CN114729387A

CN114729387A - 遗传修饰真菌和与其相关方法和用途

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Publication number: CN114729387A
Application number: CN202080064513.2A
Authority: CN
Inventors: 西莫·埃利拉; 玛哈·伊尔门; 玛雅-莉娜·维康基
Original assignee: FF Future Oy
Current assignee: FF Future Oy
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2020-08-28
Publication date: 2022-07-08
Also published as: FI20195716A1; EP4022078A1; WO2021038135A1; MX2022002419A; US20220275409A1; CA3152819A1; BR112022002866A2

Abstract

本发明涉及工业生物技术、可再生原始材料和微生物生产生物体的领域。具体地说，本发明涉及生产乳酸或乳酸酯或一种或多种选自由聚合物、聚酯和聚乳酸组成的组的产物的方法。本发明还涉及包含增加的特定酶活性的遗传修饰真菌、制备所述遗传修饰真菌的方法、和所述真菌用于生产乳酸、乳酸酯或聚合物的用途。

Description

遗传修饰真菌和与其相关方法和用途

发明领域

本发明涉及工业生物技术、可再生原料材料和微生物生产生物体的领域。具体地说，本发明涉及生产乳酸或乳酸酯或一种或多种选自由聚合物、聚酯和聚乳酸组成的组的产物的方法。本发明还涉及包含增加的特定酶活性的遗传修饰真菌、制备所述遗传修饰真菌的方法、和所述真菌用于生产乳酸、乳酸酯或聚合物的用途。

发明背景

乳酸发酵是例如葡萄糖和其他己糖(六碳糖)或六碳糖的双糖(例如蔗糖或乳糖)藉以转化成能量和乳酸的厌氧代谢过程。目前在美国，乳酸由玉米淀粉生产，并且在其他地方，由诸如甜菜和甘蔗的其他糖来源生产。所述淀粉和糖来源主要包含简单碳水化合物。生产乳酸用于食物用途，但是也作为生产聚乳酸(PLA)的前体。PLA是越来越多地用于制造生物塑料的可再生聚合物。对于PLA生产来说，需要通常不由野生型微生物生产的光学纯异构体。

需要用于生产乳酸的更便宜和生态相容的原料。举例来说，细菌唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)已用于将大豆糖蜜转化成乳酸(Montelongo J等人,1993,Journal of food science,第58卷,863-866)。然而，仍然存在对于能够将复杂碳水化合物诸如低聚半乳糖转化成乳酸的有效真菌的显著未满足的需要。

发明简述

本发明的目标，即获得生产乳酸和/或乳酸酯的有效方法以及获得能够有效地将碳水化合物转化成乳酸和/或乳酸酯的真菌通过使用真菌的遗传修饰来实现。

本发明使得能够克服现有技术的缺陷，包括但不限于缺乏能够将复杂碳水化合物(包括但不限于碳水化合物大豆糖蜜)转化成乳酸的真菌。事实上，与例如玉米淀粉和蔗糖相比，本发明的真菌和方法允许使用替代碳源物以工业规模生产乳酸。因此，本发明通过允许利用包含复杂碳水化合物的工业侧流来为生态发展提供价值。

目前，例如PLA的成本与合成塑料不具有竞争性。然而，本发明允许降低聚合物诸如PLA或聚酯的生产成本。

意外地，本发明的真菌和方法使得能够以有利于工业经济运行的高产率、滴度和生产力来生产纯L-乳酸异构体。

本发明涉及生产乳酸和/或乳酸酯的方法，所述方法包括

提供经遗传修饰来增加乳酸脱氢酶和α-半乳糖苷酶活性的真菌，

在包含碳源物(例如包含低聚半乳糖的碳源物)的培养基中培养所述真菌来获得乳酸和/或乳酸酯。

另外，本发明涉及包含增加的乳酸脱氢酶和α-半乳糖苷酶活性的遗传修饰真菌。

本发明还涉及制备包含增加的乳酸脱氢酶和α-半乳糖苷酶活性的本发明的遗传修饰真菌的方法，其中所述方法包括提供真菌和遗传修饰真菌来增加乳酸脱氢酶和α-半乳糖苷酶活性。

此外，本发明涉及包含增加的乳酸脱氢酶和α-半乳糖苷酶活性的本发明的真菌用于生产乳酸和/或乳酸酯或用于生产聚合物，任选地聚酯或聚乳酸的用途。

并且此外，本发明涉及生产一种或多种选自由聚合物、聚酯和聚乳酸组成的组的产物的方法，所述方法包括在含有碳源物例如低聚半乳糖的培养基中培养本发明的遗传修饰真菌(包含增加的乳酸脱氢酶和α-半乳糖苷酶活性)以便生产乳酸，回收所得乳酸和使用回收的乳酸来生产聚合物、聚酯和/或聚乳酸。

本发明的其他目标、细节和优势由以下附图、详细说明和实施例而变得显而易知。

附图简述

图1示出使用半乳糖作为唯一碳源，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)和蜜生假丝酵母(Candida apicola)的各种野生型真菌菌株的生长。菌株的生长通过量化OD₆₀₀来评估。

图2示出使用半乳糖作为唯一碳源，表达乳酸脱氢酶(ldh)的四种真菌菌株的生长。菌株的生长通过量化OD₆₀₀来评估。

图3示出在具有1％蜜二糖或蜜三糖作为碳源的SC-Ura培养基上，表达编码α-半乳糖苷酶的不同基因的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株的生长。在30℃下，伴以220rpm振荡，菌株在24孔板中以4ml培养体积培养过夜。

图4示出来自亲代菌株(VTT-C-02453ura3Δ/ura3Δ)和表达不同α-半乳糖苷酶的衍生菌株的1:3稀释大豆糖蜜的24h培养物的通过HPLC量化的乙醇滴度(g/L)。

图5示出来自亲代菌株(VTT-C-02453ura3Δ/ura3Δ)和表达不同α-半乳糖苷酶的衍生菌株的1:3稀释大豆糖蜜的24h培养物的通过HPLC量化的残留糖(g/L)。

图6示出来自酿酒酵母E79-4和表达不同α-半乳糖苷酶的衍生菌株的生物反应器培养物的通过HPLC量化的乳酸(g/L)。菌株使用大豆糖蜜作为唯一碳源来生长。

图7示出来自酿酒酵母E79-4和表达不同α-半乳糖苷酶的衍生菌株的生物反应器培养物的量化残留低聚半乳糖(g/L)。菌株使用大豆糖蜜作为唯一碳源来生长。结果报告为蜜三糖、水苏糖、毛蕊花糖、蜜二糖、甘露三糖和甘露四糖的浓度的总和。

图8示出用于实施例1-4中的质粒的图谱。

图9揭示来自使用大豆糖蜜作为修饰酵母菌株VTT C-191026和表达额外不同α-半乳糖苷酶基因拷贝的菌株的碳源的摇瓶培养物的量化残留四和三糖。

图10揭示来自使用大豆糖蜜作为修饰酵母菌株VTT C-191026和修饰库德毕赤酵母(P.kudriavzevii)菌株VTT C-201040的碳源的摇瓶培养物的量化所生产乳酸和残留三和二糖。

图11示出用于实施例6中的质粒的图谱。

序列表

SEQ ID NO:1：α-半乳糖苷酶(黑曲霉(A.niger)aglC)之氨基酸序列

SEQ ID NO:2：α-半乳糖苷酶(里氏木霉(T.reesei)agl1)之氨基酸序列

SEQ ID NO:3：α-半乳糖苷酶(米黑根毛霉菌(Rhizomucor miehei)GAL36)之氨基酸序列

SEQ ID NO:4：α-半乳糖苷酶(赤霉菌(Gibberella)属F75 GAL36)之氨基酸序列

SEQ ID NO:5：α-半乳糖苷酶(费氏曲霉(Aspergillus fischeri)GAL27B)之氨基酸序列

SEQ ID NO:6：α-半乳糖苷酶(酿酒酵母MEL5)之氨基酸序列

SEQ ID NO:7：编码α-半乳糖苷酶(黑曲霉aglC)之多核苷酸序列

SEQ ID NO:8：编码α-半乳糖苷酶(里氏木霉agl1)之多核苷酸序列

SEQ ID NO:9：编码α-半乳糖苷酶(米黑根毛霉菌GAL36)之多核苷酸序列

SEQ ID NO:10：编码α-半乳糖苷酶(赤霉菌属F75 GAL36)之多核苷酸序列

SEQ ID NO:11：编码α-半乳糖苷酶(费氏曲霉GAL27B)之多核苷酸序列

SEQ ID NO:12：编码α-半乳糖苷酶(酿酒酵母MEL5)之多核苷酸序列

SEQ ID NO:13：引物32MEL5-ATG-F

SEQ ID NO:14:引物33MEL5-stopR

SEQ ID NO:15:质粒pMIE-16(黑曲霉aglC；Q9UUZ4)之密码子优化多核苷酸序列，

SEQ ID NO:16:质粒pMIE-17(里氏木霉agl1；Q92456)之密码子优化多核苷酸序列

SEQ ID NO:17:质粒pMIE-18(米黑根毛霉菌GAL36；H8Y263)之密码子优化多核苷酸序列

SEQ ID NO:18:质粒pMIE-19(赤霉菌属F75 GAL36；C6FJG8)之密码子优化多核苷酸序列

SEQ ID NO:19:质粒pMIE-20(费氏曲霉GAL27B；AJA29661.1)之密码子优化多核苷酸序列

SEQ ID NO:20:质粒pMIE-5(酿酒酵母MEL5)之多核苷酸序列

SEQ ID NO:21:引物2ScADH1-150F

SEQ ID NO:22:引物5ScADH1 stopR

SEQ ID NO:23:质粒pMIE-21B之多核苷酸序列

SEQ ID NO:24:质粒pMIE-24B之多核苷酸序列

SEQ ID NO:25:质粒pMIE-25B之多核苷酸序列

SEQ ID NO:26:质粒pMIE-26A之多核苷酸序列

SEQ ID NO:27:质粒pMIE-031之多核苷酸序列

SEQ ID NO:28:质粒pMIE-032之多核苷酸序列

SEQ ID NO:29:质粒pMIE-034之多核苷酸序列

SEQ ID NO:30:引物3ScPDC5-210F

SEQ ID NO:31:引物6ScPDC5 stopR

SEQ ID NO:32:引物4ScPDC5-136F

SEQ ID NO:33:质粒pMIE-8之多核苷酸序列

SEQ ID NO:34转化酶(酿酒酵母SUC2)之氨基酸序列

SEQ ID NO:35编码转化酶(酿酒酵母SUC2)之多核苷酸序列

SEQ ID NO:36质粒pMIPk124之多核苷酸序列

SEQ ID NO:37质粒pEKOPA8之多核苷酸序列

SEQ ID NO:38质粒pEKOPA9之多核苷酸序列

发明详述

本发明的目标通过增加乳酸脱氢酶活性和α-半乳糖苷酶活性来实现。本公开的发明人能够提供经遗传修饰来增加乳酸脱氢酶和α-半乳糖苷酶活性的真菌。

在生产乳酸和/或乳酸酯的本发明的方法中，经遗传修饰来增加乳酸脱氢酶和α-半乳糖苷酶活性的真菌在包含碳源物的培养基中培养以便获得所述乳酸和/或乳酸酯。

如在此使用，“乳酸”是指具有分子式CH₃CH(OH)CO₂H(化学式C₃H₆O₃)的有机酸。在行业中，乳酸发酵通过将碳源物(例如简单碳水化合物诸如葡萄糖、蔗糖或半乳糖)转化成乳酸的微生物来执行。

乳酸以两个立体异构体形式，D和L乳酸，和这些异构体的所谓外消旋混合物出现。在一个实施方案中，通过本发明的方法或遗传修饰真菌来生产的乳酸是L-乳酸异构体或D-乳酸异构体或其组合。在一个实施方案中，乳酸是光学纯乳酸异构体，任选地L-乳酸异构体。如在此使用，“光学纯乳酸异构体”是指基本上只包含一种立体异构体形式的乳酸并且不包含其镜像(例如约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多(例如99.5％或更多)的一种立体异构体形式的乳酸)的溶液或固体。

本发明的有效真菌被工程化来水解碳水化合物并且将其转化成乳酸，例如光学纯L-乳酸。所述真菌用于在包含碳源物例如包含简单和/或复杂碳水化合物的碳源物的培养基中培养真菌来生产乳酸或乳酸酯的方法中。事实上，本发明使得能够在大规模生产过程期间操作和控制碳源，从而为制造商提供灵活性和对于所述过程的极好控制。如在此使用，“简单碳水化合物”是指简单糖，其可分类为单一糖(单糖)，包括葡萄糖、果糖和半乳糖，或双重糖(双糖)，包括蔗糖、乳糖和麦芽糖。如在此使用，“复杂碳水化合物”是指包含三个或更多个连接糖的多糖。事实上，与较短非多糖相比，分解多糖耗费更长时间。

意外地，在一个实施方案中，本发明的真菌和方法能够利用复杂碳水化合物，例如大豆糖蜜，作为碳源物。在本发明的具体实施方案中，碳源物包含复杂碳水化合物或是复杂碳水化合物。在更具体实施方案中，碳源物包含低聚半乳糖或是低聚半乳糖。发现于植物材料中的最常见低聚半乳糖是蜜三糖家族低聚糖(RFO)。这些分子是蔗糖的衍生物，具有额外α-(1→6)-连接半乳糖基部分。根据连接半乳糖基单元的数目的不同RFO糖包括蜜三糖(一个半乳糖单元)、水苏糖(两个半乳糖单元)、毛蕊花糖(三个半乳糖单元)和ajucose(四个半乳糖单元)。除了RFO以外，例如豆类可包含含有末端肌醇基团的其他低聚半乳糖，诸如属于碳水化合物的半乳糖肌醇、半乳糖松醇和荞麦醇系列的那些低聚半乳糖。在本发明的一个实施方案中，碳源物包含所述碳源物中的总碳水化合物的至少约10重量％、20重量％、30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、或90重量％的复杂碳水化合物或低聚半乳糖，和/或所述碳源物中的总碳水化合物的至少约10重量％、20重量％、30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％或90重量％的简单碳水化合物(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖或麦芽糖或其任何组合)。

在本发明的一个实施方案中，碳源物包含一种或多种低聚半乳糖，其选自由以下组成的组：蜜二糖、甘露三糖、甘露四糖、蜜三糖、水苏糖、毛蕊花糖、ajucose、半乳糖肌醇、双半乳糖基肌醇、半乳糖松醇A、半乳糖松醇B、鹰嘴豆糖醇、荞麦醇B1、荞麦醇B2和其任何组合。在具体实施方案中，低聚半乳糖是来自由蜜三糖、水苏糖、毛蕊花糖、蜜二糖、甘露三糖和甘露四糖的组成的组的一个或多个。

在一个实施方案中，碳源物包含葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、纤维素和/或其任何组合。如在此使用，“淀粉”是指具有式(C₆H₁₀O₅)_n-(H₂O)的聚合物碳水化合物，即包含或由通过糖苷键接合的大量葡萄糖单元组成。如在此使用，“纤维素”是指具有式(C₆H₁₀O₅)_n的有机化合物，由多个(例如一百个至数千个)β(1-4)连接D-葡萄糖单元的直链组成的多糖。

用于本发明中的碳源物可获自或可来自任何含碳材料，例如不同含碳材料的组合。在一个实施方案中，碳源物来自豆类诸如大豆(例如，扁豆)、蚕豆、豌豆、鹰嘴豆、玉米(例如，玉米芯仁)、甘蔗(例如，植物)、甜菜(甜菜的甜菜头)、木质纤维素或其任何组合；且/或碳源物包括大豆糖蜜、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜和/或柑橘糖蜜。如在此使用，“木质纤维素”是指包含纤维素、半纤维素和木质素的材料。例如大豆、甘蔗、甜菜或柑橘的“糖浆”是指分别将扁豆、植物、甜菜或果实提纯成糖所得的产物。

在一个实施方案中其中培养真菌以便生产乳酸和/或乳酸酯的碳源物或培养基包含5-100重量％大豆糖蜜(例如，至少约5重量％、10重量％、20重量％、30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、或90重量％)。

