KR102287810B1 - Msn2의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된, 스트레스 내성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법 - Google Patents

Msn2의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된, 스트레스 내성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

모세포에 비하여 MSN2의 활성이 증가된, 스트레스-내성(stress tolerance)을 갖는 효모 세포, 상기 효모 세포를 제조하는 방법, 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

MSN2의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된, 스트레스 내성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법{Genetically engineered and stress resistant yeast cell with enhanced activity of MSN2 and method for producing lactate using the same}
MSN2의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된, 스트레스-내성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.
유기산은 산업적으로 널리 이용된다. 예를 들면, 락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.
유기산은 그의 pKa 값보다 높은 산도, 예를 들면, 중성 조건에서 수소 이온과 유기산의 음이온으로 분리된다. 그러나, 유기산, 예를 들면, 젖산은 pKa 값보다 낮은 산성 조건에서는 전자기력을 가지지 않는 유리산 (free acid) 형태로 존재한다. 음이온 형태는 세포막을 투과하지 못하나, 유리산 형태는 세포막을 투과할 수 있으므로, 유기산의 농도가 높은 환경에서 세포막 외부의 유기산이 세포 내부로 유입되어 세포 내 pH가 떨어지는 현상이 일어날 수 있다. 또한, 유기산의 pKa보다 높은 산도 조건에 존재하는 음이온 형태의 유기산은 세포의 배양 또는 발효시에 중화제와 같은 염을 첨가하여 염의 형태로 존재하고, 그 후 생성된 염의 형태로부터 유기산을 분리하여야 하는 단점이 있다. 그 결과, 내산성 (acid resistance)이 결여된 세포는 젖산이 포함된 산성 조건에서 세포의 활성을 잃고 사멸할 수 있다.
따라서, 이러한 산성에 대하여 내성을 갖는 미생물뿐만 아니라 삼투압과 같은 스트레스에 대한 내성을 갖는 미생물에 대하여 요구되고 있다.
일 양상은 MSN2의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된, 스트레스-내성을 갖는 효모 세포를 제공하는 것이다.
다른 양상은 MSN2를 과발현시키는 단계를 포함하는, 스트레스-내성이 증가된 효모 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 효모 세포를 이용하여 락테이트를 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 효소 또는 폴리펩티드 또는 단백질의 "활성 증가" 또는 "증가된 활성"은 효소 또는 폴리펩티드 또는 단백질이 활성을 나타낼 수 있도록 충분한 정도로 증가된 것일 수 있으며, 세포 또는 단리된 폴리펩티드가 비교 가능한 동일 종의 세포, 모세포, 또는 그의 본래 폴리펩티드에서 측정된 활성 수준과 비교하여 높은 활성 수준을 나타냄을 의미한다. 즉 해당 폴리펩티드의 활성이 본래 조작되지 않은 세포의 폴리펩티드, 모세포의 폴리펩티드, 또는 야생형 폴리펩티드에 의한 동일한 생화학적 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 증가된 활성을 갖는 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
폴리펩티드의 활성 증가는 폴리펩티드의 발현 증가 또는 비활성 (specific activity)의 증가에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 발현 증가는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되거나 세포 내 카피 수가 증가되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이는 유전자의 발현 조절 서열의 변형을 갖는 것일 수 있다. 상기 조절 서열은 상기 유전자 발현을 위한 프로모터 서열 또는 전사 종결자 서열일 수 있다. 또한, 상기 조절 서열은 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 모티프를 코딩하는 서열일 수 있다. 상기 모티프는 예를 들면, 이차 구조-안정화 모티프, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프, 폴리아데닐화 모티프, 아데닌-풍부 서열 (adenine-rich sequence), 또는 엔도뉴클레아제 인식 부위일 수 있다.
외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 숙주 세포 게놈으로 도입 (integration)되는 등의 숙주 세포 내로 유전자가 도입되는 것을 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다.
용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포 또는 모세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.
용어 "유전자 (gene)"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 코딩영역 또는 코딩영역 외 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence)과 3'-비코딩 서열 (3'-non coding sequence) 등의 조절 서열 (regulatory sequence)을 포함할 수 있다. 상기 조절 영역은 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터, 리보좀 결합 부위, polyA 결합 서열, 또는 터미네이터 영역 등을 포함할 수 있다.
"이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미한다.
"분비 (secretion)"는 물질이 세포 내부에서 주변세포질공간 (periplasmic space)이나 세포 외 환경으로 이동되는 것을 의미한다.
본 명세서에 언급된 "유기산 (organic acid)"은, 중성 형태의 유기산뿐만 아니라, 음전하 형태의 유기산, 및 그 염을 포함하며 이들 서로 교환가능하게 사용될 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 피루브산, TCA 회로의 중간 산물, 예를 들면, 시트르산, 이탄콘산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 알파-케토글루타르산, 숙신산, 숙신일-CoA, 푸마르산, 말레산, 또는 옥살로아세트산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 젖산은 락테이트 또는 그의 염과 교환가능하게 사용된다.
효소 또는 폴리펩티드의 "활성의 감소" 또는 "감소된 활성"은 세포 또는 단리된 효소 또는 폴리펩티드가 비교 가능한 동일 종의 세포, 모세포, 또는 그의 본래 폴리펩티드에서 측정된 활성 수준과 비교하여 낮은 활성 수준을 나타내거나 활성을 나타내지 않는 것을 의미한다. 즉 해당 폴리펩티드의 활성이 본래 조작되지 않은 폴리펩티드, 본래 조작되지 않은 세포의 폴리펩티드, 또는 모세포의 폴리펩티드 또는 야생형(wild-type) 폴리펩티드에 의한 동일한 생화학적 활성보다 약 10%이상, 약 20%이상, 약 30%이상, 약 40%이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 감소된 효소 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 활성의 감소는 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우 또는 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 조작이 되지 않은 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 아생형 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다.
상기 효소의 활성이 감소되는 것은 상기 효소를 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴에 의한 것일 수 있다. 유전자의 "제거 (deletion)" 또는 "파괴 (disruption)"는 유전자가 발현되지 않거나 발현량이 감소되거나 발현되어도 효소 활성을 나타내지 않거나 활성이 감소되도록, 유전자의 일부 또는 전부가, 또는 그 프로모터, 그 터미네이터 영역 등의 조절 인자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입되는 것을 말한다. 상기 유전자의 제거 또는 파괴는 상동 재조합과 같은 유전자 조작, 돌연변이 유발, 분자 진화를 통해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 같은 유전자를 포함하거나 2개 이상의 다른 폴리펩티드 동종상동유전자 (paralog)를 포함하는 경우, 하나 또는 그 이상의 유전자가 제거 또는 파괴될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 아미노산 잔기 또는 염기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
용어 “모세포(parent cell)”는 유전적으로 조작된 세포를 수득할 수 있게 하는 특정 유전적 변형을 갖지 않는 세포를 지칭할 수 있다. 용어 “야생형(wild-type)” 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있게 하는 특정 유전적 변형을 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 모세포는 MSN2의 활성이 증가되도록, 유전적으로 조작되지 않은 것일 수 있다. 상기 모세포는 MSN2의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작하는데 사용된 모균주 (parent strain)일 수 있다. 상기 모세포는 MSN2의 활성이 증가되도록 하는 유전적 변형을 갖지 않는 세포일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 락테이트(lactate)는 젖산(lactic acid) 자체뿐만 아니라, 음이온 형태, 그의 염, 용매화물, 다형체 또는 그 조합을 포함하는 것으로 해석된다. 상기 염은 예를 들면 무기산염, 유기산염 또는 금속염일 수 있다. 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염 또는 이황산염일 수 있다. 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염 또는 아스파르트산염일 수 있다. 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염 또는 칼륨염일 수 있다.
