CN108473968A - 生产植物鞘氨醇或二氢神经鞘氨醇的方法 - Google Patents

Abstract

提供了使用酵母生产目标物质例如植物鞘氨醇和二氢神经鞘氨醇的方法。通过在培养基中培养具有生产目标物质的能力并以使由LCB4和CKA2基因编码的蛋白质的表达和/或活性降低的方式进行了修饰的酵母，和从酵母的细胞和/或培养基收集目标物质来生产目标物质。

Description

生产植物鞘氨醇或二氢神经鞘氨醇的方法

技术领域

本发明涉及使用酵母生产目标物质例如植物鞘氨醇(PHS)和二氢神经鞘氨醇(DHS)的方法。PHS和DHS作为药物、化妆品等的成分在工业上有用。

背景技术

已经尝试使用生物工程技术生产鞘氨醇碱和鞘脂类。作为使用生物工程技术生产鞘氨醇碱和鞘脂类的方法，已经报道了使用酵母的方法(JP2014-529400)。

LCB4基因编码主要鞘氨醇碱激酶。报道了LCB4基因是从鞘氨醇碱合成神经酰胺的关键调节分子(J Biol Chem.2003Feb 28；278(9):7325-34.)。CKA2基因编码酪蛋白激酶2的α’亚基。报道了CKA2基因对于神经酰胺合酶的完全活化是必需的(EukaryotCell.2003Apr；2(2):284-94.)

发明简述

本发明实现的目标

本发明的目标是开发新的技术，其用于改善酵母的目标物质例如植物鞘氨醇(PHS)和二氢神经鞘氨醇(DHS)的生产，并从而提供高效地生产目标物质的方法。

实现目标的手段

为了实现上述目标，本发明的发明人进行了研究。结果，本发明人发现通过以使LCB4和CKA2基因编码的蛋白质的表达和/或活性降低的方式对酵母进行修饰，能够改善酵母生产目标物质例如植物鞘氨醇(PHS)和二氢神经鞘氨醇(DHS)的能力，从而完成了本发明。

也就是说，本发明可以例如如下实施：

[1]生产目标物质的方法，所述方法包括：

在培养基中培养具有生产所述目标物质的能力的酵母；和

从所述酵母的细胞和/或所述培养基收集所述目标物质，

其中以使由LCB4和CKA2基因编码的蛋白质的表达和/或活性降低的方式对所述酵母进行了修饰，且

其中所述目标物质选自植物鞘氨醇(PHS)和二氢神经鞘氨醇(DHS)。

[2]上述方法，其中通过弱化所述LCB4和/或CKA2基因的表达，或通过破坏所述LCB4和/或CKA2基因来降低所述蛋白质的活性。

[3]上述方法，其中通过使所述LCB4和/或CKA2基因缺失来降低所述蛋白质的活性。

[4]上述方法，其中由所述LCB4基因编码的蛋白质是下述(A)、(B)或(C)中定义的蛋白质：

(A)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的蛋白质；

(B)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列但包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有鞘氨醇碱激酶活性的蛋白质；

(C)包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有鞘氨醇碱激酶活性的蛋白质。

[5]上述方法，其中由所述CKA2基因编码的蛋白质是下述(A)、(B)或(C)中定义的蛋白质：

(A)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的蛋白质；

(B)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列但包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有酪蛋白激酶2活性的蛋白质；

(C)包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有酪蛋白激酶2活性的蛋白质。

[6]上述方法，其中以使一种或多种蛋白质的表达和/或活性降低的方式对所述酵母进行了进一步的修饰，所述一种或多种蛋白质选自由LCB5、ELO3、ORM2和CHA1基因编码的蛋白质。

[7]上述方法，其中通过弱化编码所述一种或多种蛋白质的相应基因的表达或通过破坏编码所述一种或多种蛋白质的相应基因来降低所述一种或多种蛋白质的活性。

[8]上述方法，其中通过使编码所述一种或多种蛋白质的相应基因缺失来降低所述一种或多种蛋白质的活性。

[9]上述方法，其中以使一种或多种蛋白质的表达和/或活性增加的方式对所述酵母进行了进一步的修饰，所述一种或多种蛋白质选自由LCB1、LCB2、TSC10和SUR2基因编码的蛋白质。

[10]上述方法，其中通过增加编码所述一种或多种蛋白质的相应基因的表达来增加所述一种或多种蛋白质的活性。

[11]上述方法，其中通过以增加所述基因的拷贝数的方式进行修饰和/或通过修饰所述基因的表达控制序列来增加所述基因的表达。

[12]上述方法，其中所述植物鞘氨醇选自C16PHS、C18PHS，C20PHS、C18:1PHS、C20:1PHS、4-(羟甲基)-2-甲基-6-十四酰-1,3-恶嗪烷-5-醇和4-(羟甲基)-2-甲基-6-十六酰-1,3-恶嗪烷-5-醇。

[13]上述方法，其中所述培养基含有能够联合、结合、增溶和/或捕获所述目标物质的添加剂。

[14]上述方法，其中所述添加剂选自环糊精和沸石。

[15]上述方法，其中所述酵母属于酵母属。

[16]上述方法，其中所述酵母是酿酒酵母。

[17]上述方法，其中所述酵母能够在培养基或所述酵母的细胞中以比未修饰的菌株可获得的量更大的量生产和积累所述目标物质。

附图简述

[图1]该图显示了关于小规模培养中的PHS生产的数据。PHS：鞘脂类途径基因LCB1、LCB2、TSC10和SUR2。

[图2]该图显示了使用菌株EVST20240的生物反应器发酵的数据。

发明详述

以下将对本发明进行详细描述。

本发明的方法是用于生产目标物质的方法，其包括在培养基中培养具有生产目标物质的能力的酵母，和从酵母的细胞和/或培养基收集目标物质，其中以使由LCB4和CKA2基因编码的蛋白质的表达和/或活性降低的方式对所述酵母进行了修饰。用于本发明的方法的酵母也称为“本发明的酵母”。

<1>本发明的酵母

本发明的酵母是具有生产目标物质的能力的酵母，其以使由LCB4和CKA2基因编码的蛋白质的表达和/或活性降低的方式的方式进行了修饰。“生产目标物质的能力”也可以称为“目标物质生产能力”。

<1-1>具有目标物质生产能力的酵母

在本发明中，术语“具有目标物质生产能力的酵母”是指当在培养基中培养酵母时，能够在培养基或酵母的细胞中以能够收集目标物质的程度生产并积累目标物质的酵母。培养基可以是能够在本发明的方法中使用的培养基，且特别可以是含有能够联合、结合、增溶和/或捕获目标物质的添加剂的培养基。具有目标物质生产能力的酵母也可以是能够在培养基或酵母的细胞中以比未修饰的菌株可获得的量更大的量生产和积累目标物质的酵母。术语“未修饰的菌株”可以指没有以赋予或增强目标物质生产能力的方式进行修饰的参照菌株，且特别是可以指没有以使由LCB4和CKA2基因编码的蛋白质的表达和/或活性降低的方式的方式进行了修饰的参照菌株。未修饰的菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株，例如酿酒酵母菌株BY4742(ATCC201389；EUROSCARF Y10000)，S288C(ATCC 26108)和NCYC3608。具有目标物质生产能力的酵母还可以是能够在培养基中以下述量生产和积累目标物质的酵母，所述量优选为5mg/L或更多，更优选为10mg/L或更多。

在本发明中，目标物质选自植物鞘氨醇(PHS)和二氢神经鞘氨醇(DHS)。

植物鞘氨醇(PHS)和二氢神经鞘氨醇(DHS)各自包含具有C2处的氨基和羟基的长烷基链。构成目标物质的烷基链的长度和不饱和度可以变化。烷基链可以具有例如C16，C18或C20的长度。烷基链可以具有一个或多个不饱和双键。也就是说，目标物质的实例还包括植物鞘氨醇(PHS)和二氢神经鞘氨醇(DHS)的变体种类，该变体种类具有不同的长度和/或不同的不饱和度。术语“植物鞘氨醇(PHS)”可以指C18PHS，其是PHS的典型种类，或者可以共同指PHS的变体种类，例如具有饱和C16烷基链的C16PHS；具有饱和C18烷基链的C18PHS；和具有饱和C20烷基链的C20PHS；具有含有一个不饱和双键的C18烷基链的C18:1PHS；和具有含有一个不饱和双键的C20烷基链的C20:1PHS。术语“植物鞘氨醇(PHS)”还可以包括PSH的加合物，例如4-(羟甲基)-2-甲基-6-十四酰-1,3-恶嗪烷-5-醇和4-(羟甲基)-2-甲基-6-十六酰-1,3-恶嗪烷-5-醇，其可以分别经由C18PHS和C20PHS与乙醛的反应生成。相似的，术语“二氢神经鞘氨醇(DHS)”可以指C18DHS，其是DHS的典型种类并且具有饱和的C18烷基链，或者可以总的指DHS的此类变体种类。

要生产的目标物质可以是游离化合物，其盐或其混合物。也就是说，在本发明中，术语“目标物质”可以指游离形式的目标物质，其盐或其混合物。盐的实例包括例如无机酸盐如硫酸盐，盐酸盐和碳酸盐，以及有机酸盐如乳酸盐和乙醇酸盐(Acta DermVenereol.2002；82(3):170-3)。作为目标物质的盐，可以使用一种盐，或者可以使用两种或更多种盐。

酵母没有特别的限制，只要其能够用于本发明的方法即可。酵母可以是出芽酵母，或者可以是裂殖酵母。酵母可以是单倍体酵母，或者可以是二倍体或多倍体酵母。

酵母的实例包括属于酵母属(Saccharomyces)的酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，毕赤酵母属(也称为Wickerhamomyces属)，如Pichiaciferrii，Pichia sydowiorum和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，假丝酵母属如产朊假丝酵母属(Candida utilis)，汉逊酵母如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。毕赤酵母属的一些物种已被重新分类到Wickerhamomyces属(Int J Syst EvolMicrobiol.2014Mar；64(Pt 3)：1057-61)。因此，例如，Pichia ciferrii和Pichiasydowiorum也分别称为Wickerhamomyces ciferrii和Wickerhamomyces sydowiorum。在本发明中，术语“毕赤酵母”应该包括已经分类到毕赤酵母属中但已经重新分类到另一属例如Wickerhamomyces中的物种。

酿酒酵母的具体实例包括菌株BY4742(ATCC 201389；EUROSCARF Y10000)，S288C(ATCC 26108)，Y006(FERM BP-11299)，NCYC 3608，及其衍生菌株。Pichia ciferrii(Wickerhamomyces ciferrii)的具体实例包括菌株NRRL Y-1031(ATCC 14091)，菌株CS.PCΔPro2(Schorsch et al.,2009,Curr Genet.55,381-9.)，WO 95/12683中公开的菌株，及其衍生菌株。Pichia sydowiorum(Wickerhamomyces sydowiorum)的具体实例包括菌株NRRL Y-7130(ATCC 58369)及其衍生菌株。

这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(ATCC，地址：12301 ParklawnDrive，Rockville，Maryland 20852，PO Box 1549，Manassas，VA 20108，United States ofAmerica)，欧洲酿酒酵母功能分析档案馆(EUROpean Saccharomyces Cerevisiae ARchivefor Functional Analysis)(EUROSCARF，地址：Institute for Molecular Biosciences,Johann Wolfgang Goethe-University Frankfurt,Max-von-Laue Str.9；Building N250,D-60438Frankfurt,Germany)，国家酵母菌保藏中心(NCYC，地址：Institute of FoodResearch,Norwich Research Park,Norwich,NR4 7UA,UK)，或对应保藏菌株的保藏机构获得。也就是说，例如在ATCC菌株的情况下，将登录号分配给相应菌株，并且可以通过使用这些登录号来购买菌株(参见http://www.atcc.org/)。美国典型培养物保藏中心(ATCC)的目录中列出了菌株的登录号。

本发明的酵母可以是固有具有目标物质生产能力的酵母，或者可以是修饰成具有目标物质生产能力的酵母。可以通过赋予如上所述的酵母以目标物质生产能力，或者通过提高如上所述的酵母的目标物质生产能力来获得具有目标物质生产能力的酵母。

以下，具体例示赋予或提高目标物质生产能力的方法。用于赋予或增强目标物质生产能力的所有修饰可以独立使用或以任何适当的组合使用。用于构建本发明的酵母的修饰可以以任意顺序进行

可以以使参与目标物质生产的一种或多种蛋白质的表达和/或活性增加或降低的方式对酵母进行修饰来赋予或增强目标物质生产能力。也就是说，可以以使参与目标物质生产的一种或多种蛋白质的表达和/或活性增加或降低的方式对本发明的酵母进行修饰。术语“蛋白质”也包括所谓的肽例如多肽。参与目标物质生产的蛋白质的实例包括催化目标物质合成的酶(也称为“目标物质的生物合成酶”)，催化从目标物质的生物合成途径分支的反应以生成除目标物质之外的化合物的酶(也称为“副产物的生物合成酶”)，催化目标物质的降解的酶(也称为“目标物质的降解酶”)，以及影响例如增加或降低酶例如上述那些酶的活性的蛋白质。

可以适当地选择要增加或降低表达和/或活性的蛋白质，其取决于目标物质的类型以及参与目标物质生产且本发明的酵母固有保持的蛋白质的类型和活性。例如，可以优选增加选自目标物质的生物合成酶的一种或多种蛋白质的表达和/或活性。另外，例如，可以优选降低选自副产品的生物合成酶和目标物质的降解酶的一种或多种蛋白质的表达和/或活性。

将在下文中描述用于增加或降低蛋白质的表达和/或活性的方法。可以通过例如增加编码蛋白质的基因的表达来增加蛋白质的活性。可以通过例如弱化编码蛋白质的基因的表达或破坏编码蛋白质的基因来降低蛋白质的活性。基因的表达也称为“蛋白质的表达(即由基因编码的蛋白质)”。此类增加或降低蛋白质的表达和/或活性的方法是本领域中公知的。

参与目标物质生产的蛋白质的具体实例包括由以下基因编码的蛋白质：LCB1,LCB2,TSC10,SUR2,LCB4,LCB5,ELO3,CKA2,ORM2和CHA1基因。这些基因可以总地称为“靶基因”，而由其编码的蛋白质可以总地称为“靶蛋白质”。

本发明的酵母至少以使由LCB4和CKA2基因编码的蛋白质的表达和/或活性降低的方式进行了修饰。表述“由LCB4和CKA2基因编码的蛋白质的活性降低”可以特别是表示LCB4基因和/或CKA2基因的表达弱化，或LCB4基因和/或CKA2基因被破坏。由LCB4和CKA2基因编码的蛋白质的表达和/或活性降低导致目标物质生产能力的增加，并从而导致目标物质的生产增加。可以以使LCB4和CKA2基因编码的蛋白质的表达和/或活性降低的方式对具有目标物质生产能力的酵母进行修饰获得本发明的酵母。也可以以使LCB4和CKA2基因编码的蛋白质的表达和/或活性降低的方式对酵母进行修饰，然后赋予或提高目标物质生产能力来获得本发明的酵母。本发明的酵母也可以是通过使LCB4和CKA2基因编码的蛋白质的表达和/或活性降低的方式进行修饰获得了目标物质生产能力的酵母。

可以以使选自由LCB1、LCB2、TSC10和SUR2基因编码的蛋白质的一种或多种蛋白质的表达和/或活性增加的方式，和/或使选自由LCB5、ELO3、ORM2和CHA1基因编码的蛋白质的一种或多种蛋白质的表达和/或活性降低的方式修饰本发明的酵母。表述“选自由LCB1、LCB2、TSC10和SUR2基因编码的蛋白质的一种或多种蛋白质的表达和/或活性增加”可以特别是表示选自LCB1、LCB2、TSC10和SUR2基因的一种或多种基因的表达增加。表述“选自由LCB5、ELO3、ORM2和CHA1基因编码的蛋白质的一种或多种蛋白质的表达和/或活性降低”可以特别是表示选自LCB5、ELO3、ORM2和CHA1基因的一种或多种基因的表达弱化，或选自LCB5、ELO3、ORM2和CHA1基因的一种或多种基因被破坏。

LCB1和LCB2基因编码丝氨酸棕榈酰基转移酶。术语“丝氨酸棕榈酰基转移酶”指具有催化从丝氨酸和棕榈酰基-CoA合成3-酮二氢神经鞘氨醇的活性(EC 2.3.1.50)的蛋白质。该活性可以称为“丝氨酸棕榈酰基转移酶活性”。由LCB1和LCB2基因编码的蛋白质分别可以称为“Lcb1p”和“Lcb2p”。LCB1和LCB2基因的实例包括酵母例如酿酒酵母和Pichiaciferrii的那些。酿酒酵母S288C的LCB1和LCB2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和3所示，且由其编码的Lcb1p和Lcb2p的氨基酸序列如SEQ ID NO:2和4所示。Lcb1p和Lcb2p可以形成异二聚体以作为丝氨酸棕榈酰基转移酶发挥功能(Plant Cell.2006 Dec；18(12):3576-93.)。可以增加Lcb1p和Lcb2p之一或两者的活性。Lcb1p和Lcb2p之一或两者的活性增加可以特别是表示丝氨酸棕榈酰基转移酶活性增加。可以通过例如已知方法测量棕榈酰基转移酶活性(J Biol Chem.2000Mar 17；275(11):7597-603.)。

TSC10基因编码3-脱氢二氢神经鞘氨醇还原酶。术语“3-脱氢二氢神经鞘氨醇还原酶”指在存在电子供体例如NADPH的情况下具有催化3-酮二氢神经鞘氨醇转化为二氢鞘氨醇(二氢神经鞘氨醇)的活性(EC 1.1.1.102)的蛋白质。该活性可以称为“3-脱氢二氢神经鞘氨醇还原酶活性”。由TSC10基因编码的蛋白质可以称为“Tsc10p”。TSC10基因的实例包括酵母例如酿酒酵母和Pichia ciferrii的那些。酿酒酵母S288C的TSC10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，且由其编码的Tsc10p的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。可以增加Tsc10p的活性。Tsc10p的活性增加可以特别是表示3-脱氢二氢神经鞘氨醇还原酶活性增加。可以通过例如已知方法测量3-脱氢二氢神经鞘氨醇还原酶活性(Biochim BiophysActa.2006Jan；1761(1):52-63.)。

SUR2(SYR2)基因编码鞘氨醇羟化酶。术语“鞘氨醇羟化酶”是指具有催化鞘氨醇碱的羟基化或神经酰胺的鞘氨醇碱部分的羟基化的活性(EC1.-.-.-)的蛋白质。该活性可以称为“鞘氨醇羟化酶活性”。鞘氨醇羟化酶可以催化例如二氢鞘氨醇(DHS；二氢神经鞘氨醇)羟基化以形成植物鞘氨醇(PHS)，或含有DHS的神经酰胺(二氢神经酰胺)的羟基化以形成含有PHS的神经酰胺(植物神经酰胺)。由SUR2基因编码的蛋白质可以称为“Sur2p”。SUR2基因的实例包括酵母例如酿酒酵母和Pichia ciferrii的那些。酿酒酵母S288C的SUR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，且由其编码的Sur2p的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。Pichia ciferrii的SUR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，且由其编码的Sur2p的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。在例如生产PHS的情况下可以增加Sur2p的活性。Sur2p的活性增加可以特别是表示鞘氨醇羟化酶的活性增加。可以通过例如将酶与DHS或二氢神经酰胺孵育并测定PHS或植物神经酰胺的酶依赖生产来测量鞘氨醇羟化酶活性。