举例来说，大豆糖蜜是生产大豆蛋白质浓缩物的副产物。这是通常注定用于生产动物饲料或甚至燃烧的低价值物流。然而，它可含有很高浓度的可增值的大豆碳水化合物(例如，>300g/L)。难题是这些糖是非传统低聚糖诸如蜜三糖和水苏糖，需要水解，然后所有产生的单糖葡萄糖、果糖和半乳糖需要代谢成产物。与例如玉米淀粉和蔗糖相比，大豆糖蜜是用于生产乳酸的更廉价原料的实例。大豆糖蜜可用作本身用于生产真菌乳酸的碳源物；没有额外营养物要求，从而进一步有助于最大限度地减少乳酸的生产成本。

为了生产乳酸，遗传修饰真菌在培养基中培养，所述培养基包含一种或多种适合碳源和任选地选自由以下组成的组的其他成分：氮或氮源(诸如氨基酸、蛋白质、无机氮源诸如氨或铵盐)、酵母萃取物、胨、无机物和维生素。在一个实施方案中，真菌的培养在本领域技术人员已知的合适条件下执行。合适培养条件，诸如温度、pH、细胞密度、营养物的选择等在本领域技术人员的知识范围内并且所述本领域技术人员能够选择、修改或控制所述条件。在具体实施方案中，培养温度为约25至45℃(例如，约30-35℃)且/或培养基的pH为2-10(例如，3-6)。自然地，合适培养条件可取决于特定真菌。培养条件可在生产乳酸或乳酸酯的方法期间保持或替代地，其可定期调整。在一个实施方案中，当一个以上罐用于生产乳酸或乳酸酯的方法中时，培养条件可能在不同罐中有所不同。

在本发明的一个实施方案中，乳酸或乳酸酯通过厌氧、准厌氧或需氧发酵来生产。

在一个实施方案中，真菌的培养以连续发酵方法或以分批或分批补料发酵方法来执行。

在本发明的一个实施方案中，在培养基中培养遗传修饰真菌之后，方法还包括从培养基中回收所得乳酸或乳酸酯。事实上，可在不干扰细胞的情况下执行从培养基中的回收。在一个实施方案中，在培养基中培养真菌之后，方法还包括分离和/或纯化乳酸或乳酸酯。本领域技术人员已知的任何合适方法可用于分离乳酸或乳酸酯。举例来说，常见分离技术可用于从培养基中移除生物质，并且常见隔离程序可用于从无真菌培养基中获得乳酸或乳酸酯。乳酸或乳酸酯可在其生产的同时加以分离，或它可在乳酸或乳酸酯生产终止之后从培养基中分离。乳酸和乳酸酯可通过使用在本领域中已知的任何常规方法来回收、分离和/或纯化，诸如吸附、离子交换程序、色谱方法、双相萃取、分子蒸馏、熔融结晶、萃取、蒸馏或其任何组合。

在一个实施方案中，用于生产方法期间的真菌得以回收并且重复使用于后续生产方法中。

PLA，一种热塑性脂族聚酯，可从乳酸，例如，从通过本发明的方法产生并且任选地回收、分离和/或纯化的乳酸中，通过包括但不限于以下的不同方法来制备：丙交酯(从乳酸衍生)与各种金属催化剂的开环聚合、乳酸单体的直接缩合、乳酸的聚合、使乳酸与沸石接触、PLA从乳酸的直接生物合成。在一个实施方案中，本发明的方法包括从所获得的乳酸来制备PLA。

本发明涉及遗传修饰酵母和与其相关的方法和用途，其中酵母具有增加的乳酸脱氢酶和α-半乳糖苷酶活性。用于本发明中的遗传修饰至少用于修改，更具体地说增加，乳酸脱氢酶和α-半乳糖苷酶的活性。乳酸脱氢酶允许生产乳酸和乳酸酯并且α-半乳糖苷酶使得能够降解和消耗复杂碳水化合物包括但不限于大豆糖蜜碳水化合物。

如在此使用，“乳酸脱氢酶活性”是指催化将丙酮酸酯转换成乳酸酯的能力。因此，“乳酸脱氢酶“是指具有将丙酮酸酯转化成乳酸酯的活性的蛋白质。L-乳酸脱氢酶(L-LDH)将丙酮酸酯转化成L-乳酸酯并且D-乳酸脱氢酶(D-LDH)将丙酮酸酯转化成D-乳酸酯。L-乳酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶分别分类为EC 1.1.1.27和EC 1.1.1.28。乳酸脱氢酶(LDH)不仅是指真菌或细菌(诸如米根霉或瑞士乳杆菌)而且是指来自任何微生物、生物体或哺乳动物例如牛的任何其他LDH同系物。另外，所有同功酶、同种型和变体包括在LDH的范围内。在具体实施方案中，LDH是L-LDH。相应地，米根霉ldhA(AF226154)和ldhB(AF226155)的LDH蛋白质和ldh基因在Skory(2000Appl.Environ.Microbiol.66:2343-2348)的文章中得以鉴定，并且瑞士乳杆菌ldhL(U07604)在Savijoki K.,Palva A.(1997.Appl.Environ.Microbiol.63:2850-2856)的文章中得以鉴定。合适开放解读码组(ORF)的实例包括但不限于米根霉ldhA(Q9P4B6)和ldhB(Q9P4B5)和瑞士乳杆菌ldhL(CAB03618)的ORF。举例来说，ldh1、ldh2、ldh3、ldh4、ldh5、ldh6A、ldh6B、ldhA、ldhB、ldhC和ldhL编码在ldh的范围内的相关但是不相同多肽。编码相关但是不相同多肽的基因的数目取决于所讨论的微生物或生物体。

如在此使用，“α-半乳糖苷酶活性”是指催化来自包括半乳糖和蜜三糖低聚糖、半乳甘露聚糖和半乳糖脂的各种α-半乳糖苷的非还原末端α-半乳糖基残基的水解的能力。因此，“α-半乳糖苷酶”是指具有水解来自各种α-半乳糖苷的非还原末端α-半乳糖基残基的活性的蛋白质。α-半乳糖苷酶分类为EC 3.2.1.22。α-半乳糖苷酶不仅是指真菌(诸如酿酒酵母)或细菌而且是指来自任何微生物或生物体的任何其他α-半乳糖苷酶同系物。另外，所有同功酶、同种型和变体包括在α-半乳糖苷酶的范围内。举例来说，(例如，里氏木霉)agl1、agl2和agl3，(例如，黑曲霉)aglA、aglB、aglC和aglD，和(例如，酿酒酵母)MEL1、MEL2、MEL5、和MEL6编码在α-半乳糖苷酶的范围内的相关但是不相同多肽。编码相关但是不相同多肽的基因的数目取决于所讨论的微生物或生物体。

本发明的工程化真菌包含增加蛋白质或酶活性的遗传修饰。如在此使用，“增加的蛋白质或酶活性”是指与野生型蛋白质相比，存在蛋白质的较高活性，或与未修饰细胞或真菌相比，细胞或真菌的较高总蛋白质活性。增加的蛋白质活性可由多肽表达的上调、基因表达的上调、基因的至少一部分的添加(包括基因拷贝的添加或通常在所述细胞或真菌中不存在的基因的添加)、蛋白质的增加和/或蛋白质的增加活性所引起。产生增加的蛋白质或酶活性的具体实例在实施例部分中提供。

细胞或真菌中的蛋白质活性的存在、不存在或量可通过在本领域中已知的任何合适方法来检测。合适检测方法的非限制实例包括市场上的商用试剂盒、酶测定、免疫检测方法(例如，对于所述蛋白质具有特异性的抗体)、基于PCR的测定(例如，qPCR、RT-PCR)、和其任何组合。在一个特定实施例中，乳酸脱氢酶的活性通过监测在乳酸锂和NAD+存在下培育酶或真菌之后的吸光度来确定，例如如Tokuhiro等人(2009,Appl Micro-biol Biotechnol82,883-890)所描述，且/或α-半乳糖苷酶的活性通过在将酶或真菌与对硝基苯基-α-吡喃半乳糖苷(pNPG)一起培育之后测量所释放的对硝基苯基(pNP)来确定，例如如Chen等人(2015,Protein Expression and purification,110,107-114)所描述，和/或通过在将酶或真菌与甲基伞形基-α-D-吡喃半乳糖苷(MUG)一起培育之后，测量所释放的甲基伞形基(MU)，例如如

等人(2010,J Microbiol Biotechnol,20(12),1653-1663)所描述。

导致增加的蛋白质活性的遗传修饰包括但不限于一或多个基因或其片段的遗传插入、缺失或中断或一或多个核苷酸的插入、缺失、中断或取代，或质粒的添加。如在此使用，“中断”是指将一个或多个核苷酸插入基因或多核苷酸序列中，导致不存在对应蛋白质或存在非功能性蛋白质或具有降低活性的蛋白质。

如在此使用，“基因或多肽表达的上调”是指通过与未修饰真菌相比，产生更多产物(例如，相应地mRNA或蛋白质)而导致基因或多肽的过度表达。举例来说，一种或多种基因的一或多个拷贝可转化至细胞中以便上调基因表达。术语还涵盖实施方案，其中调控区域诸如启动子或启动子区域得以修饰或改变或插入不天然存在于真菌中的调控区域(例如，启动子)以便允许基因的过度表达。另外，在“遗传修饰”中包括表观遗传修饰诸如减少DNA甲基化或组蛋白修饰，导致基因或多肽的表达上调。如在此使用，“增加或上调的表达”是指与没有遗传修饰的野生型真菌相比，所关注的基因或多肽的增加的表达。表达或增加的表达可例如通过蛋白质印迹、RNA印迹或DNA印迹或定量PCR或本领域技术人员已知的任何其他合适方法来证实。

在某些实施方案中，工程化真菌包含至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个)异源多核苷酸。任何插入多核苷酸或基因(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个)可对于宿主真菌来说是异源或同源的。真菌可通过将它用编码异源蛋白质的异源多核苷酸转化来遗传修饰。或者，例如异源启动子或其他调控序列可用于本发明的真菌中。如在此使用，“异源多核苷酸”是指不天然存在于细胞或真菌中的多核苷酸，即细胞或真菌正常地不包含所述多核苷酸。典型地所述异源多核苷酸通过重组技术来插入或修饰。

另一方面，任何插入多核苷酸或基因(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个)可与待遗传修饰的真菌相同或非常同源的。这样，例如与未遗传修饰真菌相比，真菌中的多核苷酸或基因的拷贝数可增加。或者，例如可利用与待遗传修饰的真菌相同或非常同源的启动子或其他调控序列。事实上，取决于所讨论的真菌，本发明的真菌可用通常包含在所述真菌中的多核苷酸来修饰。

在具体实施方案中，遗传修饰的真菌最初(即在所述遗传修饰之前)不包含ldh基因(例如，L-ldh基因)和/或α-半乳糖苷酶基因。

在本发明的方法、用途或遗传修饰真菌的一个实施方案中，α-半乳糖苷酶是异源α-半乳糖苷酶且/或乳酸脱氢酶是异源乳酸脱氢酶。

如果在本发明中利用异源α-半乳糖苷酶，那么它可以是来自任何合适生物体的α-半乳糖苷酶。在这种情况下，所述异源α-半乳糖苷酶必须在本发明中具有功能性。在一个实施方案中，异源α-半乳糖苷酶是例如选自以下属类的酵母或丝状真菌的α-半乳糖苷酶：曲霉(Aspergillus)、赤霉菌(Gibberella)、小克银汉霉(Cunninghamella)、镰刀菌(Fusarium)、球囊霉(Glomus)、腐质霉(Humicola)、被孢霉(Mortierella)、毛霉菌(Mucor)、青霉菌(Penicillium)、腐霉(Pythium)、根毛霉(Rhizomucor)、根霉(Rhizopus)、木霉(Trichoderma)和酵母属(Saccharomyces)，尤其由以下组成的组：玉米赤霉(Gibberellazeae)、中间赤霉(Gibberella intermdia)、串珠状赤霉(Gibberella moniliformis)、藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、尼加迈赤霉(Gibberella nygamai)、赤霉菌属F75、镰刀菌属2F75、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、芒果镰刀菌(Fusarium mangiferae)、层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)、轮状镰刀菌(Fusarium verticilloides)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、土曲霉(Aspergillusterreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、费氏曲霉(Aspergillus fischeri)、米黑根霉(Rhizopus miehei)、米黑根毛霉菌(Rhizomucor miehei)、米根霉(Rhizopus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在具体实施方案中，异源α-半乳糖苷酶是，或α-半乳糖苷酶基因是功能α-半乳糖苷酶基因，所述基因编码与例如黑曲霉、赤霉菌属F75、费氏曲霉、里氏木霉、酿酒酵母、米黑根毛霉菌物种中的任何一个的α-半乳糖苷酶基因所编码的蛋白质至少60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的蛋白质。

如果在本发明中利用异源乳酸脱氢酶，那么它可以是来自任何合适生物体，包括哺乳动物诸如牛的乳酸脱氢酶。在这种情况下，所述异源乳酸脱氢酶必须在本发明中具有功能性。在具体实施方案中，异源乳酸脱氢酶来自生物体、哺乳动物、微生物、真菌、或细菌，例如任选地来自哺乳动物诸如牛属(Bos)(例如黄牛(Bos taurus))，真菌诸如克鲁维斯酵母或根霉(例如耐热克鲁维斯酵母(Kluyveromyces thermotolerans)或米根霉)，或细菌诸如乳杆菌(例如瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)或干酪乳杆菌(L casei))，片球菌(例如乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici))或芽孢杆菌属(例如巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium))，或来自单细胞原生动物寄生虫例如疟原虫(例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum))。在具体实施方案中，异源乳酸脱氢酶是，或ldh基因是功能ldh基因，所述基因编码与例如瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸克鲁维斯酵母、巨大芽孢杆菌、乳酸片球菌、黄牛、米根霉或恶性疟原虫物种中的任何一个的L-ldh基因所编码的蛋白质至少40％、50％、60％、70％80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的蛋白质。特定D-ldh基因的实例是从瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、德氏乳杆菌(L.delbrueckiii)、植物乳杆菌(L.plantarum)、戊糖乳杆菌(L.pentosus)和嗜酸乳杆菌(P.acidilactici)获得的那些基因。与这些L-ldh或D-ldh基因相同或在氨基酸水平下与这些基因至少35％、60％、70％或80％相同的功能基因是合适的。在具体实施方案中，L-ldh基因从瑞士乳杆菌获得或与所述基因至少35％、60％、70％、80％、85％、90％或95％相同。另一个合适L-ldh基因从巨大芽孢杆菌获得或与所述基因至少35％、60％、70％、80％、85％、90％或95％相同。合适D-ldh基因从瑞士乳杆菌获得或与所述基因至少45％、60％、70％、80％、85％、90％或95％相同。

在本发明的一个实施方案中，将异源ldh和/或α-半乳糖苷酶基因整合到真菌细胞的基因组中。在具体实施方案中，将ldh和/或α-半乳糖苷酶基因整合到原生PDC基因的基因座中。异源ldh和/或α-半乳糖苷酶基因可例如在对于真菌细胞是原生或异源的启动子的转录控制下。在一个实施方案中，所述方法、用途或真菌可利用转化载体，所述载体包含与例如对于待遗传修饰的真菌是原生的启动子序列可操作地连接的功能ldh和/或α-半乳糖苷酶基因。可使用在不同类型启动子和/或终止子的控制下的不同异源ldh和/或α-半乳糖苷酶基因。

在一个实施方案中，转化真菌细胞可含有单一ldh基因和/或α-半乳糖苷酶基因，或多个ldh和/或α-半乳糖苷酶基因，诸如1-10个ldh和/或α-半乳糖苷酶基因，尤其1-5个ldh和/或α-半乳糖苷酶基因。当转化细胞含有多个ldh和/或α-半乳糖苷酶基因时，个别基因可以是同一基因的拷贝，或包括两个或更多个不同ldh和/或α-半乳糖苷酶基因的拷贝。异源和/或内源ldh和/或α-半乳糖苷酶基因的多个拷贝可整合在单一基因座处(以使得其彼此相邻)，或真菌细胞的基因组内的多个基因座处。举例来说，类似或不同ldh基因和/或α-半乳糖苷酶基因的两个拷贝可整合在二倍体真菌的同源等位基因处。

识别含有所关注的异源多核苷酸的细胞的方法是本领域技术人员熟知的。这些方法包括但不限于PCR和核酸杂交技术诸如RNA和DNA分析。在一些情况下，免疫组织化学和生物化学技术可用于通过检测所述特定核酸分子所编码的编码酶性多肽的表达来确定是否细胞含有特定核酸。举例来说，具有对于编码酶的特异性的抗体可用于确定是否特定细胞或真菌含有所述编码酶。此外，生物化学技术可用于通过检测由于酶性多肽的表达而生产的有机产物来确定是否细胞含有编码酶性多肽的特定核酸分子。

