BR112018076492B1 - levedura recombinante e método para a produção de etanol usando a mesma - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a metabolizar ácido acético em um meio no momento de cultura, tal como fermentação de etanol por levedura, e reduzir a concentração de ácido acético. Especificamente, a invenção refere-se a uma levedura recombinante resultante de introdução do gene de acetaldeído desidrogenase (EC 1.2.1.10) e regulação de uma enzima envolvida no acúmulo de trealose.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção se refere a uma levedura recombinante e a um método para produzir etanol usando a mesma.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[002] Uma biomassa celulósica é um material inicial eficaz para um álcool útil, tal como etanol, ou um ácido orgânico. De modo a aumentar a quantidade de etanol produzido com o uso de uma biomassa celulósica, foram desenvolvidas cepas de levedura capazes de usar uma xilose, a qual é uma pentose, como substrato. Por exemplo, a Literatura de Patente 1 descreve uma cepa de levedura recombinante resultante da incorporação de um gene de xilose redutase e um gene de xilitol desidrogenase derivado de Pichia stipitis e um gene de xiluloquinase derivado de S. cerevisiae em seu cromossoma.

[003] Sabe-se que uma grande quantidade de ácido acético está contida em um hidrolisado de uma biomassa celulósica e que o ácido acético inibe a fermentação do etanol por uma cepa de levedura. No caso de uma cepa de levedura na qual foi introduzido um gene de assimilação de xilose em particular, sabe-se que o ácido acético inibe a fermentação de etanol realizada com o uso de xilose como fonte de sacarídeo em um nível significativo (Literaturas Não Patente 1 e 2).

[004] Um mosto (moromi) resultante da fermentação de uma biomassa celulósica sacarificada com uma celulase é composto principalmente de resíduo não fermentado, resíduo pouco fermentável, enzimas e micro-organismos fermentadores. O uso de uma solução de reação que contém mosto para o subsequente processo de fermentação permite a reutilização de micro-organismos fermentadores, redução da quantidade de micro-organismos fermentadores a serem introduzidos e redução de custos. Neste caso, contudo, o ácido acético contido na pasta é simultaneamente introduzido, a concentração de ácido acético contida em um meio de fermentação é consequentemente aumentada, e isto pode inibir a fermentação de etanol. No caso de uma técnica de fermentação contínua na qual o mosto em um tanque de fermentação é transferido para um tanque de queima no qual um nível de pressão reduzido é mantido, o etanol é removido do tanque de queima e o mosto é retornado para o tanque de fermentação, embora a remoção do ácido acético da mistura seja difícil. Assim, a inibição da fermentação mediada por ácido acético seria crítica.

[005] De modo a evitar a inibição da fermentação pelo ácido acético, há relatos sobre a capacidade de fermentação do etanol na presença de ácido acético que foi aprimorada por meio de superexpressão do gene de LPP1 ou ENA1 (Literatura Não Patente 3) ou inativação do gene de FPS1 (Literatura Não Patente 4) de Saccharomyces cerevisiae, a qual é uma cepa geralmente usada para fermentação de etanol. No entanto, tal literatura relata os resultados referentes à fermentação alcoólica realizada com o uso de um substrato de glicose, e os efeitos sobre a fermentação alcoólica realizados com o uso de um substrato xilose, o qual é inibido pelo ácido acético em um nível significativo, permanecem desconhecidos. Mesmo se as cepas de levedura mutantes relatadas em tal literatura fossem usadas, a quantidade de carga de ácido acético, a qual seria problemática no momento de reutilização de micro-organismos fermentadores ou fermentação contínua, não seria reduzida.

[006] Alternativamente, a inibição da fermentação pelo ácido acético pode ser evitada pela metabolização do ácido acético em um meio simultaneamente com a fermentação do etanol. No entanto, o metabolismo do ácido acético é uma reação aeróbica, a qual se sobrepõe à via metabólica do etanol. Embora o metabolismo de ácido acético possa ser conseguido conduzindo a fermentação sob condições aeróbicas, consequentemente, o etanol como uma substância alvo também seria metabolizado.

[007] Como meio de metabolizar o ácido acético sob condições anaeróbias nas quais o etanol não é metabolizado, foi relatada a assimilação de ácido acético alcançada pela introdução do gene que codifica a acetaldeído desidrogenase (EC 1.2.1.10) em uma cepa de Saccharomyces cerevisiae na qual os genes de GPD1 e GPD2 da via de produção de glicerina foram inativados (Literaturas Não Patente 5 e 6 e Literaturas de Patente 2 a 4). A acetaldeído desidrogenase catalisa a reação reversível descrita abaixo. Acetaldeído + NAD+ + coenzima A ^ acetil coenzima A + NADH + H+

[008] A via de produção de glicerina mediada pelos genes de GPD1 e GPD2 é uma via que oxida o excesso de coenzima NADH resultante do metabolismo em NAD+, conforme mostrado na reação química a seguir. 0,5 glicose + NADH + H+ + ATP ^ glicerina + NAD+ + ADP + Pi

[009] A via de reação é destruída pela inativação dos genes de GPD1 e GPD2, a coenzima NADH em excesso é fornecida através da introdução de acetaldeído desidrogenase, e a reação prossegue conforme mostrado abaixo. Acetil coenzima A + NADH + H+ ^ acetaldeído + NAD+ + coenzima A

[0010] A acetil coenzima A é sintetizada a partir do ácido acético pela acetil-CoA sintetase e o acetaldeído é convertido em etanol. Eventualmente, a coenzima NADH em excesso é oxidada e o ácido acético é metabolizado, conforme mostrado na reação química a seguir. Ácido acético + 2NADH + 2H+ + ATP ^ etanol + NAD+ + AMP + Pi

[0011] Conforme descrito acima, é necessário destruir a via da glicerina de modo a conferir capacidade de metabolização de ácido acético a uma cepa de levedura. No entanto, sabe-se que a cepa com GPD1 e GPD2 inativados reduziu significativamente a capacidade de fermentação, e a utilidade no nível industrial é baixa.

[0012] Há um relatório sobre o fornecimento em excesso de coenzima NADH que causa um desequilíbrio nas condições de oxidação-redução intracelular, dependendo da diferença da dependência de coenzima entre a xilose redutase (XR) e a xilitol desidrogenase (XDH) através da introdução de XR e XDH da via metabólica de xilose em vez de inativar os genes GPD1 e GPD2 (Literatura Não Patente 7). Especificamente, a XR converte a xilose em xilitol usando principalmente NADPH como coenzima para preparar NADP+, enquanto que a XDH converte xilitol em xilulose usando NAD+ como uma coenzima para preparar NADH. Ao causar um desequilíbrio nos requisitos de coenzima de tais enzimas, o NADH é acumulado como uma consequência. Como um resultado da fermentação de etanol a partir da xilose com o auxílio de uma cepa de levedura na qual a XR e a XDH foram introduzidas, no entanto, um metabólito intermediário (isto é, xilitol) é acumulado. Embora ácido acético seja metabolizado, a eficiência do etanol é pobre, e este método não é prático.

[0013] Uma cepa resultante da introdução de acetaldeído desidrogenase em uma cepa que não foi submetida à inativação dos genes de GPD1 ou GPD2 também foi citada (Literatura Não Patente 8). Embora a Literatura Não Patente 8 relate que a quantidade de produção de ácido acético é reduzida após a introdução da acetaldeído desidrogenase, não é relatado que o ácido acético no meio seria reduzido. Além disso, a Literatura Não Patente 8 não se refere a uma cepa de levedura que assimila xilose.

[0014] Também, há relatos sobre uma cepa de levedura que assimila xilose resultante da introdução de um gene de xilose isomerase (XI) (derivado dos protozoários intestinais de cupins) (Literatura de Patente 5) e uma cepa resultante da introdução adicional do gene de acetaldeído desidrogenase (derivado de Bifidobacterium adolescentis) em uma cepa de levedura que assimila xilose que compreende um gene de XI (derivado de Piromyces sp. E2) introduzido na mesma (Literatura de Patente 6), embora a literatura acima não relate a assimilação de ácido acético no momento da assimilação de xilose.

[0015] De acordo com técnicas convencionais, conforme descrito acima, não há relatos de técnicas para metabolizar e degradar eficientemente o ácido acético sob condições nas quais nem o gene de GPD1 nem o gene de GPD2 foram inativados.

[0016] Entretanto, foi relatado que o NTH1 é um gene de enzima de degradação de trealose e sua inativação resultaria em um aumento da quantidade de trealose acumulada em uma célula e tolerância ao congelamento é obtida (Literatura de Patente 7).Também foi relatado que a tolerância ao etanol e a tolerância ao calor são aprimoradas (Literatura de Patente 8). No entanto, não houve relato de melhora na assimilação de ácido acético como um resultado do acúmulo de trealose no momento da fermentação de etanol.

LISTA DE CITAÇÕES LITERATURA DE PATENTE

[0017]Literatura de Patente 1:documento JP 2009-195220 A

[0018]Literatura de Patente 2:documento WO2011/010923

[0019]Literatura de Patente 3:documento WO2011/140386

[0020]Literatura de Patente 4:documento WO2014/074895

[0021]Literatura de Patente 5:documento JP 2011-147445 A

[0022]Literatura de Patente 6:documento JP 2010-239925 A

[0023]Literatura de Patente 7:documento JP 1998-11777 A

[0024]Literatura de Patente 8:documento JP 1998-243783 A

LITERATURA NÃO PATENTE

[0025] Literatura Não Patente 1: FEMS Yeast Research, vol. 9, 2009, páginas 358-364

[0026] Literatura Não Patente 2: Enzyme and Microbial Technology 33, 2003, páginas 786-792

[0027] Literatura Não Patente 3: Biotecnol. Bioeng., 2009, 103 (3): páginas 500-512

[0028] Literatura Não Patente 4: Biotecnol. Lett., 2011, 33: páginas 277-284

[0029] Literatura Não Patente 5: Appl. Environ Microbiol., 2010, 76: páginas 190-195

[0030] Literatura Não Patente 6: Appl. Environ Microbiol., 2015, 81: 08-17

[0031] Literatura Não Patente 7: Nat Commun., 2013, 4, 2580

[0032] Literatura Não Patente 8: Biotecnol. Lett. 2011, 33: 13751380

SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[0033] Conforme descrito acima, a fermentação de etanol com o auxílio de uma levedura envolve a inativação da via de produção de glicerina em combinação com a introdução de acetaldeído desidrogenase. Assim, o ácido acético pode ser assimilado até determinado ponto, embora a capacidade de fermentação de etanol de tal levedura esteja deteriorada. No caso de uma levedura que envolve apenas a introdução de acetaldeído desidrogenase, no entanto, a capacidade de assimilação de ácido acético desta levedura é insuficiente.

[0034] Nas circunstâncias acima, é um objetivo da presente invenção fornecer uma levedura recombinante que tem uma capacidade aprimorada de assimilação de ácido acético sem envolver a inativação da via de produção de glicerina, o que deterioraria a capacidade de fermentação de etanol, e um método para produzir etanol usando tal levedura recombinante.

SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA

[0035] Os presentes inventores conduziram estudos concentrados para atingir os objetos acima. Como um resultado, eles descobriram que uma levedura recombinante obtida ao regular a via de produção de trealose e aumentar a quantidade de trealose acumulada em uma célula, bem como introduzir o gene de acetaldeído desidrogenase, seria capaz de aumentar a capacidade de assimilação de ácido acético no momento de cultura, tal como a fermentação de etanol. Isto levou à conclusão da presente invenção.