LCB4和LCB5基因编码鞘氨醇碱激酶。术语“鞘氨醇碱激酶”指具有催化鞘氨醇碱的磷酸化以形成鞘氨醇碱磷酸的活性(EC 2.7.1.91)的蛋白质。该活性可以称为“鞘氨醇碱激酶活性”。由LCB4和LCB5基因编码的蛋白质可以分别称为“Lcb4p”和“Lcb5p”。酿酒酵母S288C的LCB4和LCB5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和11所示，且由其编码的Lcb4p和Lcb5p的氨基酸序列如SEQ ID NO:10和12所示。在这些中，Lcb4p是酿酒酵母中的主要鞘氨醇碱激酶(J Biol Chem.2003Feb 28；278(9):7325-34.)。可以降低至少Lcb4p的活性。也可以降低Lcb5p的活性。Lcb4p和Lcb5p之一或两者的活性降低可以特别是表示鞘氨醇碱激酶活性降低。可以通过例如已知的方法测量鞘氨醇碱激酶活性(Plant Physiol.2005Feb；137(2):724-37.)。

ELO3基因编码脂肪酸延长酶III。术语“脂肪酸延长酶III”是指具有催化C18-CoA的延长以形成C20-C26-CoA的活性(EC 2.3.1.199)的蛋白质。该活性可以称为“脂肪酸延长酶III活性”。C26-CoA可以优选用于由神经酰胺合酶催化的神经酰胺的合成。由ELO3基因编码的蛋白质可以称为“Elo3p”。酿酒酵母S288C的ELO3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，且由其编码的Elo3p的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。可以降低Elo3p的活性。Elo3p的活性降低可以特别是表示脂肪酸延长酶III活性降低。可以通过例如已知的方法测量脂肪酸延长酶III活性(J Biol Chem.1997Jul 11；272(28):17376-84.)。

CKA2基因编码酪蛋白激酶2的α’亚基。术语“酪蛋白激酶2”是指具有催化蛋白质的丝氨酸/苏氨酸选择性磷酸化的活性(EC 2.7.11.1)的蛋白质。该活性可以称为“酪蛋白激酶2活性”。由CKA2基因编码的蛋白质可以称为“Cka2p”。酿酒酵母S288C的CKA2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，且由其编码的Cka2p的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。Cka2p可以与CKA1、CKB1和CKB2基因产物即Cka1p、Ckb1p和Ckb2p组合形成异四聚体，以作为酪蛋白激酶2发挥功能。Cka2p对于神经酰胺合酶的完全活化可以是需要的(EukaryotCell.2003Apr；2(2):284-94.)。可以降低Cka2p的活性。Cka2p的活性降低可以特别是表示酪蛋白激酶2的活性降低。另外，Cka2p的活性降低可以特别是表示神经酰胺合酶活性降低。可以通过例如已知的方法测量酪蛋白激酶2活性(Gene.1997Jun 19；192(2):245-50.)。

ORM2基因编码调节丝氨酸棕榈酰基转移酶活性的膜蛋白。由ORM2基因编码的蛋白质可以称为“Orm2p”。酿酒酵母S288C的ORM2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，且由其编码的Orm2p的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。可以降低Orm2p的活性。Orm2p的活性降低可以特别是表示丝氨酸棕榈酰基转移酶活性增加。

CHA1基因编码L-丝氨酸/L-苏氨酸脱氨酶。术语“L-丝氨酸/L-苏氨酸脱氨酶”是指具有催化L-丝氨酸和L-苏氨酸的降解反应的活性(EC 4.3.1.17和EC 4.3.1.19)的蛋白质。该活性可以称为“L-丝氨酸/L-苏氨酸脱氨酶活性”。由CHA1基因编码的蛋白质可以称为“Cha1p”。酿酒酵母S288C的CHA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，且由其编码的Cha1p的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。可以降低Cha1p的活性。Cha1p的活性降低可以特别是表示L-丝氨酸/L-苏氨酸脱氨酶活性降低。可以通过例如已知的方法测量L-丝氨酸/L-苏氨酸脱氨酶活性(Eur J Biochem.1982Apr；123(3):571-6.)。

靶基因和蛋白质即LCB1、LCB2、TSC10、SUR2、LCB4,LCB5,ELO3,CKA2,ORM2,和CHA1基因以及由其编码的蛋白质可以具有上述核苷酸和氨基酸序列。表述“基因或蛋白质具有核苷酸或氨基酸序列”包含了其中基因或蛋白质包含核苷酸或氨基酸序列的情况以及其中基因或蛋白质由核苷酸或氨基酸序列组成的情况。

靶基因可以是上述例示的相应基因的变体，只要保持其原始功能。相似的，靶蛋白质可以是上述例示的相应蛋白质的变体，只要保持其原始功能。此类保持其原始功能的变体也可以称为“保守变体”。除上述例示的相应基因外，术语“LCB1”,“LCB2”,“TSC10”,“SUR2”，“LCB4”,“LCB5”,“ELO3”,“CKA2”,“ORM2”,和“CHA1”基因包括其保守变体。相似的，除上述例示的相应蛋白质外，术语“Lcb1p”,“Lcb2p”,“Tsc10p”,“Sur2p”,“Lcb4p”,“Lcb5p”,“Elo3p”,“Cka2p”,“Orm2p”,和“Cha1p”包括其保守变体。也就是说，例如术语“LCB1基因”包括上述例示的LCB1基因例如酿酒酵母的LCB1基因，且还包括其变体。相似的，例如术语“Lcb1蛋白”包括上述例示的Lcb1蛋白例如由酿酒酵母的LCB1基因编码的蛋白质，且还包括其变体。保守变体的实例包括例如对上述例示的靶基因和蛋白质的同系物和人工修饰形式。生成基因或蛋白质的变体的方法是本领域中公知的。

表述“保持原始功能”表示基因或蛋白质的变体具有对应于原始基因或蛋白质的功能(例如活性或性质)的功能(例如活性或性质)。关于基因的表述“保持原始功能”表示基因的变体编码维持原始功能的蛋白质。关于蛋白质的表述“维持原始功能”表示蛋白质的变体具有对应的功能例如以上例示的活性或性质。也就是说，关于靶蛋白质的表述“维持原始功能”可以表示对于Lcb1p和Lcb2p变体蛋白质具有丝氨酸棕榈酰基转移酶活性；对于Tsc10变体蛋白质具有3-脱氢二氢神经鞘氨醇还原酶活性；对于Sur2p变体蛋白质具有鞘氨醇羟化酶活性；对于Lcb4p和Lcb5p变体蛋白质具有鞘氨醇碱激酶活性；对于Elo3p变体蛋白质具有脂肪酸延长酶III活性；对于Cka2p变体蛋白质具有酪蛋白激酶2活性；对于Orm2p变体蛋白质具有调节丝氨酸棕榈酰基转移酶活性的性质；和对于Cha1p变体蛋白质具有L-丝氨酸/L-苏氨酸脱氨酶活性。另外，关于Cka2p的表述“保持原始功能”也可以表示蛋白质的变体具有以下性质，即其活性降低导致神经酰胺合酶活性降低。另外，关于Orm2p的表述“保持原始功能”也可以表示蛋白质的变体具有以下性质，即其活性降低导致丝氨酸棕榈酰转移酶活性增加。在靶蛋白质作为由多个亚基组成的复合物发挥功能的情况下，关于靶蛋白质的表述“维持原始功能”也可以表示蛋白质变体与其它适合的亚组组合展现出对应的功能例如以上例示的活性和性质。也就是说，例如关于Lcb1p的表述“维持原始功能”也可以表示变体蛋白质与适合的Lcb2p组合具有丝氨酸棕榈酰基转移酶活性，而关于Lcb2p的表述“维持原始功能”也可以表示变体蛋白质与适合的Lcb1p组合具有丝氨酸棕榈酰基转移酶活性。

此后，将例示保守变体。

可以从公共数据库容易地获得以上例示的基因的同系物或以上例示的蛋白质的同系物，其例如通过使用以上例示的任何基因的核苷酸序列或以上例示的任何蛋白质的氨基酸序列作为查询序列的BLAST搜索或FASTA搜索。此外，以上例示的基因的同系物例如可以通过以下获得：使用生物体例如酵母的染色体作为模板，和基于以上例示的任何基因的核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物的PCR。

靶基因可以各自是编码蛋白质的基因，所述蛋白质具有任何上述氨基酸序列但包括一个或几个位置处的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，只要保持初始功能即可。例如，可以延长或缩短编码的蛋白质的N端和/或C末端。尽管上文使用的术语“一个或几个”所指的数字可以根据蛋白质的三维结构中的氨基酸残基的位置或氨基酸残基的类型而不同，具体地，例如其是1至50、1至40或1至30，优选1至20、更优选1至10、还更优选1至5、特别优选1至3。

一个或几个氨基酸残基的上述取代，缺失，插入或添加是保持蛋白质正常功能的保守突变。保守突变的典型例子是保守取代。保守取代是以下突变，其中如果取代位点是芳香族氨基酸，取代在Phe,Trp,和Tyr之间相互发生；如果其是疏水性氨基酸，取代发生在Leu,Ile,和Val之间；如果其是极性氨基酸，取代发生在Gln和Asn之间；如果其是碱性氨基酸，发生在Lys,Arg,和His之间；如果其是酸性氨基酸，发生在Asp和Glu之间；以及如果其是具有羟基的氨基酸，取代发生在Ser和Thr之间。认为是保守取代的取代的实例特别包括用Ser或Thr取代Ala、用Gln，His或Lys取代Arg、用Glu，Gln，Lys，His或Asp取代Asn、用Asn，Glu或Gln取代Asp、用Ser或Ala取代Cys、用Asn，Glu，Lys，His，Asp或Arg取代Gln、用Gly，Asn，Gln，Lys或Asp取代Glu、用Pro取代Gly、用Asn，Lys，Gln，Arg或Tyr取代His、用Leu，Met，Val或Phe取代Ile、用Ile，Met，Val或Phe取代Leu、用Asn，Glu，Gln，His或Arg取代Lys、用Ile，Leu，Val或Phe取代Met、用Trp，Tyr，Met，Ile或Leu取代Phe、用Thr或Ala取代Ser、用Ser或Ala取代Thr、用Phe或Tyr取代Trp、用His，Phe或Trp取代Tyr，以及用Met,Ile,或Leu取代Val。此外，上述此类氨基酸残基取代，缺失，插入或添加包括由于个体差异，或基因来源于的细菌的物种差异所带来的天然存在的突变(突变体或变体)。

此外，靶基因各自可以是编码蛋白质的基因，所述蛋白质与上述任何总氨基酸序列显示80％或更高，优选90％或更高，更优选95％或更高，还更优选97％或更高，特别优选99％或更高的同源性，只要维持原始功能即可。另外在本说明书中，“同源性”表示“同一性”。

此外，靶基因各自可以是在严格条件下与可由任何前述核苷酸序列制备的探针，例如与任何上述核苷酸序列的整个序列或部分序列互补的序列杂交的DNA，只要保持初始功能。术语“严格条件”指形成所谓的特异性杂交物，并且不形成非特异性杂交物的条件。严格条件的例子包括那些在该条件下高度同源的DNA彼此杂交，例如不低于80％同源，优选不低于90％同源，更优选不低于95％同源，进一步更优选不低于97％同源，特别优选不低于99％同源的DNA，彼此杂交，并且低于上述同源的DNA彼此不杂交的条件，或者典型的Southern杂交的洗涤条件，即，在对应于1x SSC,0.1％SDS在60℃，优选0.1x SSC,0.1％SDS在60℃，更优选0.1x SSC,0.1％SDS在68℃的盐浓度和温度下洗涤一次，优选两次或三次的条件。

用于上述杂交的探针可以是与上述基因互补的序列的一部分。此类探针可以通过使用基于已知基因的序列制备的寡核苷酸作为引物，和含有核苷酸序列的DNA片段作为模板的PCR来制备。作为探针，例如可以使用具有约300bp的长度的DNA片段。当具有约300bp的长度的DNA片段用作探针时，具体的杂交的洗涤条件例如可以是50℃,2x SSC和0.1％SDS。

此外，靶基因各自可以是具有任意上述核苷酸序列的基因，其中任意密码子被替换为等同密码子。例如，靶基因各自可以是根据要使用的宿主中的密码子频率，修饰成具有最优密码子的基因。

两个序列之间的序列同一性的百分比例如可以通过使用数学算法来确定。此类数学算法的非限制性例子包括Myers and Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法，Smith etal(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法，Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的同源性比对算法，Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的搜索同源性方法，以及Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264的修改版本的算法，如描述于Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877。

通过使用基于此类数学算法的程序，可以进行用于确定序列同一性的序列比较(即比对)。该程序可以由计算机适当执行。此类程序的例子包括但不限于PC/Gene程序的CLUSTAL(可从Intelligenetics获得,Mountain View,Calif.),ALIGN程序(版本2.0),以及Wisconsin遗传学软件包版本8的GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA和TFASTA(可从GeneticsComputer Group获得(GCG),575Science Drive,Madison,Wis.,USA)。可以例如通过使用初始参数进行使用这些程序的比对。CLUSTAL程序很好地描述于Higgins et al.(1988)Gene73:237-244(1988),Higgins et al.(1989)CABIOS 5:151-153,Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90,Huang et al.(1992)CABIOS 8:155-65,和Pearson etal.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331。

为了获得与目标核苷酸序列同源的核苷酸序列，特别地，例如，可以通过使用得分为100且字长为12的BLASTN程序来执行BLAST核苷酸搜索。为了获得与目标蛋白同源的氨基酸序列，特别地，例如，可以通过使用得分为50且字长为3的BLASTX程序来执行BLAST蛋白搜索。参见对于BLAST核苷酸搜索和BLAST蛋白质搜索的http://www.ncbi.nlm.nih.gov。此外，可以使用缺口BLAST(Gapped BLAST)(BLAST 2.0)以获得包括缺口的比对用于比较的目的。此外，可以使用PSI-BLAST以进行对检测量序列间远端关系的重复搜索。对于缺口BLAST和PSI-BLAST，参见Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389。当使用BLAST，缺口BLAST，或PSI-BLAST时，可以使用每个程序(例如用于核苷酸序列的BLASTN，和用于氨基酸序列的BLSATX)的初始参数。也可以手工进行比对。

当比对两个序列以便最大地彼此符合时，两个序列之间的序列同一性计算为两个序列中匹配的残基比例。

<1-2>增加蛋白质活性的方法

以下，说明增加蛋白质的活性的方法。

表述“蛋白质的活性增加”表示与未修饰的菌株相比，每细胞的蛋白质的活性增加。术语“未修饰的菌株”可以指没有以增加目标蛋白的活性的方式进行修饰的参照菌株。未修饰的菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。“蛋白质的活性增加”的状态也可以表示为“蛋白质的活性升高”。特别地，表述“蛋白质的活性增加”表示相比于未修饰的菌株，每细胞的蛋白质的数量增加，和/或蛋白质的每个分子的功能增加。也就是说，表述“蛋白质的活性增加”中的术语“活性”不限于蛋白质的催化活性，而是也可以指编码蛋白质的基因的转录量(即，mRNA的量)，或蛋白质的翻译量(即蛋白质的量)。尽管蛋白质的活性增加的程度没有特别限制，只要与未修饰的菌株相比蛋白质的活性增加即可，与未修饰的菌株相比蛋白质的活性可以增加1.5或更多、2倍或更多、或3倍或更多。此外，“蛋白质的活性增加”的状态不仅包括目标蛋白质的活性在固有具有目标蛋白质的活性的菌株中增加的状态，而且还包括在对不固有地具有目标蛋白质活性的菌株赋予目标蛋白质的活性的状态。此外，只要蛋白质的活性最终增加，可以减弱和/或消除宿主中固有地含有的目标蛋白质的活性，然后可以对宿主引入适当类型的目标蛋白质。

用于增加蛋白质活性的修饰通过例如增加编码蛋白质的基因的表达来实现。表述“基因表达增加”是指与未修饰的菌株如野生型菌株和亲本菌株相比，每细胞的基因的表达量增加。表述“基因表达增加”特别可以表示基因的转录量(即mRNA的量)增加，和/或基因的翻译量(即从基因表达的蛋白质的量)增加。“基因的表达增加”的状态也可以称为“基因的表达增强”。与未修饰的菌株中观察到的基因表达相比，基因的表达可以增加1.5倍或更多、2倍或更多、或3倍或更多。此外，“基因表达增加”的状态不仅包括在固有地表达目标基因的菌株中目标基因的表达量增加的状态，而且还包括将基因导入到不固有地表达目标基因的菌株中并且在其中表达的状态。也就是说，措辞“基因的表达增加”也可以意味着例如将目标基因导入不具有该基因的菌株中，并且在其中表达。

可以通过例如增加基因的拷贝数来增加基因的表达。

可以通过将基因导入宿主的染色体增加基因的拷贝数。可以通过例如使用同源重组(Miller,J.H.,Experiments in Molecular Genetics,1972,Cold Spring HarborLaboratory)将基因导入染色体中。可以导入仅一个拷贝，或两个或更多个拷贝的基因。例如通过使用在染色体上以多个拷贝存在的序列作为靶标进行同源重组，可以将基因的多个拷贝引入染色体中。此类在染色体上以多个拷贝存在的序列的实例包括由特定的短重复序列组成的自主复制序列(APS)，和在染色体上以约150个拷贝存在的rDNA序列。WO 95/32289公开了其中通过使用同源重组在酵母中进行基因重组的实例。另外，可以通过例如将基因整合到转座子中并将转座子转移到染色体上来将基因引入染色体。

可以使用具有与基因的全部或一部分互补的序列的探针通过Southern杂交，使用基于该基因序列制备的引物进行PCR等确认目标基因整合到染色体中。

此外，还可以通过将包括基因的载体引入宿主中来增加目标基因的拷贝数。例如，可以通过将含有目标基因的DNA片段与在宿主中发挥功能的载体连接来构建基因的表达载体，并用表达载体转化宿主来增加目标基因的拷贝数。包括目标基因的DNA片段可以通过例如使用具有目标基因的微生物的基因组DNA作为模板的PCR获得。作为载体，可以使用在宿主细胞中自主复制的载体。载体可以是单拷贝载体或者可以是多拷贝载体。此外，载体优选包括用于选择转化体的标志物。标志物的实例包括生物素抗性基因例如KanMX,NatMX(nat1),和HygMX(hph)基因，和补充营养缺陷型的基因例如LEU2,HIS3,和URA3基因。在酵母中自主复制的载体的实例包括具有CEN4复制起点的质粒和具有2μm DNA复制起点的质粒。在酵母中自主复制的载体的具体实例包括pAUR123(TAKARA BIO)和pYES2(Invitrogen)。

当引入基因时，该基因被本发明的酵母以可表达方式保持是足够的。具体地说，引入基因使得它在本发明的酵母中发挥功能的启动子序列的控制之下表达是足够的。启动子序列可以是源自宿主的启动子，或异源启动子。启动子可以是待引入的基因的天然启动子或另一基因的启动子。作为启动子，例如还可以使用如下文所述的更强的启动子。

终止子可以位于基因的下游。终止子没有特别限制，只要选择在本发明的酵母中发挥功能的终止子即可。终止子可以是源自宿主的终止子，或异源终止子。终止子可以是待引入的基因的天然终止子，或另一基因的终止子。在本发明的酵母中发挥功能的终止子的具体实例包括CYC1,ADH1,ADH2,ENO2,PGI1,和TDH1终止子。

可用于各种微生物的载体、启动子和终止子详细公开于"FundamentalMicrobiology Vol.8,Genetic Engineering,KYORITSU SHUPPAN CO.,LTD,1987"中，并且可以使用那些。