在本发明的方法、用途或真菌的一个实施方案中，真菌被遗传修饰来过度表达编码乳酸脱氢酶的基因和/或编码α-半乳糖苷酶的基因。“过度表达基因”是指当与没有所述修饰的真菌相比时，由于遗传修饰而导致的所述基因的上调表达。在具体实施方案中，所述修饰真菌包含编码乳酸脱氢酶的基因和/或编码α-半乳糖苷酶的基因的一或多个拷贝。

在本发明的方法、用途或真菌的一个实施方案中，编码乳酸脱氢酶的基因选自由以下组成的组：ldh1、ldh2、ldh3、ldh4、ldh5、ldh6A、ldh6B、ldhA、ldhB、ldhC和ldhL，且/或编码α-半乳糖苷酶的基因选自由以下组成的组：agl1、agl2、agl3、aglA、aglB、aglC、aglD、MEL1、MEL2、MEL5、和MEL6。

在一个实施方案中，除了导致乳酸脱氢酶和α半乳糖苷酶酶活性增加的遗传修饰以外，本发明的真菌可还包含一个或多个遗传修饰。在一个实施方案中，真菌进一步遗传修饰来降低乙醇生产。在具体实施方案中，真菌被遗传修饰以便通过修饰或缺失与乙醇生产相关的基因的至少一部分或通过灭活与乙醇生产相关的基因来降低乙醇生产。任选地与乙醇生产相关的一种或多种基因选自由以下组成的组：PDC1、PDC5、PDC6、ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、和ADH5、和其任何组合。在一个具体实施例中，PDC1和ADH1已缺失或修饰。在另一个具体实施方案中，PDC1和PDC5已缺失或修饰。在一个非常具体实施方案中，PDC1；PDC1和ADH1；PDC1和PDC5；ADH1和PDC5；或PDC5中的一或多个等位基因已缺失或修饰。

如在此使用，PDC基因是指编码丙酮酸酯脱羧酶的基因，所述酶催化将丙酮酸酯降解成乙醛和二氧化碳。至少PDC1、PDC5、和PDC6编码丙酮酸酯脱羧酶的不同同功酶。丙酮酸酯脱羧酶分类为EC 4.1.1.1。所有同功酶、同种型和变体包括在PDC的范围内。

如在此使用，ADH是指编码醇脱氢酶的基因，所述酶催化将乙醛转化成乙醇。酵母和大多数细菌使碳源物诸如葡萄糖发酵成乙醇和CO2。事实上，由糖酵解所产生的丙酮酸酯被转化成乙醛和二氧化碳，并且然后通过醇脱氢酶使乙醛还原成乙醇。至少ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、和ADH5编码醇脱氢酶的不同同功酶。醇脱氢酶分类为EC 1.1.1.1。所有同功酶、同种型和变体包括在ADH的范围内。

在一个实施方案中，与乙醇生产相关的一种或多种基因被修饰或至少部分地缺失或失活。在另一个实施方案中，不同于与乙醇生产相关的基因的任何其他基因被修饰或至少部分地缺失或失活。在本发明的一个实施方案中，真菌包含减少蛋白质或酶活性的遗传修饰。“降低活性”是指分别与野生型蛋白质或真菌相比，在特定蛋白质或修饰真菌中存在较小活性(如果有的话)，或与未修饰细胞或真菌相比，细胞或真菌中的较低活性(如果有的话)。降低活性可由多肽表达的下调、基因表达的下调、基因的至少一部分的缺乏、蛋白质的缺乏和/或蛋白质的降低活性所导致。存在用于减少蛋白质的活性的各种遗传技术并且所述技术是本领域技术人员熟知的。这些技术利用基因的核苷酸序列或基因附近的核苷酸序列。

在本发明的具体实施方案中，一或多个蛋白质失活。如在此使用，“失活”是指其中蛋白质的活性完全失活的情况，即细胞没有特定蛋白质的活性。基因可例如通过预防其表达或通过基因或其部分的突变或缺失而失活。在本发明的一个实施方案中，一或多个基因或其任何片段已缺失。在具体实施方案中，真菌通过缺失基因的至少一部分来遗传修饰。如在此使用，“基因的一部分”是指基因或其任何片段的一个或多个核苷酸。举例来说，基因敲除方法适合于缺失编码具有特定活性的多肽的核苷酸序列、其任何部分。

PDC和/或ADH基因的缺失或修饰可以各种方法实现，包括但不限于同源重组、破坏基因位点、反义分子或存在于细胞中的例如用于减少PDC和/或ADH基因的表达的杀伤质粒。

在本发明的方法、用途或真菌的一个实施方案中，真菌还包含选自由以下组成的组的一种或多种基因的遗传修饰：CYB2、GPD1、GPD2、GPP1、GPP2和其任何组合。CYB2编码使乳酸酯氧化的L-乳酸酯:细胞色素c氧化还原酶。GPD1、GPP1和GPP2是与甘油生物合成相关的基因。GPD1编码甘油-3-磷酸酯脱氢酶。GPP1和GPP2分别编码甘油-1-磷酸酯磷酸水解酶1和2。

本发明的遗传修饰真菌通过执行特定遗传修饰来获得。在一个实施方案中，遗传修饰真菌是重组真菌。如在此使用，“重组真菌”是指被遗传修饰以便与修饰之前的真菌相比，含有不同遗传物质(例如，与修饰之前的真菌相比，包含包括整个基因或其一部分的一种或多种核酸的缺失、取代、破坏或插入)的任何真菌。“重组真菌”另外是指包含所述遗传修饰的宿主细胞。

编码已知多肽的多核苷酸可使用常见分子或遗传技术来突变。核酸和氨基酸数据库(例如GenBank)可用于识别编码具有酶活性的多肽的多核苷酸序列。序列比对软件诸如BLAST(蛋白质或核苷酸)可用于比较各种序列。简单地说，与具有酶活性的多肽具有某种同源性的任何氨基酸序列，或与编码具有酶活性的多肽的序列具有某种同源性的任何核酸序列可用作搜索例如GenBank的查询。序列的一致性百分比可方便地使用具有默认参数的BLAST软件来计算。使用具有默认参数的BLAST算法，具有给定百分比的一致性评分和阳性评分的序列被认为所述百分比一致或同源的。

在本发明的具体实施方案中，用于本发明中的多肽包含与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、或6具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性的序列，或其酶活性片段或变异体。序列ID NO 1-6是α-半乳糖苷酶的多肽序列。在本发明的具体实施方案中，用于本发明中的多核苷酸包含与SEQ ID NO：7、8、9、10、11或12具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性的序列，或其活性片段或变异体。序列ID NO 7-12是α-半乳糖苷酶基因的核苷酸序列。

众所周知一个或少许氨基酸的缺失、添加或取代不一定改变酶类蛋白质的催化性质。因此本发明还涵盖具有规定酶活性的给定氨基酸序列的变体和片段。如在此使用的术语“变体”是指如与给定序列相比，具有氨基酸序列的轻微变化的序列。这种变体可例如作为相同菌株、物种或属类内的等位基因变体而自然地发生，或它可通过诱变或其他基因修饰来产生。它可包含氨基酸取代、缺失或插入，但是它仍然以与给定酶大致上相同的方式起作用，具体地说它保留其作为酶的催化功能。

给定蛋白质或多肽序列的“片段”意指所述序列的部分，例如在N和/或C末端处截短的序列。它可以例如是包含信号序列的蛋白质的成熟部分，或它可以只是成熟蛋白质的酶活性片段。

本发明基于真菌和与其相关方法和用途。各种真菌适合用于本发明中。在一个实施方案中，真菌是酵母或丝状真菌。在具体实施方案中，真菌是选自以下属类的酵母或丝状真菌：曲霉、酵母属、克鲁维斯酵母、毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母、丝孢酵母属(Trichosporon)、根霉、圆孢菌(Torulaspora)、伊萨酵母(Issatchenkia)和舍弗氏菌(Scheffersomyces)，例如尤其来自由以下组成的组：酿酒酵母、葡萄汁酵母(S.uvarum)、耐热克鲁维斯酵母、乳酸克鲁维斯酵母、马克斯克鲁维斯酵母、多形汉逊酵母、树干舍弗氏菌(Scheffersomyces stipitis)、米根霉、比勒陀利亚圆孢菌(Torulaspora pretoriensis)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、盔状毕赤酵母(P.galeiformis)、沙漠毕赤酵母(P.deserticola)、膜醭毕赤酵母(P.membranifaciens)、杰丁毕赤酵母(P.jadinii)、库德毕赤酵母(P.kudriavzevii)、异常毕赤酵母(P.anomala)、乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)、索诺拉假丝酵母(C.sonorensis)和蜜生假丝酵母(C.apicola)。

在本发明的方法、用途或真菌的一个实施方案中，真菌在登录号VTT C-191026或VTT C-201040下寄存于VTT保藏。根据用于专利程序目的寄存微生物的国际公认布达佩斯条约，以下菌株寄存于VTT培养物保藏，P.O.Box 1000(Vuorimiehentie 3),Fl-02044VTT,Finland：登录号VTT C-191026和登录号VTT C-201040。(关于VTT C-191026，参见实例3的E143-4；关于VTT C-201040，参见实例6。)

本发明的遗传修饰真菌可通过本领域技术人员已知的任何遗传方法来制备。所述方法包含至少提供真菌和遗传修饰真菌来增加乳酸脱氢酶和α-半乳糖苷酶活性。真菌或真菌细胞的遗传修饰在一或多个步骤中通过设计和构造合适载体和用所述载体来转化真菌细胞来实现。可使用电穿孔和/或化学(诸如基于氯化钙或乙酸锂)转化方法。转化真菌细胞的方法在本领域技术人员的知识范围内。可能遗传修饰的实例如上在本公开中描述。在一个实施方案中，将编码一或多个异源酶的一或多个多核苷酸添加至真菌或真菌细胞，并且任选地将编码一或多个内源酶的一或多个多核苷酸修饰(例如通过一或多个核苷酸的插入、缺失或取代)以便增加或降低所述真菌中的所述酶的活性。编码多肽的多核苷酸序列或多肽序列的知识可用于遗传修饰合适真菌。

当真菌存在于包含低聚半乳糖的发酵培养基中时，本发明的遗传修饰真菌能够水解来自各种α-半乳糖苷的非还原末端半乳糖基残基，消耗丙酮酸酯和生产乳酸和/或乳酸酯。在一个非常具体实施方案中，所述真菌可以高生产力和产率来生产L-乳酸。在一个实施方案中，本发明的真菌耐受高乳酸浓度。在一个非常具体实施方案中，真菌是被修饰以便最小程度地生产天然发酵产物乙醇并且替代地生产乳酸的酸耐受性真菌。

在本发明的一个实施方案中，真菌具有增加的乳酸生产。生产乳酸的方法可导致约30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、或130克/L或更大的乳酸滴度和/或约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g L^-1h^-1或更大的乳酸生产力。

在一个实施方案中，本发明的真菌具有极优异性能，以超过80％产率(即，g有机产物/g消耗碳源)、超过2g L^-1h^-1生产率来转化糖(例如大豆糖蜜糖)并且达到高滴度(多达129g/L乳酸)。

生产乳酸酯的方法可导致约30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、或130克/L或更大的乳酸酯滴度和/或约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g L^-1h^-1或更大的乳酸酯生产力。

检测乳酸、乳酸酯和/或低聚半乳糖的方法是本领域技术人员熟知的。举例来说，可使用色谱方法诸如HPLC和离子色谱。乳酸酯的存在可确定例如如Witte等人(1989,J.Basic Microbiol.29:707-716)所描述。

本发明的真菌可用于生产乳酸和/或乳酸酯或生产聚合物，任选地聚酯或聚乳酸。

生产一种或多种选自由聚合物、聚酯和聚乳酸组成的组的产物的本发明方法包括在含有碳源物(例如低聚半乳糖)的培养基中培养本发明的遗传修饰真菌以便生产乳酸，回收所得乳酸和使用回收的乳酸来生产聚合物、聚酯和/或聚乳酸。聚合物的生产是本领域技术人员熟知的方法，包括但不限于例如乳酸的聚合。

在本公开中，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用来意指任何长度的氨基酸的聚合物。如在此使用，“酶”是指能够加速或催化化学反应的蛋白质或多肽。

如在此使用，“多核苷酸”是指包含编码所讨论的多肽的核酸序列或其保守序列变异体的任何多核苷酸，诸如单链或双链DNA(基因组DNA或cDNA)或RNA。保守核苷酸序列变体(即，不显著改变所编码的多肽的生物性质的核苷酸序列修饰)包括由遗传密码的简并和沉默突变所产生的变体。

本领域技术人员显而易知，随着技术进步，本发明概念可以不同的方式实施。本发明和其实施方案不限于以下描述的实施例而是可在权利要求的范围内变化。

实施例

实施例1-半乳糖上的不同真菌物种的生长

在摇瓶培养中研究多个野生型和ldh表达真菌菌株在半乳糖上的生长。菌株在具有10mL SC培养基、酵母氮源和20g/L半乳糖作为碳源的50mL锥形瓶中培养。菌株的生长通过在培养过程期间量化光密度(OD₆₀₀)来评估。在野生型菌株(图1)之中，所有马克斯克鲁维酵母菌株能够在半乳糖上生长，而两种测试蜜生假丝酵母菌株都不展示可证明的生长。在表达编码L-乳酸脱氢酶的瑞士乳杆菌ldhL的菌株之中，仅酿酒酵母H5037(从野生型菌株C-02453衍生)生长较好，而属于毕赤酵母属、杰丁毕赤酵母、库德毕赤酵母、或异常毕赤酵母的菌株中没有一个能够在此糖上生长(图2)。最后，在真菌或酵母物种之间，存在其利用半乳糖作为碳源的能力的显著变化。

实施例2-真菌中的α-半乳糖苷酶活性的展示

酿酒酵母菌株VTT-C-02453从VTT培养物保藏接收。所有其他菌株是VTT-C-02453的后代。

酿酒酵母VTT-C-02453的尿苷营养缺陷型衍生物通过将URA3基因的蛋白质编码区域替换成赋予潮霉素抗性的hph基因来构建。hph表达盒侧接有loxP位点以便促进通过cre重组酶来进行标志物切除。两种URA3等位基因在二倍体宿主中缺失。

对于α-半乳糖苷酶的多拷贝游离基因表达，酿酒酵母MEL5基因(GenBank登录号Z37511)通过来自质粒pMLV18(pMEL5-39衍生物，Naumov等人1990.Mol Gen Genet224:119-128；Turakainen等人1994Yeast 10:1559-1568)使用引物32MEL5-ATG-F(SEQ ID NO：13)和33MEL5-stopR(SEQ ID NO：14)的PCR来扩增，用EcoRI和Asci消化，并且在酿酒酵母ENO1启动子与终止子之间克隆至pMI529中(Ilmén等人2011Biotech for Biofuels 4:30)，从而产生pMIE-005。通过Genscript(USA)，其他α-半乳糖苷酶编码基因的蛋白质编码区域得以合成并且优化以便在酿酒酵母中表达，并且pMIE-5中的MEL5基因通过合成基因来替换，产生质粒pMIE-16(黑曲霉aglC；Q9UUZ4)(SEQ ID NO：15)、pMIE-17(里氏木霉agl1；Q92456)(SEQID NO：16)、pMIE-18(米黑根毛霉菌GAL36；H8Y263)(SEQ ID NO：17)、pMIE-19(赤霉菌属F75GAL36；C6FJG8)(SEQ ID NO：18)、和pMIE-20(费氏曲霉GAL27B；AJA29661.1)(SEQ ID NO：19)。

使用乙酸锂方法(Gietz等人1992Nucleic Acids Res.20:1425.)，VTT-C-02453ura3Δ/ura3Δ用URA3可选择α-半乳糖苷酶表达载体pMIE-5(酿酒酵母MEL5)(SEQ IDNO：20)、pMIE-16(黑曲霉aglC)、pMIE-17(里氏木霉agl1)、pMIE-18(米黑根毛霉菌GAL36；H8Y263)、pMIE-19(赤霉菌属F75 GAL36；C6FJG8)、或pMIE-20(费氏曲霉GAL27B；AJA29661.1)中的每一个来转化。转化株在SCD-Ura培养基上选择，基于补充有5-溴基-4-氯基-3-吲哚基-α-D-吡喃半乳糖苷(α-X-gal)的琼脂板上的菌落的蓝色的形成，观察到α-半乳糖苷酶活性。

