每轮的工程化，靶位点侧翼上游和下游区域的PCR扩增子设计为包含同源尾部。侧翼和标志物都被转化，随后在包含G418和Nat二者的YPD培养基上选择(图8B)。

在构建中采用的每个工程化步骤之后，随后删除和/或用期望的表达盒(Mascoma装配体)替换所有的标志物，产生没有抗生素标志物的菌株(图9)。

每个菌株构建的整合方案显示在图10中。菌株的基因型可见于表2。

表2.酿酒酵母菌株。

实施例2

PKA和PTA表达挽救(rescue)M3293菌株中的厌氧生长缺陷

比较来自实施例1的表达PHK和PTA的菌株的厌氧生长与不表达PHK和PTA的菌株的厌氧生长。具有完全的厌氧甘油生产途径的M2390用作野生型对照菌株。包含GPD1、GPD2、FDH1和FDH2缺失和表达青春双歧杆菌adhE的M3293没有厌氧生长的能力，除非提供乙酸盐。功能异源磷酸转酮酶/磷酸转乙酰酶途径弥补了M3293的厌氧生长缺陷。

来自所有菌株的细胞在YPD中生长过夜并且在包含100μl YPD的96孔板中接种至0.1g/l DCW的终浓度。使接种的板在厌氧室中平衡20分钟，然后密封板。如图11中可见，M3293不能厌氧生长，但是，包含异源磷酸转酮酶途径的M4408、M4409、M4410能够生长。这些结果表明当与来自青春双歧杆菌的磷酸转乙酰酶基因一起表达时，来自青春双歧杆菌、植物乳杆菌和黑曲霉的磷酸转酮酶能够实现厌氧生长。图12中显示的结果表明M3293和包含磷酸转酮酶的菌株之间的需氧生长速率仅有微小的差别。

实施例3

使用31％固体玉米醪液的发酵分析

在另一个实施方案中，比较来自实施例1的包含表达PHK和PTA的GPD1和GPD2的缺失的菌株发酵玉米醪液的能力与包含GPD1和GPD2缺失但是不表达PHK和PTA的菌株(M3293)的发酵玉米醪液的能力。通过在4ml的30％固体玉米醪液中接种酵母至0.1g/l DCW的初始浓度开始发酵。使用在培养基和顶部空间中的氧开始玉米醪液发酵。因为不能厌氧地开始发酵并且存在乙酸盐，因此预期M3293的生长有限。在玉米醪液发酵期间，存在0.3-0.5g/l的乙酸盐。磷酸转酮酶/磷酸转乙酰酶途径的存在能够在提供氧和耗尽乙酸盐之后实现生长。所有的三种包含磷酸转酮酶的菌株达到比M3293对照菌株显著更高的效价(图13)。M4408、M4409和M4410中的乙酸盐累积(图14)可能已经导致更低pH和更低的乙醇产率。

实施例4

限定的培养基中的发酵分析

将表2中描述的所有菌株接种至没有氨基酸的限定培养基。用如下面描述的培养基制备净化的厌氧瓶。通过用酵母菌株接种这些瓶子至0.1g/l DCW细胞的初始浓度开始发酵。接种之后，将瓶子放入保持在35C的震荡培养箱中。取出样品并且通过HPLC分析测定代谢物浓度。

限定的培养基

1.7g/l YNB-无AA没有AS(Sigma)

40g/l葡萄糖

2.3g/l尿素或5.0g/L硫酸铵

6.6g/l K₂S0₄

0.5g/l MgSO₄

3g/l KH₂PO₄

1000X–吐温80/麦角固醇(终浓度：20mg/L

麦角固醇420mg/L吐温)

Verduyn维生素&微量元素；每种1ml/L

包含磷酸转酮酶的菌株M4408和M4410相对于M3293具有改善的生长(图15)；但是，菌株相对于野生型对照菌株M2390具有减少的生物质形成。未在限定的培养基中观察到玉米醪液发酵中观察到的乙酸盐形成。M4408和M4410的乙醇效价比M2390高约9％(图16)，而甘油减少约2.4g/l(图17)。