일 양상은 유전적으로 조작되지 않은 세포에 비하여 MSN2의 활성이 증가된, 스트레스-내성(stress tolerance)을 갖는 효모 세포를 제공한다.
MSN2는 서열번호 1과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성 (identity)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 MSN2 유전자는 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 일례로 MSN2 유전자는 각각 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포에 있어서, 스트레스는 삼투압일 수 있다. 상기 효모 세포는 삼투압에 대한 내성을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 모세포에 비하여 증가된 글리세롤 함량을 갖는 것일 수 있다. 또한 상기 효모 세포는 모세포에 비하여 증가된 트레할로스 함량을 갖는 것일 수 있다. 또한 상기 효모 세포는 모세포에 비하여 증가된 트레할로스 발현을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 변형된 특정 지방산 함량을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 모세포에 비하여 감소된 특정 지방산 함량을 갖는 것일 수 있다. 상기 특정 지방산은 세포막을 이루는 것일 수 있다. 상기 특정 지방산은 불포화 지방산일 수 있다. 상기 특정 지방산은 헥사데카노익산일 수 있다. 상기 효모 세포는 모세포에 비하여 모세포에 비하여 저농도의 특정 지방산을 갖고, 세포막의 유동성을 낮추어 세포막 강성을 증가시킬 수 있다. 모세포에 비하여 감소된 특정 지방산 함량을 갖는 효모 세포는 산, 또는 삼투압과 같은 스트레스에 대한 내성을 갖게 할 수 있다.
상기 효모 세포에 있어서, 스트레스는 산일 수 있다. 상기 효모 세포는 내산성을 갖는 것일 수 있다. 내산성 (acid resistance)은 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 좋은 성장을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 MSN2의 활성이 증가되지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.5, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, 또는 pH 3.3 내지 3.8의 범위에서 더 잘 생장할 수 있는 것일 수 있다.
또는 내산성은 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 높은 생존을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 MSN2의 활성이 증가되지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.5, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, 또는 pH 3.3 내지 3.8의 범위에서 더 잘 생존할 수 있는 것일 수 있다.
또는 내산성은 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 좋은 대사 과정을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 MSN2의 활성이 증가되지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.5, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, 또는 pH 3.3 내지 3.8의 범위에서 더 잘 대사할 수 있는 것일 수 있다. 이 때 "대사할 수 있는 (metabolizable)"의 정도는 세포당 영양분 흡수율, 예를 들면, 세포당 포도당 흡수율을 통해 측정될 수 있다. 또는 "대사할 수 있는 (metabolizable)"의 정도는 세포당 산물 배출율, 예를 들면 세포당 이산화탄소 배출율을 통해 측정될 수 있다.
상기 효모 세포는 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 쉬조사카로마이스세 (Shizosaccharomyces) 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속에 속하는 것일 수 있다. 사카로마이세스 속은 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다.
상기 MSN2의 활성이 증가되는 것은, 상기 MSN2를 코딩하는 유전자의 카피 수 증가 또는 상기 유전자의 발현 조절 서열의 변형에 의한 것일 수 있다. 상기 카피 수 증가는 상기 유전자의 세포 외부로부터 내부로의 도입 또는 내재적 유전자의 증폭에 의한 것일 수 있다. 상기 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입 또는 게놈에 삽입된 도입일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 상기 유전자가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 유전자가 게놈 내로 통합됨으로써 이루어질 수 있다. 상기 유전자는 그의 발현을 조절에 관련된 조절 서열과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 조절 서열은 프로모터, 5'-비코딩 서열, 3'-비코딩 서열, 전자 종결자 서열, 인핸서, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 유전자는 내재적 유전자 또는 외인성 유전자일 수 있다. 또한, 상기 조절 서열은 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 모티프를 코딩하는 서열일 수 있다. 상기 모티프는 예를 들면, 이차 구조-안정화 모티프, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프, 폴리아데닐화 모티프, 아데닌-풍부 서열(adenine-rich sequence), 또는 엔도뉴클레아제 인식 부위일 수 있다. 상기 MSN2의 활성이 증가되는 것은, 상기 MSN2를 코딩하는 유전자의 돌연변이에 의한 것일 수 있다. 돌연변이는 하나 이상의 염기의 치환, 삽입, 부가, 또는 전환을 야기하는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 데히드로게나제 (LDH)일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있다. 또한 상기 락테이트 데히드로게나제는 스테레오-특이적 (specific)일 수 있으며, L-락테이트만 또는 D-락테이트만, 또는 L-락테이트와 D-락테이트 모두를 생산할 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.27, 또는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.28로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 락테이트 생산능을 갖는 효모 세포는 락테이트 데히드로게나제의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 적어도 하나의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 유전자는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 락토바실루스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), L. 불가리쿠스 (L. bulgaricus), L. 존소니 (L. johnsonii), L. 플란타룸(L. plantarum), 일본자라 (Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리 (Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래 (Tursiops truncatus), 노르웨이산집쥐 (Rattus norvegicus), 및 개구리 (Xenopus laevis)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일본자라로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 오리너구리로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 병코돌고래로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 및 노르웨이산집쥐로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제는 각각 서열번호 3, 4, 5, 및 6의 아미노산 서열과 60%이상, 또는 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 또는 99%이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3, 4, 5, 및 6의 아미노산 서열과 95%이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또는 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3, 4, 5, 6의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터 내 포함될 수 있다. 상기 벡터는 복제개시점, 프로모터, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 CYC (cytochrome c), TEF (transcription elongation factor), GPD, ADH 유전자, 및 CCW12의 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 있다. 상기 CYC (cytochrome c), TEF (transcription elongation factor), GPD, ADH 유전자, 및 CCW12의 프로모터는 각각 서열번호 27, 28, 29, 30, 및 31의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c 1), 및 GAL1 (galactokinase 1) 유전자의 터미네이터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효모 세포의 특정 위치에 게놈에 포함될 수 있다. 상기 특정 위치는 PDC, CYB2와 같이 제거 또는 파괴하고자 하는 유전자의 유전자좌 (locus)를 포함할 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 단백질을 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다.
상기 효모 세포는 단일의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 2 내지 10 카피수의 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는 예를 들면 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3 카피의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 각각의 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 둘 이상의 상이한 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조합일 수 있다. 외인성 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌 (locus) 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있고, 각 카피의 프로모터나 터미네이터가 동일하거나 상이할 수 있다.
또한, 상기 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 방해하는 경로의 활성이 불활성화 또는 감소된 것일 수 있다. 또한 상기 효모 세포는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 촉진하거나 도와주는 경로의 활성이 증가된 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, 알데히드 데히드로게나제, 또는 그의 조합의 활성이 감소된 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 예를 들면, 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase)일 수 있으며, PDC1일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 8의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 pdc1일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제일 수 있고, CYB2 (CAA86721.1), CYB2A, CYB2B, 또는 DLD1 등일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 10의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제일 수 있으며, NADH 또는 NADP의 NAD+ 또는 NADP+로의 산화를 이용하여 디히록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC 1.1.1.8에 속하는 것일 수 있다. 상기 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제는 GPD1일 수 있다. 상기 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제는 서열번호 12의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 아세트알데히드에서 에탄올로 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC. 1.1.1.1에 속하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 NADH로부터 NAD+로의 전환을 이용하여, 아세트알데히드에서 에탄올로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 알코올 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase; Adh)일 수 있으며, Adh1일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 14의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 14의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 일례로 adh1일 수 있다.