α-X-gal上的α-半乳糖苷酶基因活性在表达α-半乳糖苷酶的每个酵母转化株中观察到(数据未展示)。α-X-gal阳性转化株在含有1％蜜二糖或蜜三糖作为唯一碳源的液体SC-Ura-培养基中生长的能力在30℃下在220rpm振荡下在24孔板上在4ml o/n培养物中测试。包括含有功能URA3基因的亲本菌株作为阴性对照。表达酿酒酵母、黑曲霉、赤霉菌属、或费氏曲霉的α-半乳糖苷酶的转化株在蜜二糖上生长较好至8至12的OD₆₀₀，而缺少α-半乳糖苷酶的亲本菌株和带有里氏木霉或米黑根毛霉菌α-半乳糖苷酶基因的转化株的OD₆₀₀具有低于1的OD₆₀₀(图3)。相比之下，在蜜三糖上的生长不单独取决于α-半乳糖苷酶，因为转化酶将蜜三糖裂解成果糖和蜜二糖，并且果糖可被亲本菌株消耗。

pMIE-5(酿酒酵母MEL5)、pMIE-16(黑曲霉aglC)、pMIE-17(里氏木霉agl1)、pMIE-19(赤霉菌属F75 GAL36；C6FJG8)、和pMIE-20(费氏曲霉GAL27B；AJA29661.1)转化株(参见实例2)在24孔板上在1:3稀释大豆糖蜜中以4ml培养24小时以便证明菌株将不同糖转化成乙醇的能力。过滤样品在35℃，0.3mL/min流量的5mM H2SO4下在Aminex HPX-87H管柱(BioRad)上运作以便量化所生产乙醇和残留糖。所述方法不区分三糖(蜜三糖/甘露三糖)或双糖(蔗糖，蜜二糖)，并且不将果糖与半乳糖分离。当表达酿酒酵母MEL5、黑曲霉aglC、赤霉菌属F75 GAL36或费氏曲霉GAL27B时，相对于亲本菌株VTT-C-02453ura3Δ/ura3Δ，乙醇生产大大增加(图4)。通过这些菌株的大豆糖蜜低聚半乳糖(GOS)的消耗从HPLC结果中也是明显的(图5)。亲本菌株和表达里氏木霉AGL1的菌株展示显著残留二和三糖，而这些对于表达酿酒酵母MEL5、黑曲霉aglC、赤霉菌属F75 GAL36或费氏曲霉GAL27B的菌株来说是不明显的。

实施例3-构建表达LDH和不同α-半乳糖苷酶的真菌

VTT-C-02453中的ADH1基因通过将编码区域替换成PCR产物来缺失，所述PCR产物包含侧接有loxP位点的KanMX遗传霉素抗性盒，其使用引物2ScADH1-150F(SEQ ID NO：21)和5ScADH1stopR(SEQ ID NO：22)从pUG6(＝B901)扩增，获得缺失构建体2+5-ScADH1。

为了将不同α-半乳糖苷酶表达盒整合至酿酒酵母CAN1基因座中，pMIE-5、pMIE-16、pMIE-19、pMIE-20用Smal和Swal消化，去磷酸化，并且将含有α-半乳糖苷酶的片段连接至含有KanMX盒和CAN1同源性区域的B3033＝pMI-503的5177bp Mscl-EcoRV片段，分别产生pMIE-21B(SEQ ID NO：23)、pMIE-24B(SEQ ID NO：24)、pMIE-25B(SEQ ID NO：25)、pMIE-26A(SEQ ID NO：26)。

为了将编码L-乳酸脱氢酶的瑞士乳杆菌ldhL整合至PDC1基因座中，构建表达载体pMIE-8(SEQ ID NO：33)。它含有酿酒酵母PGK1启动子与ADH1终止子之间的瑞士乳杆菌ldhL和棉蚜(A.gossypii)TEF1启动子与终止子之间的赋予潮霉素抗性的大肠杆菌hph基因，围绕有用于标志物切除的loxP位点，和促进在PDC1基因座中同源重组的PDC1的5'和3'区域。

对于标志物切除，将cre重组酶在来自诺尔丝菌素可选择着丝粒载体cre-NAT的GAL1启动子下表达。

酿酒酵母使用PEG-乙酸锂方法(Gietz等人1992Nucleic Acids Res.20:1425)来转化。转化株在视情况补充有200μg/ml潮霉素、300μg/ml遗传霉素、或200μg/ml诺尔丝菌素的琼脂固化YPD培养基中选择。

VTT-C-02453用pMIE-8转化并且分离潮霉素抗性转化株E16。潮霉素抗性标志物通过将cre-重组酶表达载体pSK-70转化至E16中来切除并且分离诺尔丝菌素抗性转化株E23。E23用pMIE-8转化并且分离潮霉素抗性转化株E51-6。PCR分析指示PDC1编码区域不存在于E51-6中。E51-6用ADH1缺失盒转化并且分离G418抗性转化株E79-4、E79-5、E79-9和E79-10。PCR分析指示ADH1编码区域存在于E79-5、E79-9和E79-10中但是不存在于E79-4中，表明两种ADH1等位基因在E79-4中缺失。根据此情况，与E79-5、E79-9和E79-10相比，E79-4形成较小菌落。抗性标志物通过将cre-重组酶表达载体pSK-70转化至E79-4中来切除并且分离诺尔丝菌素抗性转化株。

转化株E79-4的无标记衍生物用Sacll-Scal消化pMIE-24B、pMIE-25B、和pMIE-26A转化，以便分别表达黑曲霉、赤霉菌属、和费氏曲霉的α-半乳糖苷酶基因。靶向α-半乳糖苷酶基因以便整合至CAN1基因座中。转化株基于遗传霉素抗性来选择，基于补充有α-X-gal的琼脂板上的菌落的蓝色的形成，观察到α-半乳糖苷酶活性。

菌株E142-1、E143-4(VTT C-191026)和E144-4分别表达黑曲霉、赤霉菌属F75和费氏曲霉的α-半乳糖苷酶基因。

针对乳酸生产和减少乙醇生产而从VTT-C-02453工程化的酿酒酵母菌株E79-4(对于ADH1基因缺失和ldhL整合，参见实施例2)在使用大豆糖蜜作为唯一碳源的生物反应器中培养。此菌株的乳酸生产与如实施例2所描述的表达整合至CAN1基因座中的不同异源α-半乳糖苷酶的衍生菌株进行比较。另外，亲代菌株E79-4用5U/mL初始剂量的商用α-半乳糖苷酶(BioCat AGF)来培养。菌株使用Infers Multifors生物反应器系统来培养。分批培养基包含高压处理的大豆糖蜜，其在反渗(RO)水中稀释至其原始体积的六分之一，以80g/LCaCO₃作为缓冲剂和1mL/L Adeka nol 109作为消泡剂。所使用的发酵条件是：温度-30℃，搅动-550rpm，通气-0,15LPM。所有菌株在摇瓶中的标准YPD培养基上预先培养2天。将细胞离心并且用水洗涤两次，然后将其重悬浮于发酵分批培养基中，然后接种于生物反应器中。将最初批次的细胞标准化以便对应于1的起始光密度(OD₆₀₀)。20小时发酵之后，将用RO水稀释至其原始体积三分之一的总计250mL高压灭菌大豆糖蜜以约8mL/h的速率馈送至反应器中。

每隔一定间隔，将样品从反应器中取出，并且将所生产的乳酸和残留碳水化合物量化。乳酸在35℃，0.3mL/min流量的5mM H₂SO₄下通过使用Aminex HPX-87H管柱(Bio Rad)的HPLC来量化。低聚半乳糖(GOS)使用Dionex ICS-3000系统和CarboPac PA1管柱来量化。总GOS报告为蜜三糖、水苏糖、毛蕊花糖、蜜二糖、甘露三糖和甘露四糖的浓度的总和。

结果证明，当真菌能够通过α-半乳糖苷酶的作用来利用蜜三糖家族低聚糖作为碳源时，乳酸生产显著增加(图6)。低聚半乳糖的降解可被视为培养上清液中的这些糖的显著减少(图7)。意外地，与使用添加商用酶获得的乳酸酯滴度相比，表达α-半乳糖苷酶的菌株达到更高乳酸酯滴度。

通过将第二α-半乳糖苷酶基因整合至其余CAN1等位基因中，α-半乳糖苷酶的表达水平在分别表达α-半乳糖苷酶黑曲霉或赤霉菌属F75的E142-1和E143-4(VTT C-191026)中进一步修饰。E142-1和E143-4(VTT C-191026)个别地用相应地带有黑曲霉aglC、赤霉菌属F75 GAL36和费氏曲霉GAL27B基因的Kpnl-Sapl消化pMIE-031(SEQ ID NO：27)、pMIE-032(SEQ ID NO：28)、和pMIE-034(SEQ ID NO：29)来转化。转化株基于潮霉素抗性来选择。缺失两种CAN1等位基因的转化株表达黑曲霉aglC(E157)、黑曲霉aglC和赤霉菌属F75 GAL36(E158，E160)的两个拷贝，赤霉菌属F75 GAL36(E161)和赤霉菌属F75 GAL36和费氏曲霉GAL27B(E162)的两个拷贝。乳酸的生产在如上所述的使用大豆糖蜜作为唯一碳源的生物反应器中展示。

实施例4-使用表达ldh和不同α-半乳糖苷酶的真菌来生产乳酸

PDC5基因通过将编码区域替换成PCR产物来缺失，所述PCR产物包含侧接有loxP位点的KanMX遗传霉素抗性盒，其使用引物3ScPDC5-210F(SEQ ID NO:30和6ScPDC5stopR(SEQID NO:31)从pUG6(＝B901)扩增。

VTT-C-02453用上述PDC5缺失盒转化并且分离G418抗性转化株E3。E3用Notl消化pMIE-8转化并且分离潮霉素抗性转化株E15。KanMX和潮霉素抗性标志物通过将cre-重组酶表达载体pSK-70转化至E15中来切除并且分离诺尔丝菌素抗性转化株E22。

E22用pMIE-8转化并且分离潮霉素抗性转化株。PCR分析指示PDC1编码区域不存在于转化株E68-1中。E68-1用PDC5缺失盒转化，所述盒通过使用引物4ScPDC5-136F(SEQ IDNO：32)和6ScPDC5stopR(SEQ ID NO：31)和pUG6质粒作为模板的PCR来制备，并且分离G418抗性转化株E82。转化株中PDC5编码区域的缺乏通过PCR来验证。

并行地，E22用PDC5缺失盒转化并且分离G418抗性株。PCR分析指示PDC5编码区域不存在于转化株E78-1中，表明两种PDC5等位基因在E78-1中缺失。E78-1用Notl消化pMIE-008转化以便缺失其余PDC1等位基因并且分离潮霉素抗性转化株。转化株E94中PDC1编码区域的缺乏通过PCR来验证。

缺失pdc1和pdc5的两个拷贝的转化株E82和E94用cre-重组酶表达载体pSK-70转化以便切除KanMX和潮霉素抗性标志物。转化株E82和E94的无标记衍生物用Sacll-Scal消化pMIE-24B、pMIE-25B、和pMIE-26A转化，以便分别表达黑曲霉、赤霉菌属、和费氏曲霉的α-半乳糖苷酶基因。靶向α-半乳糖苷酶基因以便整合至CAN1基因座中。转化株基于遗传霉素抗性来选择，基于补充有α-X-gal的琼脂板上的菌落的蓝色的形成，观察到α-半乳糖苷酶活性。乳酸的生产在如实施例3所描述的使用大豆糖蜜作为唯一碳源的生物反应器中展示。

图8示出实施例1-4中描述或提及的质粒的图谱。

实施例5-通过表达一种以上α-半乳糖苷酶的菌株来生产乳酸

菌株VTT C-191026(E143-4，参见实施例3)和含有另外α-半乳糖苷酶基因的三个菌株在摇瓶中使用大豆糖蜜作为碳源来培养。三个菌株包含赤霉菌属F75 GAL36，或黑曲霉aglC或费氏曲霉GAL27B的另外拷贝，如实施例3所描述。不同菌株的预培养物在30℃下在YPD培养基中生长过夜。细胞通过离心来收获并且重新悬浮于RO-H₂O中以便给出20的OD₆₀₀值。大豆糖蜜用RO-H₂O来稀释至其原始浓度三分之一并且使用标准高压釜液体循环(121℃，20min)来灭菌。将50毫升的这份经灭菌、稀释的大豆糖蜜添加至250mL锥形烧瓶，所述烧瓶用2.5g CaCO₃使用干燥循环(160℃，3h)来预先灭菌。将500微升的细胞悬浮液用于接种每个培养瓶，以获得对应于大约0.2的OD₆₀₀值的原始细胞密度。

伴以200rpm搅动，将烧瓶在30℃下保持在振荡培养器中，并且将样品定期取出。将样品离心并且所得上清液浸没于沸水浴中10分钟。沸腾之后，将样品再次离心，并且所得上清液在HPLC洗脱剂(5mM H₂SO₄)中稀释10倍。样品在55℃和0.5mL流量下在Aminex HPX-84H管柱(Bio Rad)上运作。水苏糖用作四糖的标准，而麦芽三糖和麦芽糖分别用作三和二糖的标准。所获得的结果在图9中给出并且表明与VTT C-191026相比，α-半乳糖苷酶基因的另外拷贝可进一步增强大豆糖蜜低聚半乳糖的水解速率。

实施例6-通过替代酵母库德毕赤酵母来生产乳酸

为了证明在除了酿酒酵母以外的酵母中表达α-半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶也可导致较高水平地从大豆糖蜜生产乳酸，合适菌株(VTT C-201040)从库德毕赤酵母VTT-C-79090产生。因为酵母天然地不能够水解蔗糖，所以需要转化酶上的另外表达。

为了将编码L-乳酸脱氢酶的瑞士乳杆菌ldhL整合至PDC1基因座中，构建表达载体pMIPk124(SEQ ID NO：36，图11)。它含有库德毕赤酵母PGK1启动子与酿酒酵母ADH1终止子之间的瑞士乳杆菌ldhL和库德毕赤酵母PGK1启动子与酿酒酵母MEL5终止子之间的赋予潮霉素抗性的大肠杆菌hph基因，围绕有用于标志物切除的loxP位点，和促进在PDC1基因座中同源重组的库德毕赤酵母PDC1的5'和3'区域。通过Notl消化，将表达盒从载体序列释放。库德毕赤酵母使用PEG-乙酸锂方法(Gietz等人1992Nucleic Acids Res.20:1425)来转化。转化株在视情况补充有500μg/ml潮霉素、或200μg/ml诺尔丝菌素的琼脂固化YPD培养基中选择。潮霉素抗性标志物通过将cre-重组酶表达载体pKLNatCreloPGK转化至中来切除并且分离诺尔丝菌素抗性转化株。pKLNatCreloPGK通过在非选择性培养基上生长细胞来移除，导致分离菌株H4927。H4927再次用pMIPk124转化以便将二倍体基因组中的两个PDC1等位基因用ldhL表达载体替换，并且分离H4948。

以如上所述类似的方式，用cre-重组酶将潮霉素抗性标志物从菌株H4948中移除并且所获得的菌株被命名为H5661。H5661是用于将转化酶和α-半乳糖苷酶整合至ADH1基因座中的亲代菌株。构建两种表达载体pEKOPA8(SEQ ID NO：37，图11)和pEKOPA9(SEQ ID NO：38，图11)，其含有编码转化酶(SEQ ID NO：34)的酿酒酵母SUC2(SEQ ID NO：35)以及各自编码α-半乳糖苷酶的赤霉菌GibGAL36(pEKOPA8)或黑曲霉AglC(pEKOPA9)，以及促进在ADH1基因座中同源重组的库德毕赤酵母ADH1的5'和3'区域。将两个表达盒从载体中释放以便用Notl限制酶转化。表达转化酶和α-半乳糖苷酶的转化株在补充有20g/l D(+)-蔗糖和40μg/mlα-X-gal的琼脂固化YP培养基中选择。

为了表明从大豆糖蜜生产乳酸，与VTT C-191026并行地，将表达转化酶和赤霉菌GibGAL36α-半乳糖苷酶的库德毕赤酵母菌株VTT-C-201040在使用大豆糖蜜作为碳源的摇瓶中培养。培养条件与实施例5所描述相同。如以前实施例所描述，量化来自培养样品的所产生的乳酸和残留低聚糖，并且结果在图10中给出。对于两种菌株，获得可比较的乳酸生产水平。结果指示来自大豆糖蜜的高水平的乳酸生产可使用具有类似遗传修饰的另一种酵母菌株来实现。