实施例5

工程化用于酿酒酵母的PHK和PTA表达载体

使用PMU1689载体产生酿酒酵母磷酸转酮酶表达载体。植物乳杆菌PHK1、植物乳杆菌PHK2、黑曲霉PHK、干酪乳杆菌PHK、青春双歧杆菌PHK或粗糙脉孢菌PHK被克隆至PMU1689。为了产生磷酸转酮酶表达载体，使用表3中列举的引物和模板，由基因组DNA模板扩增PCR产物并且与线性化的pMU1689重组，使得每个基因的ORF紧邻ADH启动子的下游和紧邻PDC1终止子的上游。PHK表达载体的示意图可参见图18-23。

使用pMU1771表达载体产生酿酒酵母磷酸转乙酰酶表达载体(图24)。使用表3中列举的引物和模板，由青春双歧杆菌基因组DNA模板扩增青春双歧杆菌磷酸转乙酰酶orf并且与线性化的pMU1771重组，使得每个基因的ORF紧邻TEF2启动子的下游和紧邻ADH3终止子的上游。

表3.磷酸转酮酶克隆模板和载体

实施例6

磷酸转酮酶途径的组分的分析

为了评估磷酸转酮酶途径的组分，将表4中列举的菌株接种至包含4ml的补充225g/L麦芽糖糊精的YP培养基(10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨)的小瓶。当在发酵开始时添加0.6AGU/gTS葡糖淀粉酶时开始麦芽糊精水解。小瓶在32℃下孵育68hr并且取样用于HPLC分析。

表4.用于发酵研究的菌株。

M2390是常规的野生型酵母。M3293包含两种甘油-3-磷酸脱氢酶基因(GPD1和GPD2)的缺失、两种甲酸脱氢酶基因(FDH1和FDH2)，以及青春双歧杆菌双功能醇/醛脱氢酶表达。该菌株在厌氧条件下生长差并且仅能够产生42g/l乙醇的效价，而M2390能够达到113g/l乙醇(图25)。

添加磷酸转酮酶途径的组分至M3293使得乙醇生产改善。青春双歧杆菌和干酪乳杆菌PHK结合青春双歧杆菌PTA基因的表达使得分别产生60.7和72.3g/l(图25)，表明途径部分弥补M3293中观察到的缺陷。青春双歧杆菌PHK、PTA和ACK基因的表达使得产生92g/l的乙醇。该组合产生比当仅仅添加青春双歧杆菌PHK和PTA时显著更高的效价。

用于产生菌株的盒的描述见下文和图26-34中。如例如实施例1中描述产生菌株。

将本文引用的所有文献，包括期刊文章或摘要，公开的或相应的美国或外国专利申请、发行的或外国专利或任何其他文献的全部内容均各自引入本文作为参考，包括引用的文献中存在的所有的数据、表格、图和内容。

本领域技术人员将认识到，或仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在被以下权利要求书囊括。

Claims

1.一种重组微生物，其包括：

(a)编码磷酸转酮酶的异源核酸；

(b)至少一种编码乙酰辅酶A生产途径中的酶的异源核酸；

(c)编码双功能乙醛-醇脱氢酶的异源核酸；和，

(d)导致甘油生产途径中的酶下调的至少一种基因修饰。

2.权利要求1所述的重组微生物，其中所述磷酸转酮酶是具有酶学委员会编号4.1.2.9的单特异性磷酸转酮酶。

3.权利要求1所述的重组微生物，其中所述磷酸转酮酶是具有酶学委员会编号4.1.2.22的双特异性磷酸转酮酶。

4.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中所述磷酸转酮酶源自选自以下的属：曲霉属、脉胞菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、青霉菌属、明串珠菌属和酒球菌属。

5.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中所述磷酸转酮酶对应选自SEQ IDNO：9、11、12、13、14、15、62、64、66、68、70、72、74、78、94和102的多肽。

6.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中所述乙酰辅酶A生产途径中的所述酶是具有酶学委员会编号2.3.1.8的磷酸转乙酰酶。

7.权利要求6所述的重组微生物，其中所述磷酸转乙酰酶源自选自以下的属：双歧杆菌属、乳杆菌属、梭菌属、明串珠菌属和酒球菌属。

8.权利要求7所述的重组微生物，其中所述磷酸转乙酰酶对应选自SEQ ID NO：10、34、80、82、84、86和96的多肽。

9.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中所述乙酰辅酶A生产途径中的所述酶是具有酶学委员会编号2.7.2.12的乙酸激酶。