[0036] A presente invenção inclui o seguinte.

[0037](1) Uma levedura recombinante resultante da introdução do gene de acetaldeído desidrogenase (EC 1.2.1.10) e regulação de uma enzima envolvida no acúmulo de trealose.

[0038](2) A levedura recombinante, de acordo com (1), em que o gene de acetaldeído desidrogenase codifica a acetaldeído desidrogenase derivada de E. coli.

[0039](3) A levedura recombinante, de acordo com (2), em que a acetaldeído desidrogenase derivada de E. coli é a proteína (a) ou (b) abaixo: (a)uma proteína que consiste na sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, 4 ou 6; ou (b)uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos com 90 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, 4 ou 6 e que tem atividade de acetaldeído desidrogenase.

[0040](4) A levedura recombinante, de acordo com qualquer um de (1)a (3), em que a regulação de uma enzima envolvida no acúmulo de trealose tem um baixo nível de expressão do gene de trealose.

[0041](5) A levedura recombinante, de acordo com qualquer um de (2)a (4), a qual compreende ainda o gene de xilose isomerase introduzido na mesma.

[0042](6) A levedura recombinante, de acordo com (5), em que a xilose isomerase é a proteína (a) ou (b) abaixo: (a)uma proteína que consiste na sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 12; ou (b)uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos que tem 90 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 12 e tem atividade enzimática de conversão de xilose em xilulose.

[0043](7) A levedura recombinante, de acordo com qualquer um de (1) a (6), a qual ainda compreende o gene de xiluloquinase introduzido na mesma.

[0044](8) A levedura recombinante, de acordo com qualquer um de (1) a (7), a qual compreende ainda um gene que codifica uma enzima selecionada a partir do grupo de enzimas que constituem uma via de processo não oxidativo na via de pentoses fosfato introduzida na mesma.

[0045](9) A levedura recombinante, de acordo com (8), em que o grupo de enzimas que constituem uma via de processo não oxidativo na via de pentoses fosfato inclui ribose-5-fosfato isomerase, ribulose-5- fosfato-3-epimerase, transcetolase e transaldolase.

[0046](10) A levedura recombinante, de acordo com qualquer um de (1) a (9), em que o gene de álcool desidrogenase que tem atividade de converter acetaldeído em etanol é expresso em um nível elevado.

[0047](11) A levedura recombinante, de acordo com qualquer um de (1) a (10), em que o nível de expressão do gene de álcool desidrogenase que tem atividade de converter etanol em acetaldeído é reduzido.

[0048](12) Um método para a produção de etanol que compreende uma etapa de fermentação de etanol via cultura da levedura recombinante de acordo com qualquer um de (1) a (11) em um meio que contém glicose e/ou xilose.

[0049](13) O método, de acordo com (12), em que o meio contém celulose e a fermentação de etanol prossegue simultaneamente com a sacarificação de pelo menos a celulose.

[0050] A presente descrição inclui parte ou todo o conteúdo conforme descrito na Descrição do Pedido de Patente Japonesa N° 2016-126016, ao qual o presente pedido reivindica prioridade.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[0051] Com o uso da levedura recombinante de acordo com a presente invenção, a concentração de ácido acético em um meio pode ser diminuída no momento de cultura, tal como fermentação de etanol, e a fermentação inibida pelo ácido acético pode ser eficazmente evitada. Como um resultado, o método para a produção de etanol da presente invenção permite a manutenção da eficiência de fermentação do etanol em um nível elevado com o uso da levedura recombinante de acordo com a presente invenção, deste modo, obtendo um excelente rendimento de etanol.

[0052] Consequentemente, o método para a produção de etanol de acordo com a presente invenção permite a redução da quantidade de ácido acético no momento de reutilização da levedura recombinante ou seu uso para cultura contínua, deste modo, permitindo a manutenção de um excelente rendimento de etanol.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES LEVEDURA RECOMBINANTE

[0053] A levedura recombinante de acordo com a presente invenção é obtida através da introdução do gene de acetaldeído desidrogenase (EC 1.2.1.10) e regulação de uma enzima envolvida no acúmulo de trealose de modo a aumentar a quantidade de trealose acumulada em uma célula. A levedura recombinante de acordo com a presente invenção é caracterizada por ser capaz de metabolizar o ácido acético contido em um meio e reduzir a concentração de ácido acético em um meio quando de cultura, tal como fermentação de etanol.

[0054] Um gene de acetaldeído desidrogenase a ser introduzido em uma levedura não está particularmente limitado e pode ser usado um gene derivado de qualquer espécie de organismo. Quando genes de acetaldeído desidrogenase derivados de outros organismos que não um fungo, tal como levedura (por exemplo, genes derivados de bactérias, animais, plantas, insetos ou algas) são usados, é preferível que a sequência de nucleotídeos do gene seja modificada de acordo com a frequência de uso de códons em uma levedura na qual o gene de interesse deve ser introduzido.

[0055] Mais especificamente, o gene fr mhpF de E. coli e o gene ALDH1 de Entamoeba histolytica, conforme descrito em Applied and Environmental Microbiology, Maio de 2004, páginas 2892-2897, vol. 70, N° 5, podem ser usados como genes de acetaldeído desidrogenase. A sequência de nucleotídeos do gene de mhpF de E. coli e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo gene de mhpF são mostradas em SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente.

[0056] O gene de acetaldeído desidrogenase não está limitado ao gene identificado por SEQ ID NOs: 1 e 2. Ele pode ser um gene parálogo ou um gene homólogo, no sentido estrito, que tem diferentes sequências de nucleotídeos e de aminoácidos, contato que seja uma enzima definida com EC 1.2.1.10.Exemplos dos genes de acetaldeído desidrogenase incluem um gene de adhE e um gene de eutE de E. coli, um gene de acetaldeído desidrogenase derivado de Clostridium beijerinckii e um gene de acetaldeído desidrogenase derivado de Chlamydomonas reinhardtii. Aqui, a sequência de nucleotídeos do gene de adhE de E. coli e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo gene de adhE são mostradas em SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente. A sequência de nucleotídeos do gene de eutE de E. coli e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo gene de eutE são mostradas em SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente. Adicionalmente, a sequência de nucleotídeos do gene de acetaldeído desidrogenase derivado de Clostridium beijerinckii e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo gene são mostradas em SEQ ID NOs: 7 e 8, respectivamente. Além disso, a sequência de nucleotídeos do gene de acetaldeído desidrogenase derivado de Chlamydomonas reinhardtii e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo gene são mostradas em SEQ ID NOs: 9 e 10, respectivamente.

[0057] Os genes de acetaldeído desidrogenase não estão limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 1 e 2, 3 e 4, 5 e 6, 7 e 8, e 9 e 10. Por exemplo, ele pode ser um gene que codifica uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos que tem 70 % ou mais, de preferência 80 % ou mais, mais preferivelmente 90 % ou mais e, ainda mais preferivelmente, 95 % ou mais de similaridade ou identidade de sequência com a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10 e que tem atividade de acetaldeído desidrogenase. O grau de similaridade ou identidade de sequência pode ser determinado usando o programa BLASTN ou BLASTX equipado com o algoritmo BLAST (nas configurações padrão). O grau de similaridade de sequência é determinado ao submeter um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento emparelhada, identificar resíduos de aminoácidos e resíduos de aminoácidos completamente idênticos que exibem funções físico-químicas similares, determinar o número total de tais resíduos de aminoácidos e calcular a percentagem de todos os resíduos de aminoácidos submetidos à comparação contabilizados pelo número total dos resíduos de aminoácidos mencionados acima. O grau de identidade da sequência é determinado ao submeter um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento emparelhada, identificar resíduos de aminoácidos completamente idênticos e calcular a percentagem de todos os resíduos de aminoácidos submetidos à comparação representados por estes resíduos de aminoácidos completamente idênticos.

[0058] Além disso, os genes de acetaldeído desidrogenase não estão limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 1 e 2, 3 e 4, 5 e 6, 7 e 8, e 9 e 10. Por exemplo, ele pode ser um gene que codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10 por meio de substituição, eliminação, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos e que tem atividade de acetaldeído desidrogenase. O termo "vários" usado aqui se refere, por exemplo, a 2 a 30, de preferência 2 a 20, mais preferivelmente 2 a 10 e, ainda mais preferivelmente, 2 a 5.

[0059] Além disso, os genes de acetaldeído desidrogenase não estão limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 1 e 2, 3 e 4, 5 e 6, 7 e 8, e 9 e 10. Por exemplo, ele pode ser um gene que hibridiza, sob condições rigorosas, à sequência de comprimento total ou uma sequência parcial de uma fita de DNA complementar que consiste na sequência de nucleotídeos conforme mostrado em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9 e que codifica uma proteína que tem atividade de acetaldeído desidrogenase. Sob "condições rigorosas", os assim denominados híbridos específicos são formados, porém, híbridos não específicos não são formados. Tais condições podem ser adequadamente determinadas por meio de referência, por exemplo, a Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira Edição). Especificamente, o grau de rigor pode ser determinado de acordo com a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para a hibridização de Southern e a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para a etapa de lavagem em hibridização de Southern. Sob condições rigorosas, mais especificamente, a concentração de sódio é 25 a 500 mM e, de preferência, 25 a 300 mM, e a temperatura é 42 graus C a 68 graus C e, de preferência, 42 graus C a 65 graus C, por exemplo. Mais especificamente, a concentração de sódio é 5x SSC (NaCl a 83 mM, citrato de sódio a 83 mM) e a temperatura é 42 graus C.

[0060] Conforme descrito acima, se um gene que consiste ou não em uma sequência de nucleotídeos que difere da sequência conforme mostrado em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9 ou um gene que codifica uma sequência de aminoácidos que difere da sequência conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10 funcionariam como um gene de acetaldeído desidrogenase pode ser determinado, por exemplo, ao preparar um vetor de expressão que compreende o gene de interesse incorporado em um sítio adequado entre um promotor apropriado e um terminador apropriado, transformar um hospedeiro, tal como E. coli, usando tal vetor de expressão, e ensaiar a atividade de acetaldeído desidrogenase da proteína expressa. A atividade de acetaldeído desidrogenase pode ser testada ao preparar uma solução que contém acetaldeído, CoA e NAD+ como substratos, permitir que a proteína alvo reaja na temperatura adequada e converter o acetil fosfato produzido em acetil fosfato com o auxílio de uma acetiltransferase fosfato ou ensaiar espectroscopicamente o NADH gerado.

[0061] A levedura recombinante de acordo com a presente invenção é obtida ao regular uma enzima envolvida no acúmulo de trealose de modo a aumentar a quantidade de trealose acumulada em uma célula. O termo "enzima envolvida no acúmulo de trealose" se refere a uma enzima a qual, direta ou indiretamente, desempenha um papel na produção ou degradação de trealose. Exemplos de enzimas envolvidas no acúmulo de trealose incluem a enzima que degrada a trealose (isto é, a trealase), tais como a trealase neutra (NTH1) e a trealase ácida (ATH1). A regulação de uma enzima envolvida no acúmulo de trealose permite que um gene que codifica esta enzima seja expresso em um nível elevado de modo a aumentar a quantidade de trealose acumulada em uma célula ou o nível de expressão do gene que codifica a enzima diminui. Expressão genética de alto nível é conseguida, por exemplo, por meio de um método no qual um gene estranho relevante é introduzido em uma levedura ou um método no qual um promotor de gene endógeno relevante é substituído por um promotor para expressão de alto nível. De modo a reduzir o nível de expressão de um gene, tal como um gene de trealase, um promotor ou terminador do gene endógeno pode ser modificado ou o gene pode ser inativado. Tal gene pode ser inativado ao inativar um ou ambos os alelos existentes em uma levedura diploide. Exemplos de técnicas para suprimir a expressão gênica incluem a técnica do transposon, a técnica do transgene, a técnica de silenciamento gênico pós-transcricional, a técnica de RNAi, a técnica de declínio mediado no sentido errôneo (em inglês, NMD), a técnica de ribozima, a técnica antissenso, a técnica de miRNA (micro-RNA) e a técnica de siRNA (pequeno RNA de interferência).