图11示出实施例6中描述或提及的质粒的图谱。

SEQUENCE LISTING

<110> FF-未来公司（Finnfoam Oy）

<120> 遗传修饰真菌和与其相关方法和用途

<130> BP300169PC

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 747

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 1

Met Ile Gly Ser Ser His Ala Val Val Ala Leu Gly Leu Phe Thr Leu

1 5 10 15

Tyr Gly His Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ile Gly Ala Ser Asn Ser Gln

20 25 30

Thr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Phe Ala Leu Asn Gly Asp Asn Val

35 40 45

Ser Tyr Arg Phe His Val Asn Ser Ser Thr Gly Asp Leu Ile Ser Asp

50 55 60

His Phe Gly Gly Val Val Ser Gly Thr Ile Pro Ser Pro Val Glu Pro

65 70 75 80

Ala Val Asn Gly Trp Val Gly Met Pro Gly Arg Ile Arg Arg Glu Phe

85 90 95

Pro Asp Gln Gly Arg Gly Asp Phe Arg Ile Pro Ala Val Arg Ile Arg

100 105 110

Glu Ser Ala Gly Tyr Thr Val Ser Asp Leu Gln Tyr Val Ser His Glu

115 120 125

Val Ile Glu Gly Lys Tyr Ala Leu Pro Gly Leu Pro Ala Thr Phe Gly

130 135 140

Asp Ala Gln Asp Ala Thr Thr Leu Val Val His Leu Tyr Asp Asn Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Val Ala Ala Asp Leu Ser Tyr Ser Ile Phe Pro Lys Tyr Asp

165 170 175

Ala Ile Val Arg Ser Val Asn Val Thr Asn Gln Gly Pro Gly Asn Ile

180 185 190

Thr Ile Glu Ala Leu Ala Ser Ile Ser Ile Asp Phe Pro Tyr Glu Asp

195 200 205

Leu Asp Met Val Ser Leu Arg Gly Asp Trp Ala Arg Glu Ala Asn Val

210 215 220

Gln Arg Ser Lys Val Gln Tyr Gly Val Gln Gly Phe Gly Ser Ser Thr

225 230 235 240

Gly Tyr Ser Ser His Leu His Asn Pro Phe Leu Ala Ile Val Asp Pro

245 250 255

Ala Thr Thr Glu Ser Gln Gly Glu Ala Trp Gly Phe Asn Leu Val Tyr

260 265 270

Thr Gly Ser Phe Ser Ala Gln Val Glu Lys Gly Ser Gln Gly Phe Thr

275 280 285

Arg Ala Leu Leu Gly Phe Asn Pro Asp Gln Leu Ser Trp Asn Leu Gly

290 295 300

Pro Gly Glu Thr Leu Thr Ser Pro Glu Cys Val Ala Val Tyr Ser Asp

305 310 315 320

Lys Gly Leu Gly Ser Val Ser Arg Lys Phe His Arg Leu Tyr Arg Asn

325 330 335

His Leu Met Lys Ser Lys Phe Ala Thr Ser Asp Arg Pro Val Leu Leu

340 345 350

Asn Ser Trp Glu Gly Val Tyr Phe Asp Tyr Asn Gln Ser Ser Ile Glu

355 360 365

Thr Leu Ala Glu Glu Ser Ala Ala Leu Gly Val His Leu Phe Val Met

370 375 380

Asp Asp Gly Trp Phe Gly Asp Lys Tyr Pro Arg Val Ser Asp Asn Ala

385 390 395 400

Gly Leu Gly Asp Trp Met Pro Asn Pro Ala Arg Phe Pro Asp Gly Leu

405 410 415

Thr Pro Val Val Gln Asp Ile Thr Asn Leu Thr Val Asn Gly Thr Glu

420 425 430

Ser Thr Lys Leu Arg Phe Gly Ile Trp Val Glu Pro Glu Met Val Asn

435 440 445

Pro Asn Ser Thr Leu Tyr His Glu His Pro Glu Trp Ala Leu His Ala

450 455 460

Gly Pro Tyr Pro Arg Thr Glu Arg Arg Asn Gln Leu Val Leu Asn Leu

465 470 475 480

Ala Leu Pro Ala Val Gln Asp Phe Ile Ile Asp Phe Met Thr Asn Leu

485 490 495

Leu Gln Asp Thr Gly Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Asn Asn Arg Gly

500 505 510

Ile His Glu Thr Pro Ser Pro Ser Thr Asp His Gln Tyr Met Leu Gly

515 520 525

Leu Tyr Arg Val Phe Asp Thr Leu Thr Thr Arg Phe Pro Asp Val Leu

530 535 540

Trp Glu Gly Cys Ala Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp Ala Gly Met Leu

545 550 555 560

Gln Tyr Val Pro Gln Ile Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Ile Asp

565 570 575

Arg Ile Thr Ile Gln Phe Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Pro Ser Ala

580 585 590

Met Gly Ala His Leu Ser Ala Val Pro Asn Ala Gln Thr Gly Arg Thr

595 600 605

Val Pro Phe Thr Phe Arg Ala His Val Ala Met Met Gly Gly Ser Phe

610 615 620

Gly Leu Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Glu Gly Asp Glu Ile Val Pro

625 630 635 640

Glu Leu Leu Ala Leu Ala Glu Lys Val Asn Pro Ile Ile Leu Asn Gly

645 650 655

Asp Leu Tyr Arg Leu Arg Leu Pro Gln Asp Ser Gln Trp Pro Ala Ala

660 665 670

Leu Phe Val Ser Gln Asp Gly Ala Gln Ala Val Leu Phe Tyr Phe Gln

675 680 685

Val Gln Pro Asn Val Asn His Ala Val Pro Trp Val Arg Leu Gln Gly

690 695 700

Leu Asp Pro Lys Ala Asp Tyr Thr Val Asp Gly Asp Gln Thr Tyr Ser

705 710 715 720

Gly Ala Thr Leu Met Asn Leu Gly Leu Gln Tyr Ser Phe Asp Thr Glu

725 730 735

Tyr Gly Ser Lys Val Val Phe Leu Glu Arg Gln

740 745

<210> 2

<211> 444

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 2

Met Thr Pro His Ser Ile Asp Arg Ala Ala Arg Pro Ser Val Trp Ser

1 5 10 15

Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ser Thr Ala His Ala Ile Val Met Pro Asp

20 25 30

Gly Val Thr Gly Lys Val Pro Ser Leu Gly Trp Asn Ser Trp Asn Ala

35 40 45

Tyr His Cys Asp Ile Asp Glu Ser Lys Phe Leu Ser Ala Ala Glu Val

50 55 60

Ile Val Ser Ser Gly Leu Leu Asp Ala Gly Tyr Asn Tyr Val Asn Ile

65 70 75 80

Asp Asp Cys Trp Ser Met Lys Asp Gly Arg Val Asp Gly His Ile Ala

85 90 95

Val Asn Thr Thr Arg Phe Pro Asp Gly Ile Asp Gly Leu Ala Lys Lys

100 105 110

Val His Asp Leu Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ser Thr Ala Gly Thr

115 120 125

Ala Thr Cys Ala Gly Tyr Pro Ala Ser Leu Gly Tyr Glu Asp Val Asp

130 135 140

Ala Ala Asp Phe Ala Asp Trp Gly Val Asp Tyr Leu Lys Tyr Asp Asn

145 150 155 160

Cys Asn Val Pro Ser Asp Trp Gln Asp Glu Tyr Val Ala Cys Ala Pro

165 170 175

Asp Ala Val Gln Thr Gly Pro Asn Gly Thr Cys Ser Thr Ala Leu Glu

180 185 190

Pro Asn Leu Ala Pro Pro Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Ser Lys Ser Ala

195 200 205

Glu Arg Phe Asn Ala Met Arg Asn Ala Leu Ala Lys Gln Ser Arg Glu

210 215 220

Ile Val Leu Ser Leu Cys Ile Trp Gly Val Ala Asp Val Phe Ser Trp

225 230 235 240

Gly Asn Glu Thr Gly Ile Ser Trp Arg Met Ser Gly Asp Ile Ser Pro

245 250 255

Glu Trp Gly Ser Val Thr His Ile Ile Asn Met Asn Ser Phe Lys Met

260 265 270

Asn Ser Val Gly Phe Trp Gly His Asn Asp Ala Asp Ile Leu Glu Val

275 280 285

Gly Asn Gly Asn Leu Thr Ala Ala Glu Thr Arg Thr His Phe Ala Leu

290 295 300

Trp Ala Ala Met Lys Ser Pro Leu Leu Ile Gly Thr Asp Leu Ala Gln

305 310 315 320

Leu Ser Gln Glu Asn Ile Glu Leu Leu Lys Asn Lys His Leu Leu Ala

325 330 335

Phe Asn Gln Asp Ser Val Tyr Gly Gln Pro Ala Thr Pro Tyr Lys Trp

340 345 350

Gly Val Asn Pro Asp Trp Thr Phe Asn Tyr Thr Asn Pro Ala Glu Tyr

355 360 365

Trp Ala Gly Pro Ser Ser Lys Gly His Leu Val Leu Met Met Asn Thr

370 375 380

Leu Asp His Thr Val Arg Lys Glu Ala Lys Trp Ser Glu Ile Pro Gly

385 390 395 400

Leu Ser Ala Gly Arg Tyr Glu Val Arg Asp Val Trp Thr Asp Lys Ser

405 410 415

Leu Gly Cys Leu Ser Ser Tyr Lys Thr Ala Val Ala Ala His Asp Thr

420 425 430

Ala Val Ile Leu Val Gly Lys Lys Cys Arg Asn Trp

435 440

<210> 3

<211> 751

<212> PRT

<213> Rhizomucor miehei

<400> 3

Met Leu Arg Cys Val Leu Ser Gly Leu Ala Thr Ser Thr Leu Val Cys

1 5 10 15

Ser Leu Leu Val Ser Ala Ala Leu Asp Thr Gly Ile His Lys His Pro

20 25 30

Asp Leu Asp Thr Trp Phe Leu Val Thr Asp Lys Ser Thr Tyr Val Ile

35 40 45

Gly Ala Thr Ala Glu Gly Tyr Val Cys Asn Val Tyr Trp Gly Ser Arg

50 55 60

Leu Glu His Met Asp Asn Leu Asn Ala Thr Leu Pro Ala Tyr Thr Ser

65 70 75 80

Ser Gln Asn Pro Pro Ile Thr Tyr Ala Thr Glu Glu Leu Pro Ala Phe

85 90 95

Gly Gly Leu Arg Tyr Arg Glu Asn Leu Leu Asp Val Glu Leu Pro Asp

100 105 110

Gly Val Arg Glu Leu Asn Leu Leu Tyr Asn Gly Lys Thr Asn Thr Thr

115 120 125

Gly Asp Asn His Leu Asp Val Glu Leu Val Asp Gly Asn Arg Thr Asp

130 135 140

Leu Thr Val Thr Leu His Tyr Glu Leu Asp Ile Glu Asn Asp Ile Ile

145 150 155 160

Arg Arg Ser Tyr Thr Ile Arg Asn Gly Leu Lys Lys Arg Val Asn Leu

165 170 175

Ser Arg Ala Gln Ser Ala Ala Trp His Pro Pro Thr Ala Leu Gly Val

180 185 190

Asp Asp Thr Arg Glu Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Trp Gly Asn Glu

195 200 205

Ala Gln Thr Gln Arg Thr Ile Leu Arg Pro Gly Leu Thr His Val Ile

210 215 220

Gln Ser Lys Arg Gly His Thr Ala His Gln Ser Tyr Pro Phe Phe Ala

225 230 235 240

Leu Arg Gln Val Pro Ser Asp Leu Ser Pro Ala Ser Asn Glu Val Tyr

245 250 255

Phe Gly Ala Leu Ala Trp Ser Gly Ser Trp Glu Ile Thr Val Asp Met

260 265 270

Asn Ile Tyr Gly Tyr Ser Arg Ile Thr Gly Gly Ile His His His Asp

275 280 285

Phe Gly Trp Thr Leu Glu Pro Gly Glu Ser Phe Thr Val Pro Glu Phe

290 295 300

Ala Ala Gly Tyr Thr Gln Asp Gly Ile Pro Gly Ala Arg Lys Leu Leu

305 310 315 320

Pro Arg His Val Arg Lys Tyr Gln Leu Lys Asn Val Lys Thr Gln Gln

325 330 335

Lys Lys Asp Met Tyr Asn Pro Val Leu Tyr Asn Ser Trp Glu Ala Leu

340 345 350

Thr Phe Asn Ile Thr Tyr Asp Lys Gln Ile Ala Leu Ala Asp Lys Ala

355 360 365

Ala Pro Met Gly Ile Glu Leu Phe Ala Val Asp Asp Gly Trp Phe Gly

370 375 380

Ala Arg Asp Asn Asp Ser Ala Gly Leu Gly Asp Trp Phe Val Ser Lys

385 390 395 400

Lys Lys Phe Pro Glu Gly Met Lys Pro Leu Ala Asp His Val His Lys

405 410 415

Leu Gly Met Lys Phe Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Ala Val Asn Pro

420 425 430

Asp Ser Asp Leu Tyr Arg Glu His Pro Asp Trp Val Phe Phe Tyr Asp

435 440 445

Gly Ile Pro Arg Tyr Thr Gly Arg Asn Gln Leu Gln Leu Asn Leu Gly

450 455 460

Leu Lys Glu Val Arg Glu Tyr Leu Tyr Asp Arg Leu Ser Thr Leu Ile

465 470 475 480

Arg Glu Val Gly Ile Asp Tyr Ile Lys Trp Asp Met Asn Arg Pro Phe

485 490 495

Ala Glu Val Thr Met His His Tyr Lys Arg Asn Pro Arg Glu Ala Trp

500 505 510

Val His Ile Val Thr Gly Phe Tyr Ser Ile Val Asp Arg Leu Lys Lys

515 520 525

Glu Phe Pro Glu Leu Leu Ile Glu Thr Cys Ser Ser Gly Gly Gly Arg

530 535 540

Met Asp Ile Gly Ile Leu Gln Lys Val Asp Asn Ala Trp Thr Ser Asp

545 550 555 560

Asn Thr Arg Pro Asp Ala Arg Leu Phe Ile Gln His Gly Ala Ser Leu

565 570 575

Phe Leu Pro Pro Arg Ile Met Tyr Gly Trp Val Thr Asp Ser Pro Ser

580 585 590

Asp Ser Gln Ile Asp Ile Pro Leu Ser Phe Arg Phe His Val Ser Tyr

595 600 605

Met Gly Gly Leu Gly Ile Gly Ser Asn Leu Asn Thr Met Thr Glu Gln

610 615 620

Glu Ile Lys Glu Ala Thr Gly Trp Ile Lys Leu Tyr Lys Gln Ile Arg

625 630 635 640

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645 650 655

Val Gly Asp Leu Ile Ala Ala Thr Gln Thr Thr Thr Gln Asp Gln Ser

660 665 670

Glu Ala Val Val Leu Ala Phe Arg Tyr Asn Ser Val Phe Ser Asn Ala

675 680 685

Leu Asn Pro Ile Arg Leu Arg Tyr Leu Glu Pro Ser Ala Ile Tyr Arg

690 695 700

Val Leu Val Tyr Glu Glu Asp Pro Glu Ile Val Ala Glu Asp Tyr Asp

705 710 715 720

Met Ser Gly Ala Leu Leu Met Asn Lys Gly Ile Ser Leu Asp Gly Leu

725 730 735

Asn Asn Ile Met Phe Arg Ser Ala Val Val Trp Val Gln Lys Lys

740 745 750

<210> 4

<211> 744

<212> PRT

<213> Gibberella sp. F75

<400> 4

Met Val Leu Val Thr Leu Arg Gly Ile Thr Thr Thr Ala Val Leu Phe

1 5 10 15

Cys Gln Ala Ile Ser Ala Leu Ala Glu Ser Ser Asp Pro Ile His Val

20 25 30

Asp Gly Thr Ser Phe Ala Leu Asn Gly Asp Asn Val Ser Tyr Arg Phe

35 40 45

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50 55 60

Pro Val Ala Glu Asp Gly Ile Thr Ala Glu Ile Gly Pro Ile Gln Gly

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Thr Thr Val Thr Asp Phe Arg Tyr Lys Ser His Glu Val Val Glu Gly