10.权利要求9所述的重组微生物，其中所述乙酸激酶源自选自以下的属：双歧杆菌属、乳杆菌属、梭菌属、明串珠菌属和酒球菌属。

11.权利要求10所述的重组微生物，其中所述乙酸激酶对应选自SEQ ID NO：16、76、88、92和100的多肽。

12.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中所述双功能乙醛-醇脱氢酶选自具有以下酶学委员会编号两者的酶：EC 1.2.1.10和1.1.1.1。

13.权利要求12所述的重组微生物，其中所述双功能乙醛-醇脱氢酶来自青春双歧杆菌并且对应SEQ ID NO：44编码的多肽。

14.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中所述双功能乙醛-醇脱氢酶是NADPH依赖性双功能乙醛-醇脱氢酶，其选自具有以下酶学委员会编号的酶：EC 1.2.1.10和1.1.1.2。

15.权利要求14所述的重组微生物，其中所述NADPH依赖性双功能乙醛-醇脱氢酶源自选自以下的属：明串珠菌属和酒球菌属。

16.权利要求15所述的重组微生物，其中所述NADPH依赖性双功能乙醛-醇脱氢酶对应选自SEQ ID NO：90和98的多肽。

17.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中甘油生产途径中的所述酶是具有酶学委员会编号1.1.1.8的甘油-3-磷酸脱氢酶。

18.权利要求17所述的重组微生物，其中所述甘油-3-磷酸脱氢酶选自甘油-3-磷酸脱氢酶1、甘油-3-磷酸脱氢酶2和其组合。

19.权利要求18所述的重组微生物，其中所述甘油-3-磷酸脱氢酶1来自酿酒酵母并且对应SEQ ID NO：28编码的多肽。

20.权利要求18所述的重组微生物，其中所述甘油-3-磷酸脱氢酶2来自酿酒酵母并且对应SEQ ID NO：30编码的多肽。

21.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中甘油生产途径中的所述酶是具有酶学委员会编号3.1.3.21的甘油-3-磷酸磷酸酶。

22.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物进一步包括至少一种另外的上调的酶。

23.权利要求22所述的重组微生物，其中具有酶学委员会编号2.2.1.2的转醛醇酶被上调。

24.权利要求23所述的重组微生物，其中所述转醛醇酶来自酿酒酵母并且对应SEQ IDNO：36编码的多肽。

25.权利要求22所述的重组微生物，其中具有酶学委员会编号2.2.1.1的转酮酶被上调。

26.权利要求25所述的重组微生物，其中所述转酮酶来自酿酒酵母并且对应SEQ IDNO：38编码的多肽。

27.权利要求22所述的重组微生物，其中具有酶学委员会编号5.3.1.6的核糖-5-P异构酶被上调。

28.权利要求27所述的重组微生物，其中所述核糖-5-P异构酶来自酿酒酵母并且对应SEQ ID NO：40编码的多肽。

29.权利要求22所述的重组微生物，其中具有酶学委员会编号5.1.3.1的核酮糖-5-P3-差向异构酶被上调。

30.权利要求29所述的重组微生物，其中所述核酮糖-5-P 3-差向异构酶来自酿酒酵母并且对应SEQ ID NO：42编码的多肽。

31.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中糖酵解途径中的至少一种酶被上调。

32.权利要求31所述的重组微生物，其中所述糖酵解途径中的所述酶是具有酶学委员会编号4.1.1.1的丙酮酸脱羧酶。

33.权利要求31所述的重组微生物，其中所述糖酵解途径中的所述酶是醇脱氢酶，其选自具有以下酶学委员会编号的酶：1.1.1.1和1.1.1.2。

34.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其另外包括至少一种基因修饰，所述基因修饰引起醛脱氢酶下调，所述醛脱氢酶选自具有以下酶学委员会编号的酶：1.2.1.3，1.2.1.4和1.2.1.10。

35.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其另外包括至少一种基因修饰，所述基因修饰引起醛脱氢酶上调，所述醛脱氢酶选自具有以下酶学委员会编号的酶：1.2.1.3，1.2.1.4和1.2.1.10。