此外，当引入两个或更多个基因时，基因各自被本发明的酵母以可表达方式保持是足够的。例如，所有基因可以由单个表达载体或染色体携带。或者，基因可以由两个或更多个表达载体分开携带，或者由单个或两个或更多个表达载体和染色体分开携带。还可以引入由两个或更多个基因构成的操纵子。

要引入的基因没有特别限制，只要其编码在宿主中发挥功能的蛋白质即可。要引入的基因可以是源自宿主的基因，或者可以是异源基因。可以通过例如使用基于该基因的核苷酸序列设计的引物，并且使用具有该基因的生物体的基因组DNA，或携带该基因的质粒作为模板的PCR来获得要引入的基因。要引入的基因也可以例如基于该基因的核苷酸序列而完全合成(Gene,60(1),115-127(1987))。所获得的基因可以原样使用，或根据需要进行修饰后使用。

此外，通过改善基因的转录效率可以增加基因的表达。另外，还可以通过改善基因的翻译效率来增加基因的表达。基因的转录效率和基因的翻译效率可以通过例如修饰基因的表达调控序列来改善。术语“表达控制序列”总地指影响基因表达的位点，例如启动子。可以通过使用启动子搜索载体或基因分析软件如GENETYX鉴定表达控制序列。

可以通过用更强的启动子置换染色体上的基因的启动子来改善基因的转录效率。“更强的启动子”表示与固有存在的基因的野生型启动子相比提供基因的转录改善的启动子。在酵母中可用的更强的启动子的实例包括PGK1,PGK2,PDC1,TDH3,TEF1,TEF2,TPI1,HXT7,ADH1,GPD1,和KEX2启动子。此外，作为更强的启动子，可以通过使用各种报告基因获得现有启动子的高活性类型。

基因的翻译效率也可以通过例如修饰密码子来改善。例如，在基因的异源表达等情况下，通过用更经常使用的同义密码子替换基因中存在的稀有密码子，可以提高基因的翻译效率。也就是说，可以修饰要引入的基因，例如，以便根据在待使用的宿主中观察到的密码子的频率包括最优密码子。可以通过例如位点特异性突变方法将目标突变引入DNA的目标位点来替换密码子。或者，可以完全合成其中目标密码子被替换的基因片段。“密码子选择数据库(Codon Usage Database)”(http://www.kazusa.or.jp/codon；Nakamura,Y.etal,Nucl.Acids Res.,28,292(2000))中公开了各种生物体中的密码子的频率。

此外，还可以通过扩增增加基因表达的调节子，或者缺失或弱化降低基因表达的调节子来增加基因的表达。

如上文提及的用于增加基因表达的此类方法可以独立使用或以任意组合使用。

此外，增加酶活性的修饰也可以通过例如提高酶的比活性来实现。可以通过例如搜索多种生物体来获得显示出提高的比活性的酶。此外，可以通过在现有的酶中引入突变来获得高活性型的现有酶。可以独立地使用比活性的增强，或者可以与如上文所述的用于增强基因表达的此类方法以任意组合使用。

转化的方法没有特别限定，并且可以使用常规用于酵母的转化的方法。此类方法的实例包括原生质体方法，KU方法(H.Ito et al.,J.Bateriol.,153-163(1983))，KUR方法(Fermentation and industry,vol.43,p.630-637(1985))，电穿孔方法(Luis et al.,FEMS Micro biology Letters 165(1998)335-340)，和使用载体DNA的方法(GietzR.D.and Schiestl R.H.,Methods Mol.Cell.Biol.5:255-269(1995))。用于操纵酵母的方法例如用于孢子形成的方法和用于分离单倍体酵母的方法公开于Chemistry andBiology,Experimental Line 31,Experimental Techniques for Yeast,1^st Edition,Hirokawa-Shoten；Bio-Manual Series 10,Genetic Experimental Methods for Yeast,1^st Edition,Yodosha；等等。

可以通过测量蛋白质的活性来确认蛋白质的活性的增加。

也可以通过确认编码蛋白质的基因的表达增加来确认蛋白质的活性的增加。可以通过确认基因的转录量的增加或通过确认从该基因表达的蛋白质的量的增加来确认基因表达的增加。

可以通过比较从基因转录的mRNA的量与未修饰的菌株如野生型菌株或亲本菌株中观察到的量来确认基因的转录量增加。用于评估mRNA量的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR等(Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning A Laboratory Manual/ThirdEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。mRNA的量可以增加到例如未修饰的菌株的mRNA量的1.5倍或更多、2倍或更多、或3倍或更多。

通过使用抗体的Western印迹法(Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)可以确认蛋白质量的增加。蛋白质的量可以增加到例如未修饰的菌株的蛋白质量的1.5倍或更多、2倍或更多、或3倍或更多。

<1-3>降低蛋白质活性的方法

以下，将说明降低蛋白质活性的方法。

表述“蛋白质的活性降低”是指与未修饰的菌株相比，每细胞的蛋白质的活性降低。术语“未修饰的菌株”可以指未被修饰以使得目标蛋白的活性降低的参照菌株。未修饰的菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。“蛋白质的活性降低”的状态也包括蛋白质的活性完全消失的状态。具体地，表述“蛋白质的活性降低”意味着与未修饰的菌株相比，每细胞的蛋白质的分子数目减少，和/或蛋白质的每个分子的功能降低。也就是说，表述“蛋白质的活性降低”中的术语“活性”不限于蛋白质的催化活性，而是也可以指编码蛋白质的基因的转录量(即mRNA的量)或蛋白质的翻译量(即蛋白质的量)。“每细胞的蛋白质分子的数目减少”的状态也包括蛋白质完全不存在的状态。“蛋白质的每个分子的功能降低”的状态也包括每个蛋白质分子的功能完全消失的状态。尽管蛋白质活性降低的程度没有特别限制，只要与未修饰的菌株相比活性降低即可，其可以降低至未修饰的菌株的活性的例如50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少或0％。

用于降低蛋白质活性的修饰可以通过例如降低编码蛋白质的基因的表达来实现。表述“基因表达降低”是指与未修饰的菌株如野生型菌株和亲本菌株相比，每细胞的基因的表达降低。表述“基因表达降低”可以特别是表示基因的转录量(即mRNA的量)降低，和/或基因的翻译量(即从基因表达的蛋白质的量)降低。“基因表达降低”的状态也包括基因完全不表达的状态。“基因表达降低”的状态也称为“基因的表达减弱”。基因的表达可以降低至未修饰的菌株的50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少或0％。

基因表达的降低可以是由于例如转录效率的降低、翻译效率的降低或它们的组合。通过修饰基因的表达控制序列例如启动子可以减少基因的表达。当修饰表达控制序列时，优选修饰表达控制序列的一个或多个核苷酸，更优选两个或更多个核苷酸，特别优选三个或更多个核苷酸。此外，可以缺失表达控制序列的部分或全部。基因的表达也可以通过例如操纵负责表达控制的因子来降低。负责表达控制的因子的实例包括负责转录或翻译控制的低分子(诱导物、抑制物等)、负责转录或翻译控制的蛋白质(转录因子等)、负责转录或翻译控制的核酸(siRNA等等)，等等。此外，还可以通过例如将降低基因表达的突变引入基因的编码区中来降低基因的表达。例如，可以通过用宿主中较不常使用的同义密码子替换基因的编码区中的密码子来减少基因的表达。此外，例如，如下所述基因表达可以由于基因的破坏而降低。

用于降低蛋白质活性的修饰也可以通过例如破坏编码蛋白质的基因来实现。表述“基因被破坏”意味着基因被修饰而不产生能够正常发挥功能的蛋白质。表述“不产生能够正常发挥功能的蛋白质”包括其中蛋白质完全不从基因表达的情况，以及其中从基因表达其功能(如活性或性质)降低或完全消除的蛋白质的情况。

可以通过例如缺失染色体上的基因的编码区的一部分或全部来实现基因的破坏。此外，可以缺失整个基因，包括染色体上的基因上游和下游的序列。要缺失的区域可以是任何区域，诸如N端区域、内部区域或C端区域，只要能降低蛋白质的活性即可。较长的区域的缺失通常可以更可靠地使基因失活。此外，优选的是要缺失的区域的上游和下游的序列的阅读框是不同的。

也可以通过例如对染色体上基因的编码区引入氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)、一个或两个核苷酸残基的添加或缺失的移码突变等等的突变获得基因的破坏(Journal of Biological Chemistry,272:8611-8617(1997)；Proceedings of theNational Academy of Sciences,USA,95 5511-5515(1998)；Journal of BiologicalChemistry,26 116,20833-20839(1991))。

也可以通过例如将另一个序列插入到染色体上的基因的编码区中来实现基因的破坏。插入位点可以位于该基因的任何区域中，并且较长区域的插入通常可以更可靠地使基因失活。优选的是插入位点上游和下游的序列的阅读框是不同的。另一序列没有特别限定，只要选择减少或消除编码蛋白质的活性的序列即可，并且其实例包括例如标志物基因，如抗生素抗性基因，以及对于目标物质的生产有用的基因。

如上所述的染色体上基因的此类修饰可以通过例如使用重组DNA获得。用于同源重组的重组DNA的结构没有特别限定，只要其以想要的方式引起同源重组即可。例如，可以使用包含任意序列例如缺陷型基因或任意适合的插入序列的线性DNA转化宿主，所述任意序列侧翼有染色体上的同源重组靶区的上游和下游序列，使得可以在靶区的上游和下游侧发生同源重组，从而用所述任意序列置换靶区。特别地，如上文所述的对染色体上的基因的此列修饰可以通过如下获得，例如制备缺陷型基因，该缺陷型基因修饰为使得其不能产生能够正常发挥功能的蛋白质，并使用包括缺陷性基因的重组DNA转化宿主以引起所述缺陷型基因和染色体上的野生型基因之间的同源重组，从而用缺陷型基因取代染色体上的野生型基因。在该方法中，如果根据宿主的特征如营养缺陷型选择的标志物基因被包括在重组DNA中，则操作变得容易。缺陷型基因的实例包括缺失了基因的部分或全部的基因、引入错义突变的基因、引入了插入序列如转座子或标志物基因的基因、引入无义突变的基因，和引入移码突变的基因。由缺陷型基因编码的蛋白质即便产生也具有与野生型蛋白质不同的构象，从而其功能降低或消除。

降低蛋白质活性的修饰也可以通过例如诱变处理来实现。诱变处理的实例包括常规诱变处理例如X射线或紫外线的照射和用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)等突变剂进行处理。

可以通过测量蛋白质的活性来确认蛋白质活性的降低。

可以通过确认基因的转录量降低或从基因表达的蛋白质的量的降低来确认基因的表达降低。

可以通过比较从基因转录的mRNA量与未修饰的菌株中观察到的mRNA量来确认基因的转录量的降低。用于评估mRNA量的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR等(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。mRNA的量优选降低至未修饰的菌株中观察到的量的例如50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少或0％。

可以通过使用抗体的Western印迹法(Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor(USA)2001)来确认蛋白质量的降低。蛋白质的量优选降低至未修饰的菌株的例如50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。

根据用于破坏的方式，可以通过确定基因的部分或全部的核苷酸序列、基因的限制酶图谱、全长等来确认基因的破坏。

<2>本发明的生产目标物质的方法

本发明的方法是用于生产目标物质的方法，包括在培养基中培养本发明的酵母，和从酵母的细胞和/或培养基收集目标物质。在本发明的方法中，可以生产单一种类的目标物质，或者可以生产两种或多种目标物质。

使用的培养基没有特别限制，只要本发明的酵母在其中能够增殖，且能够生产目标物质即可。作为培养基，例如可以使用用于培养酵母的常规培养基。此类培养基的实例包括SD培养基，SG培养基，SDTE培养基，和YPD培养基。培养基可以含有碳源、氮源、磷源和硫源，以及根据需要选自其它各种有机成分和无机成分的成分。培养基成分的类型和浓度可以根据各种条件例如使用的酵母的类型和待生产的目标物质的类型适当确定。

培养基可以含有能够联合、结合、增溶和/或捕获目标物质的添加剂。添加剂的使用可以导致目标物质的生产增加。也就是说，相比于不存在添加剂的情况，在添加剂的存在的情况下由本发明的酵母生产的目标物质的量可以增加。添加剂的使用可以特别是导致培养基中的目标物质生产增加。培养基中的目标物质生产也可以称为“目标物质的分泌”。表述“联合、结合、增溶和/或捕获目标物质”可以特别是表示增加目标物质在培养基中的溶解度。添加剂的实例包括环糊精和沸石。构成环糊精的葡萄糖残基的数量没有特别限制，且可以是例如5、6、7或8。也就是说，环糊精的实例包括由5个葡萄糖残基组成的环糊精，α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精及其衍生物。环糊精衍生物的实例包括其中引入了一个或多个官能团的环糊精。官能团的种类，数量和量以及引入官能团的位置没有特别限制，只要衍生物能够结合，联合，增溶和/或捕获目标物质即可。可以将官能团引入例如C2、C3、C6的羟基或其组合，其可以导致环糊精本身的溶解度增加。官能团的实例包括烷基和羟烷基。烷基和羟烷基各自可以具有直链烷基链或可以具有支链烷基链。烷基和羟烷基各自可以具有例如1、2、3、4或5的碳数量。烷基的具体实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、异丙基和异丁基。羟烷基的具体实例包括羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基、羟戊基、羟基异丙基和羟基异丁基。环糊精衍生物的具体实例包括甲基-α-环糊精，甲基-β-环糊精，羟丙基-α-环糊精如2-羟丙基-α-环糊精，和羟丙基-β-环糊精如2-羟丙基-β-环糊精。沸石的类型没有特别的限制。作为添加剂，可以使用单一种类的添加剂，或者可以组合使用两种或更多种添加剂。

在整个培养周期期间培养基中可以包含添加剂，或者仅在培养周期的一部分期间培养基含有添加剂。例如，从培养开始时，培养基可以含有或不含有添加剂。当在培养开始的时候培养基中不含有添加剂时，在培养开始后将添加剂供应至培养基。可以根据各种条件例如培养周期的长度来适当确定供应的时间。例如，可以在本发明的酵母完全生长之后将添加剂供应至培养基。此外，在任何情况下，可以根据需要将添加剂另外供应至培养基。用于将添加剂供应至培养基的方式没有特别限制。例如，可以通过将含有添加剂的补料培养基补料至培养基来供给添加剂。培养基中的添加剂浓度没有特别限制，只要目标物质能够生产。例如，培养基中的添加剂的浓度可以是0.1g/L或更高，1g/L或更高，2g/L或更高，5g/L或更高，10g/L或更高，可以是200g/L或更低，100g/L或更低，50g/L或更低，或20g/L或更低，或者可以在由其组合限定的范围内。培养基中的添加剂的浓度可以为例如0.1g/L至200g/L，1g/L至100g/L或5g/L至50g/L。在培养的整个周期期间，添加剂可以或不可以以上文例示的范围内的浓度包含在培养基中。例如，添加剂可以在培养开始时以上文例示的范围内的浓度包含在培养基中，或者其可以向培养基供应，使得在开始培养之后达到上文例示的范围内的浓度。

碳源的具体实例包括糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、赤糖糊(blackstrap molasses)、淀粉水解物和生物质的水解物，有机酸，如乙酸、延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸，醇如甘油、粗甘油和乙醇，以及脂族酸。作为碳源，可以使用单一种类的碳源，或者可以组合使用两种或更多种的碳源。

氮源的具体实例包括例如铵盐如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮源如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、和大豆蛋白分解产物，氨和脲。用于调节pH的氨气或氨水也可以用作氮源。作为氮源，可以使用单一种类的氮源，也可以组合使用两种或更多种的氮源。

磷酸源的具体实例包括例如磷酸盐如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，和磷酸聚合物如焦磷酸。作为磷酸源，可以使用单一种类的磷酸源，也可以组合使用两种或更多种的磷酸源。

硫源的具体实例包括例如无机硫化合物如硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐，和含硫氨基酸如半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽。作为硫源，可以使用单一种类的硫源，也可以组合使用两种或更多种的硫源。

其它的各种有机成分及无机成分的实例包括例如无机盐如氯化钠和氯化钾；微量金属如铁、锰、镁和钙；维生素如维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酸酰胺和维生素B12；氨基酸；核酸；含有这些的有机成分如蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白分解产物。作为其它的各种有机成分及无机成分，可以使用单一种类的成分，也可以组合使用两种或更多种的成分。

此外，当使用需要氨基酸、核酸等用于其生长的营养缺陷型突变体时，优选向培养基提供需要的营养物。

培养条件没有特别限制，只要本发明的酵母可以增殖，并且可以生产目标物质。培养可以例如在用于培养酵母的常规条件下进行。培养条件可以根据多种条件例如使用的酵母类型和生产的目标物质的类型适当确定。

可以通过使用液体培养基，在需氧、微氧或厌氧条件下进行培养。优选在需氧条件下进行培养。术语“需氧条件”可以指其中液体培养基中的溶解氧浓度为0.33ppm或更高，或者优选1.5ppm或更高的条件。在需氧条件的情况下，氧浓度可以控制为例如饱和氧浓度的5至50％，优选约10-20％。具体而言，需氧培养可以通过使用通气或振荡进行。术语“微氧条件”可以指将氧供应至培养系统，但是液体培养基中的溶解氧浓度低于0.33ppm的条件。术语“厌氧条件”可以指其中不将氧供应至培养系统的条件。培养温度可以是例如25至35℃，优选27至33℃，更优选28至32℃。培养基的pH可以是例如3至10或4至8。培养期间可以根据需要调节培养基的pH。对于调节pH，可以使用无机或有机酸性或碱性物质，例如氨气等。培养周期可以是例如10至200小时，或15至120小时。培养条件可以在整个培养周期期间恒定，或者可以在培养期间改变。培养可以以分批培养，补料-分批培养，连续培养，或这些的组合进行。此外，培养可以作为种子培养和主要培养的两步进行。在此类情况下，种子培养和主要培养的培养条件可以相同或不相同。例如，种子培养和主要培养可以作为分批培养进行。或者，例如，种子培养可以作为分批培养进行，而主要培养可以作为补料-分批培养或连续培养进行。

通过在此类条件下培养本发明的酵母，目标物质在培养基和/或酵母的细胞中积累。

可以通过用于检测或鉴定化合物的已知方法确认目标物质的生产。此类方法的实例包括例如HPLC、UPLC、LC/MS、GC/MS和NMR。这些方法可以独立使用或以任何适合的组合使用。

可以通过用于分离和纯化化合物的已知方法收集生成的目标物质。此类方法的实例包括例如离子交换树脂方法，膜处理，沉淀和结晶。这些方法可以独立使用或以任何适当的组合使用。当目标物质在细胞中积累时，可以用例如超声波处理等破碎细胞，然后可以从通过离心从细胞破碎的悬浮液中除去细胞获得的上清液中收集目标物质。要收集的目标物质可以是游离化合物，其盐或其混合物。

此外，当目标物质在培养基中沉积时，可以通过离心，过滤等来收集目标物质。沉积在培养基中的目标物质也可以在溶解在培养基中的目标物质结晶之后与溶解在培养基中的目标物质一起分离。

收集的目标物质除目标物质外可以含有酵母细胞，培养基组分，水分和酵母的副产物代谢物。收集的目标物质的纯度可以是例如50％(w/w)或更高，优选85％(w/w)或更高，特别优选95％(w/w)或更高。

目标物质例如植物鞘氨醇(PHS)和二氢神经鞘氨醇(DHS)可以通过鞘氨醇碱(PHS/DHS)和脂肪酸的混合物的化学反应转化为鞘脂类例如植物神经酰胺(PHC)和二氢神经酰胺(DHC)(J.Biol.Chem.July 2002 277(29):25847-5)。