115 120 125

Lys Pro Gly Leu Pro Gly Leu Pro Ser Thr Phe Gly Glu Ala Asp Asp

130 135 140

Val Ser Thr Leu Val Val Arg Met Tyr Asp Asn Tyr Ser Ser Ile Ala

145 150 155 160

Val Asp Leu Ser Tyr Ser Ile Phe Pro Lys Tyr Asp Ala Val Val Arg

165 170 175

Ser Val Asn Ile Thr Asn Arg Gly Asn Ala Thr Val Asn Leu Lys Arg

180 185 190

Val Ser Ser Trp Ser Val Asp Leu Gln Gln Asp Asn Leu Asp Leu Ile

195 200 205

Glu Ile Arg Gly Asp Trp Ala Arg Glu Gly Met Arg Val Arg Arg Lys

210 215 220

Val Asp Phe Gly Thr Gln Gly Phe Gln Ser Ser Thr Gly Tyr Ser Ser

225 230 235 240

His Leu His Asn Pro Phe Leu Ala Leu Val Ala Ser Thr Thr Thr Glu

245 250 255

Thr Gln Gly Glu Ala Trp Gly Phe Ser Leu Val Tyr Thr Gly Ser Phe

260 265 270

Ala Val Asp Val Glu Lys Ser Ser Gln Gly Leu Thr Arg Ala Ile Leu

275 280 285

Gly Val Asn Ser Leu Asp Phe Ser Trp Pro Leu Lys Pro Gly Gln Thr

290 295 300

Phe Thr Thr Pro Glu Val Val Ser Val Phe Ser Asn Lys Gly Val Gly

305 310 315 320

Gly Met Ser Arg Gln Phe His Arg Leu Tyr Arg Lys His Leu Met Lys

325 330 335

Ser Lys Tyr Ala Glu Glu Thr Arg Pro Val Leu Leu Asn Ser Trp Glu

340 345 350

Gly Leu Gly Phe Glu Ile Asn Glu Thr Ala Ile Glu Lys Ile Ala Lys

355 360 365

Gln Ser Ala Asp Leu Gly Ile Lys Leu Phe Val Met Asp Asp Gly Trp

370 375 380

Phe Gly Asn Lys Tyr Pro Arg Val Asn Asp Ser Ala Gly Leu Gly Asp

385 390 395 400

Trp Gln Pro Asn Lys Glu Arg Phe Pro Asp Gly Leu Thr Pro Leu Val

405 410 415

Glu Asn Ile Thr Glu Leu Arg Ile Ala Asn Ala Ser Asp Asp Leu Lys

420 425 430

Phe Gly Ile Trp Phe Glu Pro Glu Met Val Asn Pro Lys Ser Asp Leu

435 440 445

Tyr Asp Lys His Pro Asp Trp Ala Ile His Ala Gly Ser Tyr Pro Arg

450 455 460

Thr Glu Thr Arg Asn Gln Leu Val Leu Asn Val Ala Leu Pro Glu Val

465 470 475 480

Gln Glu Phe Ile Ile Asp Ser Val Ser Lys Ile Leu Arg Glu Ser Pro

485 490 495

Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Asn Asn Arg Gly Ile His Glu Thr Pro

500 505 510

Asp Pro Thr Leu Asn Tyr Lys Tyr Met Leu Gly Leu Tyr His Val Phe

515 520 525

Glu Thr Leu Thr Ser Arg Phe Pro Asp Val Leu Trp Glu Gly Cys Ala

530 535 540

Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Val Leu Gln Trp Phe Pro Gln

545 550 555 560

Ile Trp Thr Ser Asp Asp Thr Asp Ala Val Glu Arg Ile Ala Ile Gln

565 570 575

Phe Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Pro Ser Ala Met Gly Ala His Leu

580 585 590

Ser His Val Pro Asn Gly Asn Thr Gln Arg Ile Thr Ser Val Lys Phe

595 600 605

Arg Ala His Val Ala Met Met Gly Gly Ser Phe Gly Val Glu Leu Asp

610 615 620

Pro Ser Asp Leu Glu Pro Glu Glu Arg Glu Gln Ile Pro Gly Leu Ile

625 630 635 640

Glu Leu Ser Glu Lys Ile Asn Pro Ile Val Ile Thr Gly Asp Phe Tyr

645 650 655

Arg Leu Ala Leu Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Pro Ala Gly Gln Phe Ile

660 665 670

Ser Glu Asp Gly Lys Lys Val Val Leu Phe Ala Phe Gln Thr Arg Ala

675 680 685

Thr Ile Asn Asn Ser Trp Pro Trp Phe Arg Leu Gln Gly Leu Asp Ala

690 695 700

Ser Ala Lys Tyr Arg Val Asp Asn Asn Gln Thr Val Ser Gly Ser Thr

705 710 715 720

Leu Met Asn Met Gly Ile Gln Leu Thr Phe Glu Gly Asp Tyr Asp Ser

725 730 735

His Val Leu Met Ile Glu Lys Gln

740

<210> 5

<211> 481

<212> PRT

<213> Aspergillus fischeri

<400> 5

Met Gly Leu Ser Ser Leu Leu Leu Ser Ala Ala Leu Phe Gly Leu Lys

1 5 10 15

Ala Ser Ala Leu Asn Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Gln Met Gly Trp

20 25 30

Asn Thr Trp Asn Ser Phe Ala Cys Glu Leu Asn Glu Thr Val Ile Leu

35 40 45

Asn Ala Ala Glu Arg Ile Val Ser Leu Gly Phe Arg Asp Leu Gly Tyr

50 55 60

Glu Tyr Val Val Leu Asp Asp Cys Trp Ser Ala Gly Arg Asn Ser Ser

65 70 75 80

Gly Tyr Leu Ile Ala Asp Ser Glu Lys Phe Pro Asn Gly Ile Ala His

85 90 95

Leu Ala Asp Lys Val His Glu Leu Gly Leu Lys Ile Gly Ile Tyr Ser

100 105 110

Ser Ala Gly Thr Trp Thr Cys Ala Arg Tyr Glu Gly Ser Leu Gly Tyr

115 120 125

Glu Glu Lys Asp Ala Ala Leu Trp Ala Ser Trp Gly Ile Asp Tyr Leu

130 135 140

Lys Tyr Asp Asn Cys Tyr Asn Glu Gly Glu Glu Gly Thr Pro Lys Leu

145 150 155 160

Ser Phe Asp Arg Tyr Asn Ala Met Phe Lys Ala Leu Asn Ala Thr Gly

165 170 175

Arg Pro Met Leu Tyr Ser Leu Cys Asn Trp Gly Val Asp Gly Pro Trp

180 185 190

Asn Phe Ala Pro Thr Ile Ala Asn Ser Trp Arg Thr Ala Gly Asp Leu

195 200 205

Ser Asn Val Trp Asp Arg Asp Asp Val Asn Cys Pro Cys Ser Glu Leu

210 215 220

Glu Gly Leu Asp Cys Lys Thr Pro Gly Tyr Lys Cys Ser Ile Met Asn

225 230 235 240

Val Leu Asn Lys Ala Val Tyr Tyr Pro Ser Lys Ala Ile Pro Gly Ala

245 250 255

Trp Asn Asp Leu Asp Met Leu Gln Val Gly Asn Gly Gly Leu Thr Asp

260 265 270

Asp Glu Ser Ile Ala His Met Ser Leu Trp Ala Ala Leu Lys Ser Pro

275 280 285

Leu Leu Met Thr Asn Val Met Thr Lys Ile Asp Pro Pro Thr Leu Ser

290 295 300

Ile Leu Gln Asn Pro Ala Val Leu Ala Val Ser Gln Asp Pro Val Ala

305 310 315 320

Ser Thr Pro Val Arg Gln Trp Arg Tyr Phe Val Asp Asp Val Asp Glu

325 330 335

Asn Gly Lys Gly Glu Ile Gln Met Tyr Ser Gly Pro Leu Ser Gly Gly

340 345 350

Asp Gln Leu Val Leu Leu Leu Asn Ala Gly Ser Lys Ala Arg Glu Met

355 360 365

Asn Ala Thr Leu Val Asp Ile Phe Trp Glu Ser Gly Pro Lys Gly Thr

370 375 380

Ala Lys Gln Val Lys Gln His Trp Asp Val Tyr Asp Leu Trp Ala Asn

385 390 395 400

Arg Met Ser Asn Glu Asp Ala Ala Ala Ile Ile Asn Gly Thr Phe Thr

405 410 415

Gly Pro Ser Pro Tyr Asn Leu Thr Ala Met Gly Gly Ala His Glu Val

420 425 430

Tyr Ser Arg Pro Leu Pro Ser Asn Ser Lys Val Leu Met Gly Ser Lys

435 440 445

Val Gly Ser Val Gln Pro Ser Gly Thr Val Thr Ala His Val Arg Pro

450 455 460

His Gly Ile Ala Met Leu Arg Leu Arg Ala Thr Asp Lys Lys Asp Glu

465 470 475 480

Leu

<210> 6

<211> 471

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 6

Met Phe Ala Phe Tyr Phe Leu Thr Ala Cys Thr Thr Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

Phe Gly Val Ser Pro Ser Tyr Asn Gly Leu Gly Leu Thr Pro Gln Met

20 25 30

Gly Trp Asp Ser Trp Asn Thr Phe Ala Cys Asp Val Ser Glu Gln Leu

35 40 45

Leu Leu Asp Thr Ala Asp Arg Ile Ser Asp Leu Gly Leu Lys Asp Met

50 55 60

Gly Tyr Lys Tyr Val Ile Leu Asp Asp Cys Trp Ser Ser Gly Arg Asp

65 70 75 80

Ser Asp Gly Phe Leu Val Ala Asp Lys His Lys Phe Pro Asn Gly Met

85 90 95

Gly His Val Ala Asp His Leu His Asn Asn Ser Phe Leu Phe Gly Met

100 105 110

Tyr Ser Ser Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Ala Gly Tyr Pro Gly Ser Leu

115 120 125

Gly Arg Glu Glu Glu Asp Ala Gln Phe Phe Ala Asn Asn Arg Val Asp

130 135 140

Tyr Leu Lys Tyr Asp Asn Cys Tyr Asn Lys Gly Gln Phe Gly Thr Pro

145 150 155 160

Asp Val Ser Tyr His Arg Tyr Lys Ala Met Ser Asp Ala Leu Asn Lys

165 170 175

Thr Gly Arg Pro Ile Phe Tyr Ser Leu Cys Asn Trp Gly Gln Asp Leu

180 185 190

Thr Phe Tyr Trp Gly Ser Gly Ile Ala Asn Ser Trp Arg Met Ser Gly

195 200 205

Asp Ile Thr Ala Glu Phe Thr Arg Pro Asp Ser Arg Cys Pro Cys Asp

210 215 220

Gly Asp Glu Tyr Asp Cys Lys Tyr Ala Gly Phe His Cys Ser Ile Met

225 230 235 240

Asn Ile Leu Asn Lys Ala Ala Pro Met Gly Gln Asn Ala Gly Val Gly

245 250 255

Gly Trp Asn Asp Leu Asp Asn Leu Glu Val Gly Val Gly Asn Leu Thr

260 265 270

Asp Asp Glu Glu Lys Ala His Phe Ser Met Trp Ala Met Val Lys Ser

275 280 285

Pro Leu Ile Ile Gly Ala Asp Val Asn His Leu Lys Ala Ser Ser Tyr

290 295 300

Ser Ile Tyr Ser Gln Ala Ser Val Ile Ala Ile Asn Gln Asp Pro Lys

305 310 315 320

Gly Ile Pro Ala Thr Arg Val Trp Arg Tyr Tyr Val Ser Asp Thr Asp

325 330 335

Glu Tyr Gly Gln Gly Glu Ile Gln Met Trp Ser Gly Pro Leu Asp Asn

340 345 350

Gly Asp Gln Val Val Ala Leu Leu Asn Gly Gly Ser Val Ala Arg Pro

355 360 365

Met Asn Thr Thr Leu Glu Glu Ile Phe Phe Asp Ser Asn Leu Gly Ser

370 375 380

Lys Glu Leu Thr Ser Thr Trp Asp Ile Tyr Asp Leu Trp Ala Asn Arg

385 390 395 400

Val Asp Asn Ser Thr Ala Ser Ala Ile Leu Glu Gln Asn Lys Ala Ala

405 410 415

Thr Gly Ile Leu Tyr Asn Ala Thr Glu Gln Ser Tyr Lys Asp Gly Leu

420 425 430

Ser Lys Asn Asp Thr Arg Leu Phe Gly Gln Lys Ile Gly Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Asn Ala Ile Leu Asn Thr Thr Val Pro Ala His Gly Ile Ala Phe