36.权利要求33所述的重组微生物，其中所述醛脱氢酶是来自酿酒酵母的乙醛脱氢酶并且对应选自以下的多肽序列：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26。

37.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其另外包括至少一种基因修饰，所述基因修饰引起甲酸脱氢酶下调，所述甲酸脱氢酶选自具有以下酶学委员会编号的酶：1.2.1.43和1.2.1.2。

38.权利要求37所述的重组微生物，其中所述甲酸脱氢酶来自酿酒酵母并且对应选自以下的序列：对应SEQ ID NO：32的多肽序列和对应SEQ ID NO：33的多核苷酸序列。

39.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其另外包括至少一种基因修饰，所述基因修饰引起具有酶学委员会编号：2.3.1.54的丙酮酸甲酸裂解酶上调。

40.权利要求39所述的重组微生物，其中所述丙酮酸甲酸裂解酶对应SEQ ID NO：48编码的多肽。

41.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其另外包括至少一种基因修饰，所述基因修饰引起具有酶学委员会编号1.97.1.4的丙酮酸甲酸裂解酶活化酶上调。

42.权利要求41所述的重组微生物，其中所述丙酮酸甲酸裂解酶活化酶对应SEQ IDNO：46编码的多肽。

43.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物是酵母。

44.权利要求43所述的重组微生物，其中所述微生物来自酵母属。

45.权利要求44所述的重组微生物，其中所述微生物是酿酒酵母。

46.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物以比缺少所述基因修饰的在其他方面相同的微生物更高的产率产生乙醇。

47.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物产生比缺少所述基因修饰的在其他方面相同的微生物高1％至10％的乙醇效价。

48.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物以比缺少所述基因修饰的在其他方面相同的微生物更低的产率产生甘油。

49.权利要求1-3中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物比缺少所述基因修饰的在其他方面相同的微生物产生低10％至100％的甘油效价。

50.一种组合物，其包括权利要求1-49中任一项所述的重组微生物和含碳原料。

51.权利要求50所述的组合物，其中所述原料选自木质生物质、草、糖加工残渣、市政废物、农业废物或其任何组合。

52.权利要求51所述的组合物，其中所述原料包括回收的木浆纤维、锯屑、硬木、软木、稻秸、稻壳、大麦秸秆、玉米芯、谷类秸秆、小麦秸秆、油菜秸秆、燕麦秸秆、燕麦外壳、玉米纤维、秸秆、肉质植物、龙舌兰、甘蔗渣、柳枝稷、芒草、造纸污泥、市政废物或其任何组合。

53.一种使用权利要求50-52中任一项所述的组合物制备发酵产品的方法，其中所述重组微生物能够发酵含碳原料以产生发酵产品。

54.一种制备乙醇的方法，其包括：

(a)提供权利要求1-49中任一项所述的重组微生物；

(b)在存在含碳原料的情况下培养所述重组微生物足够的时间以制备乙醇；和任选地，

(c)提取乙醇。

55.一种减少甘油产生的方法，其包括提供权利要求1-49中任一项所述的重组微生物，其中所述甘油效价比缺少所述基因修饰的在其他方面相同的微生物的速率低10％至100％。

56.权利要求55所述的方法，其中与缺少所述基因修饰的在其他方面相同的微生物相比，所述甘油产生降低，并且其中当所述重组微生物在存在含碳原料的情况下培养足够的时间以制备乙醇时，乙醇效价升高至少1％至10％。

57.一种共培养物，其包括至少两种宿主细胞，其中

(a)一种宿主细胞包括权利要求1-49中任一项所述的重组微生物；和

(b)基因上与(a)不同的另一种宿主细胞。

58.权利要求57所述的共培养物，其中所述基因上不同的宿主细胞是酵母或细菌。

59.权利要求57或权利要求58所述的共培养物，其中所述基因上不同的宿主细胞是来自以下属的任何生物体：酵母属、伊氏酵母属、毕赤酵母属、棒孢酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、木霉属、嗜热子囊菌属、埃希氏菌属、梭菌属、热解纤维素菌属、发酵单胞菌属、嗜热厌氧杆菌属或嗜热厌氧菌属。