[0062] A levedura recombinante de acordo com a presente invenção pode ter capacidade de metabolização de xilose como um resultado da introdução de um gene de xilose isomerase. Isto é, o termo "levedura que tem capacidade de metabolização de xilose" se refere a qualquer uma levedura que tem a capacidade de metabolização de xilose como um resultado da introdução de um gene de xilose isomerase em uma levedura que não tem inerentemente a capacidade de metabolizar xilose, uma levedura que tem capacidade de metabolizar xilose como um resultado da introdução de um gene de xilose isomerase e outro gene associado ao metabolismo de xilose em uma levedura que não tem inerentemente capacidade de metabolização de xilose ou uma levedura que tem inerentemente a capacidade de metabolizar a xilose.

[0063] Uma levedura que tem a capacidade de metabolizar xilose é capaz de assimilar a xilose contida em um meio para produzir etanol. A xilose contida em um meio pode ser obtida através de sacarificação de xilano ou hemicelulose, a qual compreende xilose como um açúcar constituinte. Alternativamente, ela pode ser uma substância fornecida a um meio como um resultado da sacarificação de xilana ou hemicelulose contida em um meio por uma carboidrase. O último caso se refere ao assim denominado sistema simultâneo de sacarificação e fermentação.

[0064] Os genes de xilose isomerase (XI) não estão particularmente limitados e podem ser usados genes derivados de qualquer espécie de organismo. Por exemplo, uma pluralidade de genes de xilose isomerase derivados dos protozoários intestinais de cupins descritos no documento JP 2011-147445 A pode ser usada sem limitação particular. Exemplos dos genes de xilose isomerase que podem ser usados incluem um gene derivado do fungo anaeróbico Piromyces sp. cepa E2 (JP 2005-514951 A), um gene derivado do fungo anaeróbico Cyllamyces aberensis, um gene derivado de uma cepa bacteriana (isto é, Bacteroides thetaiotaomicron), um gene derivado de uma cepa bacteriana (isto é, Clostridium phytofermentans), e um gene derivado de uma cepa do agrupamento de Streptomyces murinus.

[0065] Especificamente, é preferido usar um gene de xilose isomerase derivado dos protozoários intestinais de Reticulitermes speratus como o gene de xilose isomerase. A sequência de nucleotídeos da região codificadora do gene de xilose isomerase é derivada dos protozoários intestinais de Reticulitermes speratus e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada por este gene são mostradas em SEQ ID NOs: 11 e 12, respectivamente.

[0066] O gene de xilose isomerase não está limitado ao gene identificado por SEQ ID NOs: 11 e 12. Ele pode ser um gene parálogo ou um gene homólogo, no sentido restrito, que tem sequências de nucleotídeos e de aminoácidos diferentes.

[0067] O gene de xilose isomerase não está limitado ao gene identificado por SEQ ID NOs: 11 e 12. Por exemplo, ele pode ser um gene que codifica uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos que tem 70 % ou mais, de preferência 80 % ou mais, mais preferivelmente 90 % ou mais e, ainda mais preferivelmente, 95 % ou mais de similaridade ou identidade de sequência com a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 12 e que tem atividade de xilose isomerase. O grau de similaridade ou identidade de sequência pode ser determinado usando o programa BLASTN ou BLASTX equipado com o algoritmo BLAST (nas configurações padrão). O grau de similaridade de sequência é determinado ao submeter um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento emparelhada, identificar resíduos de aminoácidos e resíduos de aminoácidos completamente idênticos que exibem funções físico-químicas similares, determinar o número total de tais resíduos de aminoácidos e calcular a percentagem de todos os resíduos de aminoácidos submetidos à comparação contabilizados pelo número total de tais resíduos de aminoácidos. O grau de identidade da sequência é determinado ao submeter um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento emparelhada, identificar resíduos de aminoácidos completamente idênticos e calcular a percentagem de todos os resíduos de aminoácidos submetidos à comparação contabilizados por tais resíduos de aminoácidos.

[0068] Além disso, o gene de xilose isomerase não está limitado ao gene identificado por SEQ ID NOs: 11 e 12. Por exemplo, ele pode ser um gene que codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12 por meio de substituição, eliminação, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos e que tem atividade de xilose isomerase. O termo "vários" usado aqui se refere, por exemplo, a 2 a 30, de preferência 2 a 20, mais preferivelmente 2 a 10 e, ainda mais preferivelmente, 2 a 5.

[0069] Além disso, o gene de xilose isomerase não está limitado ao gene identificado por SEQ ID NOs: 11 e 12. Por exemplo, ele pode ser um gene que hibridiza, sob condições rigorosas, com a sequência de comprimento total ou uma sequência parcial de uma fita de DNA complementar que consiste na sequência de nucleotídeos conforme apresentado em SEQ ID NO: 11 e que codifica uma proteína que tem atividade de xilose isomerase. Sob "condições rigorosas", os assim denominados híbridos específicos são formados, porém, híbridos não específicos não são formados. Tais condições podem ser adequadamente determinadas com referência, por exemplo, a Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira Edição). Especificamente, o grau de rigor pode ser determinado de acordo com a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para hibridização de Southern e a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para a etapa de lavagem em hibridização de Southern. Sob condições rigorosas, mais especificamente, a concentração de sódio é 25 a 500 mM e, de preferência, 25 a 300 mM, e a temperatura é 42 graus C a 68 graus C e, de preferência, 42 graus C a 65 graus C, por exemplo. Mais especificamente, a concentração de sódio é 5x SSC (NaCl a 83 mM, citrato de sódio a 83 mM) e a temperatura é 42 graus C.

[0070] Conforme descrito acima, se um gene que consiste ou não em uma sequência de nucleotídeos que difere da sequência mostrada em SEQ ID NO: 11 ou um gene que codifica uma sequência de aminoácidos que difere da sequência mostrada em SEQ ID NO: 12 funcionaria como o gene de xilose isomerase pode ser determinado, por exemplo, ao preparar um vetor de expressão que compreende o gene de interesse incorporado em um sítio adequado entre um promotor apropriado e um terminador apropriado, transformar um hospedeiro, tal como E. coli, usando tal vetor de expressão e ensaiar a atividade de xilose isomerase da proteína expressa. O termo "atividade de xilose isomerase" se refere à atividade de isomerização de xilose em xilulose. Assim, a atividade de xilose isomerase pode ser avaliada ao preparar uma solução que contém xilose como substrato, permitir que a proteína alvo reaja em uma temperatura adequada e medir a quantidade de xilose que diminuiu e/ou a quantidade de xilulose que tinha sido produzida.

[0071] O uso de um gene que codifica uma xilose isomerase mutante que consiste em uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12 através da introdução de uma mutação particular em um resíduo de aminoácido particular e que tem atividade de xilose isomerase aprimorada é particularmente preferido como um gene de isomerase xilose. Um exemplo específico de um gene que codifica uma xilose isomerase mutante é um gene que codifica uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 12 por meio de substituição de asparagina na posição 337 com cisteína. A atividade de xilose isomerase da xilose isomerase que consiste em uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos conforme apresentado em SEQ ID NO: 12 por meio de substituição de asparagina na posição 337 com cisteína é superior àquela de uma xilose isomerase de tipo selvagem. Uma xilose isomerase mutante não está limitada a uma resultante da substituição de asparagina na posição 337 por cisteína. Uma xilose isomerase mutante pode resultar da substituição de asparagina na posição 337 por um aminoácido diferente de cisteína, substituição de outro resíduo de aminoácido além de asparagina na posição 337 por outro aminoácido ou substituição de outro resíduo de aminoácido diferente daquele na posição 337.

[0072] Exemplos de genes associados ao metabolismo de xilose que não os genes de xilose isomerase incluem um gene de xilose redutase que codifica uma xilose redutase que converte a xilose em xilitol, um gene de xilitol desidrogenase que codifica uma xilitol desidrogenase que converte xilitol em xilulose e um gene de xiluloquinase que codifica uma xiluloquinase que fosforila xilulose para produzir 5-fosfato de xilulose. O 5-fosfato de xilulose produzido por uma xiluloquinase será metabolizado em uma via de pentoses fosfato.

[0073] Exemplos de genes associados ao metabolismo de xilose incluem, porém sem limitações particulares, um gene de xilose redutase e um gene de xilitol desidrogenase derivado de Pichia stipitis e um gene de xiluloquinase derivado de Saccharomyces cerevisiae (consulte Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol., 66: 3381-3386 e Toivari M.N. et al., Metab. Eng., 3: 236-249). Além disso, podem ser usados genes de xilose redutase derivados de Candida tropicalis e Candida prapsilosis, genes de xilitol desidrogenase derivados de Candida tropicalis e Candida prapsilosis e um gene de xiluloquinase derivado de Pichia stipitis.

[0074] Exemplos de leveduras que inerentemente têm capacidade de metabolizar a xilose incluem, porém sem limitações particulares, Pichia stipitis, Candida tropicalis e Candida prapsilosis.

[0075] A levedura recombinante de acordo com a presente invenção pode ainda compreender outro(s) gene(s) introduzido(s) na mesma e este(s) outro(s) gene(s) não está/estão particularmente limitado(s). Por exemplo, um gene envolvido no metabolismo de açúcar, tal como glicose, pode ser introduzido nesta levedura recombinante. Por exemplo, uma levedura recombinante pode ter atividade de betaglucosidase resultante da introdução do gene de beta-glucosidase.

[0076] O termo "atividade de beta-glucosidase" usado aqui se refere à atividade de catalisar uma reação de hidrólise de uma ligação beta- glicosídeo de um açúcar. Especificamente, a beta-glicosidase é capaz de degradar um oligossacarídeo, tal como celobiose, em glicose. O gene de beta-glucosidase pode ser introduzido na forma de um gene de exibição na superfície celular. O termo "gene de exibição da superfície celular" usado aqui se refere a um gene que é modificado para apresentar uma proteína a ser codificada pelo gene em uma superfície celular. Por exemplo, um gene de beta-glucosidase de exibição na superfície celular de um gene resultante da fusão de um gene de beta-glucosidase com um gene de proteína localizada na superfície celular. Uma proteína localizada na superfície celular é fixada e está presente em uma camada da superfície celular da levedura. Exemplos incluem proteínas aglutinantes, tais como alfa ou α-aglutinina, e proteínas FLO. Em geral, uma proteína localizada na superfície celular compreende uma sequência de sinalização secretora N-terminal e um sinal de reconhecimento de ligação à âncora de GPI C-terminal. Embora uma proteína localizada na superfície celular compartilhe propriedades com uma proteína secretora em termos da presença de um sinal secretório, a proteína localizada na superfície celular difere da proteína secretora pelo fato de que a proteína localizada na superfície celular é transportada enquanto fixada a uma membrana celular através de uma âncora de GPI. Quando uma proteína localizada na superfície celular passa através de uma membrana celular, uma sequência sinalizadora de reconhecimento de ligação à âncora de GPI é seletivamente cortada, se liga a uma âncora de GPI em uma região C-terminal recentemente saliente e é depois fixada à membrana celular. Posteriormente, a raiz da âncora de GPI é cortada pela fosfolipase C dependente de fosfatidilinositol (PI-PLC).Subsequentemente, uma proteína separada da membrana celular é integrada em uma parede celular, fixada em uma camada da superfície celular e depois localizada em uma camada da superfície celular (consulte, por exemplo, documento JP 2006-174767 A).