상기 효모 세포는 알데히드 데히드로게나제(aldehyde dehydrogenase: ALD)를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 알데히드 데히드로게나제는 EC.1.2.1.4에 속하는 효소일 수 있다. 알테히드 데히드로게나제는 ALD6일 수 있으며, ALD6는 알데히드 데히드로게나제의 구성적 세포질 형태 (constitutive cytosolic form)를 코딩하는 것일 수 있다. ALD6는 Mg2 +에 의하여 활성화되고, NADP에 특이적인 것일 수 있다. 이 효소는 아세테이트의 생성에 관여하는 것일 수 있다. 생성된 아세테이트로부터 세포질 아세틸-CoA가 합성될 수 있다. 상기 알데히드 데히드로게나제는 서열번호 16의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 16의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 일례로 ald6일 수 있다.
상기 효모 세포는 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 활성을 갖거나, 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 활성이 증가된 것일 수 있다. 상기 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드는 "acetaldehyde dehydrogenase (acetylating)" 또는 "acetaldehyde:NAD+ oxidoreductase (CoA-acetylating)"일 수 있다. 또한, 상기 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드는 EC 1.2.1.10로 분류되는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 아세트알데히드 + coenzyme A + NAD+로부터 아세틸-CoA + NADH로의 가역적 반응을 촉매할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 예를 들면 MhpF일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)에서 유래한 것일 수 있다. 아세트알데히드 데히드로게나제 유전자(mhpF)는 mhpA, mhpB, mhpC, mhpD, mhpE 및 mhpF의 전사체 단위(transcription unit)로 구성된 유닛 중의 하나일 수 있다. 다른 미생물에서는 MhpE와 MhpF는 하나의 복합체로 구성되어 존재하나, 에스케리키아 콜라이에서는 MhpF가 단독으로 존재가 가능하며, 활성을 나타낸다. 상기 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 아미노산 서열 동일성 (identity)을 가진 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 MhpF는 예를 들면 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 18의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일례로 상기 유전자는 에스케리키아 콜라이에서 유래한 상기 폴리펩티드가 효모 세포에 적합하도록 코돈이 치환될 수 있다. 이때의 상기 유전자의 변형은 폴리펩티드의 서열이 바뀌지 않는 범위 내에서 치환될 수 있다. 일례로, 상기 효모에 적합하도록 변형된 유전자는 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가된 것일 수 있다. 또한 상기 효모 세포는 방사선 감수성 보완 키나아제의 발현 증가 또는 비활성의 증가에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 발현 증가는 방사선 감수성 보완 키나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되거나 세포 내 카피 수가 증가되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 방사선 감수성 보완 키나아제는 세린/트레오닌-프로테인 키나아제 (Serine/threonine-protein kinase)일 수 있다. 상기 키나아제는 EC 2.7.11.1에 속하는 효소일 수 있다. 방사선 감수성 보완 키나아제는 RCK1 또는 RCK2일 수 있다. 방사선 감수성 보완 키나아제는 서열번호 22 또는 23과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 아미노산 서열 동일성 (identity)을 가진 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 일례로, RCK1 및 RCK2는 각각 서열번호 22 및 23의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 방사선 감수성 보완 키나아제는 서열번호 1 또는 2와 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3 및 서열 번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 일례로 rck1 및 rck2 유전자는 각각 서열번호 24 및 25의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한 일례로 효모 세포는 모세포에 비하여 MSN2의 활성이 증가되어 있고; 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 제거 또는 파괴되어 있고; 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 포함 또는 추가 도입되어 있는 효모 세포일 수 있다. 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다. 상기 효모 세포는 KCTC 12415 BP의 수탁번호일 수 있다.
다른 양상은 상기한 효모 세포를 포함하는, 락테이트를 생산하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 MSN2를 과발현시키는 단계를 포함하는, 스트레스-내성이 증가된 효모 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 효모 세포 및 스트레스에 대하여는 상기한 바와 같다. 과발현은 모세포의 특정 유전자의 발현 수준 보다 증가된 특정 유전자의 발현 수준을 의미한다. 상기 모세포에 대하여는 상기한 바와 같다.
다른 양상은 상기한 효모 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 효모 세포에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식, 연속식 및 유가식 배양을 포함할 수 있다. 상기 박테리아 세포는 상기한 바와 같다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.
상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유과 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 예를 들면, 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 (CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
상기 세포는 호기, 미호기, 또는 혐기 조건에서 배양될 수 있다. 상기 미호기 조건은 대기 중 산소의 수준보다 낮은 수준의 산소가 배지 중으로 용해되는 배양 조건을 의미한다. 상기 낮은 수준의 산소는 예를 들면, 대기에 대한 포화 용존 산소 농도의 0.1% 내지 10%, 1% 내지 9%, 2% 내지 8%, 3% 내지 7%, 또는 4 내지 6%일 수 있다. 또한, 미호기 조건은 예를 들면, 배지 중의 용존 산소 농도가 0.9 ppm에서 3.6 ppm인 것일 수 있다. 배양 온도는 예를 들면, 20℃ 내지 45℃ 또는 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양 기간은 원하는 목적 락테이트가 원하는 만큼 얻어질 때까지 지속될 수 있다. 상기 락테이트를 생산하는 방법은 배양물로부터 락테이트를 회수 또는 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
배양물로부터의 락테이트의 회수는, 통상적으로 알려진 분리 및 정제방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 회수는 원심분리, 이온교환 크로마토그래피, 여과, 침전, 추출, 증류, 또 조합에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면 배양물을 원심분리하여 바이오매스를 제거하고, 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
일 양상에 따른 효모 세포에 의하면, 스트레스-내성을 갖는 효모 세포를 생산할 수 있다.
일 양상에 따른 스트레스-내성이 증가된 효모 세포를 제조하는 방법에 의하면, 스트레스-내성을 갖는 효모 세포를 생산할 수 있다.
일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 고농도 및 높은 수율로 생산할 수 있다.
도 1은 모균주 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 에서 RCK1 프로모터가 치환된 벡터가 삽입된 균주를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 P57 벡터를 나타내는 도면이다.
도 3은 p57-PTPI1 벡터를 나타내는 도면이다.
도 4는 pUC57-URA3-GPDp-MSN2 벡터를 나타내는 모식도로, 영양요구성 마커인 우라실3 유전자가 삽입되어 있고, 후술하는 MSN2를 유전체에 삽입시키기 위한 카세트 제작하기 위한 모벡터이다.
도 5는 MSN2 강화 균주의 MSN2 유전자 발현량을 나타낸 도면이다. 또한 MSN2 강화 균주의 TPS1 및 TSL1 유전자의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 6은 MSN2 강화 균주의 spotting 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 MSN2 강화 균주의 발효 중 글리세롤의 농도를 나타낸 도면이다.
도 8은 MSN2 강화 균주의 발효 중 트레할로스의 농도를 나타낸 도면이다.