实施例

将参照以下实施例将更具体地解释本发明。然而，这些实例不应被解释为以任何方式限制本发明。

实施例1：菌株的构建

最成熟的PHS生产菌株酿酒酵母菌株EVST20240来源于国家酵母菌保藏中心的菌株NCYC 3608。菌株NCYC 3608(基因型MATalpha gal2 ho::HygMX ura3::KanMX)是S288C的Matα衍生物。菌株EVST20240含有以下修饰，即缺失his3Δ0leu2Δ0ura3Δ0Δcha1::LoxPΔcka2::LoxPΔlcb4::LoxP Δlcb5::LoxPΔorm2::LoxP CAT5-91Met gal2ho YNRCΔ9::ScLCB1/ScSUR2 YPRCΔ15::ScLCB2/ScTSC10[ARS/CEN/URA/ScTSC10/ScSUR2][ARS/CEN/HIS/ScLCB1/ScLCB2][ARS/CEN/LEU]。可以使用标准遗传方法操纵菌株EVST20240，且可以用作常规单倍体或二倍体酵母菌株。在下文中详细描述菌株EVST20240的构建。

从菌株NCYC 3608生成酿酒酵母菌株EYS4769。第一步包括去除从HO基因的缺失中留下的HygMX选择标志物。为了该目的，构建了含有以下模块的质粒pEVE3195，所述模块由与紧邻HygMX起始密码子上游的HygMX启动子同源的区域，随后是侧翼有loxP位点的乳酸克鲁维酵母URA3基因，和与终止密码子紧邻下游的HygMX终止子同源的区域组成。该模块侧翼有两个AscI限制性位点，并通过AscI消化释放，然后释放的片段用于转化菌株S288C。结果，HygMX标志物被包括乳酸克鲁维酵母URA3选择标志物的该模块置换。最后，经由loxP序列的自发重组去除URA3标志物。首先在SC液体培养基上然后在含有1g/L的5’-氟乳清酸(5-FOA)培养基(1.926g/L不含尿嘧啶的SC混合物(SC-mix)，30mg/L尿嘧啶，6.7g/L酵母含氮碱基，20g/L葡萄糖，pH5.8)(对于完全SC混合物，参见表15)的平板上选择没有URA3的克隆，5’-氟乳清酸被具有活性URA3基因的酵母转化为毒性化合物。

如下使用PCR介导的无缝基因缺失策略实现KanMX选择标志物的去除，HygMX标志物去除留下的loxP疤痕的去除，以及LEU2和HIS3基因的缺失。

对于KanMX选择标志物的缺失，构建了含有以下模块的质粒pEVE3622，所述模块由与KanMX起始密码子紧邻上游的KanMX启动子同源的区域，和与终止密码子紧邻下游的KanMX终止子同源的区域，然后是乳酸克鲁维酵母URA3基因组成。在第一步中，通过经由限制性位点AscI向载体pEVE1915引入DNA片段A生成质粒pEVE3191。DNA片段A通过重叠PCR制备。也就是说，使用菌株NCYC 3608的基因组DNA作为模板和引物对EV3964/EV3965和EV3966/EV3967通过PCR扩增两个DNA片段。然后通过使用引物对EV3964/EV3967的PCR将这两个DNA片段连接以获得DNA片段A。在下一步中，使用引物对EVPR11045/EVPR11046从pEVE3195用PCR扩增乳酸克鲁维酵母URA3基因，并通过In-Fusion克隆将其克隆到EcoRV线性化质粒pEVE3191中。下游同源区域中的NdeI限制性位点用于质粒的限制性消化，然后是基因组整合和在没有尿嘧啶的SC培养基(1.926g/L不含尿嘧啶的SC混合物，6.7g/L酵母含氮碱基，20g/L葡萄糖，pH5.8)(对于完全SC混合物，参见表15)中选择。接着，在含有1g/L的5’-氟乳清酸(5-FOA)琼脂平板的平板上选择没有URA3标志物的克隆。获得具有野生型基因型和期望缺失的混合克隆群体，并通过PCR进行缺失突变体的鉴定。

对于LoxP疤痕的去除和LEU2和HIS3基因的缺失，使用相同的方法。引物对EV3970/EV3971,EV3972/EV3973,和EV3970/EV3973用于生成用于HIS3基因的开放读码框的缺失的靶向片段。引物对EV3976/EV3977,EV3978/EV3979,和EV3976/EV3979用于生成用于LEU2基因的开放读码框的缺失的靶向片段。靶向loxP疤痕的质粒(pEVE3621)用下游整合标签中的Pml1线性化；靶向LEU2标志物的质粒(pEVE3624)用下游整合标签中的BseRI线性化；对于靶向HIS3标志物的质粒(pEVE3623)，通过定点诱变向上游整合标签中引入独特限制性位点HindIII生成pEVE3763，并用HindIII消化。基因组整合和在没有尿嘧啶的SC培养基中选择后，在含有1g/L 5-FOA的琼脂平板上选择没有URA3标志物的克隆。获得具有野生型基因型和期望缺失的混合克隆群体，并通过PCR进行缺失突变体的鉴定。

通过缺失LCB4基因从先前描述的菌株EYS4769生成酿酒酵母菌株EYS4789。这通过基于PCR的基因缺失策略完成，其产生开放读码框的起始到终止密码子缺失。LCB4基因被缺失构建体置换，所述缺失构建体由侧翼有loxP位点的诺尔斯菌素抗性基因NatMX(nat1)，和与LCB4基因的天然启动子和终止子同源的序列构成，所述序列通过使用引物EV4024和EV4025(表9)的PCR添加。在含有100mg/L诺尔斯菌素的SC-琼脂平板上选择转化体。克隆通过PCR测试缺失构建体的正确插入。

从先前描述的菌株EYS4789生成酿酒酵母菌株EYS4839,EYS4840,和EYS4845，其通过首先如下去除先前插入的NatMX选择标志物：使用含有Cre重组酶的表达盒的URA3可选择质粒pEVE0078转化菌株EYS4789。Cre重组酶催化在NatMX标志物侧翼的两个loxP位点之间的位点特异性重组，伴随NatMX标志物的去除。在没有尿嘧啶的SC-琼脂平板上选择表达Cre重组酶的克隆。挑取一些克隆并通过在相应选择性平板上铺板测试选择标志物的丢失。通过在1g/L 5’-氟乳清酸的存在下培养菌株去除含有Cre重组酶的质粒pEVE0078，5’-氟乳清酸由URA3基因编码的酶活性转化为毒性化合物。仅丢失了该质粒的克隆能够在含有5-FOA的培养基上生长。一个阳性克隆产生了菌株EYS4964。

酿酒酵母菌株EYS4946用于ORM2,LCB5和ELO3基因的缺失以构建EYS4839，EYS4840和EYS4845。EYS4839菌株缺少ORM2基因，菌株EYS4840缺少LCB5基因，而菌株EYS4845缺少ELO3基因。这是通过基于PCR的基因缺失策略完成，产生开放读码框的起始到终止密码子缺失。ORM2，LCB5和ELO3基因被相应的缺失构建体置换，所述缺失构建体由侧翼有loxP位点的诺尔斯菌素抗性基因NatMX(nat1)和与ORM2，LCB5和ELO3基因的天然启动子和终止子同源的序列构成，所述序列通过使用引物对EV4215/EV4216，EV4030/EV4031和EV5103/EV5104的PCR添加。在含有100mg/L诺尔斯菌素的SC-琼脂平板上选择转化体。克隆通过PCR测试确认缺失构建体的正确插入。

酿酒酵母菌株EYS5009通过CKA2基因的缺失从先前描述的菌株EYS4789衍生。这是通过基于PCR的基因缺失策略来完成的，产生开放读码框的起始到终止密码子缺失。CKA2基因被缺失构建体置换，所述缺失构建体由侧翼有loxP位点的潮霉素抗性基因HygMX(hph)，和与CKA2基因的天然启动子和终止子同源的序列构成，所述序列通过使用引物对EV4740和EV4741(表9)的PCR添加。在含有300mg/L潮霉素的SC-琼脂平板上选择转化体。克隆通过PCR测试确认缺失构建体的正确插入。在第二步中，通过使用含有Cre重组酶的表达盒的URA3可选择质粒pEVE0078转化去除先前插入的选择标志物。Cre重组酶催化在HygMX(hph)标志物侧翼的两个loxP位点之间的位点特异性重组，伴随HygMX(hph)标志物的去除。在没有尿嘧啶的SC-琼脂平板上选择表达Cre重组酶的克隆。挑取一些克隆并通过在相应选择性平板上铺板测试选择标志物的丢失。通过在1g/L 5’-氟乳清酸的存在下培养菌株去除含有Cre重组酶的质粒pEVE0078，5’-氟乳清酸由URA3基因编码的酶活性转化为毒性化合物。仅丢失了该质粒的克隆能够在含有5-FOA的SC培养基上生长。

酿酒酵母菌株EYS5066通过LCB5基因的缺失从先前描述的菌株EYS5009衍生。这是通过基于PCR的基因缺失策略来完成的，产生开放读码框的起始到终止密码子缺失。LCB5基因被缺失构建体置换，所述缺失构建体由侧翼有loxP位点的诺尔斯菌素抗性基因NatMX(nat1)，和与LCB5基因的天然启动子和终止子同源的序列构成，所述序列通过使用引物对EV4030和EV4031(表9)的PCR添加。在含有100mg/L诺尔斯菌素的SC-琼脂平板上选择转化体。克隆通过PCR测试确认缺失构建体的正确插入。

酿酒酵母菌株EYS5175通过ORM2基因的缺失从先前描述的菌株EYS5066衍生。这是通过基于PCR的基因缺失策略来完成的，产生开放读码框的起始到终止密码子缺失。ORM2基因被缺失构建体置换，所述缺失构建体由侧翼有loxP位点的潮霉素抗性基因HygMX(hph)，和与ORM2基因的天然启动子和终止子同源的序列构成，所述序列通过使用引物对EV4215和EV4216(表9)的PCR添加。在含有100mg/L潮霉素的SC-琼脂平板上选择转化体。克隆通过PCR测试确认缺失构建体的正确插入。

酿酒酵母菌株EVST20057通过CHA1基因的缺失从先前描述的菌株EYS5175生成，所述缺失是通过基于PCR的基因缺失策略来完成的，产生开放读码框的起始到终止密码子缺失。CHA1基因被缺失构建体置换，所述缺失构建体由侧翼有loxP位点的赋予对氨基糖苷类抗生素G418的抗性的KanMX基因，和与CHA1基因的天然启动子和终止子同源的序列构成，所述序列通过使用引物对EV3782和EV3783(表9)的PCR添加。在含有100mg/L G418的SC-琼脂平板上选择转化体。克隆通过PCR测试确认缺失构建体的正确插入。另外，先前分别用于缺失LCB5,ORM2和CHA1基因的抗性标志物NatMX,HygMX(Hph)和KanMX通过用pEVE0078转化从EYS5175去除，pEVE0078是含有Cre重组酶的表达盒的URA3可选择质粒。Cre重组酶催化上述标志物侧翼的两个loxP位点之间的位点特异性重组，伴随标志物的去除。在没有尿嘧啶的SC-琼脂平板上选择表达Cre重组酶的克隆。挑取一些克隆并通过在相应选择性平板上铺板测试选择标志物的丢失。通过在1g/L 5’-氟乳清酸的存在下培养菌株去除含有Cre重组酶的质粒pEVE0078，5’-氟乳清酸由URA3基因编码的酶活性转化为毒性化合物。仅丢失了该质粒的克隆能够在含有尿嘧啶的培养基上生长。

通过将表达模块整合到基因组Ty1长末端重复YNRCΔ9(染色体XIV 727363-727661)中，从先前描述的菌株EVST20057生成酿酒酵母菌株EVST20160，所述表达模块由两个天然酿酒酵母LCB1和SUR2基因和可选择标志物NatMX组成。LCB1和SUR2基因分别从天然酿酒酵母GPD1和TEF2启动子(表13)表达，然后是天然酿酒酵母CYC1和PGI1终止子(表14)。另外，将表达两种天然酿酒酵母LCB2和TSC10基因和可选择标志物HygMX(Hph)的第二整合模块整合到基因组Ty1长末端重复YPRCΔ15中(染色体XVI 776667..776796)。LCB2和TSC10基因分别从天然酿酒酵母PGK1和TPI1启动子(表13)表达，随后是天然酿酒酵母ADH2和TDH1终止子(表14)。

通过用三种质粒转化从先前描述的菌株EVST20160生成酿酒酵母菌株EVST20240。质粒1(pEVE4932)含有双表达盒，其具有侧翼有天然酿酒酵母TEF1启动子和天然酿酒酵母ADH1终止子的酿酒酵母LCB1基因的开放读码框，和侧翼有天然酿酒酵母PGK1启动子和天然酿酒酵母CYC1终止子的酿酒酵母LCB2基因的开放读码框。质粒2(pEV22325)含有双表达盒，其具有侧翼有天然酿酒酵母TEF1启动子(表13)和天然酿酒酵母ADH1终止子(表14)的酿酒酵母TSC10基因的开放读码框，和侧翼有天然酿酒酵母PGK1启动子和天然酿酒酵母CYC1终止子的酿酒酵母SUR2基因的开放读码框。质粒3(pEVE2159)含有空表达盒，其仅具有天然酿酒酵母PKG2启动子和天然酿酒酵母ADH2终止子，而没有开放读码框。该质粒仅用于使得菌株对于亮氨酸为原养型。在不含氨基酸组氨酸和亮氨酸以及嘧啶碱基尿嘧啶的琼脂糖平板上选择含有全部三种质粒的转化体，其通过分别存在于质粒1，2或3上的选择标志物HIS3，URA3和LEU2进行选择。

实施例2：在小规模分批培养中培养菌株并分析PHS生产

酵母菌株(图1)在缺乏亮氨酸，组氨酸和尿嘧啶的选择性SC-琼脂平板上划线出斑块。过夜生长之后，通过接种缺乏亮氨酸，组氨酸和尿嘧啶的SC培养基(1.546g/L没有亮氨酸、组氨酸、尿嘧啶的SC-混合物，6.7g/L酵母含氮碱基，20g/L葡萄糖，pH5.8)(对于完全SC混合物，参见表15))设置在14ml圆底管中的1ml预培养物。将预培养物在30℃振荡培养24小时，然后用于接种96孔深孔板中的主要培养物，其在OD₆₀₀为0.1时接种于缺少亮氨酸，组氨酸和尿嘧啶，并含有20g/L葡萄糖和10g/Lα-环糊精的SC培养基中。在30℃振荡孵育48小时后，通过离心(5分钟，4000rpm)收获培养物，取上清液的等分试样用于鞘脂类分析。样品在甲醇中稀释，使得分析物的浓度在校准范围内。储液如表1所示制备。

[表1]

表1：标准品的储液

在甲醇中从储液制备4mg/L，2mg/L，1mg/L，0.5mg/L，0.25mg/L，0.125mg/L，62.5μg/L和31.25μg/L的系列校准溶液，并注射到UPLC-TOF中。LC-MS/MS方法如下：流动相A：溶于水的2mM甲酸铵+0.2％甲酸；流动相B：溶于乙腈/甲醇1:1的1mM甲酸铵+0.2％甲酸；柱：Acquity BEH UPLC C8,2.1 x 100mm，1.7μm。洗脱梯度如表2中所示，且LC-MS/MS条件在表3中给出。表4显示了质谱源和检测器参数。标准化合物的质量和保留时间可以在表5中找到。3-酮二氢神经鞘氨醇，C18-植物鞘氨醇和二氢神经鞘氨醇的浓度根据它们各自的校准曲线计算，而C20-植物鞘氨醇，C18:1-植物鞘氨醇和C20:1植物鞘氨醇的浓度使用C18-植物鞘氨醇校准曲线评估，且C18-植物鞘氨醇加合物和C20-植物鞘氨醇加合物根据C18-植物鞘氨醇计算并应用0.59的相关因子。

[表2]

表2：鞘脂类的分离梯度

[表3]

表3：LC-MS/MS条件

注射体积	5μl
		柱温度	50℃±5℃
注射方法	部分循环
		自动取样温度	30℃±5℃
弱清洗	溶于水/甲醇1:1的800μl 1mM甲酸铵
		强清洗	300μl 2-丙醇
密封清洗	5分钟使用水/乙腈9:1

[表4]

表4：质谱源和检测器参数

[表5]

表5：标准化合物的质量和保留时间

化合物	m/z	离子	保留时间(min)
				3-酮二氢神经鞘氨醇	300.29	[M-H]+	1.80
二氢神经鞘氨醇	302.31	[M-H]+	1.79
				C18-植物鞘氨醇	318.30	[M-H]+	1.71
C20-植物鞘氨醇	346.30	[M-H]+	2.04
				C18-植物鞘氨醇-加合物	344.30	[M-H]+	2.03
C20-植物鞘氨醇-加合物	372.30	[M-H]+	2.28

在小规模酵母培养物的上清液中测量了双缺失菌株EYS4839，EYS4840，EYS4845和EYS5009的植物鞘氨醇和二氢神经鞘氨醇生产。如表6所示，在所有双缺失菌株中，菌株中的植物鞘氨醇和二氢神经鞘氨醇生产增加，并且在具有LCB4/ELO3或LCB4/CKA2基因缺失的菌株中显著更高。

[表6]

表6：小规模培养中的植物鞘氨醇和二氢神经鞘氨醇滴度

通过进一步的遗传修饰，观察到植物鞘氨醇生产的进一步改善(图1)。在LCB4/CKA2双缺失背景中，具有LCB5和ORM2基因组合或LCB5，ORM2和CHA1基因组合的缺失观察到20-30％增加。通过整合到酵母基因组(菌株EVST20160)中过表达鞘脂类途径基因LCB1，LCB2，TSC10和SUR2，相对于起源菌株EVST20057，植物鞘氨醇生产改善了约2.5倍。通过从质粒过表达鞘脂类途径基因的额外拷贝(菌株EVST20240)，植物鞘氨醇的生产进一步增加超过30％。

实施例3：在生物反应器中培养菌株EVST20240

使用以下参数进行补料-分批发酵：温度30℃，pH控制在5.85(通过0.5M HCl和5MNH₄OH调节)，并且通过搅拌器和通气的级联将pO₂保持较高，在最大氧溶解的20％。使用的培养基对于分批阶段为选择性SC培养基，且对于补料-分批阶段为30倍浓缩的选择性SC培养基(46.38g/L无亮氨酸、组氨酸、尿嘧啶的SC-混合物，201g/L酵母含氮碱基，600g/L葡萄糖，pH 5.8)(对于完全SC混合物，参见表15)。两种培养基均补充有50g/L甲基-α-环糊精。分批阶段进行11小时，随后按照指数补料图表开始补料(表7)。在约100小时的周期内，采集样品并分析生物质和植物鞘氨醇的生产。通过LC-MS定量植物鞘氨醇。

[表7]

表7：生物反应器发酵期间的补料图表

结果显示在图2和表8中。除植物鞘氨醇外，在发酵培养液中鉴定了几种植物鞘氨醇衍生物(图2，表8)。碳链长度为18的植物鞘氨醇(PHS18)是主要种类，其次是碳链长度为20的植物鞘氨醇(PHS20)和碳链长度为16的植物鞘氨醇(PHS16)。另外，具有一个去饱和的PHS18和PHS20也以显著量存在。令人惊讶的是，还存在两种对应于4-(羟甲基)-2-甲基-6-十四酰-1,3-恶嗪烷-5-醇和4-(羟甲基)-2-甲基-6-十六酰-1,3-恶嗪烷-5-醇的植物鞘氨醇衍生物。这两种物质最有可能是PHS18或PHS20与乙醛的反应产物。通过NMR分析确认了结构1所示的4-(羟甲基)-2-甲基-6-十四酰-1,3-恶嗪烷-5-醇的结构。