[0077] O gene de beta-glucosidase não está particularmente limitado, e um exemplo é um gene de beta-glicosidase derivado de Aspergillus aculeatus (Murai, et al., Appl. Environ.Microbiol., 64: 48574861). Adicionalmente, pode ser usado um gene de beta-glucosidase derivado de Aspergillus oryzae, um gene de beta-glucosidase derivado de Clostridium cellulovorans e um gene de beta-glucosidase derivado de Saccharomycopsis fibligera.

[0078] Além do gene de beta-glucosidase, o gene que codifica outra enzima constituinte da celulase pode ter sido introduzido na levedura recombinante de acordo com a presente invenção. Exemplos de enzimas que constituem a celulase que não a beta-glicosidase incluem as exo-celobio-hidrolases que liberam celobiose da extremidade da celulose cristalina (CBH1 e CBH2) e endo-glucanase (EG), as quais não degradam a celulose cristalina, mas clivam uma celulose não cristalina (amorfa) aleatoriamente.

[0079] Exemplos de outros genes a serem introduzidos em uma levedura recombinante incluem um gene de álcool desidrogenase (o gene de ADH1) que tem atividade de converter acetaldeído em etanol, um gene de acetil-CoA sintetase (o gene de ACS1) que tem atividade de converter ácido acético em acetil-CoA e genes que têm atividade de conversão de acetaldeído em ácido acético (isto é, os genes de ALD4, ALD5 e ALD6). O gene de álcool desidrogenase (o gene de ADH2) que tem atividade de converter etanol em acetaldeído pode ser inativado.

[0080] Além disso, é preferível que a levedura recombinante de acordo com a presente invenção permita a expressão de alto nível do gene de álcool desidrogenase (o gene de ADH1) que tem atividade de conversão de acetaldeído em etanol. Para obter expressão de alto nível de tal gene, por exemplo, um promotor do gene inerente pode ser substituído por um promotor pretendido para expressão de alto nível ou um vetor de expressão que permite que a expressão de tal gene possa ser introduzida em uma levedura.

[0081] A sequência de nucleotídeos do gene de ADH1 de Saccharomyces cerevisiae e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada por este gene são mostradas em SEQ ID NOs: 13 e 14, respectivamente. O gene de álcool desidrogenase a ser expresso em níveis elevados não está limitado ao gene identificado por SEQ ID NOs: 13 e 14. Ele pode ser um gene parálogo ou um gene homólogo, no sentido estrito, que tem sequências de nucleotídeos e de aminoácidos diferentes.

[0082] O gene de álcool desidrogenase não está limitado ao gene identificado por SEQ ID NOs: 13 e 14. Por exemplo, ele pode ser um gene que codifica uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos que tem 70 % ou mais, de preferência 80 % ou mais, mais preferivelmente 90 % ou mais e, ainda mais preferivelmente, 95 % ou mais de similaridade ou identidade de sequência com a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 14 e que tem atividade de álcool desidrogenase. O grau de similaridade ou identidade de sequência pode ser determinado usando o programa BLASTN ou BLASTX equipado com o algoritmo BLAST (nas configurações padrão). O grau de similaridade de sequência é determinado ao submeter um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento emparelhada, identificar resíduos de aminoácidos e resíduos de aminoácidos completamente idênticos que exibem funções físico-químicas similares, determinar o número total de tais resíduos de aminoácidos e calcular a percentagem de todos os resíduos de aminoácidos submetidos à comparação contabilizados pelo número total de tais resíduos de aminoácidos. O grau de identidade da sequência é determinado ao submeter um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento emparelhada, identificar resíduos de aminoácidos completamente idênticos e calcular a percentagem de todos os resíduos de aminoácidos submetidos à comparação contabilizados pelo número total destes resíduos de aminoácidos.

[0083] Além disso, o gene de álcool desidrogenase não está limitado ao gene identificado por SEQ ID NOs: 13 e 14. Por exemplo, ele pode ser um gene que codifica uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID. NO: 14 por meio de substituição, eliminação, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos e que tem atividade de desidrogenase de álcool. O termo "vários" usado aqui se refere, por exemplo, a 2 a 30, de preferência 2 a 20, mais preferivelmente 2 a 10 e, ainda mais preferivelmente, 2 a 5.

[0084] Além disso, o gene de álcool desidrogenase não está limitado ao gene identificado por SEQ ID NOs: 13 e 14. Por exemplo, ele pode ser um gene que hibridiza, sob condições rigorosas, com a sequência inteira ou uma sequência parcial de uma fita de DNA complementar que consiste na sequência de nucleotídeos conforme mostrado em SEQ ID NO: 13 e que codifica uma proteína que tem atividade de álcool desidrogenase. Sob "condições rigorosas", os assim denominados híbridos específicos são formados, porém, híbridos não específicos não são formados. Tais condições podem ser adequadamente determinadas com referência, por exemplo, a Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira Edição). Especificamente, o grau de rigor pode ser determinado de acordo com a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para hibridização de Southern e a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para a etapa de lavagem em hibridização de Southern. Sob condições rigorosas, mais especificamente, a concentração de sódio é 25 a 500 mM e, de preferência, 25 a 300 mM, e a temperatura é 42 graus C a 68 graus C e, de preferência, 42 graus C a 65 graus C, por exemplo. Mais especificamente, a concentração de sódio é 5x SSC (NaCl a 83 mM, citrato de sódio a 83 mM) e a temperatura é 42 graus C.

[0085] Conforme descrito acima, se um gene que consiste ou não de uma sequência de nucleotídeos que difere da sequência mostrada em SEQ ID NO: 13 ou um gene que codifica uma sequência de aminoácidos que difere da sequência mostrada em SEQ ID NO: 14 funcionaria como um gene de álcool desidrogenase que tem atividade de converter acetaldeído em etanol pode ser determinado, por exemplo, ao preparar um vetor de expressão que compreende o gene de interesse incorporado em um sítio adequado entre um promotor apropriado e um terminador apropriado, transformar um hospedeiro, tal como uma levedura, usando tal vetor de expressão e ensaiar a atividade de álcool desidrogenase da proteína expressa. A atividade de álcool desidrogenase da conversão de acetaldeído em etanol pode ser ensaiada ao preparar uma solução que contém aldeído e NADH ou NADPH como substratos, permitir que a proteína alvo reaja em uma temperatura adequada e ensaiar o álcool gerado ou ensaiar espectroscopicamente o NAD+ ou NADP+.

[0086] A levedura recombinante de acordo com a presente invenção é, de preferência, caracterizada por um nível de expressão reduzido do gene de álcool desidrogenase (o gene de ADH2) que tem atividade de converter etanol em acetaldeído. De modo a diminuir o nível de expressão deste gene, um promotor do gene inerente de interesse pode ser modificado, ou este gene pode ser eliminado. De modo a eliminar o gene, um ou ambos de um par de genes de ADH2 presentes em uma levedura recombinante diploide podem ser eliminados. Exemplos de técnicas para supressão da expressão gênica incluem a técnica do transposon, a técnica do transgene, silenciamento gênico pós-transcricional, a técnica de RNAi, a técnica de declínio mediado no sentido errôneo (NMD), a técnica de ribozima, a técnica antissenso, a técnica de miRNA (micro-RNA) e a técnica de siRNA (pequeno RNA de interferência).

[0087] A sequência de nucleotídeos do gene de ADH2 de Saccharomyces cerevisiae e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada por este gene são mostradas em SEQ ID NOs: 15 e 16, respectivamente. O gene de álcool desidrogenase alvo não está limitado ao gene identificado por SEQ ID NOs: 15 e 16. Ele pode ser um gene parálogo ou um gene homólogo, no sentido restrito, que tem diferentes sequências de nucleotídeos e de aminoácidos.

[0088] O gene de álcool desidrogenase não está limitado ao gene identificado por SEQ ID NOs: 15 e 16. Por exemplo, ele pode ser um gene que codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que tem 70 % ou mais, preferivelmente 80 % ou mais, mais preferivelmente 90 % ou mais e, ainda mais preferivelmente, 95 % ou mais de similaridade ou identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 16 e que tem atividade de álcool desidrogenase. O grau de similaridade ou identidade de sequência pode ser determinado usando o programa BLASTN ou BLASTX equipado com o algoritmo BLAST (nas configurações padrão). O grau de similaridade de sequência é determinado ao submeter um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento emparelhada, identificar resíduos de aminoácidos e resíduos de aminoácidos completamente idênticos que exibem funções físico-químicas similares, determinar o número total de tais resíduos de aminoácidos e calcular a percentagem de todos os resíduos de aminoácidos submetidos à comparação contabilizados pelo número total de tais resíduos de aminoácidos. O grau de identidade de sequência é determinado ao submeter um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento emparelhada, identificar resíduos de aminoácidos completamente idênticos e calcular a percentagem de todos os resíduos de aminoácidos submetidos à comparação contabilizados pelo número total destes resíduos de aminoácidos.

[0089] Além disso, o gene de álcool desidrogenase não está limitado ao gene identificado por SEQ ID NOs: 15 e 16. Por exemplo, ele pode ser um gene que codifica uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID. NO: 16 por meio de substituição, eliminação, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos e que tem atividade de desidrogenase de álcool. O termo "vários" usado aqui se refere, por exemplo, a 2 a 30, de preferência 2 a 20, mais preferivelmente 2 a 10 e, ainda mais preferivelmente, 2 a 5.

[0090] Além disso, o gene de álcool desidrogenase não está limitado ao gene identificado por SEQ ID NOs: 15 e 16. Por exemplo, ele pode ser um gene que hibridiza, sob condições rigorosas, com a sequência inteira ou uma sequência parcial de uma fita de DNA complementar que consiste na sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 15 e que codifica uma proteína que tem atividade de álcool desidrogenase. Sob "condições rigorosas", os assim denominados híbridos específicos são formados, porém, híbridos não específicos não são formados. Tais condições podem ser adequadamente determinadas com referência, por exemplo, a Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira Edição). Especificamente, o grau de rigor pode ser determinado de acordo com a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para hibridização de Southern e a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para a etapa de lavagem em hibridização de Southern. Sob condições rigorosas, mais especificamente, a concentração de sódio é 25 a 500 mM e, de preferência, 25 a 300 mM, e a temperatura é 42 graus C a 68 graus C e, de preferência, 42 graus C a 65 graus C, por exemplo. Mais especificamente, a concentração de sódio é 5x SSC (NaCl a 83 mM, citrato de sódio a 83 mM) e a temperatura é 42 graus C.

[0091] Conforme descrito acima, se um gene que consiste ou não de uma sequência de nucleotídeos que difere da sequência mostrada em SEQ ID NO: 15 ou um gene que codifica uma sequência de aminoácidos que difere da sequência mostrada em SEQ ID NO: 16 funcionaria como um gene de álcool desidrogenase que tem atividade de conversão de etanol em acetaldeído pode ser determinado, por exemplo, ao preparar um vetor de expressão que compreende o gene de interesse incorporado em um sítio adequado entre um promotor apropriado e um terminador apropriado, transformar um hospedeiro, tal como uma levedura, usando tal vetor de expressão e ensaiar a atividade de álcool desidrogenase da proteína expressa. A atividade de álcool desidrogenase de converter etanol em acetaldeído pode ser ensaiada ao preparar uma solução que contém álcool e NAD+ ou NADP+ como substratos, permitir que a proteína alvo reaja na temperatura adequada e ensaiar o aldeído gerado ou ensaiar espectroscopicamente o NADH ou NADPH.