도 9는 MSN2 강화 균주의 발효 중 9-헥사데카노익산의 농도를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 락테이트 생산능이 향상된 효모 세포의 제작
1. 락테이트 생산능이 향상된 효모 세포의 제조
S. cerevisiae CEN . PK2 -1D에서 락테이트 생산능을 향상시키기 위하여, 대사 산물의 흐름을 락테이트 이외의 경로로 흐르게 하는 경로, 즉, 피루베이트로부터 에탄올로의 경로에 관여하는 효소인 피루베이트 데카르복실라제 1(pyruvate decarboxylase 1: PDC1) 및 알콜 데히드로게나제 1 (alcohol dehydrogease 1: ADH1) 유전자를 결실시켰다. PDC1은 피루베이트를 아세트알데히드와 CO2로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다. ADH1은 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다.
이때 pdc1 유전자 및 adh1 유전자의 결실과 동시에 각각 락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: ldh) 유전자를 도입하였다. LDH는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다.
또한, 락테이트로부터 피루베이트로 전환하는 반응을 촉매하는 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제 (L-lactate cytochrome-c oxidoreductase: cyb2) 유전자를 결실시켰다. 이때 cyb2 유전자의 결실과 동시에 락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: ldh) 유전자를 도입하였다.
또한, 해당과정에서 피루베이트로의 대사 흐름을 강화하기 위하여, 디히드록시아세톤 포스페이트 (dihydroxy acetone phosphate: DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트 (glycerol-3-phosphate: G3P)로 전환하는 반응을 촉매하는 활성을 갖는 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 1 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1: gpd1) 유전자를 결실시켰다. GPD1은 상기 반응과 동시에 NADH를 NAD+로 전환시킨다. 이때 gpd1 유전자의 결실과 동시에 락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: ldh) 유전자를 도입하였다.
또한, 대장균 유래의 MhpF (acetaldehyde dehydrogenase(acylating))를 코딩하는 유전자를 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D에 도입하였다. MhpF는 EC.1.2.1.10에 속하는 것일 수 있다. MhpF는 아세트알데히드를 acetyl-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 것일 수 있다. MhpF는 NAD+ 및 조효소 A를 사용하는 것일 수 있다. MhpF는 3-HPP의 분해를 위한 메타-절단 결로 (meta-cleavage pathway)의 마지막 효소일 수 있다. MhpF 유전자는 자체의 알데히드 데히드로게나제 6 (aldehyde dehydrogenase 6: ALD6)를 코딩하는 유전자인 ald6 유전자 부위에 도입되어 ald6 유전자를 결실시키는 것일 수 있다. ALD6는 알데히드 데히드로게나제의 구성적 세포질 형태 (constitutive cytosolic form)를 코딩하는 것일 수 있다. ALD6는 Mg2 +에 의하여 활성화되고, NADP에 특이적인 것일 수 있다. 이 효소는 acetate의 생성에 관여하는 것일 수 있다. 생성된 acetate로부터 세포질 acetyl-CoA가 합성될 수 있다.
또한, S. cerevisiae 유래의 RCK1를 코딩하는 유전자를 S. cerevisiae CEN.PK2-1D에 도입하였다.
(1) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh )의 제작
(1.1) pdc1 를 결실시키며 ldh 를 도입하기 위한 벡터의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D에서 피루베이트로부터 아세트알데히드를 거쳐 에탄올로 가는 경로를 차단하기 위하여 피루베이트 데카르복실라제 1 (pyruvate decarboxylase1: pdc1)을 코딩하는 유전자를 제거하였다. pdc1 유전자를 제거하는 동시에 일본 자라 유래 Ldh를 발현시키기 위하여 pdc1 유전자를 'ldh 카세트'로 치환하여 pdc1 유전자를 결손시켰다. "카세트"란 달리 언급이 없으면, 프로모터, 코딩 서열, 및 터미네이터가 작동가능하게 연결된 단백질이 발현될 수 있는 단위 서열을 나타낸다.
구체적으로, 'ldh 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 33 및 34의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 얻어진 CCW12 프로모터 서열 (서열번호 31)과 'ldh 유전자 (서열번호 8)'를 각각 SacI/XbaI과 BamHI/SalI로 소화하고, 동일 효소로 소화된 pRS416 vector (ATCC87521)에 연결하였다. pRS416 vector는 T7 프로모터, 박테리아에서 암피실린 저항성, 효모에서 URA3 카세트 (선택마커), 및 제한효소 클로닝 부위를 갖는 효모 센트로미어 셔틀 플라스미드 (yeast centromere shuttle plasmid)이다. 다음으로, 얻어진 벡터에 pCEP4 plasmid (invitrogen, Cat. no. V044-50)를 주형으로 하고 서열번호 35 및 36의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한PCR하여 얻어진 증폭 산물 즉, 'HPH 카세트' 서열 (서열번호 37)을 SacI로 소화시키고, 동일한 효소로 소화된 상기 얻어진 벡터에 연결하여 'ldh 카세트'를 포함하는 벡터 p416-ldh-HPH를 제조하였다. pCEP4 plasmid는 다중클로닝 부위 (multiple cloning site)에 삽입된 재조합 유전자의 높은 수준의 전사를 위한 cytomegalovirus (CMV) immediate early enhance/promoter를 사용하는 에피좀성 포유동물 발현 벡터 (episomal mammalian expression vector)이다. pCEP4는 트란스펙션된 세포 (transfected cell)에서 안정된 선택을 위한 히그로마이신 B 저항성 유전자 (hygromycin B resistance gene)을 갖는다. 여기서 'ldh 카세트'는 ldh 유전자 및 그 조절 영역을 포함하고 있어, ldh 유전자가 발현될 수 있도록 하는 영역을 나타낸다. 상기 ldh 유전자는 CCW12 프로모터 하에서 전사되도록 하였다. 또한, 'HPH (hygromycin B phosphotransferase) 카세트'는 히그로마이신 B 저항성 유전자 (hygromycin B resistance gene) 및 그 조절 영역을 포함하고 있어, 히그로마이신 B 저항성 유전자가 발현될 수 있도록 하는 영역을 나타낸다.
pdc1의 결실용 벡터는 p416-ldh-HPH를 주형으로 하고 서열번호 38 및 39의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR에 의하여 ldh 유전자 절편과 pUC57-Ura3HA 벡터 (DNA2.0 Inc.; 서열번호 40)를 각각 SacI로 소화시킨 후 서로 연결하여 pUC-uraHA-ldh를 제조하였다. 이 벡터로부터 pdc1의 결실용 카세트는 pdc1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 41 및 42의 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하였다. 상기 서열번호 41의 1 내지 41 및 서열번호 42의 1 내지 44는 사카로마이세스 세레비지애의 염색체의 상동 서열과 상동 재조합되어 pdc1 유전자와 치환될 부분을 의미한다.
(1.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ) 제조
(1.1)에서 제작한 pdc1 deletion용 카세트를 사카로마이세스 세레비지애 (CEN.PK2-1D, EUROSCARF accession number: 30000B)에 도입하였다. 상기 pdc1 deletion용 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 pdc1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, pdc1의 결실을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 43 및 44의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 pdc1 유전자 결실 및 ldh 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh)를 제조하였다.
(2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh )의 제작
(2.1) cyb2 를 결실시키기 위한 벡터의 제작
(1)에서 얻어진 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh)에서, 락테이트에서 피루베이트로 가는 경로를 차단하기 위하여 cyb2 유전자를 제거하였다.
구체적으로, (1.1)에서 제조된 pUC-uraHA-ldh를 주형으로 하고, 서열번호 45 및 46의 cyb2 상동 재조합 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 cyb2 결실용 카세트를 얻었다. 서열번호 45의 프라이머 중 1 내지 45 및 서열번호 46의 프라이머 중 1 내지 45는 사카로마이세스 세레비지애의 염색체에 상동 재조합되어 cyb2와 치환될 부분을 의미한다.