[表8]

表8：生物反应器中多种植物鞘氨醇的滴度

Chem 1

结构1：4-(羟甲基)-2-甲基-6-十四酰-1,3-恶嗪烷-5-醇的结构

材料

实施例中使用的材料示于表9-15中。

[表9]

表9：用于基因缺失的引物对

[表10]

表10：另外的引物序列

[表11]

表11：质粒序列

质粒	SEQ ID
		pEVE1915	49
pEVE3191	50
		pEVE3195	51
pEVE4932	52
		pEV22325	53
pEVE2159	54
		pEVE0078	55
pEVE3621	62
		pEVE3623	63
pEVE3624	64

[表12]

表12：缺失构建体

缺失构建体	SEQ ID
		CHA1	56
LCB4	57
		LCB5	58
ORM2	59
		CKA2	60
ELO3	61

[表13]

表13：启动子序列

[表14]

表14：终止子序列

终止子	SEQ ID
		CYC1	70
PGI1	71
		ADH2	72
TDH1	73
		ADH1	74

[表15]

表15：完全SC混合物

[工业实用性]

根据本发明，可以改善酵母生产目标物质例如植物鞘氨醇和二氢神经鞘氨醇的能力，并可以高效生产目标物质。

<序列表的说明>

SEQ ID NO:1,酿酒酵母的LCB1基因核苷酸序列

SEQ ID NO:2,酿酒酵母的Lcb1蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:3,酿酒酵母的LCB2基因核苷酸序列

SEQ ID NO:4,酿酒酵母的Lcb2蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:5,酿酒酵母的TSC10基因核苷酸序列

SEQ ID NO:6,酿酒酵母的Tsc10蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:7,酿酒酵母的SUR2基因核苷酸序列

SEQ ID NO:8,酿酒酵母的Sur2蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:9,酿酒酵母的LCB4基因核苷酸序列

SEQ ID NO:10,酿酒酵母的Lcb4蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:11,酿酒酵母的LCB5基因核苷酸序列

SEQ ID NO:12,酿酒酵母的Lcb5蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:13,酿酒酵母的ELO3基因核苷酸序列

SEQ ID NO:14,酿酒酵母的Elo3蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:15,酿酒酵母的CKA2基因核苷酸序列

SEQ ID NO:16,酿酒酵母的Cka2蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:17,酿酒酵母的ORM2基因核苷酸序列

SEQ ID NO:18,酿酒酵母的Orm2蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:19,酿酒酵母的CHA1基因核苷酸序列

SEQ ID NO:20,酿酒酵母的Cha1蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:21,Pichia ciferrii的SUR2基因的核苷酸序列

SEQ ID NO:22,Pichia ciferrii的Sur2蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NOS:23-48,引物

SEQ ID NOS:49-55,质粒

SEQ ID NOS:56-61,基因缺失构建体

SEQ ID NOS:62-64,质粒

SEQ ID NOS:65-69,启动子

SEQ ID NOS:70-74,终止子

序列表

<110> 味之素株式会社

伊沃瓦股份有限公司

<120> 生产植物鞘氨醇或二氢神经鞘氨醇的方法

<130> D731-15327

<150> US62/208,934

<151> 2015-08-24

<150> JP2015-164693

<151> 2015-08-24

<160> 74

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1677

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 1

atggcacaca tcccagaggt tttacccaaa tcaataccga ttccggcatt tattgttacc 60

acctcatcgt acctatggta ctacttcaat ctggtgttga ctcaaatccc gggaggccaa 120

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atagggctta ttttatacgg gatcatctat tacttgtcca agccacaaca gaaaaagagt 240

cttcaagcac agaagcccaa cctatcgccc caggagattg acgcgctaat tgaggactgg 300

gagcccgagc ctctagtcga cccttctgcc accgatgagc aatcgtggag ggtggccaaa 360

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caggagaagt ataccaatgt tttcaatttg gcctcgaaca actttttgca attgtccgct 480

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cagttctttg gcacccaagg ttccgttctg tacgggcaag acttttgtgc cgcaccctct 660

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atggatcgcg caactgccat tgacattacc gttgggtcca tggccaccgc gttggggtcc 1080

accggtggtt ttgtcctggg tgacagtgtt atgtgtttgc accagcgtat tggttccaat 1140

gcatattgtt tttctgcctg tttgccggct tacaccgtca catccgtctc caaagtcttg 1200

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<210> 2

<211> 558

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<400> 2

Met Ala His Ile Pro Glu Val Leu Pro Lys Ser Ile Pro Ile Pro Ala

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Tyr Tyr Phe Asn Leu Val

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Leu Thr Gln Ile Pro Gly Gly Gln Phe Ile Val Ser Tyr Ile Lys Lys

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Ser His His Asp Asp Pro Tyr Arg Thr Thr Val Glu Ile Gly Leu Ile

50 55 60

Leu Tyr Gly Ile Ile Tyr Tyr Leu Ser Lys Pro Gln Gln Lys Lys Ser

65 70 75 80

Leu Gln Ala Gln Lys Pro Asn Leu Ser Pro Gln Glu Ile Asp Ala Leu

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Ile Gln Asn His Ile Thr Ile Thr Arg Asn Asn Leu Gln Glu Lys Tyr

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Thr Asn Val Phe Asn Leu Ala Ser Asn Asn Phe Leu Gln Leu Ser Ala

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Thr Glu Pro Val Lys Glu Val Val Lys Thr Thr Ile Lys Asn Tyr Gly

165 170 175

Val Gly Ala Cys Gly Pro Ala Gly Phe Tyr Gly Asn Gln Asp Val His

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Tyr Thr Leu Glu Tyr Asp Leu Ala Gln Phe Phe Gly Thr Gln Gly Ser

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Val Leu Tyr Gly Gln Asp Phe Cys Ala Ala Pro Ser Val Leu Pro Ala

210 215 220

Phe Thr Lys Arg Gly Asp Val Ile Val Ala Asp Asp Gln Val Ser Leu

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Pro Val Gln Asn Ala Leu Gln Leu Ser Arg Ser Thr Val Tyr Tyr Phe

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Asn His Asn Asp Met Asn Ser Leu Glu Cys Leu Leu Asn Glu Leu Thr

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Glu Gln Glu Lys Leu Glu Lys Leu Pro Ala Ile Pro Arg Lys Phe Ile

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Val Thr Glu Gly Ile Phe His Asn Ser Gly Asp Leu Ala Pro Leu Pro

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Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Lys Tyr Lys Phe Arg Leu Phe Val Asp

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Glu Thr Phe Ser Ile Gly Val Leu Gly Ala Thr Gly Arg Gly Leu Ser

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Glu His Phe Asn Met Asp Arg Ala Thr Ala Ile Asp Ile Thr Val Gly

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Ser Met Ala Thr Ala Leu Gly Ser Thr Gly Gly Phe Val Leu Gly Asp

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Ser Val Met Cys Leu His Gln Arg Ile Gly Ser Asn Ala Tyr Cys Phe

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Ser Ala Cys Leu Pro Ala Tyr Thr Val Thr Ser Val Ser Lys Val Leu

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Lys Leu Met Asp Ser Asn Asn Asp Ala Val Gln Thr Leu Gln Lys Leu

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Ser Lys Ser Leu His Asp Ser Phe Ala Ser Asp Asp Ser Leu Arg Ser

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Tyr Val Ile Val Thr Ser Ser Pro Val Ser Ala Val Leu His Leu Gln

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Leu Thr Pro Ala Tyr Arg Ser Arg Lys Phe Gly Tyr Thr Cys Glu Gln

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Leu Phe Glu Thr Met Ser Ala Leu Gln Lys Lys Ser Gln Thr Asn Lys

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Phe Ile Glu Pro Tyr Glu Glu Glu Glu Lys Phe Leu Gln Ser Ile Val

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Asp His Ala Leu Ile Asn Tyr Asn Val Leu Ile Thr Arg Asn Thr Ile

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Val Lys Gln Ser Ile Leu Ala Cys Cys Gln Glu Ser Asn Lys

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 3

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aattga 1686

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<211> 561

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<400> 4

Met Ser Thr Pro Ala Asn Tyr Thr Arg Val Pro Leu Cys Glu Pro Glu

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Glu Leu Pro Asp Asp Ile Gln Lys Glu Asn Glu Tyr Gly Thr Leu Asp

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Pro Arg Ala Gln Ile Gly Thr Thr Asp Leu His Ile Lys Ala Glu Lys

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Leu Val Ala Arg Phe Ile Gly Lys Glu Asp Ala Leu Val Phe Ser Met

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Gly Tyr Gly Thr Asn Ala Asn Leu Phe Asn Ala Phe Leu Asp Lys Lys

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Lys Lys Lys Tyr Lys Cys Tyr Leu Phe Ile Asp Glu Ala His Ser Ile

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Gly Ala Met Gly Pro Thr Gly Arg Gly Val Cys Glu Ile Phe Gly Val

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Asp Pro Lys Asp Val Asp Ile Leu Met Gly Thr Phe Thr Lys Ser Phe

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Gly Ala Ala Gly Gly Tyr Ile Ala Ala Asp Gln Trp Ile Ile Asp Arg

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Leu Arg Leu Asp Leu Thr Thr Val Ser Tyr Ser Glu Ser Met Pro Ala

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Val Val Val Ala Tyr Pro Ala Thr Pro Leu Ile Glu Ser Arg Val Arg

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Gly Lys Ser Ser Tyr Asp Gly Lys Arg Gln Arg Trp Asp Ile Glu Glu

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Asn

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<213> 酿酒酵母

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atgaagttta cgttagaaga ccaagttgtg ttgatcactg gtggttcaca aggtcttgga 60

aaggaattcg ccaaaaaata ttataatgag gctgaaaaca caaagattat tatcgtcagt 120

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tga 963

<210> 6

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<212> PRT

<213> 酿酒酵母

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Met Lys Phe Thr Leu Glu Asp Gln Val Val Leu Ile Thr Gly Gly Ser

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Asn Thr Lys Ile Ile Ile Val Ser Arg Ser Glu Ala Arg Leu Leu Asp

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Gln Arg Leu Phe Tyr Tyr Pro Cys Asp Leu Ser Cys Tyr Glu Ser Val

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Thr Leu Cys Cys Ala Gly Gly Ala Val Pro Lys Leu Phe Arg Gly Leu

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Ser Gly His Glu Leu Asn Leu Gly Met Asp Ile Asn Tyr Lys Thr Thr

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Leu Asn Val Ala His Gln Ile Ala Leu Ala Glu Gln Thr Lys Glu His

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His Leu Ile Ile Phe Ser Ser Ala Thr Ala Leu Tyr Pro Phe Val Gly

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Tyr Ser Gln Tyr Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ile Lys Ser Leu Val Ala

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Gly Asn Phe Glu Ser Glu Gly Phe Thr Val Glu Gln Leu Thr Lys Pro

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Glu Ile Thr Lys Leu Ile Glu Gly Pro Ser Asp Ala Ile Pro Cys Lys

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Gln Ala Cys Asp Ile Ile Ala Lys Ser Leu Ala Arg Gly Asp Asp Asp

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Val Phe Thr Asp Phe Val Gly Trp Met Ile Met Gly Met Asp Leu Gly

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Leu Thr Ala Lys Lys Ser Arg Phe Val Pro Leu Gln Trp Ile Phe Gly

275 280 285

Val Leu Ser Asn Ile Leu Val Val Pro Phe Tyr Met Val Gly Cys Ser

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Trp Tyr Ile Arg Lys Trp Phe Arg Glu Asn Asp Gly Lys Lys Ala Asn

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<212> DNA

<213> 酿酒酵母

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atgaacgtaa catcgaatgc aactgcagcc ggttcctttc cactagcatt tggtctcaag 60

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<212> PRT

<213> 酿酒酵母

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Ala Ile Asn Leu Arg Pro Lys Glu Ser Leu Leu Pro Glu Met Ser Asp

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Gly Val Leu Ala Leu Val Ala Pro Val Val Ala Tyr Trp Ala Leu Ser

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Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Gly Tyr Met Tyr Gly Met Ser Ala Leu Lys

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Ile Phe Ala Gly Phe Leu Phe Val Asp Thr Trp Gln Tyr Phe Leu His

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Arg Leu Met His Met Asn Lys Thr Leu Tyr Lys Trp Phe His Ser Val

180 185 190

His His Glu Leu Tyr Val Pro Tyr Ala Tyr Gly Ala Leu Phe Asn Asn

195 200 205

Pro Val Glu Gly Phe Leu Leu Asp Thr Leu Gly Thr Gly Ile Ala Met

210 215 220

Thr Leu Thr His Leu Thr His Arg Glu Gln Ile Ile Leu Phe Thr Phe

225 230 235 240

Ala Thr Met Lys Thr Val Asp Asp His Cys Gly Tyr Ala Leu Pro Leu

245 250 255

Asp Pro Phe Gln Trp Leu Phe Pro Asn Asn Ala Val Tyr His Asp Ile

260 265 270

His His Gln Gln Phe Gly Ile Lys Thr Asn Phe Ala Gln Pro Phe Phe

275 280 285

Thr Phe Trp Asp Asn Leu Phe Gln Thr Asn Phe Lys Gly Phe Glu Glu

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<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 9

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actgctaaaa atttattcct gacaaaagca aggccaatac tagtggaaag tggctgcaaa 780

atagaaattg catacacaaa atatgcccgt cacgccatcg atattgccaa agatttagat 840

atcagcaaat acgataccat tgcatgtgcc tcgggtgatg gtattccata cgaagtaatt 900

aatgggcttt atagaagacc cgacagagtg gatgcgttca ataaactagc cgtaactcag 960

ctaccttgcg gttcaggaaa tgctatgagc atttcatgtc attggacaaa taacccatcg 1020

tacgccgctc tgtgccttgt caaatccatt gaaacaagaa tagacttaat gtgttgttcc 1080

caaccttctt atatgaacga atggccaaga ttatcctttt tgagtcagac gtacggcgtt 1140

attgcagaat ctgatattaa cactgaattc atcagatgga tgggtcccgt taggtttaat 1200

ttgggtgtag cattcaacat tatccaaggt aagaaatatc cctgcgaagt tttcgtcaaa 1260

tatgctgcca aatctaaaaa ggaattaaaa gttcatttct tagaaaataa agataaaaac 1320

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tcagagctaa ctgataactt aacaatcttt tacacaggga aaatgccgta tattgctaag 1560

gacaccaaat tttttcccgc tgctttacca gcggatggta ccattgattt agtcataacg 1620

gatgcaagaa tcccagtgac aagaatgaca ccaattttat tatccttgga taaaggttct 1680

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tttgaatcca tgtag 1875

<210> 10

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<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<400> 10

Met Val Val Gln Lys Lys Leu Arg Ala Ile Leu Thr Asp Glu Gly Val

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Leu Ile Lys Ser Gln Ser His His Met Phe Asn Lys His Gly Gln Leu

20 25 30

Arg Ser Gly Asp Ser Leu Ser Leu Leu Ser Cys Leu Ser Cys Leu Asp

35 40 45

Asp Gly Thr Leu Ser Ser Asp Gly Gly Ser Phe Asp Glu Asp Asp Ser

50 55 60

Leu Glu Leu Leu Pro Leu Asn Thr Thr Ile Pro Phe Asn Arg Ile Leu

65 70 75 80

Asn Ala Lys Tyr Val Asn Val Gly Gln Lys Gly Phe Asn Asn Gly Lys

85 90 95

Ile Ser Ser Asn Pro Phe Gln Thr Glu Asn Leu Ser Ser Ser Ser Glu

100 105 110

Asn Asp Asp Val Glu Asn His Ser Leu Ser Asn Asp Lys Ala Pro Val

115 120 125

Ser Glu Ser Gln Ser Phe Pro Lys Lys Asp Lys Trp Asp Thr Lys Thr

130 135 140

Asn Thr Val Lys Val Ser Pro Asp Asp Ser Gln Asp Asn Ser Pro Ser

145 150 155 160

Leu Gly Ile Lys Asp Asn Gln Gln Leu Ile Glu Leu Thr Phe Ala Val

165 170 175

Pro Lys Gly His Asp Val Ile Pro Gln Lys Leu Thr Leu Leu Ile Asp

180 185 190

His Val Ser Arg Lys Ser Arg Ala Asn Thr Gly Glu Glu Asn Ile Ser

195 200 205

Ser Gly Thr Val Glu Glu Ile Leu Glu Lys Ser Tyr Glu Asn Ser Lys

210 215 220

Arg Asn Arg Ser Ile Leu Val Ile Ile Asn Pro His Gly Gly Lys Gly

225 230 235 240

Thr Ala Lys Asn Leu Phe Leu Thr Lys Ala Arg Pro Ile Leu Val Glu

245 250 255

Ser Gly Cys Lys Ile Glu Ile Ala Tyr Thr Lys Tyr Ala Arg His Ala

260 265 270

Ile Asp Ile Ala Lys Asp Leu Asp Ile Ser Lys Tyr Asp Thr Ile Ala

275 280 285

Cys Ala Ser Gly Asp Gly Ile Pro Tyr Glu Val Ile Asn Gly Leu Tyr

290 295 300

Arg Arg Pro Asp Arg Val Asp Ala Phe Asn Lys Leu Ala Val Thr Gln

305 310 315 320

Leu Pro Cys Gly Ser Gly Asn Ala Met Ser Ile Ser Cys His Trp Thr

325 330 335

Asn Asn Pro Ser Tyr Ala Ala Leu Cys Leu Val Lys Ser Ile Glu Thr

340 345 350

Arg Ile Asp Leu Met Cys Cys Ser Gln Pro Ser Tyr Met Asn Glu Trp

355 360 365

Pro Arg Leu Ser Phe Leu Ser Gln Thr Tyr Gly Val Ile Ala Glu Ser

370 375 380

Asp Ile Asn Thr Glu Phe Ile Arg Trp Met Gly Pro Val Arg Phe Asn

385 390 395 400

Leu Gly Val Ala Phe Asn Ile Ile Gln Gly Lys Lys Tyr Pro Cys Glu

405 410 415

Val Phe Val Lys Tyr Ala Ala Lys Ser Lys Lys Glu Leu Lys Val His

420 425 430

Phe Leu Glu Asn Lys Asp Lys Asn Lys Gly Cys Leu Thr Phe Glu Pro

435 440 445

Asn Pro Ser Pro Asn Ser Ser Pro Asp Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ile