450 455 460

Tyr Arg Leu Arg Pro Ser Ala

465 470

<210> 7

<211> 2244

<212> DNA

<213> Aspergillus niger

<400> 7

atgattggtt cttcacatgc agttgttgct ttgggtttgt ttactttata tggtcattca 60

gctgcagctc cagcaattgg tgcttctaat tcacaaacta tcgttacaaa cggtacttca 120

ttcgctttga acggtgacaa cgtttcttac agattccatg ttaattcttc aactggtgac 180

ttgatttctg atcattttgg tggtgttgtt tctggtacta ttccatcacc agttgaacca 240

gctgttaatg gttgggttgg tatgccaggt agaattagaa gagaatttcc agatcaaggt 300

agaggtgact ttagaatacc agcagttaga attagagaat ctgctggtta tacagtttca 360

gatttgcaat acgtttctca tgaagttatt gagggtaaat acgcattgcc aggtttacca 420

gctacttttg gtgacgcaca agatgctact acattggttg ttcatttgta cgataactac 480

tcttcagttg cagctgattt gtcttactca atcttcccaa agtacgatgc tatcgttaga 540

tcagttaacg ttacaaacca aggtccaggc aacatcacta tcgaagcatt ggcttctatc 600

tcaatcgatt tcccatacga agatttggat atggtttcat taagaggtga ctgggcaaga 660

gaagctaacg ttcaaagatc aaaggttcaa tatggtgttc aaggttttgg ttcttcaact 720

ggttactctt cacatttgca taacccattt ttagcaatcg ttgatccagc tactacagaa 780

tctcaaggtg aagcttgggg ttttaatttg gtttacacag gttctttttc agcacaagtt 840

gaaaaaggtt cacaaggttt tactagagct ttgttaggtt ttaatccaga tcaattgtct 900

tggaatttgg gtccaggtga aactttaaca tcaccagaat gtgttgctgt ttattctgat 960

aaaggtttgg gttctgtttc aagaaagttc catagattgt acagaaacca tttgatgaag 1020

tctaagttcg ctacatcaga tagaccagtt ttgttaaatt catgggaagg tgtttacttc 1080

gattacaacc aatcttcaat cgaaacttta gcagaagaat ctgcagcttt gggtgttcat 1140

ttgttcgtta tggatgatgg ttggtttggt gacaaatatc caagagtttc tgataatgct 1200

ggtttgggtg actggatgcc aaatccagct agatttccag atggtttgac accagttgtt 1260

caagatatca caaatttgac tgttaacggt acagaatcaa ctaagttgag attcggtatt 1320

tgggttgaac cagaaatggt taacccaaat tctacattgt accatgaaca tccagaatgg 1380

gcattacatg ctggtccata cccaagaact gaaagaagaa accaattggt tttgaatttg 1440

gcattaccag ctgttcaaga tttcatcatc gatttcatga caaatttgtt gcaagatact 1500

ggtatctctt acgttaagtg ggataacaac agaggtattc atgaaacacc atctccatca 1560

actgatcatc aatacatgtt gggtttatac agagttttcg atactttgac tacaagattc 1620

ccagatgttt tatgggaagg ttgtgcttct ggtggtggta gatttgatgc tggcatgtta 1680

caatatgttc cacaaatttg gacatctgat aacactgatg caatcgatag aatcacaatt 1740

caatttggta cttcattagc ttacccacca tctgcaatgg gtgctcattt gtcagcagtt 1800

ccaaatgctc aaacaggtag aactgttcct tttactttta gagctcatgt tgctatgatg 1860

ggtggttctt ttggtttgga attagatcca gctactgttg aaggtgacga aattgttcca 1920

gaattgttag cattggctga aaaggttaac ccaatcatct tgaacggtga cttgtacaga 1980

ttgagattac cacaagattc acaatggcca gcagctttat ttgtttctca agatggtgca 2040

caagctgttt tgttttactt ccaagttcaa ccaaacgtta accatgcagt tccatgggtt 2100

agattgcaag gtttagatcc aaaagctgat tatacagttg atggtgacca aacatactct 2160

ggtgcaactt taatgaattt gggtttacaa tactcattcg atactgaata cggttctaaa 2220

gttgttttct tggaaagaca ataa 2244

<210> 8

<211> 1335

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<400> 8

atgacaccac attctattga tagagctgca agaccatcag tttggtctgg tttggctttg 60

ttattgtcaa ctgctcatgc aattgttatg ccagatggtg ttactggtaa agttccatct 120

ttgggttgga actcttggaa tgcatatcat tgtgatatcg atgaatcaaa gttcttgtct 180

gctgcagaag ttattgtttc ttcaggttta ttggatgctg gttacaacta cgttaacatc 240

gatgattgtt ggtctatgaa ggatggtaga gttgatggtc atattgcagt taatactaca 300

agatttccag atggtattga tggtttggct aagaaagttc atgatttggg tttgaagttg 360

ggtatctatt ctacagctgg tactgcaaca tgtgctggtt atccagcatc attgggttac 420

gaagatgttg atgctgcaga ttttgctgat tggggtgttg attatttgaa gtacgataac 480

tgtaacgttc catctgattg gcaagatgaa tatgttgctt gtgcaccaga tgctgttcaa 540

actggtccaa atggtacttg ttcaacagca ttggaaccaa atttggctcc accaggttac 600

gattggtcta catcaaaatc tgcagaaaga ttcaatgcta tgagaaatgc tttggcaaag 660

caatcaagag aaatcgtttt gtcattatgt atttggggtg ttgctgatgt tttctcttgg 720

ggtaatgaaa ctggtatttc atggagaatg tctggtgaca tttcaccaga atggggttca 780

gttacacata ttattaacat gaactctttt aaaatgaact ctgttggttt ctggggtcat 840

aatgatgctg atattttgga agttggtaac ggtaatttga ctgctgcaga aactagaaca 900

cattttgcat tatgggctgc aatgaaatct ccattattga ttggtacaga tttggctcaa 960

ttatcacaag aaaacatcga attgttgaaa aataagcatt tgttggcttt taatcaagat 1020

tctgtttatg gtcaaccagc tactccatac aaatggggtg ttaacccaga ttggactttt 1080

aattacacaa acccagcaga atactgggct ggtccatctt caaagggtca tttggttttg 1140

atgatgaaca ctttggatca tacagttaga aaggaagcaa aatggtctga aattccaggt 1200

ttatcagctg gtagatatga agttagagat gtttggacag ataaatcttt gggttgttta 1260

tcttcataca aaactgcagt tgctgcacat gatacagctg ttattttggt tggtaaaaag 1320

tgtagaaact ggtaa 1335

<210> 9

<211> 2256

<212> DNA

<213> Rhizomucor miehei

<400> 9

atgttaagat gtgttttgtc tggtttagct acatcaactt tagtttgttc tttgttagtt 60

tcagctgcat tggatacagg tattcataaa catccagatt tggatacttg gttcttggtt 120

actgataagt ctacttacgt tatcggtgct actgcagaag gttatgtttg taatgtttac 180

tggggttcaa gattggaaca tatggataat ttgaatgcta cattaccagc atacacttct 240

tcacaaaatc caccaattac atacgctact gaagaattac cagcattcgg tggtttgaga 300

tatagagaaa atttgttaga tgttgaattg ccagatggtg ttagagaatt gaatttgttg 360

tacaacggta aaacaaacac tacaggtgac aaccatttgg atgttgaatt agttgatggt 420

aacagaactg atttgacagt tactttacat tacgaattgg atatcgaaaa cgatatcatt 480

agaagatcat acacaatcag aaacggtttg aagaaaagag ttaatttgtc aagagctcaa 540

tcagctgcat ggcatccacc aactgcatta ggtgttgatg atacaagaga attgttaact 600

gttgctggtg aatggggtaa cgaagcacaa acacaaagaa ctatcttaag accaggtttg 660

acacatgtta ttcaatctaa aagaggtcat actgctcatc aatcatatcc atttttcgca 720

ttaagacaag ttccatcaga tttgtctcca gcttcaaatg aagtttactt tggtgcttta 780

gcatggtctg gttcatggga aatcacagtt gatatgaaca tctatggtta ttcaagaatc 840

actggtggta ttcatcatca tgattttggt tggacattgg aacctggtga atcttttact 900

gttccagaat ttgctgcagg ttatacacaa gatggtattc caggtgctag aaagttgttg 960

ccaagacatg ttagaaagta ccaattgaaa aatgttaaaa ctcaacaaaa gaaagatatg 1020

tacaacccag ttttgtacaa ctcttgggaa gctttgactt ttaatatcac ttacgataag 1080

caaatcgctt tagcagataa agctgcacca atgggtattg aattgtttgc agttgatgat 1140

ggttggtttg gtgctagaga taatgattct gctggtttgg gtgactggtt cgtttctaaa 1200

aagaaattcc cagagggtat gaaaccattg gctgatcatg ttcataagtt gggtatgaag 1260

ttcggtttgt ggtttgaacc agaagcagtt aatccagatt ctgatttgta tagagaacat 1320

ccagattggg ttttctttta tgatggtatt ccaagataca caggtagaaa ccaattgcaa 1380

ttgaatttgg gtttaaaaga agttagagaa tatttgtacg atagattgtc aactttaatc 1440

agagaagttg gtatcgatta catcaagtgg gatatgaaca gaccattcgc tgaagttaca 1500

atgcatcatt acaagagaaa cccaagagaa gcatgggttc atatcgttac tggtttctac 1560

tctatcgttg atagattgaa gaaagaattt ccagaattgt tgattgaaac atgttcttct 1620

ggtggtggta gaatggatat cggtatttta caaaaggttg ataacgcttg gacatctgat 1680

aatactagac cagatgctag attgtttatt caacatggtg catcattgtt tttaccacca 1740

agaatcatgt atggttgggt tactgattct ccatcagatt ctcaaatcga tatcccattg 1800

tcttttagat tccatgtttc atacatgggt ggtttaggta tcggttctaa tttgaataca 1860

atgactgaac aagaaattaa agaagctaca ggttggatca agttgtacaa gcaaatcaga 1920

catatcatgc aaaacggtga cttggattgg ttggttaatc catcaagagt tggtgacttg 1980

attgctgcaa ctcaaactac aactcaagat caatcagaag ctgttgtttt ggcttttaga 2040

tacaactctg ttttctctaa cgctttgaac ccaatcagat tgagatactt agaaccatct 2100

gcaatctata gagttttagt ttacgaagaa gatccagaaa ttgttgctga agattatgat 2160

atgtctggtg cattgttgat gaataagggt atctcattgg atggtttaaa taacatcatg 2220

tttagatcag ctgttgtttg ggttcaaaag aaataa 2256

<210> 10

<211> 2235

<212> DNA

<213> Gibberella sp. F75

<400> 10

atggttttgg ttactttaag aggtatcact acaactgctg ttttattttg tcaagcaatc 60

tctgctttgg cagaatcttc agatccaatt catgttgatg gtacatcttt cgctttgaac 120

ggtgacaacg tttcatacag attccatgtt gataacacaa ctggtgactt gattaatgat 180

cattacggtg gtccagttgc tgaagatggt attactgcag aaattggtcc aattcaaggt 240

tgggttaatt tgatcggtag agttagaaga gaatttccag atcatggtag aggtgacttt 300

agaataccag cttttcaatt gcaacaagca tctggtacaa ctgttacaga tttcagatac 360

aaatcacatg aagttgttga aggtaaacca ggtttgccag gtttaccatc tacttttggt 420

gaagctgatg atgtttcaac attagttgtt agaatgtacg ataactactc ttcaatcgct 480

gttgatttgt cttactcaat cttcccaaag tacgatgcag ttgttagatc agttaacatc 540

actaaccgtg gtaacgctac agttaatttg aagagagttt cttcatggtc tgttgatttg 600

caacaagata atttggattt gatcgaaatc agaggtgact gggcaagaga aggcatgaga 660

gttagaagaa aagttgattt tggtactcaa ggttttcaat cttcaacagg ttattcttct 720

catttgcata acccattttt ggctttagtt gcatctacaa ctacagaaac tcaaggtgaa 780

gcttggggtt tttctttggt ttacacaggt tcatttgcag ttgatgttga aaaatcttca 840

caaggtttga ctagagctat tttaggtgtt aattctttgg atttctcatg gccattgaaa 900

ccaggtcaaa cttttactac tccagaagtt gtttctgttt tctctaataa gggtgttggt 960

ggtatgtcaa gacaattcca tagattatac agaaagcatt tgatgaagtc taagtacgca 1020

gaagaaacta gaccagtttt gttaaattca tgggaaggtt taggtttcga aattaatgaa 1080

acagctatcg aaaagattgc taagcaatct gcagatttgg gtattaaatt gttcgttatg 1140

gatgatggtt ggttcggtaa taagtaccca agagttaacg attcagctgg tttgggtgac 1200

tggcaaccaa ataaggaaag atttccagat ggtttaactc cattggttga aaacatcaca 1260

gaattgagaa tcgctaacgc atctgatgat ttgaagttcg gtatctggtt cgaaccagaa 1320

atggttaacc caaagtctga tttgtacgat aagcatccag attgggctat tcatgcaggt 1380

tcatacccaa gaactgaaac aagaaaccaa ttggttttga atgttgcttt gccagaagtt 1440

caagagttta ttatcgattc tgtttcaaaa attttgagag aatctccaat ctcatacgtt 1500

aagtgggata acaacagagg tattcatgaa actccagatc caacattaaa ctacaagtac 1560

atgttgggtt tataccatgt tttcgaaact ttaacttcaa gattcccaga tgttttgtgg 1620

gaaggttgtg cttctggtgg tggtagattt gatccaggtg ttttgcaatg gtttccacaa 1680

atttggactt ctgatgatac agatgctgtt gaaagaatcg caatccaatt cggtacttct 1740

ttagcttacc caccatcagc tatgggtgca catttgtctc atgttccaaa cggtaacact 1800

caaagaatca catcagtcaa gtttagagct catgttgcaa tgatgggtgg ttcttttggt 1860

gttgaattag atccatcaga tttggaacca gaagaaagag aacaaatccc aggtttgatc 1920

gaattgtctg aaaagattaa tccaatcgtt atcactggtg acttctacag attggcttta 1980

ccagaagaaa caaattaccc agcaggtcaa ttcatttcag aagatggtaa aaaggttgtt 2040

ttgttcgctt tccaaactag agcaacaatt aataactctt ggccatggtt cagattgcaa 2100

ggtttagatg cttcagcaaa gtacagagtt gataacaacc aaactgtttc tggttcaaca 2160

ttaatgaaca tgggtattca attgactttt gagggtgact acgattctca tgttttgatg 2220

atcgaaaagc aataa 2235

<210> 11

<211> 1446

<212> DNA

<213> Aspergillus fischeri

<400> 11

atgggtttgt cttcattgtt attgtcagct gcattgttcg gtttaaaagc atctgctttg 60

aacaacggtt tagcaagaac tccacaaatg ggttggaata catggaactc ttttgcttgt 120

gaattaaacg aaactgttat tttgaacgct gcagaaagaa tcgtttcttt gggttttaga 180

gatttgggtt acgaatacgt tgttttagat gattgttggt cagcaggtag aaattcttca 240

ggttatttga tcgctgattc tgaaaagttc ccaaacggta tcgcacattt ggctgataaa 300

gttcatgaat tgggtttaaa gatcggtata tattcttctg caggtacttg gacatgtgct 360

agatatgaag gttcattggg ttacgaagaa aaagatgctg cattatgggc atcttggggt 420

atcgactatt tgaagtacga taactgttac aacgaaggtg aagaaggtac tccaaagttg 480

tcattcgata gatacaacgc tatgttcaaa gcattgaatg ctacaggtag accaatgttg 540

tactctttgt gtaactgggg tgttgatggt ccatggaatt ttgcaccaac tattgctaat 600

tcatggagaa cagctggtga cttgtctaat gtttgggata gagatgatgt taattgtcca 660

tgttctgaat tggaaggttt agattgtaaa actccaggtt acaagtgttc aatcatgaac 720

gttttgaata aggcagttta ttacccatct aaagcaattc caggtgcttg gaacgatttg 780

gatatgttgc aagttggtaa cggtggttta acagatgatg aatcaatcgc tcatatgtct 840

ttgtgggctg cattgaaatc accattattg atgactaacg ttatgacaaa gatcgatcca 900

ccaactttgt ctatcttgca aaacccagca gttttagctg tttcacaaga tccagttgct 960

tctacaccag ttagacaatg gagatacttc gttgatgatg ttgatgaaaa cggtaaaggt 1020

gaaatccaaa tgtactctgg tccattgtct ggtggtgacc aattggtttt gttgttgaac 1080

gcaggttcaa aggctagaga aatgaacgct actttggttg atattttctg ggaatctggt 1140

ccaaaaggta cagcaaagca agttaagcaa cattgggatg tttacgattt gtgggctaat 1200

agaatgtcta atgaagatgc tgcagctatt attaacggta cttttacagg tccatcacca 1260

tataatttga ctgcaatggg tggtgctcat gaagtttatt caagaccatt gccatctaat 1320

tcaaaggttt tgatgggttc taaagttggt tcagttcaac catctggtac tgttacagct 1380

catgttagac cacatggtat tgcaatgttg agattaagag ctacagataa gaaagatgaa 1440

ttataa 1446

<210> 12

<211> 1416

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 12

atgtttgctt tctactttct caccgcatgc accactttga agggtgtttt cggagtttct 60

ccgagttaca atggtcttgg tctcacccca cagatgggtt gggacagctg gaatacgttt 120

gcctgcgatg tcagtgaaca gctacttcta gacactgctg atagaatttc tgacttgggg 180

ctaaaggata tgggttacaa gtatgtcatc ctagatgact gttggtctag cggcagggat 240

tccgacggtt tcctcgttgc agacaagcac aaatttccca acggtatggg ccatgttgca 300

gaccacctgc ataataacag ctttcttttc ggtatgtatt cgtctgctgg tgagtacacc 360

tgtgctgggt accctgggtc tctggggcgt gaggaagaag atgctcaatt ctttgcaaat 420

aaccgcgttg actacttgaa gtatgataat tgttacaata aaggtcaatt tggtacacca 480

gacgtttctt accaccgtta caaggccatg tcagatgctt tgaataaaac tggtaggcct 540

attttctatt ctctatgtaa ctggggtcag gatttgacat tttactgggg ctctggtatc 600

gccaattctt ggagaatgag cggagatatt actgctgagt tcacccgtcc agatagcaga 660

tgtccctgtg acggtgacga atatgattgc aagtacgccg gtttccattg ttctattatg 720

aatattctta acaaggcagc tccaatgggg caaaatgcag gtgttggtgg ttggaacgat 780

ctggacaatc tagaggtcgg agtcggtaat ttgactgacg atgaggaaaa ggcccatttc 840

tctatgtggg caatggtaaa gtccccactt atcattggtg ccgacgtgaa tcacttaaag 900

gcatcttcgt actcgatcta cagtcaagcc tctgtcatcg caattaatca agatccaaag 960

ggtattccag ccacaagagt ctggagatat tatgtttcag acaccgatga atatggacaa 1020

ggtgaaattc aaatgtggag tggtccgctt gacaatggtg accaagtggt tgctttattg 1080

aatggaggaa gcgtagcaag accaatgaac acgaccttgg aagagatttt ctttgacagc 1140

aatttgggtt caaaggaact gacatcgact tgggatattt acgacttatg ggccaacaga 1200

gttgacaact ctacggcgtc tgctatcctt gaacagaata aggcagccac cggtattctc 1260

tacaatgcta cagagcagtc ttataaagac ggtttgtcta agaatgatac aagactgttt 1320

ggccagaaaa ttggtagtct ttctccaaat gctatactta acacaactgt tccagctcat 1380

ggtatcgcct tctataggtt gagaccctcg gcttaa 1416

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> oligonucleotide 32 MEL5-ATG-F

<400> 13

acacaaacac taaatcaaag aattcatgtt tgctttctac tttctcac 48

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> oligonucleotide 33 MEL5-stopR