(2.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh )의 제조
(2.1)에서 제작한 cyb2 결실용 카세트를 상기한 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 cyb2 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 cyb2의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 47 및 48의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 cyb2 유전자 결실된 것을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh)를 제조하였다.
(3) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 , ㅿ gpd1 :: ldh )의 제조
(3.1) gpd1 를 결실시키기 위한 벡터의 제작
(2)에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2)에서 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)에서 글리세롤-3-포스페이트로 가는 경로를 차단하기 위하여 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1, gpd1)을 코딩하는 유전자를 제거하였다.
구체적으로, (1.1)에서 제조된 pUC-uraHA-ldh를 주형으로 하고, 서열번호 49 및 50의 gpd1 상동 재조합 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 gpd1 결실용 카세트를 얻었다. 서열번호 49의 프라이머 중 1 내지 50 및 서열번호 50의 프라이머 중 1 내지 50은 사카로마이세스 세레비지애의 염색체에 상동 재조합되어 gpd1과 치환될 부분을 의미한다.
(3.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh )의 제조
(3.1)에서 제작한 gpd1 deletion용 카세트를 (2)에서 제조한 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 gdp1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 gpd1의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 51 및 52의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 gpd1 유전자 결실을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh)를 제조하였다.
S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh)는 2013.5.30일자로 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 수탁번호 KCTC12415BP로 기탁하였다.
(4) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh ,ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ adh1 :: ldh )
(4.1) adh1 을 결실하기 위한 벡터의 제작
(3)에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh)에서 아세트알데히드에서 에탄올로 가는 경로를 차단하기 위하여 알코올 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase, adh1)를 코딩하는 유전자를 제거하였다. adh1 유전자를 제거하는 동시에 Ldh를 발현시키기 위하여 adh1 유전자를 ldh-HPH 카세트로 치환시켜 결손시켰다.
구체적으로, (1.1)에서 제조된 p416-ldh-HPH 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 53 및 54의 adh1 상동 재조합 서열 및 프로모터가 결합된 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 adh1 deletion 용 카세트를 얻었다. 서열번호 53의 프라이머 중 1 내지 51 및 서열번호 54의 프라이머 중 1 내지 51은 사카로마이세스 세레비지애의 염색체에 상동 재조합되어 adh1 유전자와 치환될 부분을 의미한다.
(4.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh ,ㅿadh1::ldh)의 제조
(4.1)에서 제작한 adh1 deletion용 카세트를 (3)에서 제조한 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh)에 도입하였다.
도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 선택 마커인 히그로마이신 B의 존재하에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 adh1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 adh1의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 55 및 56의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 adh1 유전자 결실 및 ldh 유전자 도입을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh)를 제조하였다.
(5) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh ,ㅿadh1::ldh, ㅿ ald6 :: mhpF )의 제조
(5.1) mhpF 를 도입하기 위한 벡터의 제작 및 도입
(4)에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh, ㅿadh1::ldh)에서 아세트알데히드로부터 acetyl-CoA로 전환하는 경로를 강화하기 위하여, MhpF 유전자를 ald6 유전자 부위에 도입하였다.
구체적으로, MhpF 유전자는 대장균에서 유래한 MhpF 유전자를 기초로 S.cerevisiae 코돈-최적화된 (codon-optimized) 뉴클레오티드 서열을 구하고, 이 서열을 합성하였다 (DNA2.0 Inc; 서열번호 22). 얻어진 MhpF 유전자와 'HIS3 카세트'를 각각 SalI 제한 효소를 사용하여, 'pUC19 벡터'(NEB, N3041)에 연결하여, pUC19-His-MhpF 벡터 (서열번호 57)를 제조하였다. 상기 HIS3 카세트는 pRS413 (ATCC8758)을 주형으로 하고 서열번호 60 및 61의 프라이머를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하여 얻은 증폭 산물이다. pUC19-His-MhpF 벡터에서 mhpF는 GPD 프로모터 (서열번호 29) 하에서 발현된다.
제조된 pUC19-His-MhpF 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 58 및 59의 ald6 상동 재조합 및 프로모터가 결합된 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 mhpF 삽입용 카세트를 얻었다. 서열번호 58의 프라이머 중 1 내지 44 및 서열번호 59의 프라이머 중 1 내지 45는 사카로마이세스 세레비지애의 염색체에 상동 재조합되어 ald6 유전자와 치환될 부분을 의미한다.
(5.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh ,ㅿadh1::ldh, ㅿ ald6 :: mhpF )의 제조
(5.1)에서 제작한 mhpF 삽입용 카세트를 (4)에서 제조한 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh)에 도입하였다.
도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 histidine drop out 배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without histidine (Sigma-Aldrich: cat. no. Y1751) 1.9 g/L, 및 포도당 2 (w/v)%)에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 ald6 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 ald6 유전자의 결실 및 mhpF 유전자의 도입을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 62 및 63의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 유전자 결실 및 유전자 도입 여부를 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF)를 제조하였다.
(7) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh ,ㅿadh1::ldh, ㅿ ald6 :: mhpF , ㅿ P RCK1 :: P TPI1 )의 제조
(7.1) RCK1 유전자를 과발현하기 위한 벡터의 제작 및 도입
RCK1 유전자의 과발현을 위해서 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 의 RCK1 유전자 프로모터(PRCK11)를 발현 수준이 높은 TPI1 유전자 프로모터(PTPI1)로 교체하기 위해 다음과 같이 실시하였다. 도 1은 모균주 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D에서 RCK1 프로모터가 치환된 벡터가 삽입된 균주를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
TPI1 유전자 프로모터(PTPI1) (서열번호 64)를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해, Qiagen(사)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 사카로마이세스 세레비지애 야생주인 CEN.PK2-1D의 염색체 DNA(gDNA)를 추출하고, 상기 gDNA를 주형으로 PCR HL premix kit(BIONEER사 제품, 이하 동일함)를 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 약칭함)을 수행하였다.
PTPI1을 증폭시키기 위한 PCR은 서열번호 65 및 66의 프라이머를 사용하여 94℃에서 30초의 변성(denaturation), 52℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 30초의 신장(elongation)으로 이루어진 사이클을 30회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물을 EcoRI으로 절단하여 DNA 단편(이하, "PTPI1 카세트"라 명명)을 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 용리(鎔離)하여 수득하였다. P57 벡터(GenScript)(서열번호 67) 및 수득한 PTPI1 카세트를 제한효소 EcoRI로 처리하고 라이게이션(ligation)시켜서 p57-PTPI1(서열번호 68)벡터를 제작하였다. 도 2는 P57 벡터를 나타내는 도면이다. 도 3은 p57-PTPI1 벡터를 나타내는 도면이다.
(7.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh ,ㅿadh1::ldh, ㅿ ald6 :: mhpF , ㅿ P RCK1 :: P TPI1 )의 제조
RCK1 프로모터(PRCK11)를 상동성 재조합 방법으로 PTPI1 프로모터(PTPI1)로 교체시키기 위하여 상기 p57-PTPI1 벡터를 이용하였다. 상기 p57-PTPI1 벡터를 주형으로 하고 서열번호 69 및 70의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 PRCK1을 PTPI1으로 교체할 카세트를 제작하였다.