450 455 460

Asn Asn Ser Thr Lys Asp Glu Leu Ser Pro Asn Phe Leu Asn Glu Asp

465 470 475 480

Asn Phe Lys Leu Lys Tyr Pro Met Thr Glu Pro Val Pro Arg Asp Trp

485 490 495

Glu Lys Met Asp Ser Glu Leu Thr Asp Asn Leu Thr Ile Phe Tyr Thr

500 505 510

Gly Lys Met Pro Tyr Ile Ala Lys Asp Thr Lys Phe Phe Pro Ala Ala

515 520 525

Leu Pro Ala Asp Gly Thr Ile Asp Leu Val Ile Thr Asp Ala Arg Ile

530 535 540

Pro Val Thr Arg Met Thr Pro Ile Leu Leu Ser Leu Asp Lys Gly Ser

545 550 555 560

His Val Leu Glu Pro Glu Val Ile His Ser Lys Ile Leu Ala Tyr Lys

565 570 575

Ile Ile Pro Lys Val Glu Ser Gly Leu Phe Ser Val Asp Gly Glu Lys

580 585 590

Phe Pro Leu Glu Pro Leu Gln Val Glu Ile Met Pro Met Leu Cys Lys

595 600 605

Thr Leu Leu Arg Asn Gly Arg Tyr Ile Asp Thr Glu Phe Glu Ser Met

610 615 620

<210> 11

<211> 2064

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 11

atgactttga aaccttcaaa gagacgtaag ggcaggtctc gccattccag gaagaagcaa 60

ataacgtcag cgatactgac tgaggaagga ataatgatca aggcaaaacc atcaagtcct 120

tacacatacg caaatagaat ggcagataaa cgaagtcgca gcagcattga caacatcagt 180

agaactagct ttcaaagcaa catcagtaga actagctttc aaagcaacag tgataacaac 240

agtatatttg aaacggcttc actaattagc tgtgttacct gtttaagcga tactgataca 300

atagacagat cggaaacatc gacaacggat acaagtaaag atgatctttc tgctaatcca 360

aaacttcatt atccttcggt gaatggtcaa ttgccagcaa acaccgttat cccctatgga 420

cgaattctgg atgccagata cattgaaaag gaacctctgc attattatga tgccaattca 480

tcacccagtt cacctttaag cagctcaatg agtaacatta gtgaaaagtg tgatcttgat 540

gaattagagt cttcccaaaa aaaagaaagg aagggcaact cgctatcgcg aggaagtaac 600

agtagtagta gcctcctgac ttccagatct ccttttacga aactagtaga ggttatattt 660

gctaggccaa gacggcatga cgttgtaccc aaaagggttt cattgtatat tgactataaa 720

ccccattcat cttctcactt aaaagaagaa gatgacttgg ttgaggagat tttaaagaga 780

agctacaaaa acactagaag gaacaaatcc atatttgtga tcattaatcc gtttggtggt 840

aaaggtaagg cgaaaaaact gtttatgaca aaggcaaagc cgttactatt agcaagtcgg 900

tgttccatag aagtggttta tacaaaatac cctggtcatg ctatagagat cgcgcgggaa 960

atggatattg acaaatatga cactattgct tgcgcttcgg gagatggcat tcctcatgag 1020

gtgatcaatg ggttatacca aaggcctgat catgtcaaag cattcaacaa tatcgccatt 1080

acagaaattc catgcggatc aggtaacgca atgagcgtat cctgccactg gacaaacaat 1140

ccttcgtact caactttatg cttaattaaa tcgatagaga ctagaattga tttgatgtgt 1200

tgttcgcagc cttcttatgc aagagagcac ccaaagttat catttttaag tcaaacatat 1260

ggtctcattg cagaaactga cataaacact gaatttatta gatggatggg acctgcaagg 1320

tttgaattgg gtgtagcctt caatatcata caaaaaaaaa aatatccttg tgagatatat 1380

gtaaagtatg ctgccaaatc aaaaaacgag ttaaaaaatc attacctgga acacaaaaat 1440

aaagggtcgt tagaattcca gcatattact atgaacaaag ataacgagga ttgtgataat 1500

tacaattacg aaaatgaata cgaaaccgaa aacgaagatg aagatgaaga tgcggatgcg 1560

gatgacgaag actcccactt gatatctcgt gatctggcag attctagtgc tgatcaaatt 1620

aaagaggaag atttcaaaat aaaatatcca ttagatgaag gtatccctag tgactgggaa 1680

agattggatc ctaatatttc gaacaaccta ggtatcttct atacgggtaa aatgccatat 1740

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ataccaaagc tagggaacgg cttgttctct gtcgatggcg agaaatttcc tctagagccc 1980

cttcaagtcg aaattatgcc acgcttatgc aagacgttac tgagaaatgg ccgttatgtg 2040

gacacagatt tcgattctat gtga 2064

<210> 12

<211> 687

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<400> 12

Met Thr Leu Lys Pro Ser Lys Arg Arg Lys Gly Arg Ser Arg His Ser

1 5 10 15

Arg Lys Lys Gln Ile Thr Ser Ala Ile Leu Thr Glu Glu Gly Ile Met

20 25 30

Ile Lys Ala Lys Pro Ser Ser Pro Tyr Thr Tyr Ala Asn Arg Met Ala

35 40 45

Asp Lys Arg Ser Arg Ser Ser Ile Asp Asn Ile Ser Arg Thr Ser Phe

50 55 60

Gln Ser Asn Ile Ser Arg Thr Ser Phe Gln Ser Asn Ser Asp Asn Asn

65 70 75 80

Ser Ile Phe Glu Thr Ala Ser Leu Ile Ser Cys Val Thr Cys Leu Ser

85 90 95

Asp Thr Asp Thr Ile Asp Arg Ser Glu Thr Ser Thr Thr Asp Thr Ser

100 105 110

Lys Asp Asp Leu Ser Ala Asn Pro Lys Leu His Tyr Pro Ser Val Asn

115 120 125

Gly Gln Leu Pro Ala Asn Thr Val Ile Pro Tyr Gly Arg Ile Leu Asp

130 135 140

Ala Arg Tyr Ile Glu Lys Glu Pro Leu His Tyr Tyr Asp Ala Asn Ser

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Pro Leu Ser Ser Ser Met Ser Asn Ile Ser Glu Lys

165 170 175

Cys Asp Leu Asp Glu Leu Glu Ser Ser Gln Lys Lys Glu Arg Lys Gly

180 185 190

Asn Ser Leu Ser Arg Gly Ser Asn Ser Ser Ser Ser Leu Leu Thr Ser

195 200 205

Arg Ser Pro Phe Thr Lys Leu Val Glu Val Ile Phe Ala Arg Pro Arg

210 215 220

Arg His Asp Val Val Pro Lys Arg Val Ser Leu Tyr Ile Asp Tyr Lys

225 230 235 240

Pro His Ser Ser Ser His Leu Lys Glu Glu Asp Asp Leu Val Glu Glu

245 250 255

Ile Leu Lys Arg Ser Tyr Lys Asn Thr Arg Arg Asn Lys Ser Ile Phe

260 265 270

Val Ile Ile Asn Pro Phe Gly Gly Lys Gly Lys Ala Lys Lys Leu Phe

275 280 285

Met Thr Lys Ala Lys Pro Leu Leu Leu Ala Ser Arg Cys Ser Ile Glu

290 295 300

Val Val Tyr Thr Lys Tyr Pro Gly His Ala Ile Glu Ile Ala Arg Glu

305 310 315 320

Met Asp Ile Asp Lys Tyr Asp Thr Ile Ala Cys Ala Ser Gly Asp Gly

325 330 335

Ile Pro His Glu Val Ile Asn Gly Leu Tyr Gln Arg Pro Asp His Val

340 345 350

Lys Ala Phe Asn Asn Ile Ala Ile Thr Glu Ile Pro Cys Gly Ser Gly

355 360 365

Asn Ala Met Ser Val Ser Cys His Trp Thr Asn Asn Pro Ser Tyr Ser

370 375 380

Thr Leu Cys Leu Ile Lys Ser Ile Glu Thr Arg Ile Asp Leu Met Cys

385 390 395 400

Cys Ser Gln Pro Ser Tyr Ala Arg Glu His Pro Lys Leu Ser Phe Leu

405 410 415

Ser Gln Thr Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Thr Asp Ile Asn Thr Glu Phe

420 425 430

Ile Arg Trp Met Gly Pro Ala Arg Phe Glu Leu Gly Val Ala Phe Asn

435 440 445

Ile Ile Gln Lys Lys Lys Tyr Pro Cys Glu Ile Tyr Val Lys Tyr Ala

450 455 460

Ala Lys Ser Lys Asn Glu Leu Lys Asn His Tyr Leu Glu His Lys Asn

465 470 475 480

Lys Gly Ser Leu Glu Phe Gln His Ile Thr Met Asn Lys Asp Asn Glu

485 490 495

Asp Cys Asp Asn Tyr Asn Tyr Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Glu Asn Glu

500 505 510

Asp Glu Asp Glu Asp Ala Asp Ala Asp Asp Glu Asp Ser His Leu Ile

515 520 525

Ser Arg Asp Leu Ala Asp Ser Ser Ala Asp Gln Ile Lys Glu Glu Asp

530 535 540

Phe Lys Ile Lys Tyr Pro Leu Asp Glu Gly Ile Pro Ser Asp Trp Glu

545 550 555 560

Arg Leu Asp Pro Asn Ile Ser Asn Asn Leu Gly Ile Phe Tyr Thr Gly

565 570 575

Lys Met Pro Tyr Val Ala Ala Asp Thr Lys Phe Phe Pro Ala Ala Leu

580 585 590

Pro Ser Asp Gly Thr Met Asp Met Val Ile Thr Asp Ala Arg Thr Ser

595 600 605

Leu Thr Arg Met Ala Pro Ile Leu Leu Gly Leu Asp Lys Gly Ser His

610 615 620

Val Leu Gln Pro Glu Val Leu His Ser Lys Ile Leu Ala Tyr Lys Ile

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Ile Pro Lys Leu Gly Asn Gly Leu Phe Ser Val Asp Gly Glu Lys Phe

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Pro Leu Glu Pro Leu Gln Val Glu Ile Met Pro Arg Leu Cys Lys Thr

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Leu Leu Arg Asn Gly Arg Tyr Val Asp Thr Asp Phe Asp Ser Met

675 680 685

<210> 13

<211> 1038

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 13

atgaacacta ccacatctac tgttatagca gcagttgccg accagttcca gtctttgaac 60

tcttcttctt catgtttctt gaaggttcat gttccttcca ttgagaaccc attcggtatt 120

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ttcgagttta ttcacaataa gactttcttg gctaacgggt atcatgctgt tagtattatt 240

atcgtttatt acattattat ctttggtggc caagctatct tacgcgcctt gaacgcctct 300

ccattaaagt ttaaattgct tttcgagata cacaacttgt ttttgacttc tatttctcta 360

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<210> 14

<211> 345

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<400> 14

Met Asn Thr Thr Thr Ser Thr Val Ile Ala Ala Val Ala Asp Gln Phe

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Gln Ser Leu Asn Ser Ser Ser Ser Cys Phe Leu Lys Val His Val Pro

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Ser Ile Glu Asn Pro Phe Gly Ile Glu Leu Trp Pro Ile Phe Ser Lys

35 40 45

Val Phe Glu Tyr Phe Ser Gly Tyr Pro Ala Glu Gln Phe Glu Phe Ile

50 55 60

His Asn Lys Thr Phe Leu Ala Asn Gly Tyr His Ala Val Ser Ile Ile

65 70 75 80

Ile Val Tyr Tyr Ile Ile Ile Phe Gly Gly Gln Ala Ile Leu Arg Ala

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Leu Asn Ala Ser Pro Leu Lys Phe Lys Leu Leu Phe Glu Ile His Asn

100 105 110

Leu Phe Leu Thr Ser Ile Ser Leu Val Leu Trp Leu Leu Met Leu Glu

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Gln Leu Val Pro Met Val Tyr His Asn Gly Leu Phe Trp Ser Ile Cys

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Ser Lys Glu Ala Phe Ala Pro Lys Leu Val Thr Leu Tyr Tyr Leu Asn

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Tyr Leu Thr Lys Phe Val Glu Leu Ile Asp Thr Val Phe Leu Val Leu

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Arg Arg Lys Lys Leu Leu Phe Leu His Thr Tyr His His Gly Ala Thr

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Ala Leu Leu Cys Tyr Thr Gln Leu Ile Gly Arg Thr Ser Val Glu Trp

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Val Val Ile Leu Leu Asn Leu Gly Val His Val Ile Met Tyr Trp Tyr

210 215 220

Tyr Phe Leu Ser Ser Cys Gly Ile Arg Val Trp Trp Lys Gln Trp Val

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Thr Arg Phe Gln Ile Ile Gln Phe Leu Ile Asp Leu Val Phe Val Tyr

245 250 255

Phe Ala Thr Tyr Thr Phe Tyr Ala His Lys Tyr Leu Asp Gly Ile Leu

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Pro Asn Lys Gly Thr Cys Tyr Gly Thr Gln Ala Ala Ala Ala Tyr Gly

275 280 285

Tyr Leu Ile Leu Thr Ser Tyr Leu Leu Leu Phe Ile Ser Phe Tyr Ile

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Gln Ser Tyr Lys Lys Gly Gly Lys Lys Thr Val Lys Lys Glu Ser Glu

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Val Ser Gly Ser Val Ala Ser Gly Ser Ser Thr Gly Val Lys Thr Ser

325 330 335

Asn Thr Lys Val Ser Ser Arg Lys Ala

340 345

<210> 15

<211> 1020

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 15

atgccattac ctccgtcaac attgaaccag aaatctaata gagtctactc tgtagctagg 60

gtgtacaaga atgcctgcga ggagagacca caagaatact gggactacga acaaggggtg 120

accatcgatt ggggaaagat ttccaattac gaaattatca acaaaattgg aagagggaaa 180

tattccgaag tgttcagcgg tagatgtatt gtaaacaacc agaagtgtgt tattaaagtt 240

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gacaacatta tgagagactt tacaaaaaaa tcgtggacac actttataac ctccgagacc 900

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gaaagattaa cagcaaagga ggctatggat cataagtttt tcaaaacgaa gtttgaataa 1020

<210> 16

<211> 339

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<400> 16

Met Pro Leu Pro Pro Ser Thr Leu Asn Gln Lys Ser Asn Arg Val Tyr

1 5 10 15

Ser Val Ala Arg Val Tyr Lys Asn Ala Cys Glu Glu Arg Pro Gln Glu

20 25 30

Tyr Trp Asp Tyr Glu Gln Gly Val Thr Ile Asp Trp Gly Lys Ile Ser

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Asn Tyr Glu Ile Ile Asn Lys Ile Gly Arg Gly Lys Tyr Ser Glu Val

50 55 60

Phe Ser Gly Arg Cys Ile Val Asn Asn Gln Lys Cys Val Ile Lys Val

65 70 75 80

Leu Lys Pro Val Lys Met Lys Lys Ile Tyr Arg Glu Leu Lys Ile Leu

85 90 95

Thr Asn Leu Thr Gly Gly Pro Asn Val Val Gly Leu Tyr Asp Ile Val

100 105 110

Gln Asp Ala Asp Ser Lys Ile Pro Ala Leu Ile Phe Glu Glu Ile Lys

115 120 125

Asn Val Asp Phe Arg Thr Leu Tyr Pro Thr Phe Lys Leu Pro Asp Ile

130 135 140

Gln Tyr Tyr Phe Thr Gln Leu Leu Ile Ala Leu Asp Tyr Cys His Ser

145 150 155 160

Met Gly Ile Met His Arg Asp Val Lys Pro Gln Asn Val Met Ile Asp

165 170 175

Pro Thr Glu Arg Lys Leu Arg Leu Ile Asp Trp Gly Leu Ala Glu Phe

180 185 190

Tyr His Pro Gly Val Asp Tyr Asn Val Arg Val Ala Ser Arg Tyr His

195 200 205

Lys Gly Pro Glu Leu Leu Val Asn Leu Asn Gln Tyr Asp Tyr Ser Leu

210 215 220

Asp Leu Trp Ser Val Gly Cys Met Leu Ala Ala Ile Val Phe Lys Lys

225 230 235 240

Glu Pro Phe Phe Lys Gly Ser Ser Asn Pro Asp Gln Leu Val Lys Ile

245 250 255

Ala Thr Val Leu Gly Thr Lys Glu Leu Leu Gly Tyr Leu Gly Lys Tyr

260 265 270

Gly Leu His Leu Pro Ser Glu Tyr Asp Asn Ile Met Arg Asp Phe Thr

275 280 285

Lys Lys Ser Trp Thr His Phe Ile Thr Ser Glu Thr Lys Leu Ala Val

290 295 300

Pro Glu Val Val Asp Leu Ile Asp Asn Leu Leu Arg Tyr Asp His Gln

305 310 315 320

Glu Arg Leu Thr Ala Lys Glu Ala Met Asp His Lys Phe Phe Lys Thr

325 330 335

Lys Phe Glu

<210> 17

<211> 651

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 17

atgattgacc gcactaaaaa cgaatctcca gcttttgaag agtctccgct tacccccaat 60

gtgtctaacc tgaaaccatt cccttctcaa agcaacaaaa tatccactcc agtgaccgac 120

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agactaagaa tatccatccc tggtattacg ggccgtgctc aaattagtta g 651

<210> 18

<211> 216

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<400> 18

Met Ile Asp Arg Thr Lys Asn Glu Ser Pro Ala Phe Glu Glu Ser Pro

1 5 10 15

Leu Thr Pro Asn Val Ser Asn Leu Lys Pro Phe Pro Ser Gln Ser Asn

20 25 30

Lys Ile Ser Thr Pro Val Thr Asp His Arg Arg Arg Arg Ser Ser Ser

35 40 45

Val Ile Ser His Val Glu Gln Glu Thr Phe Glu Asp Glu Asn Asp Gln

50 55 60

Gln Met Leu Pro Asn Met Asn Ala Thr Trp Val Asp Gln Arg Gly Ala

65 70 75 80

Trp Leu Ile His Ile Val Val Ile Val Leu Leu Arg Leu Phe Tyr Ser

85 90 95

Leu Phe Gly Ser Thr Pro Lys Trp Thr Trp Thr Leu Thr Asn Met Thr

100 105 110

Tyr Ile Ile Gly Phe Tyr Ile Met Phe His Leu Val Lys Gly Thr Pro

115 120 125

Phe Asp Phe Asn Gly Gly Ala Tyr Asp Asn Leu Thr Met Trp Glu Gln

130 135 140

Ile Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Thr Pro Thr Arg Lys Phe Leu Leu Ile