[0092] Outros exemplos de outros genes que podem ser introduzidos em uma levedura recombinante incluem genes associados à via metabólica da L-arabinose, a qual é uma pentose contida na hemicelulose que constitui uma biomassa. Exemplos de tais genes incluem um gene de L-arabinose isomerase, um gene de L- ribuloquinase e um gene de L-ribulose-5-fosfato 4-epimerase derivado de procariotas e um gene de L-arabitol-4-desidrogenase e um gene de L-xilose redutase derivado de eucariotas.

[0093] Em particular, um exemplo de outro gene a ser introduzido em uma levedura recombinante é um gene capaz de promover o uso de xilose em um meio. Um exemplo específico deste é um gene que codifica a xiluloquinase que tem atividade de gerar xilulose-5-fosfato usando xilulose como substrato. O fluxo metabólico da via de pentoses fosfato pode ser aprimorado através da introdução do gene de xiluloquinase.

[0094] Além disso, um gene que codifica uma enzima selecionada a partir do grupo de enzimas que constituem uma via de processo não oxidativo na via de pentoses fosfato pode ser introduzido em uma levedura recombinante. Exemplos de enzimas que constituem uma via de processo não oxidativo na via das pentoses fosfato incluem ribose- 5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato-3-epimerase, transcetolase e transaldolase. É preferível que um ou mais genes codificadores de tais enzimas sejam introduzidos. É preferível introduzir dois ou mais destes genes em combinação, sendo mais preferível introduzir três ou mais genes em combinação e ainda mais preferível introduzir todos os genes acima.

[0095] Mais especificamente, o gene de xiluloquinase (XK) de qualquer origem pode ser usado sem limitação particular. Uma grande variedade de micro-organismos, tais como bactérias e leveduras, que assimilam a xilulose, possuem o gene de XK. Informações sobre os genes de XK podem ser obtidas no site do NCBI ou de outras instituições, de acordo com a necessidade. Exemplos preferidos de tais genes incluem os genes de XK derivados de leveduras, bactérias do ácido láctico, bactérias E. coli e plantas. Um exemplo de um gene de XK é XKS1, o qual é um gene de XK derivado da cepa S288C de S. cerevisiae (GenBank: Z72979) (a sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos na região codificadora de CDS).

[0096] Mais especificamente, um gene de transaldolase (TAL), um gene de transcetolase (TKL), um gene de ribulose-5-fosfato-epimerase (RPE) e um gene de ribose-5-fosfato-cetoisomerase (RKI) de qualquer origem podem ser usados sem particular limitação. Uma grande variedade de organismos que compreendem a via de pentoses-fosfato possui tais genes. Por exemplo, uma levedura comum, tal como S. cerevisiae, possui tais genes. Informações sobre estes genes podem ser obtidas no site do NCBI ou em outras instituições, de acordo com a necessidade. Os genes derivados do mesmo gênero que as células eucariotas hospedeiras, tais como células eucariotas ou de levedura, são preferidos, e os genes com origem na mesma espécie que as células eucariotas hospedeiras são ainda preferíveis. Um gene de TAL1, um gene de TKL1 e um gene de TKL2, um gene de RPE1 e um gene de RKI1 podem, de preferência, ser usados como o gene de TAL, o gene de TKL, o gene de RPE e o gene de RKI, respectivamente. Exemplos de tais genes incluem um gene de TAL1 derivado da cepa S288 de S. cerevisiae (GenBank: U19102), um gene de TKL1 derivado da cepa S288 de S. cerevisiae (GenBank: X73224), um gene de RPE1 derivado da cepa S288 de S. cerevisiae (GenBank: X83571) e um gene de RKI1 derivado da cepa S288 de S. cerevisiae (GenBank: Z75003).

PRODUÇÃO DE LEVEDURA RECOMBINANTE

[0097] O gene de acetaldeído desidrogenase conforme descrito acima é introduzido no genoma de uma levedura hospedeira, uma enzima envolvida no acúmulo de trealose é regulada nesta levedura e a levedura recombinante de acordo com a presente invenção pode ser produzida. O gene de acetaldeído desidrogenase pode ser introduzido em uma levedura que não tem capacidade de metabolizar xilose, uma levedura a qual tem inerentemente a capacidade de metabolizar xilose ou uma levedura que não tem capacidade de metabolizar xilose em conjunto com o gene associado ao metabolismo de xilose. Quando o gene de acetaldeído desidrogenase e os genes descritos acima são introduzidos em uma levedura, tais genes podem ser introduzidos simultaneamente ou tais genes podem ser sucessivamente introduzidos com o uso de diferentes vetores de expressão.

[0098] Exemplos de leveduras hospedeiras que podem ser usadas incluem, porém sem limitações particulares, Candida Shehatae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus, Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccaromyces pombe, Saccharomyces cerevisiae sendo particularmente preferível. Cepas de levedura experimentais também podem ser usadas do ponto de vista da conveniência experimental ou cepas industriais (práticas) também podem ser usadas do ponto de vista da utilidade prática. Exemplos de cepas industriais incluem cepas de levedura usadas para a produção de vinho, saquê e shochu.

[0099] O uso de uma levedura hospedeira que tem propriedades homotálicas é preferível. De acordo com a técnica descrita no documento JP 2009-34036 A, múltiplas cópias de genes podem ser facilmente introduzidas em um genoma com o uso de uma levedura que tem propriedades homotálicas. O termo "levedura que tem propriedades homotálicas" tem o mesmo significado que o termo "levedura homotálica". Leveduras que têm propriedades homotálicas não estão particularmente limitadas, e quaisquer leveduras podem ser usadas.Um exemplo de uma levedura que tem propriedades homotálicas é a cepa OC-2 de Saccharomyces cerevisiae (NBRC2260), embora as leveduras não estejam limitadas à mesma. Exemplos de outras leveduras que têm propriedades homotálicas incluem uma levedura produtora de álcool (Taiken N° 396, NBRC02 16) (referência: "Alcohol kobo no shotokusei" ("Various properties of alcohol-producing yeast"), Shuken Kaiho N° 37, páginas 18-22, 1998.8), uma levedura produtora de etanol isolada no Brasil e em Okinawa, Japão (referência: "Brazil to Okinawa de bunri shita Saccharomyces cerevisiae yaseikabu no idengakuteki seishitsu" ("Genetic properties of wild-type Saccharomyces cerevisiae isolated in Brazil and in Okinawa"), o Journal of the Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry, Vol. 65, n° 4, páginas 759-762, 1991.4) e 180 (referência: "Alcohol Hakkoryoku no tsuyoi kobo no screening" ("Screening of yeast having potent alcohol-fermenting ability"), o Journal of the Brewing Society of Japan, Vol. 82, No. 6, pp. 439-443, 1987.6). Adicionalmente, o gene de HO pode ser introduzido em uma levedura que exibe fenótipos heterotálicos de uma maneira passível de expressão e a levedura resultante pode ser usada como uma levedura que tem propriedades homotálicas. Isto é, o termo "levedura que tem propriedades homotálicas" usado aqui também se refere a uma levedura na qual o gene de HO foi introduzido de uma maneira passível de expressão.

[00100] A cepa OC-2 de Saccharomyces cerevisiae é particularmente preferida, uma vez que tem sido usada até agora para fermentação de vinho e sua segurança foi verificada. Conforme descrito nos Exemplos abaixo, a cepa OC-2 de Saccharomyces cerevisiae é preferível em termos de sua excelente atividade promotora em altas concentrações de açúcar. Em particular, a cepa OC-2 de Saccharomyces cerevisiae é preferível em termos de sua excelente atividade promotora para o gene de piruvato descarboxilase (PDC1) em concentrações elevadas de açúcar.

[00101] Os promotores gênicos a serem introduzidos não estão particularmente limitados. Por exemplo, podem ser usados promotores do gene de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (TDH3), do gene de 3-fosfoglicerato quinase (PGK1) e do gene de resposta à elevada pressão osmótica 7 (HOR7). O promotor do gene de piruvato descarboxilase (PDC1) é particularmente preferível em termos de sua elevada capacidade de expressar genes alvo em uma região a jusante em níveis elevados.

[00102] Especificamente, os genes conforme descrito acima podem ser introduzidos no genoma da levedura juntamente com um promotor regulador de expressão ou outra região com expressão regulada. Tal gene pode ser introduzido no genoma de uma levedura hospedeira de tal maneira que sua expressão seja regulada por um promotor ou outra região com expressão regulada de um gene que está inerentemente presente.

[00103] Os genes descritos acima podem ser introduzidos no genoma por meio de qualquer técnica convencional conhecida, tal como a técnica de transformação de levedura. Exemplos específicos incluem, porém sem limitações, eletroporação (Meth. Enzym., 194, páginas 182, 1990), a técnica de esferoplastos (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, páginas 1929, 1978) e o método de acetato de lítio (J. Bacteriology, 153, páginas 163, 1983; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, páginas 1929, 1978; e Methods in Levygenics, Edição de 2000: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual).

PRODUÇÃO DE ETANOL

[00104] O método para a produção de etanol de acordo com a presente invenção é um método para sintetizar etanol a partir de uma fonte de sacarídeo contida em um meio com o uso da levedura recombinante descrita acima. De acordo com o método para a produção de etanol de acordo com a presente invenção, a levedura recombinante pode metabolizar o ácido acético contido em um meio e a concentração de ácido acético em um meio é reduzida em associação com a fermentação de etanol.

[00105] Quando de produção de etanol com o uso da levedura recombinante descrita acima, a fermentação de etanol é realizada através de cultura em um meio que contém pelo menos um ou ambos de glicose e xilose. Um meio no qual a fermentação de etanol é realizada contém pelo menos um ou ambos de glicose e xilose como uma fonte de carbono (ou fontes de carbono). O meio pode conter outra fonte de carbono.

[00106] Um ou ambos de glicose e xilose que estão contidas em um meio a ser usado para fermentação de etanol podem ser derivadas de uma biomassa celulósica. A biomassa celulósica pode ter sido submetida a uma técnica de pré-tratamento convencional. Exemplos de técnicas de pré-tratamento incluem, porém sem limitações particulares, degradação de uma lignina com um micro-organismo e trituração de uma biomassa celulósica. Por exemplo, uma biomassa celulósica triturada pode ser submetida a pré-tratamento, tal como embeber em uma solução diluída de ácido sulfúrico, solução alcalina ou solução iônica, tratamento hidrotérmico ou trituração fina. Assim, a eficiência da sacarificação da biomassa pode ser aprimorada.

[00107] Em outras palavras, o meio pode compreender celulose, tal como uma biomassa celulósica e celulase. Neste caso, o meio contém glicose gerada pela reação da celulase sobre a celulose.

[00108] O meio pode ainda compreender uma biomassa celulósica e hemicelulase que sacarifica a hemicelulose contida em uma biomassa celulósica para gerar xilose.Neste caso, o meio contém xilose gerada quando a hemicelulase atua sobre a hemicelulose.