제작된 교체 카세트를 실시예 1의 (5)에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF) 균주에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환에 의하여 수행되었다. 구체적으로, 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh, ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF) 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다.
상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PRCK1의 PTPI1로의 교체를 확인하기 위해 서열번호 71 및 72의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 PRCK1의 PTPI1로의 교체를 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF, ㅿPRCK1::PTPI1)를 수득하였다.
실시예 2: 효모 세포에서 MSN2 유전자의 과발현의 효과
(2.1) MSN2 의 과발현을 위한 벡터의 제작
MSN2 유전자의 과발현을 위해서 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae CEN.PK2-1D(MATα ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3△ 1; MAL2-8C; SUC2) EUROSCARF accession number: 30000B: 이라 "CEN.PK2-1D 균주"라고도 함) 게놈 DNA로부터 MSN2의 코딩 부위 함유 서열 (서열번호 2)을 서열번호 73 및 74의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하고, 증폭 산물을 HindIII로 소화시킨 후, HindIII로 소화된 pRS416 vector (ATCC87521)에 연결하여 pRS416-MSN2 벡터를 제조하였다. 상기 벡터에서 MSN2 유전자는 GPD 프로모터 하에서 전사된다.
(2.2) MSN2 의 과발현 균주의 제작
(2.2.1) MSN2 유전자 과발현 유전체 삽입 카세트 제작
사카로마이시스 세레비지애에서 MSN2 유전자를 지속적으로 발현 (constitutive expression)하기 위한 MSN2 유전체 삽입 카세트를 다음과 같이 제작하였다.
그 후 실시예 2.1에서 만들어진 과발현 벡터를 서열번호 75 및 76의 프라이머트 세트를 사용한 프라이머로 PCR 증폭한 후 PCR 절편, 및 실시예 1의 (1.1)에서 제조된 pUC57-URA3 벡터를 SalI로 절단하여 상기 PCR 절편과 라이게이션하여 pUC57-URA3-GPDp-MSN2 벡터를 제작하였다. 도 4는 pUC57-URA3-GPDp-MSN2 벡터를 나타내는 모식도로, 영양요구성 마커인 우라실3 유전자가 삽입되어 있고, 후술하는 MSN2를 유전체에 삽입시키기 위한 카세트 제작하기 위한 모벡터이다.
그 후, 위에서 제작된 pUC57-URA3-GPDp-MSN2 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 77 및 78의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 MSN2이 삽입된 카세트를 제작하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 4분 동안 진행 후, 94℃에서 30초동안 변성, 52℃에서 30초, 및 72℃에서 3분 동안 연장의 사이클을 30번 반복하여 수행 후, 72℃ 10분 동안 진행하였다.
(2.2.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh ,ㅿadh1::ldh, ㅿ ald6 :: mhpF , MSN2 +)의 제조
사카로마이시스 세레비지애에서 MSN2를 지속적으로 발현 (constitutive expression)하기 위해, MSN2 유전체 삽입을 다음과 같이 실시하였다. CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF)를 YPD (10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20g 포도당) 고체배지에 도말하여 24시간 동안 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 10ml에 접종하여 18시간 동안 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 50ml에 1%(v/v) 접종하여 230rpm, 30℃ 배양기에서 배양하였다.
약 4-5시간 후, OD600이 0.5 정도가 되면 4,500rpm, 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 100mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그리고 다시 4,500rpm, 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 15% 글리세롤이 첨가된 1M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 100ul씩 분주하였다.
MSN2을 지속적으로 발현하기 위해, 실시예 2.2.1에서 제작된 MSN2가 삽입된 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 후, 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응 후 배양액을 유라실 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-his))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 8 개를 선별해 다시 YSD (-URA) 고체 배지에 옮김과 동시에 YSD (-URA) 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 MSN2 삽입을 확인하기 위해 하기 서열번호 79 및 80의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 MSN2 발현 카세트 삽입을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF, MSN2+) 을 제조하였다.
(2.2.3) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh ,ㅿa d h1:: ldh , ㅿ ald6 :: mhpF , ㅿ P RCK1 :: P TPI1 , MSN2 +)의 제조
사카로마이시스 세레비지애에서 MSN2를 지속적으로 발현 (constitutive expression)하기 위해, MSN2 유전체 삽입을 다음과 같이 실시하였다. CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF, ㅿPRCK1::PTPI1)를 YPD (10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20g 포도당) 고체배지에 도말하여 24시간 동안 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 10ml에 접종하여 18시간 동안 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 230 rpm, 30℃ 배양기에서 배양하였다.
약 4-5시간 후, OD600이 0.5 정도가 되면 4,500rpm, 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그리고 다시 4,500 rpm, 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 15% 글리세롤이 첨가된 1M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 100ul씩 분주하였다.
MSN2을 지속적으로 발현하기 위해, 실시예 2.2.1에서 제작된 MSN2가 삽입된 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 후, 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응 후 배양액을 유라실 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-his))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 8 개를 선별해 다시 YSD (-URA) 고체 배지에 옮김과 동시에 YSD (-URA) 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 MSN2 삽입을 확인하기 위해 하기 서열번호 79 및 80의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 MSN2 발현 카세트 삽입을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh, ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF, ㅿPRCK1::PTPI1, MSN2+) 을 제조하였다.
실시예 3. MSN2 과발현된 효모 세포의 성장, 포도당 소모량, 에탄올 및 락테이트 생산량 확인
상기에서 제조된 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF, MSN2+)의 효모 세포를 4% 포도당을 함유한 최소 배지 (minimal Ura drop-out media) 50 ml에 OD600 값 1이 되도록 접종하고, 30℃에서 90rpm으로 교반하면서 48 시간 동안 미세호기 조건에서 배양하였다. 배양 중 세포 성장은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 OD600 값을 측정하였다. 잔류 포도당 및 에탄올 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다.
약 68 시간 동안 배양 결과, 세포 성장 즉, 배양물의 OD600 값, 및 배지 중 잔류 포도당 및 젖산 농도는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
균주 세포성장(OD600) 포도당 소비(g/L) 젖산 생산량(g/L) 수율 (g/g %)
대조군 4.40 31.72g/L 20.44 68.77
MSN2 강화 균주 3.96 34.48g/L 22.93 70.70
표 1에서, 대조군은 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF)를 나타내고, MSN2 강화 균주는 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF, MSN2+)를 나타낸다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 실험 균주는 대조군에 비하여 세포 성장은 감소되었지만, 포도당 소비, 젖산 생산량, 및 수율이 증가하였다. 젖산 생산량은 MSN2 강화 균주가 대조군에 비하여 12.2% 증가하였다.
실시예 4. MSN2 과발현된 세포의 MSN2 유전자 과발현 및 트레할로스 유전자 과발현 확인 및 젖산 내성 강화 효과 확인
(1) MSN2 유전자의 발현량 확인
MSN2 강화 균주의 MSN2 유전자의 발현량을 qRT-PCT을 이용하여 확인하였다. MSN2 강화 균주는 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF, msn2+)를 나타낸다. 상기 MSN2 강화 균주의 endogenous MSN2 유전자의 발현량을 1을 기준으로 하여, 상기 MSN2 강화 균주의 MSN2 유전자의 발현량을 측정하였다. 구체적으로, 125 ml의 플라스크에서 상기 MSN2 강화 균주의 배양 0h, 19h, 25h, 및 46h에서 샘플링 후 RNeasy mini kit (Qiagen co.)를 이용 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 이용 SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 이용 cDNA를 합성 후 MSN2 유전자에 특이적으로 binding하는 서열번호 81 및 82의 프라이머를 IQ SYBR Green Supermix (Bio-rad)에 제조사에서 제시된 프로토콜에 따라 혼합, qRT-PCR 반응 측정기 (CFX96 realtime PCR detection system, Bio-rad)을 이용 그 상대적 발현양을 확인하였다.