145 150 155 160

Val Pro Ile Val Leu Phe Leu Ile Ser Asn Gln Tyr Tyr Arg Asn Asp

165 170 175

Met Thr Leu Phe Leu Ser Asn Leu Ala Val Thr Val Leu Ile Gly Val

180 185 190

Val Pro Lys Leu Gly Ile Thr His Arg Leu Arg Ile Ser Ile Pro Gly

195 200 205

Ile Thr Gly Arg Ala Gln Ile Ser

210 215

<210> 19

<211> 1083

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 19

atgtcgatag tctacaataa aacaccatta ttacgtcaat tcttccccgg aaaggcttct 60

gcacaatttt tcttgaaata tgaatgcctt caaccaagtg gctccttcaa aagtagagga 120

atcggtaatc tcatcatgaa aagtgccatt cgaattcaaa aggacggtaa aagatctcct 180

caggttttcg ctagttctgg cggtaatgcc ggttttgctg ctgcaacagc atgtcaaaga 240

ctgtctctac catgtacagt cgtggttcct acagcgacaa agaagagaat ggtagataaa 300

atcaggaaca ccggtgccca ggttatcgtg agtggtgcct actggaaaga agcagatact 360

tttttaaaaa caaatgtcat gaataaaata gactctcagg tcattgagcc catttatgtt 420

catcccttcg ataatccgga tatttgggaa ggacattcat ctatgataga tgaaatagta 480

caagatttga aatcgcaaca tatttccgtg aataaggtta aaggcatagt atgcagcgtt 540

ggtggaggtg gtttatacaa tggtattatt caaggtttgg aaaggtatgg tttagctgat 600

aggatcccta ttgtgggggt ggaaacgaat ggatgtcatg ttttcaatac ttctttgaaa 660

ataggccaac cagttcaatt caagaagata acaagtattg ctacttctct aggaacggcc 720

gtgatctcta atcaaacttt cgaatacgct cgcaaataca acaccagatc cgttgtaata 780

gaggacaaag atgttattga aacctgtctt aaatatacac atcaattcaa tatggtgatt 840

gaaccggcat gtggcgccgc attgcatttg ggttacaaca ctaagatcct agaaaatgca 900

ctgggctcaa aattagctgc ggatgacatt gtgataatta ttgcttgtgg cggctcctct 960

aatactataa aggacttgga agaagcgttg gatagcatga gaaaaaaaga cactcctgta 1020

atagaagtcg ctgacaattt catatttcca gaaaaaaata ttgtgaattt aaaaagtgct 1080

tga 1083

<210> 20

<211> 360

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<400> 20

Met Ser Ile Val Tyr Asn Lys Thr Pro Leu Leu Arg Gln Phe Phe Pro

1 5 10 15

Gly Lys Ala Ser Ala Gln Phe Phe Leu Lys Tyr Glu Cys Leu Gln Pro

20 25 30

Ser Gly Ser Phe Lys Ser Arg Gly Ile Gly Asn Leu Ile Met Lys Ser

35 40 45

Ala Ile Arg Ile Gln Lys Asp Gly Lys Arg Ser Pro Gln Val Phe Ala

50 55 60

Ser Ser Gly Gly Asn Ala Gly Phe Ala Ala Ala Thr Ala Cys Gln Arg

65 70 75 80

Leu Ser Leu Pro Cys Thr Val Val Val Pro Thr Ala Thr Lys Lys Arg

85 90 95

Met Val Asp Lys Ile Arg Asn Thr Gly Ala Gln Val Ile Val Ser Gly

100 105 110

Ala Tyr Trp Lys Glu Ala Asp Thr Phe Leu Lys Thr Asn Val Met Asn

115 120 125

Lys Ile Asp Ser Gln Val Ile Glu Pro Ile Tyr Val His Pro Phe Asp

130 135 140

Asn Pro Asp Ile Trp Glu Gly His Ser Ser Met Ile Asp Glu Ile Val

145 150 155 160

Gln Asp Leu Lys Ser Gln His Ile Ser Val Asn Lys Val Lys Gly Ile

165 170 175

Val Cys Ser Val Gly Gly Gly Gly Leu Tyr Asn Gly Ile Ile Gln Gly

180 185 190

Leu Glu Arg Tyr Gly Leu Ala Asp Arg Ile Pro Ile Val Gly Val Glu

195 200 205

Thr Asn Gly Cys His Val Phe Asn Thr Ser Leu Lys Ile Gly Gln Pro

210 215 220

Val Gln Phe Lys Lys Ile Thr Ser Ile Ala Thr Ser Leu Gly Thr Ala

225 230 235 240

Val Ile Ser Asn Gln Thr Phe Glu Tyr Ala Arg Lys Tyr Asn Thr Arg

245 250 255

Ser Val Val Ile Glu Asp Lys Asp Val Ile Glu Thr Cys Leu Lys Tyr

260 265 270

Thr His Gln Phe Asn Met Val Ile Glu Pro Ala Cys Gly Ala Ala Leu

275 280 285

His Leu Gly Tyr Asn Thr Lys Ile Leu Glu Asn Ala Leu Gly Ser Lys

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Asp Ile Val Ile Ile Ile Ala Cys Gly Gly Ser Ser

305 310 315 320

Asn Thr Ile Lys Asp Leu Glu Glu Ala Leu Asp Ser Met Arg Lys Lys

325 330 335

Asp Thr Pro Val Ile Glu Val Ala Asp Asn Phe Ile Phe Pro Glu Lys

340 345 350

Asn Ile Val Asn Leu Lys Ser Ala

355 360

<210> 21

<211> 978

<212> DNA

<213> Pichia ciferrii

<400> 21

atgtcctccc atcaattctt gatcaatcaa actactttgg ctgctccacc agttcatttg 60

gttgaaaaac catctttgat caacggtatc ccagataaca ttttggcttt gattgctcca 120

gttatcgcct actattctta ctctggtttc ttctacgtta tcgacacctt ggaaattgcc 180

gaattataca gaattcaccc accagaagaa gtctccagta gaaacaaagc tactaagttc 240

gatgttttga aggacgttgt cttgcaacac ttcatccaat ctgttgttgg ttacatcttc 300

acctacttcg acccaattca atacactggt gatgaagaat atcaagcctg gaagttgcaa 360

caaactttgc catttttgcc tttcgatgtt gcttactact ggaatatgta tggttggtcc 420

tgtttgaaga ttggtttggc cttcttgatt atcgactctt ggcaatattg gttgcacaga 480

atcatgcatt tgaacaagac cttgtacaaa agattccact ccagacacca cagattatat 540

gttccatatg cttttggtgc cttgtataac gatccattcg aaggtttttt gttggatact 600

ttgggtactg gtattgctgc tatcgttact caattgactc caagagaatc cattgtcttg 660

tacactttct ctaccttgaa aaccgttgat gatcattgcg gttattcctt gccatatgat 720

ccattccaaa tcttgttccc aaacaactcc atctaccatg atatccatca tcaacaattc 780

ggtatcaaga ccaacttctc tcaaccattt ttcacccatt gggacgtttt ctctaacacc 840

agatacaaag aaatcgacga atacagagaa aagcaaaagg ctattaccat tgccaagtac 900

aaagaatttt tacacgacag agaaatcgcc aagcaaaaga agaaagctga aatctacaag 960

gacaaaaaga ctgattaa 978

<210> 22

<211> 325

<212> PRT

<213> Pichia ciferrii

<400> 22

Met Ser Ser His Gln Phe Leu Ile Asn Gln Thr Thr Leu Ala Ala Pro

1 5 10 15

Pro Val His Leu Val Glu Lys Pro Ser Leu Ile Asn Gly Ile Pro Asp

20 25 30

Asn Ile Leu Ala Leu Ile Ala Pro Val Ile Ala Tyr Tyr Ser Tyr Ser

35 40 45

Gly Phe Phe Tyr Val Ile Asp Thr Leu Glu Ile Ala Glu Leu Tyr Arg

50 55 60

Ile His Pro Pro Glu Glu Val Ser Ser Arg Asn Lys Ala Thr Lys Phe

65 70 75 80

Asp Val Leu Lys Asp Val Val Leu Gln His Phe Ile Gln Ser Val Val

85 90 95

Gly Tyr Ile Phe Thr Tyr Phe Asp Pro Ile Gln Tyr Thr Gly Asp Glu

100 105 110

Glu Tyr Gln Ala Trp Lys Leu Gln Gln Thr Leu Pro Phe Leu Pro Phe

115 120 125

Asp Val Ala Tyr Tyr Trp Asn Met Tyr Gly Trp Ser Cys Leu Lys Ile

130 135 140

Gly Leu Ala Phe Leu Ile Ile Asp Ser Trp Gln Tyr Trp Leu His Arg

145 150 155 160

Ile Met His Leu Asn Lys Thr Leu Tyr Lys Arg Phe His Ser Arg His

165 170 175

His Arg Leu Tyr Val Pro Tyr Ala Phe Gly Ala Leu Tyr Asn Asp Pro

180 185 190

Phe Glu Gly Phe Leu Leu Asp Thr Leu Gly Thr Gly Ile Ala Ala Ile

195 200 205

Val Thr Gln Leu Thr Pro Arg Glu Ser Ile Val Leu Tyr Thr Phe Ser

210 215 220

Thr Leu Lys Thr Val Asp Asp His Cys Gly Tyr Ser Leu Pro Tyr Asp

225 230 235 240

Pro Phe Gln Ile Leu Phe Pro Asn Asn Ser Ile Tyr His Asp Ile His

245 250 255

His Gln Gln Phe Gly Ile Lys Thr Asn Phe Ser Gln Pro Phe Phe Thr

260 265 270

His Trp Asp Val Phe Ser Asn Thr Arg Tyr Lys Glu Ile Asp Glu Tyr

275 280 285

Arg Glu Lys Gln Lys Ala Ile Thr Ile Ala Lys Tyr Lys Glu Phe Leu

290 295 300

His Asp Arg Glu Ile Ala Lys Gln Lys Lys Lys Ala Glu Ile Tyr Lys

305 310 315 320

Asp Lys Lys Thr Asp

325

<210> 23

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

taagtgctgg atagacaaga gacaggaaaa ttaaccagcg agatgccagc tgaagcttcg 60

tacgc 65

<210> 24

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

tcaagggcaa attgatgctt caacgaaaaa gttattggat tttcagcata ggccactagt 60

ggatctg 67

<210> 25

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

aagactatac cattataaaa acgcataaga aacagtttca tcatgccagc tgaagcttcg 60

tacgc 65

<210> 26

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

atatatatat atatatacat atatgcgtat aggcagagcc aactagcata ggccactagt 60

ggatctg 67

<210> 27

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

aaatagaagg aacaataaac ctaaaagaat agaagaaaca gaatgccagc tgaagcttcg 60

tacgctgc 68

<210> 28

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

tggtggaaaa agaattgcct tgctaagagt attgttgtcc aattaccgca taggccacta 60

gtggatctg 69

<210> 29

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

aagtctagca gcgaaaagta cgcgaagaat ctactataga taatgccagc tgaagcttcg 60

tacgc 65

<210> 30

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

ttttacaaaa aaatcatttt tgaaggaaaa tataacgtta atctagcata ggccactagt 60

ggatctg 67

<210> 31

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

aaaccacaaa tagtgtaaga tttaaacagt aagccaaaag agatgccagc tgaagcttcg 60

tacgc 65

<210> 32

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

ttgattaatt gttcagtacg aaggaaaaga ttaagtaaag tgtcagcata ggccactagt 60

ggatctg 67

<210> 33

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

ttattcggct tttttccgtt tgtttacgaa acataaacag tcatgccagc tgaagcttcg 60

tacgct 66

<210> 34

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

ttttttcttt ttcattcgct gtcaaaaatt ctcgcttcct atttagcata ggccactagt 60

ggatctg 67

<210> 35

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

gatggcgcgc caacaaaccg aagttatctg atgtag 36

<210> 36

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

gaagcttcag ctggcggccg ccatgattta tcttcgtttc ctgcag 46

<210> 37

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

ctagtggcct atgcggccgc taaaaaactg tattataagt aaatgcatg 49

<210> 38

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

gatggcgcgc ccccaagcct tgtcccaagg ca 32

<210> 39

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

gatggcgcgc cccacgacgc tttgtcttca ttc 33

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

tcactagcgg ccgccatctt tgccttcgtt tatcttgc 38

<210> 41

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

aagatggcgg ccgctagtga caccgattat ttaaagctg 39

<210> 42

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

aagatggcgg ccgctagtga caccgattat ttaaagctg 39

<210> 43

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

gatggcgcgc cctcaggtat cgtaagatgc aagag 35

<210> 44

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

tttttagcgg ccgccattag aatggtatat ccttgaaa 38

<210> 45

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

ctaatggcgg ccgctaaaaa gattctcttt ttttatgata tttg 44

<210> 46

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

gatggcgcgc cctacgtcgt taaggccgtt tctg 34

<210> 47

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

agatcttaag gggatatctt aatggggagc gctgattctc ttttggt 47

<210> 48

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

gggaacctcg aggatatcat gtccacaaaa tcatatacca gtagagctg 49

<210> 49

<211> 3638

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒

<400> 49

cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat 60

taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat 120

tgtaatacga ctcactatag ggcgaccctt aggatctaag cattggcgcg ccccggctgt 180

ctgccatgct gcccggtgta ccgacataac cgccggtggc atagccgcgc atacgcgtct 240

ccagcgtgtt ttatctctgc gagcataatg cctgcgtcat ccgccagcag gagctggact 300

ttactgatgc ccgttatatc tgcgaaaaga ccgggatctg gacccgtgat ggcattctct 360

ggttttcgtc atccggtgaa gagattgagc cacctgacag tgtgaccttt cacatctgga 420

cagcgtacag cccgttcacc acctgggtgc agattgtcaa agactggatg aaaacgaaag 480

gggatacggg aaaacgtaaa accttcgtaa acaccacgct cggtgagacg tgggaggcga 540

aaattggcga acgtccggat gctgaagtga tggcagagcg gaaagagcat tattcagcgc 600

ccgttcctga ccgtgtggct tacctgaccg ccggtatcga ctcccagctg gaccgctacg 660

aaatgcgcgt atggggatgg gggccgggtg aggaaagctg gctgattgac cggcagatta 720

ttatgggccg ccacgacgat gaacagacgc tgctgcgtgt ggatgaggcc atcaataaaa 780

cctatacccg ccggaatggt gcagaaatgt cgatatcccg tatctgctgg gatactggac 840

gcgttttccc gtctttcagt gccttgttca gttcttcctg acgggcggta tatttctcca 900

gcttggcgcg cctaagactt agatcttaag gggatatcct cgaggttccc tttagtgagg 960

gttaattgcg agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 1020

gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 1080

atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 1140

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 1200

tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 1260

agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 1320

aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 1380

gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 1440

tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 1500

cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 1560

ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 1620

cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 1680

atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 1740

agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 1800

gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 1860

gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 1920

tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 1980

agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 2040

gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 2100

aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 2160

aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 2220

ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 2280

gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 2340

aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 2400

ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 2460

tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 2520

ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 2580

cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 2640

agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 2700

gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 2760

gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 2820

acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 2880

acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 2940

agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 3000

aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 3060

gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 3120

tccccgaaaa gtgccacctg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 3180

ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 3240

cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 3300

ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 3360

tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 3420

gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 3480

ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 3540

gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttgcca 3600

ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgat 3638

<210> 50

<211> 3819

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒

<400> 50

cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat 60

taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat 120

tgtaatacga ctcactatag ggcgaccctt aggatctaag cattggcgcg cccccaagcc 180

ttgtcccaag gcagcgtttt gttcttggaa acgctgccct acacgttcgc tatgcttcaa 240

gaacttttct gagcacttca tgatgcatgt ttgttcctta ttggttagct ttgatgttgt 300

gaagtcattg acacagtctg tgaaacatct ttctaccaga ttagagtaca aacgcatgaa 360

atccttcatt tgcttttgtt ccactacttt ttggaactct tgttgttctt tggagttcaa 420

tgcgtccatc tttacagtcc tgtcttattg ttcttgattt gtgccccgta aaatactgtt 480

acttggttct ggcgaggtat tggatagttc ctttttataa aggccatgaa gctttttctt 540

tccaattttt tttttttcgt cattatagaa atcattacga ccgagattcc cgggtaataa 600

ctgatataat taaattgaag ctctaatttg tgagtttagt atacatgcat ttacttataa 660

tacagttttt tagcggccgc catgatttat cttcgtttcc tgcaggtttt tgttctgtgc 720

agttgggtta agaatactgg gcaatttcat gtttcttcaa caccacatat gcgtatatat 780

accaatctaa gtctgtgctc cttccttcgt tcttccttct gctcggagat taccgaatca 840

aaaaaatttc aaagaaaccg gaatcaaaaa aaagaacaaa aaaaaaaaag atgaattgaa 900

aagctttatg gaccctgaaa ccacagccac attaaccttc tttgatggtc aaaacttatc 960

cttcaccata aatatgcctc gcaaaaaagg taattaacat atatagaatt acattattta 1020

tgaaatatca tcactatctc ttagcatctt taatcctttt ctacatcaga taacttcggt 1080

ttgttggcgc gcctaagact tagatcttaa ggggatatcc tcgaggttcc ctttagtgag 1140

ggttaattgc gagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 1200

cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 1260

aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 1320

acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 1380

ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 1440

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 1500

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 1560

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 1620

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 1680

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 1740

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 1800

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 1860

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 1920

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 1980

agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 2040

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 2100

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 2160

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 2220

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 2280

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 2340

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 2400

tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 2460

tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 2520

gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 2580

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<223> 质粒

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ctcacaggtt ttgtaacaag caatcgaagg ttctggaatg gcgggaaagg gtttagtacc 7440

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tctctctttc aaacagaatt gtccgaatcg tgtgacaaca acagcctgtt ctcacacact 7560

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atatatataa acttgcataa attggtcaat gcaagaaata catatttggt cttttctaat 7680

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<210> 53

<211> 8241

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒

<400> 53

cgcgcctgat gagcctgaac tgcccgggca aatcagctgg cgtaatagcg aagaggcccg 60

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caaatatgct tcccagcctg cttttctgta acgttcaccc tctaccttag catcccttcc 780

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cacggttcta tactgttgac ccaatgcgtc tcccttgtca tctaaaccca caccgggtgt 900

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gataacaaaa tctttgtcgc tcttcgcaat gtcaacagta cccttagtat attctccagt 1020

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aaatgggtaa agcgcggtgg cactagaaaa gatgatgagg tggtgttcct tggtttgctc 5340

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ggcgtcgaga atgcatgttt tccttgaagt gattctacaa catatcatac agaccattgt 7320

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caatttgttc caaactaact ttaaagggtt tgaagaatat caaaagaagc aaagacgtgt 7920

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<210> 54

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒

<400> 54

tcgctattac gccagctgat ttgcccgggc agttcaggct catcaggcgc gccatgcagg 60

atgcattgat cagttaaccc atgggcatgc gaaggaaaat gagaaatatc gagggagacg 120

attcagagga gcaggacaaa ctataaccga ctgtttgttg gaggatgccg tacataacga 180

acactgctga agctaccatg tctacagttt agaggaatgg gtacaactca caggcgaggg 240

atggtgttca ctcgtgctag caaacgcggt gggagcaaaa agtagaatat tatcttttat 300

tcgtgaaact tcgaacactg tcatctaaag atgctatata ctaatatagg catacttgat 360

aatgaaaact ataaatcgta aagacataag agatccgcgg atccccgggt cgagcctgaa 420

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catcgccaat tggagtattt tgttgataat ggtctgctag ttgaacggat ccatcttcaa 660

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taaaatcaat accttttaac tcgatacgat taacaagggt atcaccttca aacttgactt 840

cagcacgcgt cttgtagttc ccgtcatctt tgaaagatat agtgcgttcc tgtacataac 900

cttcgggcat ggcactcttg aaaaagtcat gccgtttcat atgatccgga taacgggaaa 960

agcattgaac accataagag aaagtagtga caagtgttgg ccatggaaca ggtagttttc 1020

cagtagtgca aataaattta agggtaagct ggccctgcag gccaagcttt gttttatatt 1080

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tctaagaact tgaaaaacta cgaattagaa aagaccaaat atgtatttct tgcattgacc 1200

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ttgcttgtta caaaacctgt gagccgtcgc taggaccttg ttgtgtgacg aaattggaag 1500

ctgcaatcaa taggaagaca ggaagtcgag cgtgtctggg ttttttcagt tttgttcttt 1560

ttgcaaacaa atcacgagcg acggtaattt ctttctcgat aagaggccac gtgctttatg 1620

agggtaacat caattcaaga aggagggaaa cacttccttt ttctggccct gataatagta 1680

tgagggtgaa gccaaaataa aggattcgcg cccaaatcgg catctttaaa tgcaggtatg 1740

cgatagttcc tcactctttc cttactcacg agtaattctt gcaaatgcct attatgcaga 1800

tgttataata tctgtgcgta gatctgatat ccctgcatgg cgcgcctgat gagcctgaac 1860

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tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 2700

agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 2760

agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 2820

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cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 2940

actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 3000

aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 3060

cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 3120

ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 3180

cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 3240

ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 3300

cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 3360

ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 3420

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ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 3540

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<210> 55

<211> 6979

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒

<220>

<221> misc_feature

<222> (2382)..(2382)