[00109] Uma solução sacarificada resultante da sacarificação de uma biomassa celulósica pode ser adicionada a um meio usado para fermentação de etanol. Em tal caso, a solução sacarificada pode conter celulose, ou celulase remanescente e glicose gerada, ou pode conter hemicelulose ou hemicelulase remanescente e xilose gerada.

[00110] Conforme descrito acima, o método para a produção de etanol de acordo com a presente invenção compreende um processo de fermentação de etanol realizado com o uso de pelo menos um ou ambos de glicose e xilose como uma fonte de sacarídeo (ou fontes de sacarídeo). De acordo com o método para a produção de etanol da presente invenção, o etanol pode ser produzido via fermentação de etanol realizada com o uso de um ou ambos de glicose e xilose como uma fonte de sacarídeo (ou fontes de sacarídeo). De acordo com o método para a produção de etanol com o uso da levedura recombinante de acordo com a presente invenção, a fermentação de etanol é seguida por recuperação de etanol do meio. O etanol pode ser recuperado através de qualquer meio convencional sem limitação particular. Após a conclusão do processo de fermentação de etanol mencionado acima, por exemplo, uma camada líquida que contém etanol é separada de uma camada sólida que contém a levedura recombinante ou matéria sólida via separação de solução sólida. Em seguida, o etanol contido em uma camada líquida é separado e purificado por meio de destilação, de modo que etanol altamente purificado possa ser recuperado. O grau de purificação do etanol pode ser adequadamente determinado de acordo com a finalidade de uso do etanol.

[00111] Quando da produção de etanol com o uso de um sacarídeo derivado de uma biomassa, em geral, um inibidor de fermentação, tal como ácido acético ou furfural, pode ocasionalmente ser gerado no processo de pré-tratamento ou sacarificação. Em particular, sabe-se que o ácido acético inibe o crescimento e a multiplicação de leveduras e reduz a eficiência da fermentação de etanol realizada com o uso de xilose como uma fonte de sacarídeo.

[00112] De acordo com a presente invenção, no entanto, são usadas leveduras recombinantes resultantes da introdução do gene de acetaldeído desidrogenase e regulação de uma enzima envolvida no acúmulo de trealose, de modo a aumentar a quantidade de trealose acumulada em uma célula. Assim, o ácido acético contido em um meio pode ser metabolizado e a concentração de ácido acético em um meio pode ser mantida em um nível baixo. Consequentemente, o método para a produção de etanol de acordo com a presente invenção pode alcançar um rendimento de etanol superior àquele obtido com o uso de uma levedura que não tenha sofrido a introdução do gene de acetaldeído desidrogenase ou regulação de uma enzima envolvida no acúmulo de trealose, de modo a aumentar a quantidade de trealose acumulada em uma célula.

[00113] De acordo com o método para a produção de etanol de acordo com a presente invenção, a concentração de ácido acético em um meio permanece baixa após a levedura recombinante ter sido cultivada durante um determinado período de tempo. Mesmo se parte do meio após este dado período de tempo for usado para um sistema de cultura contínuo no qual um novo processo de cultura é iniciado, a quantidade de transporte de ácido acético pode ser reduzida. De acordo com o método para a produção de etanol de acordo com a presente invenção, portanto, a quantidade de transferência de ácido acético pode ser reduzida mesmo quando as células são recuperadas e reutilizadas após a conclusão do processo de fermentação de etanol.

[00114] O método para a produção de etanol de acordo com a presente invenção pode empregar o assim denominado processo simultâneo de sacarificação e fermentação, no qual a etapa de sacarificação da celulose contida em um meio com uma celulase prossegue simultaneamente com o processo de fermentação de etanol realizado com o uso de xilose e glicose gerada na sacarificação como fontes de sacarídeos. Com o processo simultâneo de sacarificação e fermentação, a etapa de sacarificação de uma biomassa celulósica é realizada simultaneamente com o processo de fermentação de etanol.

[00115] Os métodos de sacarificação não estão particularmente limitados, e, por exemplo, um método enzimático que envolve o uso de uma preparação de celulase, tal como celulase ou hemicelulase, pode ser empregado. Uma preparação de celulase contém uma pluralidade de enzimas envolvidas na degradação de uma cadeia de celulose e uma cadeia de hemicelulose e exibe uma pluralidade de tipos de atividade, tais como atividade de endoglucanase, atividade de endoxilanase, atividade de celobiohidrolase, atividade de glucosidase e atividade de xilosidase. As preparações de celulases não estão particularmente limitadas e exemplos incluem celulases produzidas por Trichoderma reesei e Acremonium cellulolyticus.Também podem ser usadas preparações de celulase comercialmente disponíveis.

[00116] No processo simultâneo de sacarificação e fermentação, uma preparação de celulase e a levedura recombinante conforme descrito acima são adicionadas a um meio que contém uma biomassa celulósica (uma biomassa após o pré-tratamento pode ser usada), e a levedura recombinante é cultivada em uma determinada faixa de temperatura. A cultura pode ser realizada em qualquer temperatura sem limitação particular, e a temperatura pode ser de 25 graus C a 45 graus C e, de preferência, 30 a 40 graus C, do ponto de vista da eficiência de fermentação de etanol. O nível de pH da solução de cultura é, de preferência, de 4 a 6. Quando se realiza a cultura, agitação pode ser realizada. Alternativamente, o processo simultâneo de sacarificação e fermentação pode ser realizado de forma irregular, de modo que a sacarificação seja primeiramente realizada em uma temperatura ideal para uma enzima (40 °C a 70 °C), a temperatura seja reduzida para um dado nível (30 graus C a 40 graus C), e uma levedura recombinante seja, então, adicionada à mesma.

EXEMPLOS

[00117] A seguir, a presente invenção é descrita em maiores detalhes com referência aos Exemplos, embora o âmbito técnico da presente invenção não esteja limitado a estes Exemplos.

EXEMPLO 1

[00118] No presente Exemplo, foi preparada uma levedura recombinante resultante da introdução do gene de acetaldeído desidrogenase e inativação do gene de NTH1 envolvido no acúmulo de trealose. A capacidade de metabolizar ácido acético da levedura recombinante resultante foi avaliada.

Preparação do Vetor Para Introdução do Gene (1)Plasmídeo para introdução dos genes de XI, XKS1, TKL1, TAL1, RKI1 e RPE1 e inativação do gene de GRE3

[00119] Um plasmídeo, pUC-5U_GRE3- P_HOR7- TKL1- TAL1- FBA1_P-P_ADH1-RPE1- RKI1-TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C-T_DIT1- P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3,foi preparado. Este plasmídeo foi construído para compreender, no locus do gene de GRE3, uma sequência necessária para inativação do gene de GRE3 e introdução dos seguintes genes em levedura: um gene mutante para o qual a taxa de assimilação de xilose foi aprimorada como um resultado da substituição de asparagina na posição de aminoácido 337 do gene de xilose isomerase derivado dos protozoários intestinais de Reticulitermes speratus (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 11; sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 12) por cisteína (XI_N337C; SEQ ID NO: 48 no documento WO 2014/156194); um gene de xiluloquinase derivada de levedura (XKS1) (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 17; sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 18); um gene de transcetolase 1 (TKL1) (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 19; sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 20), um gene de transaldolase 1 (TAL1) (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 21; sequência de aminoácidos: SEQ ID NO:22), um gene de ribulose-fosfato-epimerase 1 (RPE1) (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 23; sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 24) e um gene de ribose fosfato cetoisomerase (RKI1) (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 25; sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 26) da via de pentoses fosfato.

[00120] Este plasmídeo foi construído para compreender: o gene de TKL1 derivado da cepa BY4742 de Saccharomyces cerevisiae na qual um promotor de HOR7 é adicionado no lado 5'; o gene de TAL1 no qual um promotor de FBA1 é adicionado; o gene de RKI1 no qual um promotor de ADH1 é adicionado; o gene de RPE1 no qual um promotor de TEF1 é adicionado; XI_N337C no qual um promotor de TDH1 e um terminador de DIT1 são adicionados (preparados através da síntese total com base em uma sequência concebida por meio de alteração de códons em toda a região de acordo com a frequência de uso de códons da levedura); o gene de XKS1 no qual um promotor de TDH3 e um terminador de HIS3 são adicionados; uma sequência gênica (5U_GRE3) que compreende uma região a montante de aproximadamente 700 pb a partir da extremidade 5' do gene de GRE3 e uma sequência de DNA (3U_GRE3) que compreende uma região a jusante de aproximadamente 800 pb a partir da extremidade 3' do gene de GRE3, as quais são as regiões a serem integradas no genoma da levedura via recombinação homóloga; e uma sequência gênica (marcador G418) que compreende o gene de G418, o qual é um marcador. A sequência LoxP foi introduzida em ambos os lados do gene marcador, deste modo, tornando possível remover o marcador.

[00121] Cada sequência de DNA pode ser amplificada via PCR com o uso dos iniciadores mostrados na Tabela 1. De modo a permitir que os fragmentos de DNA se liguem uns aos outros, uma sequência de DNA foi adicionada a um iniciador de modo a se sobrepor a uma sequência de DNA adjacente de15 pb, um fragmento de DNA alvo da mesma foi amplificado com o uso do DNA genômico da cepa BY4742 de Saccharomyces cerevisiae, DNA do gene sintético XI_N337C e DNA sintético da sequência LoxP como modelos, os fragmentos de DNA foram sucessivamente ligados uns aos outros com o uso do kit In-Fusion (marca registrada) AD Cloning (Takara Bio), e o produto resultante foi, em seguida, clonado no plasmídeo pUC19. Assim, o plasmídeo que atende ao objetivo final foi preparado.

(2)Plasmídeo Para Introdução dos Genes de mhpF e ADH1 e Inativação do Gene de ADH2

[00122] Foi preparado um plasmídeo, pUC-5U_ADH2-P_TDH3- ADH1-T_ADH1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2. Este plasmídeo foi construído para compreender, no locus do gene de ADH2, uma sequência necessária para inativação do gene de ADH2 (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 15; e sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 16) e introdução dos genes a seguir em levedura: o gene de acetaldeído desidrogenase (mhpF) derivado de E. coli (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 1; e sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 2) e o gene de álcool desidrogenase 1 (ADH1) derivado de levedura (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 13; e sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 14).

[00123] Este plasmídeo foi construído para compreender: o gene de ADH1 derivado da cepa BY4742 de Saccharomyces cerevisiae, no qual é adicionado um promotor de TDH3 no lado 5'; o gene de mhpF no qual um promotor de HOR7 e um terminador de DIT1 são adicionados (N° de Acesso NCBI: 945008; preparados através de síntese total com base em uma sequência concebida pela alteração de códons em toda a região de acordo com a frequência de uso de códons da levedura); uma sequência gênica (5U_ADH2) que compreende uma região a montante de aproximadamente 700 pb a partir da extremidade 5' do gene de ADH2 e uma sequência de DNA (3U_ADH2) que compreende uma região a jusante de aproximadamente 800 pb a partir da extremidade 3' do gene de ADH2, as quais são regiões a serem integradas no genoma da levedura via recombinação homóloga; e uma sequência gênica (marcador URA3) que compreende o gene de URA3, o qual é um marcador.

[00124] Cada sequência de DNA pode ser amplificada via PCR com o uso dos iniciadores mostrados na Tabela 1. De modo a permitir que os fragmentos de DNA se liguem uns aos outros, uma sequência de DNA foi adicionada a um iniciador de modo a se sobrepor a uma sequência de DNA adjacente de 15 pb, um fragmento de DNA alvo da mesma foi amplificado com o uso do DNA genômico da cepa BY4742 de Saccharomyces cerevisiae ou DNA do gene sintético mhpF como modelo, os fragmentos de DNA foram sucessivamente ligados uns ao outros com o uso do kit In-Fusion (marca registrada) HD Cloning, e o resultante foi, então, clonado no plasmídeo pUC19. Assim, o plasmídeo que atende ao objetivo final foi preparado.