도 5는 MSN2 강화 균주의 MSN2 유전자 발현량을 나타낸 도면이다. 상대적 발현량 비교는 ㅿㅿCT 방법을 이용하였으며, TAF10을 Reference gene으로 사용하였으며, Bar는 3번 반복한 값의 standard error를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 MSN2 강화 균주에서 약 20~30 배 이상의 MSN2 유전자가 실제로 과발현되는 것을 확인하였다.
(2) 트레할로스 유전자의 발현량 확인
도 5는 또한 MSN2 강화 균주의 TPS1 및 TSL1 유전자의 발현량을 나타낸 도면이다. TPS1 및 TSL1 유전자는 STRE 유전자의 예이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, MSN2 강화 균주에서 TPS1 유전자의 발현량을 서열번호 83 및 84의 프라이머를 사용한 PCR을 통해 확인하고, TSL1 유전자의 발현량을 서열번호 85 및 86의 프라이머를 사용한 PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, TPS1 유전자 및 TLS1 유전자가 대조군에 비하여 MSN2 강화 균주에서 약 5배 과발현되는 것을 알 수 있다. 따라서 MSN2 강화 균주는 스트레스 반응에 관련하는 유전자를 발현시키는 것을 확인하였다.
(3) 젖산 내성 강화 효과 확인
(3.1) MSN2 강화 균주의 내산성 평가
OD 약 1의 조건에서, pH 3.5, 40 g/L의 젖산을 포함한 YPD 고체 배지에 MSN2 강화 균주를 4 ul 정도 spotting하였다. 도 6은 MSN2 강화 균주의 spotting 결과를 나타낸 도면이다. 도 6에서, 대조군은 S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF)이며, MSN2는 S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF, MSN+) 균주를 나타낸다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군의 경우 pH 3.5에서 콜로니가 관찰되지 않는 반면, MSN2 강화 균주는 pH 3.5의 조건에서도 콜로니가 존재하는 것을 알 수 있다. 이로부터, MSN2 강화 균주는 산에 대하여 내성을 갖는 것을 알 수 있다. 상기 MSN2 강화 균주는 젖산에 대하여 내성을 가지며, pH 3.5의 산에 대하여 내성을 갖는 것을 알 수 있다.
(3.2) MSN2 강화 균주에 대한 발효조에서 내산성 평가
실시예 2의 (2.2)에서 제조된 MSN2 강화 균주인 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF, ㅿPRCK1::PTPI1, MSN2+)를 8% 글루코스, 1% 효모 추출물, 2% Bacto-peptone을 포함한 YPD 배지에 접종하고, 혐기 조건으로 30℃에서 약 90 rpm으로 교반하면서 총 46시간 동안 배양하였다. 배양 초기에 세포의 OD600 nm에서 측정한 OD값은 1 이었다. 배양 도중 플라스크로부터 주기적으로 배양물을 채취하여, OD값, 락테이트, 글루코스, 에탄올 및 글리세롤의 농도를 측정하였다. 이때, 내산성 발효 조건을 테스트 하기 위해, 상술한 발효 조건에 비하여 중화제로서 Ca(OH)2의 사용량을 반으로 줄인 경우의 최종 pH, OD값, 글루코스 소비, 생산된 젖산, 에탄올, 및 글리세롤의 농도를 측정하였다.
표 2는 대조군 및 MSN2 강화 균주의 46시간 배양 후 사용한 5N Ca(OH)2의 농도를 조절한 경우의, OD값, 소비된 글루코스의 양, 최종 pH, 젖산, 에탄올, 및 글리세롤의 농도를 나타낸 것이다. 대조군은 S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF, ㅿPRCK1::PTPI1)을 나타내며, MSN2 강화 균주는 S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF, ㅿPRCK1::PTPI1, MSN2+)를 나타낸다.
표 2에 나타낸 바와 같이, Ca(OH)2의 양을 반으로 줄인 경우, 최종 pH는 약 3.3에서 3.1로 감소되었음을 알 수 있고, MSN2 강화 균주의 경우 OD값이 10.44에서 10.58로 증가하여 세포의 성장이 증가하며, 대조군의 경우는 OD값이 11.32에서 10.58로 감소하여 세포의 성장이 감소하며, 락테이트 생산량도 pH가 더 낮은 경우, MSN2 강화 균주가 99.99 g/L의 락테이트 생산량을 갖는 대조군에 비하여 높은 락테이트 생산량 (105.95g/L)을 갖는 것을 확인하였다. 이는 MSN2 강화 균주의 내성, 예를 들면 내산성, 더 낮은 산에 대하여 내성을 갖는 것임을 알 수 있다.
균주 대조군 MSN2 강화 균주 대조군 MSN2 강화 균주
5N Ca(OH)2 (g/L) 235.00 235.00 117.00 117.00
OD600 11.32 10.44 10.58 10.58
글루코스 소비 (g/L) 165.00 165.45 131.78 142.22
최종 pH 3.37 3.33 3.17 3.14
락테이트 농도 (g/L) 124.07 123.26 99.99 105.95
에탄올 (g/L) 6.89 7.94 7.10 8.74
글리세롤 (g/L) 0.30 0.39 0.24 0.28
실시예 5. MSN2 강화 균주에 대한 대사체 ( metabolite ) 분석
MSN2 강화 균주를 상술한 발효 조건에서 배양 중 생성된 대사체 (글리세롤, 트레할로스, 9-헥사데카노익산)를 정성/정량 분석하였다. 사용된 기기는 기체크로마토그래피-질량분석기 (Agilent GC/MS 7890A/5975)이고 DB-5MS 컬럼을 사용하여 샘플을 분리하였다. 샘플은 기체 크로마토그래피에서 분석할 수 있도록 MSTFA [N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide] 유도체화 시약을 이용하여 syliation 반응을 시켰다.
(5.1) 글리세롤의 농도 분석
발효 중 글리세롤의 농도를 측정하였다. 도 7은 MSN2 강화 균주의 발효 중 글리세롤의 농도를 나타낸 도면이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, MSN2 강화 균주는 대조군에 비하여 발효 개시 후 9시간에 2.30 ng/107cells에서 4.74 ng/107cells로 증가하여, 글리세롤의 농도가 약 2배 이상 증가하고, 증가 후 초기 상태를 유지한 것을 알 수 있다.
이는 발효 초반에 젖산이 생산됨에 따라 pH는 감소하며, pH가 중성에서 약 pH4 정도로 유지되는 경우, 젖산은 음이온의 형태로 존재하게 되며 이 음이온의 형태의 젖산이 삼투압 스트레스를 일으킬 수 있다. MSN2 강화 균주의 경우, 발효 개시 후 9시간에 높은 글리세롤의 농도로 증가하는 것은 음이온 형태의 젖산으로 인한 삼투압 스트레스에 대응한 것임을 알 수 있다. 따라서, 이와 같은 고농도의 글리세롤 농도를 갖는 MSN2 강화 균주는 삼투압에 대하여 내성을 갖는 것을 보여준다.