<223> n是a, c, g, 或t

<400> 55

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gcattttcca ggtatgctca gaaaacgcct ggcgatccct gaacatgtcc atcaggttct 3600

tgcgaacctc atcactcgtt gcatcgaccg gtaatgcagg caaattttgg tgtacggtca 3660

gtaaattgga catttaacac tcagataatg gttttaagta aagtgtacag gatcggctct 3720

gcccctcgac ggtatcgata agcttgatat cgaattcctg cagcccgggg gatccactag 3780

ttctagaatc cggggttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt 3840

ttgttgatac ttttattaca tttgaataag aagtaataca aaccgaaaat gttgaaagta 3900

ttagttaaag tggttatgca gtttttgcat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat 3960

cgcttcgctg attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccta 4020

tggttgttaa tttgattcgt tcatttgaag gtttgtgggg ccaggttact gccaattttt 4080

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atcgttaatc gaatgtatat ctatttaatc tgcttttctt gtctaataaa tatatatgta 6780

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<211> 1704

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因缺失构建体

<400> 56

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ggatctgata tcacctaata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tattaagggt 120

tctcgagagc tcgttttcga cactggatgg cggcgttagt atcgaatcga cagcagtata 180

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tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact 480

caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc 540

caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat 600

caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag cttatgcatt tctttccaga 660

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tatgggctaa atgtacgggc gacagtcaca tcatgcccct gagctgcgca cgtcaagact 1500

gtcaaggagg gtattctggg cctccatgtc gctggccggg tgacccggcg gggacgaggc 1560

aagctaaaca gatctctaga cctaataact tcgtatagca tacattatac gaagttatat 1620

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tgtctcttgt ctatccagca ctta 1704

<210> 57

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因缺失构建体

<400> 57

aagtctagca gcgaaaagta cgcgaagaat ctactataga taatgccagc tgaagcttcg 60

tacgctgcag gtcgacaacc cttaatataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120

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tccttcaaaa atgatttttt tgtaaaa 1467

<210> 58

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因缺失构建体

<400> 58

aaaccacaaa tagtgtaaga tttaaacagt aagccaaaag agatgccagc tgaagcttcg 60

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<210> 59

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因缺失构建体

<400> 59

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<210> 60

<211> 1706

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因缺失构建体

<400> 60

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<211> 1467

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<220>

<223> 基因缺失构建体

<400> 61

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<210> 62

<211> 4602

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因缺失构建体

<400> 62

cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat 60

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tcttatgatg gttttttgga attattatta tcctaccatc aagcgtctga cattgctgca 720

gatttctcca tctcacttta tatttggtgg catttctacc acttttttcc aacagtggtt 780

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<210> 63

<211> 4583

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因缺失构建体

<400> 63

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ctttgtcttc attcaacgtt tcccattgtt tttttctact attgctttgc tgtgggaaaa 240

acttatcgaa agatgacgac tttttcttaa ttctcgtttt aagagcttgg tgagcgctag 300

gagtcactgc caggtatcgt ttgaacacgg cattagtcag ggaagtcata acacagtcct 360

ttcccgcaat tttctttttc tattactctt ggcctcctct agtacactct atattttttt 420

atgcctcggt aatgattttc attttttttt tccacctagc ggatgactct ttttttttct 480

tagcgattgg cattatcaca taatgaatta tacattatat aaagtaatgt gatttcttcg 540

aagaatatac taaaaaatga gcaggcaaga taaacgaagg caaagatggc ggccgctagt 600

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ttatgttcct cctcacttaa gaggaaaacc aagaagtgcc agaaataaca gtagcaacta 1020

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accttaggat ctctaccctt ggcgaaaagt cctctgccaa caatgatgat atctgatcca 1200

ccacttacaa cttcgtcgac ggttctgtac tgctgaccca atgcatcgcc tttgtcgtct 1260

aaacctacac ctggggtcat gattagccaa tcaaaccctt cttctcttcc tcccatatcg 1320

ttctgagcaa tgaacccaat aacgaaatct ttatcactct ttgcaatatc aacggtaccc 1380

ttagtatatt caccgtgtgc tagagaaccc ttggaagaca attcagcaag catcaataat 1440

ccccttggtt ctttggtgac ctcttgcgca ccttgtttca agccagcaac aataccagca 1500

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gtatattgta atttgactgt gttaccgata tcggcgaatt ttctgtcctc aaatatcaag 1620

aacttgtatt tctctgccaa tgctttcaat ggaacgacag taccctcata actgaaatca 1680

tccaagatat caacgtgtgt tttcaaaagg caaatgtatg gacccaacgt ttcaacaagt 1740

ttcaatagct catcagtcga acgaacgtca agagaagcac acaaattggt cttcttttca 1800

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caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 2040

cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 2100

gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 2160

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 2220

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 2280

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 2340

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 2400

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 2460

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 2520

gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 2580

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 2640

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 2700

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 2760

cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 2820

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 2880

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 2940

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 3000

attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 3060

ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 3120

tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 3180

aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 3240

acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 3300

aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 3360

agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 3420

ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 3480

agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 3540

tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 3600

tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 3660

attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 3720

taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 3780

aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 3840

caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 3900

gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 3960

cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 4020

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 4080

acctgacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt 4140

gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct 4200

cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg 4260

atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag 4320

tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa 4380

tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga 4440

tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa 4500

atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt tgccattcgc cattcaggct 4560

gcgcaactgt tgggaagggc gat 4583

<210> 64

<211> 4598

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因缺失构建体

<400> 64

cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat 60

taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat 120

tgtaatacga ctcactatag ggcgaccctt aggatctaag cattggcgcg ccctcaggta 180

tcgtaagatg caagagttcg aatctcttag caaccattat ttttttcctc aacataacga 240

gaacacacag gggcgctatc gcacagaatc aaattcgatg actggaaatt ttttgttaat 300

ttcagaggtc gcctgacgca tatacctttt tcaactgaaa aattgggaga aaaaggaaag 360

gtgagagcgc cggaaccggc ttttcatata gaatagagaa gcgttcatga ctaaatgctt 420

gcatcacaat acttgaagtt gacaatatta tttaaggacc tattgttttt tccaataggt 480

ggttagcaat cgtcttactt tctaactttt cttacctttt acatttcagc aatatatata 540

tatatatttc aaggatatac cattctaatg gcggccgcta aaaagattct ctttttttat 600

gatatttgta cataaacttt ataaatgaaa ttcataatag aaacgacacg aaattacaaa 660

atggaatatg ttcatagggt agacgaaact atatacgcaa tctacataca tttatcaaga 720

aggagaaaaa ggaggatgta aaggaataca ggtaagcaaa ttgatactaa tggctcaacg 780

tgataaggaa aaagaattgc actttaacat taatattgac aaggaggagg gcaccacaca 840

aaaagttagg tgtaacagaa aatcatgaaa ctatgattcc taatttatat attggaggat 900

tttctctaaa aaaaaaaaaa tacaacaaat aaaaaacact caatgacctg accatttgat 960

ggagtttaag tcaatacctt cttgaaccat ttcccataat ggtgaaagtt ccctcaagaa 1020

ttttactctg tcagaaacgg ccttaacgac gtagggcgcg cctaagactt agatcttaag 1080

gggatatctt aatggggagc gctgattctc ttttggtacg cttcccatcc agcatttctg 1140

tatctttcac cttcaacctt aggatctcta cccttggcga aaagtcctct gccaacaatg 1200

atgatatctg atccaccact tacaacttcg tcgacggttc tgtactgctg acccaatgca 1260

tcgcctttgt cgtctaaacc tacacctggg gtcatgatta gccaatcaaa cccttcttct 1320

cttcctccca tatcgttctg agcaatgaac ccaataacga aatctttatc actctttgca 1380

atatcaacgg tacccttagt atattcaccg tgtgctagag aacccttgga agacaattca 1440

gcaagcatca ataatcccct tggttctttg gtgacctctt gcgcaccttg tttcaagcca 1500

gcaacaatac cagcaccagt aaccccgtgg gcgttggtga tatcagacca ttctgcgata 1560

cggtaaacgc ccgatgtata ttgtaatttg actgtgttac cgatatcggc gaattttctg 1620

tcctcaaata tcaagaactt gtatttctct gccaatgctt tcaatggaac gacagtaccc 1680

tcataactga aatcatccaa gatatcaacg tgtgttttca aaaggcaaat gtatggaccc 1740

aacgtttcaa caagtttcaa tagctcatca gtcgaacgaa cgtcaagaga agcacacaaa 1800

ttggtcttct tttcatccat taaacgtaaa agtttcgatg caaccggact tgcatgagtc 1860

tcagctctac tggtatatga ttttgtggac atgatatcct cgaggttccc tttagtgagg 1920

gttaattgcg agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 1980

gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 2040

atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 2100

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 2160

tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 2220

agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 2280

aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 2340

gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 2400

tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 2460

cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 2520

ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 2580

cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 2640

atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 2700

agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 2760

gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 2820

gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 2880

tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 2940

agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 3000

gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 3060

aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 3120

aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 3180

ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 3240

gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 3300

aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 3360

ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 3420

tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 3480

ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 3540

cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 3600

agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 3660

gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 3720

gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 3780

acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 3840

acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 3900

agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 3960

aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 4020

gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 4080

tccccgaaaa gtgccacctg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 4140

ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 4200

cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 4260

ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 4320

tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 4380

gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 4440

ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 4500

gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttgcca 4560

ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgat 4598

<210> 65

<211> 686

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 65

gatctcagtt cgagtttatc attatcaata ctgccatttc aaagaatacg taaataatta 60

atagtagtga ttttcctaac tttatttagt caaaaaatta gccttttaat tctgctgtaa 120

cccgtacatg cccaaaatag ggggcgggtt acacagaata tataacatcg taggtgtctg 180

ggtgaacagt ttattcctgg catccactaa atataatgga gcccgctttt taagctggca 240

tccagaaaaa aaaagaatcc cagcaccaaa atattgtttt cttcaccaac catcagttca 300

taggtccatt ctcttagcgc aactacagag aacaggggca caaacaggca aaaaacggac 360

acaacctcaa tggagtgatg caacctgcct ggagtaaatg atgacacaag gcaattgacc 420

cacgcatgta tctatctcat tttcttacac cttctattac cttctgctct ctctgatttg 480

gaaaaagctg aaaaaaaagg ttgaaaccag ttccctgaaa ttattcccct acttgactaa 540

taagtatata aagacggtag gtattgattg taattctgta aatctatttc ttaaacttct 600

taaattctac ttttatagtt agtctttttt ttagttttaa aacaccaaga acttagtttc 660

gaataaacac acataaacaa acaaaa 686

<210> 66

<211> 559

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 66

gtttagttaa ttatagttcg ttgaccgtat attctaaaaa caagtactcc ttaaaaaaaa 60

accttgaagg gaataaacaa gtagaataga tagagagaaa aatagaaaat gcaagagaat 120

ttatatatta gaaagagaga aagaaaaatg gaaaaaaaaa aataggaaaa gccagaaata 180

gcactagaag gagcgacacc agaaaagaag gtgatggaac caatttagct atatatagtt 240

aactaccggc tcgatcatct ctgcctccag catagtcgaa gaagaatttt ttttttcttg 300

aggcttctgt cagcaactcg tattttttct ttcttttttg gtgagcctaa aaagttccca 360

cgttctcttg tacgacgccg tcacaaacaa ccttatgggt aatttgtcgc ggtctgggtg 420

tataaatgtg tgggtgcaac atgaatgtac ggaggtagtt tgctgattgg cggtctatag 480

ataccttggt tatggcgccc tcacagccgg caggggaagc gcctacgctt gacatctact 540

atatgtaagt atacggccc 559

<210> 67

<211> 750

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 67

acgcacagat attataacat ctgcataata ggcatttgca agaattactc gtgagtaagg 60

aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc gcgaatcctt 120

tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt ttccctcctt 180

cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga aattaccgtc 240

gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc tcgacttcct 300

gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag cgacggctca 360

caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt agtaccacat 420

gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg ttactctctc 480

tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca cacactcttt 540

tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac atttacatat 600

atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt tctaattcgt 660

agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc aaggaagtaa 720

ttatctactt tttacaacaa atataaaaca 750

<210> 68

<211> 532

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 68

agttataata atcctacgtt agtgtgagcg ggatttaaac tgtgaggacc ttaatacatt 60

cagacacttc tgcggtatca ccctacttat tcccttcgag attatatcta ggaacccatc 120

aggttggtgg aagattaccc gttctaagac ttttcagctt cctctattga tgttacacct 180

ggacacccct tttctggcat ccagttttta atcttcagtg gcatgtgaga ttctccgaaa 240

ttaattaaag caatcacaca attctctcgg ataccacctc ggttgaaact gacaggtggt 300

ttgttacaca tgctaatgca aaggagccta tatacctttg gctcggctgc tgtaacaggg 360

aatataaagg gcagcataat ttaggagttt agtgaacttg caacatttac tattttccct 420

tcttacgtaa atatttttct ttttaattct aaatcaatct ttttcaattt tttgtttgta 480

ttcttttctt gcttaaatct ataactacaa aaaacacata cataaactaa aa 532

<210> 69

<211> 413

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 69

ttagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca 60

tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc 120

tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt 180

tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat 240

tttttttttt gatttttttc tctttcgatg acctcccatt gatatttaag ttaataaacg 300

gtcttcaatt tctcaagttt cagtttcatt tttcttgttc tattacaact ttttttactt 360

cttgctcatt agaaagaaag catagcaatc taatctaagt tttaattaca aaa 413

<210> 70

<211> 326

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 70

ggcacgtccg acggcggccc gacgggtccg aggcctcgga gatccgtccc ccttttcctt 60

tgtcgatatc atgtaattag ttatgtcacg cttacattca cgccctcccc ccacatccgc 120

tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt atttttttat 180

agttatgtta gtattaagaa cgttatttat atttcaaatt tttctttttt ttctgtacag 240

acgcgtgtac gcatgtaaca ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt tgggacgctc 300

gaaggcttta atttgcaagc tgcatg 326

<210> 71

<211> 352

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 71

acaaatcgct cttaaatata tacctaaaga acattaaagc tatattataa gcaaagatac 60

gtaaattttg cttatattat tatacacata tcatatttct atatttttaa gatttggtta 120

tataatgtac gtaatgcaaa ggaaataaat tttatacatt attgaacagc gtccaagtaa 180

ctacattatg tgcactaata gtttagcgtc gtgaagactt tattgtgtcg cgaaaagtaa 240

aaattttaaa aattagagca ccttgaactt gcgaaaaagg ttctcatcaa ctgtttaaaa 300

ggaggatatc aggtcctatt tctgacaaac aatatacaaa tttagtttca aa 352

<210> 72

<211> 311

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 72

ggatctctta tgtctttacg atttatagtt ttcattatca agtatgccta tattagtata 60

tagcatcttt agatgacagt gttcgaagtt tcacgaataa aagataatat tctacttttt 120

gctcccaccg cgtttgctag cacgagtgaa caccatccct cgcctgtgag ttgtacccat 180

tcctctaaac tgtagacatg gtagcttcag cagtgttcgt tatgtacggc atcctccaac 240

aaacagtcgg ttatagtttg tcctgctcct ctgaatcgtc tccctcgata tttctcattt 300

tccttcgcat g 311

<210> 73

<211> 352

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 73

ataaagcact cttgatgagg ataatgattt ttttttgaat atacataaat actaccgttt 60

ttctgctaga ttttgtgaag acgtaaataa gtacatatta ctttttaagc caagacaaga 120

ttaagcatta actttaccct tttctcttct aagtttcaat actagttatc actgtttaaa 180

agttatggcg agaacgtcgg cggttaaaat atattaccct gaacgtggtg aattgaagtt 240

ctaggatggt ttaaagattt ttcctttttg ggaaataagt aaacaatata ttgctgcctt 300

tgcaaaacgc acatacccac aatatgtgac tattggcaaa gaacgcaacg cg 352

<210> 74

<211> 292

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 74

ttcttcgcca gaggtttggt caagtctcca atcaaggttg tcggcttgtc taccttgcca 60

gaaatttacg aaaagatgga aaagggtcaa atcgttggta gatacgttgt tgacacttct 120

aaataagcga atttcttatg atttatgatt tttattatta aataagttat aaaaaaaata 180

agtgtataca aattttaaag tgactcttag gttttaaaac gaaaattctt attcttgagt 240

aactctttcc tgtaggtcag gttgctttct caggtatagc atgaggtcgc tc 292

Claims (17)

1.生产目标物质的方法，所述方法包括：

在培养基中培养具有生产所述目标物质的能力的酵母；和

从所述酵母的细胞和/或所述培养基收集所述目标物质，

其中以使由LCB4和CKA2基因编码的蛋白质的表达和/或活性降低的方式对所述酵母进行了修饰，且

其中所述目标物质选自植物鞘氨醇(PHS)和二氢神经鞘氨醇(DHS)。

2.根据权利要求1的方法，其中通过弱化所述LCB4和/或CKA2基因的表达，或通过破坏所述LCB4和/或CKA2基因来降低所述蛋白质的活性。

3.根据权利要求1或2的方法，其中通过使所述LCB4和/或CKA2基因缺失来降低所述蛋白质的活性。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中由所述LCB4基因编码的蛋白质是下述(A)、(B)或(C)中定义的蛋白质：

(A)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的蛋白质；

(B)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列但包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有鞘氨醇碱激酶活性的蛋白质；

(C)包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有鞘氨醇碱激酶活性的蛋白质。

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中由所述CKA2基因编码的蛋白质是下述(A)、(B)或(C)中定义的蛋白质：

(A)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的蛋白质；

(B)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列但包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有酪蛋白激酶2活性的蛋白质；

(C)包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有酪蛋白激酶2活性的蛋白质。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中以使一种或多种蛋白质的表达和/或活性降低的方式对所述酵母进行了进一步的修饰，所述一种或多种蛋白质选自由LCB5、ELO3、ORM2和CHA1基因编码的蛋白质。

7.根据权利要求6的方法，其中通过弱化编码所述一种或多种蛋白质的相应基因的表达或通过破坏编码所述一种或多种蛋白质的相应基因来降低所述一种或多种蛋白质的活性。

8.根据权利要求6或7的方法，其中通过使编码所述一种或多种蛋白质的相应基因缺失来降低所述一种或多种蛋白质的活性。

9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中以使一种或多种蛋白质的表达和/或活性增加的方式对所述酵母进行了进一步的修饰，所述一种或多种蛋白质选自由LCB1、LCB2、TSC10和SUR2基因编码的蛋白质。

10.根据权利要求9的方法，其中通过增加编码所述一种或多种蛋白质的相应基因的表达来增加所述一种或多种蛋白质的活性。

11.根据权利要求9或10的方法，其中通过以增加所述基因的拷贝数的方式进行修饰和/或通过修饰所述基因的表达控制序列来增加所述基因的表达。

12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其中所述植物鞘氨醇选自C16PHS、C18PHS，C20PHS、C18:1PHS、C20:1PHS、4-(羟甲基)-2-甲基-6-十四酰-1,3-恶嗪烷-5-醇和4-(羟甲基)-2-甲基-6-十六酰-1,3-恶嗪烷-5-醇。

13.根据权利要求1至12中任一项的方法，其中所述培养基含有能够联合、结合、增溶和/或捕获所述目标物质的添加剂。

14.根据权利要求13的方法，其中所述添加剂选自环糊精和沸石。

15.根据权利要求1至14中任一项的方法，其中所述酵母属于酵母属。

16.根据权利要求1至15中任一项的方法，其中所述酵母是酿酒酵母。

17.根据权利要求1至16中任一项的方法，其中所述酵母能够在培养基或所述酵母的细胞中以比未修饰的菌株可获得的量更大的量生产和积累所述目标物质。