(3)Plasmídeo para Introdução do Gene de adhE e ADH1 e Inativação do Gene de ADH2

[00125] Foi preparado um plasmídeo, pUC-5U_ADH2-P_TDH3- ADH1-T_ADH1-DIT1_T-adhE-HOR7_P-URA3-3U_ADH2. Este plasmídeo foi construído para compreender, no locus do gene de ADH2, uma sequência necessária para inativação do gene de ADH2 (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 15; sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 16) e introdução dos seguintes genes na levedura: o gene de acetaldeído desidrogenase (adhE) derivado de E. coli (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 3; sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 4) e o gene de álcool desidrogenase 1 (ADH1) derivado de levedura (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 13; sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 14).

[00126] Este plasmídeo foi construído para compreender: o gene de ADH1 derivado da cepa BY4742 de Saccharomyces cerevisiae, no qual é adicionado um promotor de TDH3 no lado 5'; o gene de adhE no qual um promotor de HOR7 e um terminador de DIT1 são adicionados (N° de Acesso NCBI: 945837; preparados através da síntese total com base em uma sequência concebida pela alteração de códons sobre toda a região de acordo com a frequência de uso de códons da levedura); uma sequência gênica (5U_ADH2) que compreende uma região a montante de aproximadamente 700 pb a partir da extremidade 5' do gene de ADH2 e uma sequência de DNA (3U_ADH2) que compreende uma região a jusante de aproximadamente 800 pb a partir a extremidade 3' do gene de ADH2, as quais são regiões a serem integradas no genoma da levedura via recombinação homóloga; e uma sequência gênica (marcador URA3) que compreende o gene de URA3, o qual é um marcador.

[00127] Cada sequência de DNA pode ser amplificada via PCR com o uso dos iniciadores mostrados na Tabela 1. De modo a permitir que os fragmentos de DNA se liguem uns ao outros, uma sequência de DNA foi adicionada a um iniciador de modo a se sobrepor a uma sequência de DNA adjacente de 15 pb, um fragmento de DNA alvo da mesma foi amplificado com o uso de DNA do plasmídeo pUC-5U_ADH2-P_TDH3- ADH1-T_ADH1-DIT1_T- mhpF -HOR7_P-URA3-3U_ADH2 ou o gene sintético adhE como modelo, os fragmentos de DNA foram sucessivamente ligados uns aos outros com o uso do kit In-Fusion (marca registrada) HD Cloning, e o resultante foi, então, clonado no plasmídeo pUC19. Assim, o plasmídeo que atende ao objetivo final foi preparado.

(4)Plasmídeo para Introdução dos Genes de eutE e ADH1 e Inativação do Gene de ADH2

[00128] Foi preparado um plasmídeo, pUC-5U_ADH2-P_TDH3- ADH1-T_ADH1-DIT1_T-eutE-HOR7_P-URA3-3U_ADH2. Este plasmídeo foi construído para compreender, no locus do gene de ADH2, uma sequência necessária para inativação do gene de ADH2 (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 15; sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 16) e introdução dos seguintes genes na levedura: o gene de acetaldeído desidrogenase (eutE) derivado de E. coli (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 5; sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 6) e o gene de álcool desidrogenase 1 (ADH1) derivado de levedura (sequência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 13; sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 14).

[00129] Este plasmídeo foi construído para compreender: o gene de ADH1 derivado da cepa BY4742 de Saccharomyces cerevisiae, no qual é adicionado um promotor de TDH3 no lado 5'; o gene de eutE no qual o promotor de HOR7 e o terminador de DIT1 são adicionados (N° de Acesso NCBI: 946943, preparados através da síntese total com base em uma sequência concebida pela alteração de códons em toda a região de acordo com a frequência de uso de códons da levedura); uma sequência gênica (5U_ADH2) que compreende uma região a montante de aproximadamente 700 pb a partir da extremidade 5' do gene de ADH2 e uma sequência de DNA (3U_ADH2) que compreende uma região a jusante de aproximadamente 800 pb a partir a extremidade 3' do gene de ADH2, as quais são regiões a serem integradas no genoma da levedura via recombinação homóloga; e uma sequência gênica (marcador URA3) que compreende o gene de URA3, o qual é um marcador.

[00130] Cada sequência de DNA pode ser amplificada via PCR com o uso dos iniciadores mostrados na Tabela 1. De modo a permitir que os fragmentos de DNA se liguem uns ao outros, uma sequência de DNA foi adicionada a um iniciador de modo a se sobrepor a uma sequência de DNA adjacente de 15 pb, um fragmento de DNA alvo da mesma foi amplificado com o uso do plasmídeo pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1- T_ADH1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2 ou DNA do gene sintético eutE como modelo, os fragmentos de DNA foram sucessivamente ligados uns aos outros com o uso do kit In-Fusion (marca registrada) HD Cloning, e o resultante foi, então, clonado no plasmídeo pUC19. Assim, o plasmídeo que atende ao objetivo final foi preparado.

(5)Plasmídeo para inativação do gene de NTH1

[00131] Foi preparado um plasmídeo, pCR-5U_NTH1U- LoxP-G418- LoxP -3U_NTH1, o qual compreende uma sequência necessária para inativação do gene de NTH1.

[00132] Este plasmídeo foi construído para compreender: uma sequência de DNA (5U_NTH1) que compreende uma região a montante de aproximadamente 1050 pb do gene de NTH1 e uma sequência de DNA (3U_NTH1) que compreende uma região a jusante de aproximadamente 1050 pb do gene de NTH1, as quais são regiões a serem integradas no genoma da levedura através de recombinação homóloga e inativar o gene de trealase neutra (NTH1); e uma sequência gênica (marcador G418) que compreende o gene de G418, o qual é um marcador.

[00133] Cada sequência de DNA pode ser amplificada via PCR com o uso dos iniciadores mostrados na Tabela 1. De modo a permitir que os fragmentos de DNA se liguem uns ao outros, uma sequência de DNA foi adicionada a um iniciador de modo a se sobrepor a uma sequência de DNA adjacente de 15 pb, um fragmento de DNA alvo foi amplificado com o uso do plasmídeo (pUC-5U_GRE3-P_HOR7-TKL1-TAL1- FBA1_P-P_ADH1-RPE1-RKI1-TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C-T_DIT1- P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3) ou DNA genômico da cepa OC2 de levedura como modelo, os fragmentos de DNA foram sucessivamente ligados uns aos outros com o uso do kit InFusion (marca registrada) HD Cloning, e o resultante foi, então, clonado no plasmídeo pUC19. Assim, o plasmídeo que atende ao objetivo final foi preparado.

(6)Plasmídeo para substituição do terminador do gene de NTH1

[00134] Um plasmídeo, pUC-5U_NTH1-NTH1-T_GIC1-LoxP- P_CYC1-G418-T_URA3-LoxP-3U_NTH1, o qual compreende uma sequência necessária para a substituição do terminador do gene de NTH1 por GIC1, o qual é um terminador cujo nível de expressão é baixo (US20130244243), foi preparado.

[00135] Este plasmídeo foi construído para compreender: uma sequência de DNA (5U_NTH1) que compreende uma região a montante de aproximadamente 1050 pb do gene de NTH1, ORF de NTH1 e uma sequência de DNA (3U_NTH1) que compreende uma região a jusante de aproximadamente 1050 pb do gene de NTH1, as quais são regiões a serem integradas no genoma da levedura através de recombinação homóloga e para substituir o terminador do gene de trealase neutra (NTH1); e uma sequência gênica (marcador G418) que compreende o gene de G418, o qual é um marcador.

[00136] Cada sequência de DNA pode ser amplificada via PCR com o uso dos iniciadores mostrados na Tabela 1. De modo a permitir que os fragmentos de DNA se liguem uns ao outros, uma sequência de DNA foi adicionada a um iniciador de modo a se sobrepor a uma sequência de DNA adjacente de 15 pb, um fragmento de DNA alvo da mesma foi amplificado com o uso do plasmídeo (pUC-5U_GRE3-P_HOR7-TKL1- TAL1-FBA1_P-P_ADH1-RPE1-RKI1-TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C- T_DIT1-P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3) ou DNA genômico da cepa OC2 de levedura como modelo, os fragmentos de DNA foram sucessivamente ligados uns aos outros com o uso do kit InFusion (marca registrada) HD Cloning, e o resultante foi, então, clonado em o plasmídeo pUC19. Assim, o plasmídeo que atende ao objetivo final foi preparado.

(7)Fragmento para Introdução do Gene de URA3

[00137] Um fragmento do gene de URA3 de tipo selvagem usado para transformar o gene de URA3 não funcional no locus do gene de URA3 em um gene de tipo selvagem através de recombinação homóloga foi amplificado a partir da cepa OC2. Este fragmento de DNA pode ser amplificado via PCR usando os iniciadores mostrados naTabela 1.

(8)Plasmídeo para expressão do gene de Cre

[00138] Foi preparado um plasmídeo, pYES-Cre, usado para expressar múltiplas cópias dos genes Cre.

[00139] Este plasmídeo foi construído ao introduzir o gene de Cre (N° de Acesso NCBI: NP_415757.1, preparado através da síntese total com base em uma sequência concebida através de alteração de códons em toda a região de acordo com a frequência de uso de códons da levedura) fundida ao promotor de GAL1, o qual é induzido com galactose, em pYES6/CT (Life Technologies Corporation).

[00140] Cada sequência de DNA necessária para a construção pode ser amplificada com o uso dos iniciadores mostrados na Tabela 1. De forma a permitir que os fragmentos de DNA se liguem uns ao outros, uma sequência de DNA foi adicionada ao iniciador mostrado na Tabela 1 de modo a se sobrepor a uma sequência de DNA adjacente em cerca de 15 pb, um fragmento de DNA alvo foi amplificado com o uso do plasmídeo (YES6/CT) ou DNA do gene de síntese Cre como modelo, os fragmentos de DNA foram ligados uns aos outros com o uso do kit InFusion (marca registrada) HD Cloning. Assim, o plasmídeo que atende ao objetivo final foi preparado. Tabela 1 Iniciadores usados para cada fragmento amplificado

Produção de Cepas de Levedura que Compreendem VetoresIntroduzidos nas Mesmas

[00141] A levedura diploide, a qual é a cepa OC2 de Saccharomyces cerevisiae (NBRC2260), foi selecionada em um meio suplementado com ácido 5-fluoro-orótico (Boeke, J.D., et al., 1987, Methods Enzymol., 154: 164-75) e uma cepa auxotrófica para uracila (OC2U) foi designada como uma cepa hospedeira.

[00142] A levedura foi transformada usando Frozen-EZ Yeast Transformation II (ZYMO RESEARCH) de acordo com os protocolos incluídos no mesmo.