(5.2) 트레할로스 ( Trehalose )의 농도 분석
발효 중 트레할로스의 농도를 측정하였다. 도 8은 MSN2 강화 균주의 발효 중 트레할로스의 농도를 나타낸 도면이다. 도 8에 나타낸 바와 같이, MSN2 강화 균주는 대조군에 비하여 발효개시 후 9시간에 9.08 μg/107cells에서 12.62 μg/107cells로 증가하여, 트레할로스의 농도가 고농도로 유지되는 것을 알 수 있다. 고농도의 트레할로스는 세포의 삼투압 및/또는 산에 대한 내성을 갖는 것을 보여준다.
(5.3) 9- 헥사데카노익산(9-hexadecenoic acid)의 농도 분석
발효 중 지방산의 농도를 측정하였다. 도 9는 MSN2 강화 균주의 발효 중 9-헥사데카노익산의 농도를 나타낸 도면이다. 상기 9-헥사데카노익산은 16 :1 지방산으로 지칭된다. 도 9에 나타낸 바와 같이, MSN2 강화 균주는 대조군에 비하여 발효개시 후 9시간에 발효개시 후 9시간에 30% 감소하여, 상기 지방산의 농도가 저농도로 유지되는 것을 알 수 있다. 이는 MSN2 강화 균주에서 상기 지방산이 저농도로 유지되어 세포막의 유동성을 저해하여 결과적으로 세포막의 강성을 증가시켜 내산성과 같은 스트레스-내성을 갖는 것을 보여준다.
한국생명공학연구원 KCTC12415BP 20130530
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365 Thr Gln Ile Leu Asn Glu Tyr Asn Met Asn Phe Asn Asp Asn Leu Gly 370 375 380 Thr Ser Thr Ser Gly Lys Asn Lys Ser Ala Cys Pro Ser Ser Phe Asp 385 390 395 400 Ala Asn Ala Met Thr Lys Ile Asn Pro Ser Gln Gln Leu Gln Gln Gln 405 410 415 Leu Asn Arg Val Gln His Lys Gln Leu Thr Ser Ser His Asn Asn Ser 420 425 430 Ser Thr Asn Met Lys Ser Phe Asn Ser Asp Leu Tyr Ser Arg Arg Gln 435 440 445 Arg Ala Ser Leu Pro Ile Ile Asp Asp Ser Leu Ser Tyr Asp Leu Val 450 455 460 Asn Lys Gln Asp Glu Asp Pro Lys Asn Asp Met Leu Pro Asn Ser Asn 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ser Gln Gln Phe Ile Lys Pro Ser Met Ile Leu Ser Asp 485 490 495 Asn Ala Ser Val Ile Ala Lys Val Ala Thr Thr Gly Leu Ser Asn Asp 500 505 510 Met Pro Phe Leu Thr Glu Glu Gly Glu Gln Asn Ala Asn Ser Thr Pro 515 520 525 Asn Phe Asp Leu Ser Ile Thr Gln Met Asn Met Ala Pro Leu Ser Pro 530 535 540 Ala Ser Ser Ser Ser Thr Ser Leu Ala Thr Asn His Phe Tyr His His 545 550 555 560 Phe Pro Gln Gln Gly His His Thr Met Asn Ser Lys Ile Gly Ser Ser 565 570 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ggtgatgttg tcattgctga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200 ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260 gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320 ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380 ggcttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aaagttgatt 1440 cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaggttggg accacctatc cttgttgcca 1500 actttcggtg ctaaggacta tgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag 1560 ttgacccaag acaagtcttt caacgacaac tctaagatca gaatgattga aatcatgttg 1620 ccagtcttcg atgctccaca aaacttggtt gaacaagcta agttgactgc tgctaccaac 1680 gctaagcaat aa 1692 <210> 12 <211> 591 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 12 Met Leu Lys Tyr Lys Pro Leu Leu Lys Ile Ser Lys Asn Cys Glu Ala 1 5 10 15 Ala Ile Leu Arg Ala Ser Lys Thr Arg Leu Asn Thr Ile Arg Ala Tyr 20 25 30 Gly Ser Thr Val Pro Lys Ser Lys Ser Phe Glu Gln Asp Ser Arg Lys 35 40 45 Arg Thr Gln Ser Trp Thr Ala Leu Arg Val Gly Ala Ile 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gaaagccaaa ttgacttggt ttcttccatt gaagctttgg acaatggtaa aactttggcc 360 ttagcccgtg gggatgttac cattgcaatc aactgtctaa gagatgctgc tgcctatgcc 420 gacaaagtca acggtagaac aatcaacacc ggtgacggct acatgaactt caccacctta 480 gagccaatcg gtgtctgtgg tcaaattatt ccatggaact ttccaataat gatgttggct 540 tggaagatcg ccccagcatt ggccatgggt aacgtctgta tcttgaaacc cgctgctgtc 600 acacctttaa atgccctata ctttgcttct ttatgtaaga aggttggtat tccagctggt 660 gtcgtcaaca tcgttccagg tcctggtaga actgttggtg ctgctttgac caacgaccca 720 agaatcagaa agctggcttt taccggttct acagaagtcg gtaagagtgt tgctgtcgac 780 tcttctgaat ctaacttgaa gaaaatcact ttggaactag gtggtaagtc cgcccatttg 840 gtctttgacg atgctaacat taagaagact ttaccaaatc tagtaaacgg tattttcaag 900 aacgctggtc aaatttgttc ctctggttct agaatttacg ttcaagaagg tatttacgac 960 gaactattgg ctgctttcaa ggcttacttg gaaaccgaaa tcaaagttgg taatccattt 1020 gacaaggcta acttccaagg tgctatcact aaccgtcaac aattcgacac aattatgaac 1080 tacatcgata tcggtaagaa agaaggcgcc aagatcttaa ctggtggcga aaaagttggt 1140 gacaagggtt 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Claims (20)

  1. 모세포에 비하여 MSN2의 활성이 증가된, 스트레스-내성(stress tolerance)을 갖는 효모 세포로서,
    피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
    피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, 및 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴되고,
    아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하고,
    락테이트 생산능을 갖고, pH 3.0 내지 3.8에서 생장할 수 있는 것인 효모 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, MSN2는 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
  3. 청구항 1에 있어서, MSN2를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형을 갖는 것인 효모 세포.
  4. 청구항 1에 있어서, MSN2를 코딩하는 유전자의 카피수가 증가된 것인 효모 세포.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 스트레스는 산인 것인 효모 세포.
  6. 청구항 1에 있어서, 모세포에 비하여 감소된, 특정 지방산 함량을 갖고, 상기 특정 지방산은 헥사데카노익산인 것인 효모 세포.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 스트레스는 삼투압인 것인 효모 세포.
  8. 청구항 1에 있어서, 모세포에 비하여 증가된 글리세롤 함량 또는 트레할로스 함량을 갖는 것인 효모 세포.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 모세포에 비하여 증가된 글리세롤 함량을 갖는 효모 세포는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것인 효모 세포.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 것인 효모 세포.
  13. 삭제
  14. 청구항 1에 있어서, 추가로 EutE를 코딩하는 유전자, 방사선 감수성 보완 키나아제를 코딩하는 유전자, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 효모 세포.
  15. 청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 쉬조사카로마이세스 (Shizosaccharomyces) 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속인 것인 효모 세포.
  16. 청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애인 것인 효모 세포.
  17. 삭제
  18. 청구항 1의 효모 세포를 배양하는 단계를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 배양은 pH 2 내지 7의 범위에서 수행되는 것인 방법.
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