[00143] As regiões entre sítios de recombinação homóloga de pUC- 5U_GRE3-P_HOR7-TKL1-TAL1-FBA1_P-P_ADH1-RPE1-RKI1- TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C-T_DIT1-P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP- G418-LoxP-3U_GRE3 foram amplificadas por PCR, os fragmentos amplificados resultantes foram usados para transformar a cepa OC2U, os transformantes resultantes foram aplicados a um meio de agar YPD que contém G418 e as colônias cultivadas foram, então, submetidas à aclimatação. A cepa de elite aclimatada foi designada como a cepa Uz1252. Esta cepa foi aplicada a um meio de esporulação (fosfato de potássio a 1 %, extrato de levedura a 0,1 %, glicose a 0,05 % e agar a 2 %) para esporulação e um diploide da cepa foi formado usando homotalalismo. A cepa na qual os genes mutantes de XI, TKL1, TAL1, RPE1, RKI1 e XKS1 foram incorporados na região do locus do gene de GRE3 de um cromossomo diploide e, assim, resultando em inativação do gene de GRE3, foi obtida. A cepa resultante foi designada como a cepa Uz1252.

[00144] O plasmídeo para a expressão do gene de Cre foi introduzido na cepa Uz1252, o gene marcador G418 flanqueado pelas sequências LoxP foi removido via recombinação sítio dirigida por Cre/LoxP e a cepa da qual o plasmídeo Cre tinha sido removido no final foi selecionada e designada como a cepa Uz1252m.

[00145] As regiões entre os sítios de recombinação homóloga dos plasmídeos: pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-mhpF- HOR7_P-URA3-3U_ADH2; pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1- DIT1_T-adhE-HOR7_P-URA3-3U_ ADH2; pUC-5U_ADH2-P_TDH3- ADH1-T_ADH1-DIT1_T-eutE-HOR7_P- URA3-3U_ADH2 e pUC- 5U_NTH1-NTH1-T_GIC1-LoxP-P_CYC1-G418-T_URA3-LoxP- 3U_NTH1, foram amplificadas por PCR, os fragmentos amplificados resultantes e um fragmento para introdução do gene de URA3 diretamente amplificado a partir do genoma da cepa OC2 foram usados para transformar a cepa Uz1252m, os transformantes resultantes foram aplicados a um meio de ágar SD sem uracila ou um meio de ágar YPD que contém G418, e as colônias cultivadas foram, então, submetidas à aclimatação. As cepas de elite aclimatadas foram designadas como cepa Uz1317, cepa Uz1298, cepa Uz1761, cepa Uz1302 e cepa Uz1313.

[00146] Recombinação heterozigótica (1 cópia) foi observada em todas as cepas acima.

[00147] A esporulação foi induzida em meio de esporulação para a linhagem Uz1317, a linhagem Uz1298, a linhagem Uz1302 e a linhagem Uz1313 obtidas. Os diploides das cepas formados usando homotalalismo foram designados como cepa Uz1319, cepa Uz1318, cepa Uz1346 e cepa Uz1323.

[00148] As regiões entre os sítios de recombinação homóloga do plasmídeo pCR-5U_NTH1U-LoxP-G418-LoxP-3U_NTH1 foram amplificadas por PCR, os fragmentos resultantes foram usados para transformar a cepa Uz1318, os transformantes resultantes foram aplicados a um meio de agar YPD que contém G418 e as colônias crescidas foram, então, submetidas à aclimatização. A cepa de elite aclimatada foi designada como cepa Uz1811. A cepa Uz1811 foi aplicada a um meio de esporulação para esporulação e um diploide da cepa foi formado usando homotalalismo. A cepa resultante foi designada como cepa Uz1811dS.

[00149] As regiões entre os sítios de recombinação homóloga do plasmídeo pCR-5U_NTH1U- LoxP-G418-LoxP -3U_NTH1 foram amplificadas por PCR, os fragmentos amplificados resultantes foram usados para transformar a cepa Uz1317, os transformantes resultantes foram aplicados a um meio de ágar YPD que contém G418 e as colônias crescidas foram, então, submetidas à aclimatação. A cepa de elite aclimatada foi designada como cepa Uz1607. A cepa Uz1607 foi aplicada a um meio de esporulação para esporulação e um diploide da cepa foi formado usando homotalalismo. Assim, a cepa que compreende diploides de 5U_ADH2-P_TDH3- ADH1-T_ADH1- DIT1_T- mhpF- HOR7_P- URA3-3U_ADH2 e 5U_NTH1U- LoxP-G418-LoxP - 3U_NTH1 introduzidos nos loci dos genes de ADH2 e NTH1 foi obtida e designada como cepa Uz1607dS.

[00150] As regiões entre os sítios de recombinação homóloga do plasmídeo pCR-5U_NTH1U- LoxP-G418-LoxP -3U_NTH1 foram amplificadas por PCR, os fragmentos resultantes foram usados para transformar a cepa Uz1761, os transformantes resultantes foram aplicados a um meio de ágar YPD que contém G418 e as colônias crescidas foram, então, submetidas à aclimatização. A cepa de elite aclimatada foi designada como cepa Uz1822. A cepa Uz1822 foi aplicada a um meio de esporulação para esporulação e um diploide da cepa foi formado usando homotalalismo. Como um resultado, uma cepa que compreende diploides de 5U_ADH2-P_TDH3- ADH1-T_ADH1- DIT1_T-eutE- HOR7_P- URA3-3U_ADH2 e 5U_NTH1U- LoxP-G418- LoxP -3U_NTH1 foram introduzidos nos loci dos genes de ADH2 e NTH1 e uma cepa que compreende um diploide de 5U_ADH2-P_TDH3- ADH1-T_ADH1- DIT1_T-eutE- HOR7_P- URA3-3U_ADH2 e os loci do gene de NTH1 transformados em seu tipo selvagem foram obtidas e designadas como cepa Uz1822dS e cepa Uz1761dS.

[00151] As regiões entre os sítios de recombinação homóloga do plasmídeo 5U_ADH2-P_TDH3- ADH1-T_ADH1- DIT1_T-eutE- HOR7_P- URA3-3U_ADH2 foram amplificadas por PCR, os fragmentos resultantes foram usados para transformar a cepa Uz1323, os transformantes resultantes foram aplicados a um meio de agar YPD que contém G418 e as colônias cultivadas foram, então, submetidas à aclimatação. As cepas de elite aclimatadas foram designadas como cepa Uz1662 e cepa Uz1661. A cepa Uz1662 e a cepa Uz1661 foram aplicadas a um meio de esporulação para esporulação e seus diploides foram formados usando homotalalismo. As cepas resultantes foram designadas como cepa Uz1662dS e cepa Uz1661dS.

[00152] As regiões entre os sítios de recombinação homóloga do plasmídeo pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-mhpF- HOR7_P-URA3-3U_ADH2 foram amplificadas por PCR, os fragmentos amplificados resultantes foram usados para transformar a cepa Uz1346, os transformantes resultantes foram aplicados. a um meio de agar YPD que contém G418 e as colônias cultivadas foram, então, submetidas à aclimatação. A cepa de elite aclimatada foi designada como cepa Uz1382. A cepa Uz1382 foi aplicada a um meio de esporulação para esporulação, um diploide da cepa foi formado usando homotalalismo e a cepa resultante foi designada como cepa Uz1382dS. Os genótipos das cepas produzidas como produtos finais estão resumidos na Tabela 2.Tabela 2

Ensaio de Fermentação

[00153] Dentre as cepas obtidas da maneira descrita acima, duas cepas que exibem elevada capacidade de fermentação foram selecionadas e submetidas a um ensaio de fermentação em frascos da maneira descrita abaixo.

[00154] Inicialmente, as cepas de teste foram introduzidas em frascos de 100 ml, cada um contendo 20 ml de meio líquido YPD que contém glicose a 20 g/l (10 g/l de extrato de levedura, 20 g/l de peptona e 20 g/l de glicose) e a cultura foi realizada a 30 e 120 rpm durante 24 horas. As cepas foram coletadas e introduzidas em frascos de 10 ml, cada um contendo 8 ml de meio para produção de etanol (cada meio possui composição diferente) (densidade celular: 0,3 g de células secas/l). O ensaio de fermentação foi realizado através de cultura sob agitação (80 rpm; largura de agitação: 35 mm; 30 graus C) ou na temperatura de 31 graus C ou 34 graus C. Cada frasco foi fechado com uma tampa de borracha que compreende uma agulha (diâmetro interno: 1,5 mm) e as condições anaeróbicas dentro do frasco foram mantidas pela montagem de uma válvula de retenção na ponta da agulha.

[00155] Glicose, xilose e etanol no licor de fermentação foram ensaiados via HPLC (LC-10A; Shimadzu Corporation) sob as condições descritas abaixo. Coluna: Aminex HPX- 87H Fase móvel: H2SO4 a 0,01 N Taxa de fluxo: 0,6 ml/min Temperatura: 30 graus C Dispositivo de detecção: Refratômetro diferencial (RID-10A)

Resultados do Ensaio de Fermentação

[00156] Conforme mostrado nas Tabelas 3 e 4, a linhagem de controle e as linhagens com inativação de NTH1 não assimilaram o ácido acético. Em contraste, as cepas nas quais o ADH2 foi inativado e o ADH1 e acetaldeído desidrogenase foram superexpressos e as cepas que envolvem inativação de NTH1, além de inativação de ADH2 e superexpressão de ADH1 e acetaldeído desidrogenase (isto é, cepas Uz1607dS, Uz1811dS e Uz1822dS), têm uma assimilação aprimorada de ácido acético.Tabela 3

Meio: glicose a 50 g/l, xilose a 100 g/l, extrato de levedura a 10 g/l, peptona a 20 g/l, ácido acético a 2,7 g/l e furfural a 0,3 g/l Duração de fermentação: 46 horas Temperatura de fermentação: 31 °C Concentração de etanol, concentração de ácido acético e taxa de assimilação de ácido acético: valores médios para 2 a 5 cepas recombinantes independentemente obtidasTabela 4

Duração de fermentação: 46 horas Temperatura de fermentação: 34 °C Concentração de etanol, concentração de ácido acético e taxa de assimilação de ácido acético: valores médios para 5 cepas recombinantes

[00157] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados são aqui incorporados por referência na íntegra.

Claims (6)

1.Levedura recombinante, caracterizada pelo fato de que apresenta uma capacidade de assimilação de ácido acético aumentada resultante da introdução do gene de acetaldeído desidrogenase (EC 1.2.1.10) consistindo na sequência de nucleotídeo com mostrada em SEQ ID NO: 1, 3 ou 5; apresentando ruptura de um gene NTH1 para diminuir um nível de expressão do dito gene NTH1; apresentando introdução de um gene de álcool desidrogenase consistindo na sequência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 13 e apresentando atividade de conversão de acetaldeído em etanol e um nível de expressão alto do dito gene de álcool desidrogenase apresentando atividade de conversão de acetaldeído em etanol; e apresentando ruptura de um gene de álcool desidrogenase consistindo na sequência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO:15 e apresentando atividade de conversão de etanol em acetaldeído pra diminuir um nível de expressão do dito gene de álcool desidrogenase apresentando atividade de conversão de etanol em acetaldeído.

2.Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda o gene de xilose isomerase consistindo na sequência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 11 introduzido na mesma.

3.Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda o gene de xiluloquinase consistindo na sequência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 17 introduzido na mesma.

4.Levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um gene selecionado do grupo consistindo no gene da ribose fosfato cetoisomerase consistindo na sequência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 25, o gene da ribulose fosfato epimerase consistindo na sequência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 23, o gene da transcetolase consistindo na sequência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 19 e o gene da transaldolase consistindo na sequência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 21 introduzida na mesma.

5.Método para a produção de etanol, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de fermentação de etanol via cultura da levedura recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em um meio que contém glicose e xilose.

6.Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o meio contém celulose e a fermentação de etanol prossegue simultaneamente com a sacarificação de pelo menos a celulose.