<400> 14

aggttgagac cctcggctta aggcgcgccc tcgagagctt ttgatta 47

<210> 15

<211> 8575

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pMIE-016_AnAglC, ligation of NoName*EcoRI+AscI 2251 bp into

pMIE-005*EcoRI+AscI 6324 bp

<400> 15

caggatccca attaatgtga gttacctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 60

gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 120

ctatgaccat gattacgaat taattcgagc tcggtacccg gggatcgatc cactagtctt 180

ctaggcgggt tatctactga tccgagcttc cactaggata gcacccaaac acctgcatat 240

ttggacgacc tttacttaca ccaccaaaaa ccactttcgc ctctcccgcc cctgataacg 300

tccactaatt gagcgattac ctgagcggtc ctcttttgtt tgcagcatga gacttgcata 360

ctgcaaatcg taagtagcaa cgtctcaagg tcaaaactgt atggaaacct tgtcacctca 420

cttaattcta gctagcctac cctgcaagtc aagaggtctc cgtgattcct agccacctca 480

aggtatgcct ctccccggaa actgtggcct tttctggcac acatgatctc cacgatttca 540

acatataaat agcttttgat aatggcaata ttaatcaaat ttattttact tctttcttgt 600

aacatctctc ttgtaatccc ttattccttc tagctatttt tcataaaaaa ccaagcaact 660

gcttatcaac acacaaacac taaatcaaag aattcatgat tggttcttca catgcagttg 720

ttgctttggg tttgtttact ttatatggtc attcagctgc agctccagca attggtgctt 780

ctaattcaca aactatcgtt acaaacggta cttcattcgc tttgaacggt gacaacgttt 840

cttacagatt ccatgttaat tcttcaactg gtgacttgat ttctgatcat tttggtggtg 900

ttgtttctgg tactattcca tcaccagttg aaccagctgt taatggttgg gttggtatgc 960

caggtagaat tagaagagaa tttccagatc aaggtagagg tgactttaga ataccagcag 1020

ttagaattag agaatctgct ggttatacag tttcagattt gcaatacgtt tctcatgaag 1080

ttattgaggg taaatacgca ttgccaggtt taccagctac ttttggtgac gcacaagatg 1140

ctactacatt ggttgttcat ttgtacgata actactcttc agttgcagct gatttgtctt 1200

actcaatctt cccaaagtac gatgctatcg ttagatcagt taacgttaca aaccaaggtc 1260

caggcaacat cactatcgaa gcattggctt ctatctcaat cgatttccca tacgaagatt 1320

tggatatggt ttcattaaga ggtgactggg caagagaagc taacgttcaa agatcaaagg 1380

ttcaatatgg tgttcaaggt tttggttctt caactggtta ctcttcacat ttgcataacc 1440

catttttagc aatcgttgat ccagctacta cagaatctca aggtgaagct tggggtttta 1500

atttggttta cacaggttct ttttcagcac aagttgaaaa aggttcacaa ggttttacta 1560

gagctttgtt aggttttaat ccagatcaat tgtcttggaa tttgggtcca ggtgaaactt 1620

taacatcacc agaatgtgtt gctgtttatt ctgataaagg tttgggttct gtttcaagaa 1680

agttccatag attgtacaga aaccatttga tgaagtctaa gttcgctaca tcagatagac 1740

cagttttgtt aaattcatgg gaaggtgttt acttcgatta caaccaatct tcaatcgaaa 1800

ctttagcaga agaatctgca gctttgggtg ttcatttgtt cgttatggat gatggttggt 1860

ttggtgacaa atatccaaga gtttctgata atgctggttt gggtgactgg atgccaaatc 1920

cagctagatt tccagatggt ttgacaccag ttgttcaaga tatcacaaat ttgactgtta 1980

acggtacaga atcaactaag ttgagattcg gtatttgggt tgaaccagaa atggttaacc 2040

caaattctac attgtaccat gaacatccag aatgggcatt acatgctggt ccatacccaa 2100

gaactgaaag aagaaaccaa ttggttttga atttggcatt accagctgtt caagatttca 2160

tcatcgattt catgacaaat ttgttgcaag atactggtat ctcttacgtt aagtgggata 2220

acaacagagg tattcatgaa acaccatctc catcaactga tcatcaatac atgttgggtt 2280

tatacagagt tttcgatact ttgactacaa gattcccaga tgttttatgg gaaggttgtg 2340

cttctggtgg tggtagattt gatgctggca tgttacaata tgttccacaa atttggacat 2400

ctgataacac tgatgcaatc gatagaatca caattcaatt tggtacttca ttagcttacc 2460

caccatctgc aatgggtgct catttgtcag cagttccaaa tgctcaaaca ggtagaactg 2520

ttccttttac ttttagagct catgttgcta tgatgggtgg ttcttttggt ttggaattag 2580

atccagctac tgttgaaggt gacgaaattg ttccagaatt gttagcattg gctgaaaagg 2640

ttaacccaat catcttgaac ggtgacttgt acagattgag attaccacaa gattcacaat 2700

ggccagcagc tttatttgtt tctcaagatg gtgcacaagc tgttttgttt tacttccaag 2760

ttcaaccaaa cgttaaccat gcagttccat gggttagatt gcaaggttta gatccaaaag 2820

ctgattatac agttgatggt gaccaaacat actctggtgc aactttaatg aatttgggtt 2880

tacaatactc attcgatact gaatacggtt ctaaagttgt tttcttggaa agacaataag 2940

gcgcgccctc gagagctttt gattaagcct tctagtccaa aaaacacgtt tttttgtcat 3000

ttatttcatt ttcttagaat agtttagttt attcatttta tagtcacgaa tgttttatga 3060

ttctatatag ggttgcaaac aagcattttt cattttatgt taaaacaatt tcaggtttac 3120

cttttattct gcttgtggtg acgcgtgtat ccgcccgctc ttttggtcac ccatgtattt 3180

aattgcataa ataattctta aaagtggagc tagtctattt ctatttacat acctctcatt 3240

tctcatttcc tcctaatgtg tcaatgatca tattcttaac tggaccgatc ttattcgtca 3300

gattcaaacc aaaagttctt agggctacca caggaggaaa attagtgtga tataatttaa 3360

ataatttatc cgccattcct aatagaacgt tgttcgacgg atatctttct gcccaaaagg 3420

gttctaagct caatgaagag ccaatgtcta aacctctttg cggccgcaag ctaattcgcg 3480

cgaagctagc ttggcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt 3540

tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccccttcgcc agctggcgta atagcgaaga 3600

ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggcgcctgat 3660

gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcataggag atctaagctc 3720

tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat 3780

ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 3840

atagggtaat aactgatata attaaattga agctctaatt tgtgagttta gtatacatgc 3900

atttacttat aatacagttt tttagttttg ctggccgcat cttctcaaat atgcttccca 3960

gcctgctttt ctgtaacgtt caccctctac cttagcatcc cttccctttg caaatagtcc 4020

tcttccaaca ataataatgt cagatcctgt agagaccaca tcatccacgg ttctatactg 4080

ttgacccaat gcgtctccct tgtcatctaa acccacaccg ggtgtcataa tcaaccaatc 4140

gtaaccttca tctcttccac ccatgtctct ttgagcaata aagccgataa caaaatcttt 4200

gtcgctcttc gcaatgtcaa cagtaccctt agtatattct ccagtagata gggagccctt 4260

gcatgacaat tctgctaaca tcaaaaggcc tctaggttcc tttgttactt cttctgccgc 4320

ctgcttcaaa ccgctaacaa tacctgggcc caccacaccg tgtgcattcg taatgtctgc 4380

ccattctgct attctgtata cacccgcaga gtactgcaat ttgactgtat taccaatgtc 4440

agcaaatttt ctgtcttcga agagtaaaaa attgtacttg gcggataatg cctttagcgg 4500

cttaactgtg ccctccatgg aaaaatcagt caagatatcc acatgtgttt ttagtaaaca 4560

aattttggga cctaatgctt caactaactc cagtaattcc ttggtggtac gaacatccaa 4620

tgaagcacac aagtttgttt gcttttcgtg catgatatta aatagcttgg cagcaacagg 4680

actaggatga gtagcagcac gttccttata tgtagctttc gacatgattt atcttcgttt 4740

cggtttttgt tctgtgcagt tgggttaaga atactgggca atttcatgtt tcttcaacac 4800

tacatatgcg tatatatacc aatctaagtc tgtgctcctt ccttcgttct tccttctgtt 4860

cggagattac cgaatcaaaa aaatttcaaa gaaaccgaaa tcaaaaaaaa gaataaaaaa 4920

aaaatgatga attgaaaagc tcttgttacc catcattgaa ttttgaacat ccgaacctgg 4980

gagttttccc tgaaacagat agtatatttg aacctgtata ataatatata gtctagcgct 5040

ttacggaaga caatgtatgt atttcggttc ctggagaaac tattgcatct attgcatagg 5100

taatcttgca cgtcgcatcc ccggttcatt ttctgcgttt ccatcttgca cttcaatagc 5160

atatctttgt taacgaagca tctgtgcttc attttgtaga acaaaaatgc aacgcgagag 5220

cgctaatttt tcaaacaaag aatctgagct gcatttttac agaacagaaa tgcaacgcga 5280

aagcgctatt ttaccaacga agaatctgtg cttcattttt gtaaaacaaa aatgcaacgc 5340

gagagcgcta atttttcaaa caaagaatct gagctgcatt tttacagaac agaaatgcaa 5400

cgcgagagcg ctattttacc aacaaagaat ctatacttct tttttgttct acaaaaatgc 5460

atcccgagag cgctattttt ctaacaaagc atcttagatt actttttttc tcctttgtgc 5520

gctctataat gcagtctctt gataactttt tgcactgtag gtccgttaag gttagaagaa 5580

ggctactttg gtgtctattt tctcttccat aaaaaaagcc tgactccact tcccgcgttt 5640

actgattact agcgaagctg cgggtgcatt ttttcaagat aaaggcatcc ccgattatat 5700

tctataccga tgtggattgc gcatactttg tgaacagaaa gtgatagcgt tgatgattct 5760

tcattggtca gaaaattatg aacggtttct tctattttgt ctctatatac tacgtatagg 5820

aaatgtttac attttcgtat tgttttcgat tcactctatg aatagttctt actacaattt 5880

ttttgtctaa agagtaatac tagagataaa cataaaaaat gtagaggtcg agtttagatg 5940

caagttcaag gagcgaaagg tggatgggta ggttatatag ggatatagca cagagatata 6000

tagcaaagag atacttttga gcaatgtttg tggaagcggt attcgcaata ttttagtagc 6060

tcgttacagt ccggtgcgtt tttggttttt tgaaagtgcg tcttcagagc gcttttggtt 6120

ttcaaaagcg ctctgaagtt cctatacttt ctagctagag aataggaact tcggaatagg 6180

aacttcaaag cgtttccgaa aacgagcgct tccgaaaatg caacgcgagc tgcgcacata 6240

cagctcactg ttcacgtcgc acctatatct gcgtgttgcc tgtatatata tatacatgag 6300

aagaacggca tagtgcgtgt ttatgcttaa atgcgttatg gtgcactctc agtacaatct 6360

gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 6420

gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 6480

gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga 6540

tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca 6600

cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 6660

tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga 6720

gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc 6780

ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg 6840

cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc 6900

ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat 6960

cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact 7020

tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat 7080

tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga 7140

tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc 7200

ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga 7260

tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag 7320

cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc 7380

gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt 7440

ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct 7500

acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg 7560

cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg 7620

atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 7680

tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 7740

tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 7800

aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 7860

aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 7920

taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 7980

taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 8040

agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 8100

tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga gaaagcgcca 8160

cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 8220

agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 8280

gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 8340

aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 8400

tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 8460

ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 8520

aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatc 8575

<210> 16

<211> 7666

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pMIE-017_TrAgl1, ligation of NoName* into pMIE-005*

<400> 16

caggatccca attaatgtga gttacctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 60

gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 120

ctatgaccat gattacgaat taattcgagc tcggtacccg gggatcgatc cactagtctt 180

ctaggcgggt tatctactga tccgagcttc cactaggata gcacccaaac acctgcatat 240

ttggacgacc tttacttaca ccaccaaaaa ccactttcgc ctctcccgcc cctgataacg 300

tccactaatt gagcgattac ctgagcggtc ctcttttgtt tgcagcatga gacttgcata 360

ctgcaaatcg taagtagcaa cgtctcaagg tcaaaactgt atggaaacct tgtcacctca 420

cttaattcta gctagcctac cctgcaagtc aagaggtctc cgtgattcct agccacctca 480

aggtatgcct ctccccggaa actgtggcct tttctggcac acatgatctc cacgatttca 540

acatataaat agcttttgat aatggcaata ttaatcaaat ttattttact tctttcttgt 600

aacatctctc ttgtaatccc ttattccttc tagctatttt tcataaaaaa ccaagcaact 660

gcttatcaac acacaaacac taaatcaaag aattcatgac accacattct attgatagag 720

ctgcaagacc atcagtttgg tctggtttgg ctttgttatt gtcaactgct catgcaattg 780

ttatgccaga tggtgttact ggtaaagttc catctttggg ttggaactct tggaatgcat 840

atcattgtga tatcgatgaa tcaaagttct tgtctgctgc agaagttatt gtttcttcag 900

gtttattgga tgctggttac aactacgtta acatcgatga ttgttggtct atgaaggatg 960

gtagagttga tggtcatatt gcagttaata ctacaagatt tccagatggt attgatggtt 1020

tggctaagaa agttcatgat ttgggtttga agttgggtat ctattctaca gctggtactg 1080

caacatgtgc tggttatcca gcatcattgg gttacgaaga tgttgatgct gcagattttg 1140

ctgattgggg tgttgattat ttgaagtacg ataactgtaa cgttccatct gattggcaag 1200

atgaatatgt tgcttgtgca ccagatgctg ttcaaactgg tccaaatggt acttgttcaa 1260

cagcattgga accaaatttg gctccaccag gttacgattg gtctacatca aaatctgcag 1320

aaagattcaa tgctatgaga aatgctttgg caaagcaatc aagagaaatc gttttgtcat 1380

tatgtatttg gggtgttgct gatgttttct cttggggtaa tgaaactggt atttcatgga 1440

gaatgtctgg tgacatttca ccagaatggg gttcagttac acatattatt aacatgaact 1500

cttttaaaat gaactctgtt ggtttctggg gtcataatga tgctgatatt ttggaagttg 1560

gtaacggtaa tttgactgct gcagaaacta gaacacattt tgcattatgg gctgcaatga 1620

aatctccatt attgattggt acagatttgg ctcaattatc acaagaaaac atcgaattgt 1680

tgaaaaataa gcatttgttg gcttttaatc aagattctgt ttatggtcaa ccagctactc 1740

catacaaatg gggtgttaac ccagattgga cttttaatta cacaaaccca gcagaatact 1800

gggctggtcc atcttcaaag ggtcatttgg ttttgatgat gaacactttg gatcatacag 1860

ttagaaagga agcaaaatgg tctgaaattc caggtttatc agctggtaga tatgaagtta 1920

gagatgtttg gacagataaa tctttgggtt gtttatcttc atacaaaact gcagttgctg 1980

cacatgatac agctgttatt ttggttggta aaaagtgtag aaactggtaa ggcgcgccct 2040

cgagagcttt tgattaagcc ttctagtcca aaaaacacgt ttttttgtca tttatttcat 2100

tttcttagaa tagtttagtt tattcatttt atagtcacga atgttttatg attctatata 2160

gggttgcaaa caagcatttt tcattttatg ttaaaacaat ttcaggttta ccttttattc 2220

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<400> 18

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gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 120

ctatgaccat gattacgaat taattcgagc tcggtacccg gggatcgatc cactagtctt 180

ctaggcgggt tatctactga tccgagcttc cactaggata gcacccaaac acctgcatat 240

ttggacgacc tttacttaca ccaccaaaaa ccactttcgc ctctcccgcc cctgataacg 300

tccactaatt gagcgattac ctgagcggtc ctcttttgtt tgcagcatga gacttgcata 360

ctgcaaatcg taagtagcaa cgtctcaagg tcaaaactgt atggaaacct tgtcacctca 420

cttaattcta gctagcctac cctgcaagtc aagaggtctc cgtgattcct agccacctca 480

aggtatgcct ctccccggaa actgtggcct tttctggcac acatgatctc cacgatttca 540

acatataaat agcttttgat aatggcaata ttaatcaaat ttattttact tctttcttgt 600

aacatctctc ttgtaatccc ttattccttc tagctatttt tcataaaaaa ccaagcaact 660

gcttatcaac acacaaacac taaatcaaag aattcatggt tttggttact ttaagaggta 720

tcactacaac tgctgtttta ttttgtcaag caatctctgc tttggcagaa tcttcagatc 780

caattcatgt tgatggtaca tctttcgctt tgaacggtga caacgtttca tacagattcc 840

atgttgataa cacaactggt gacttgatta atgatcatta cggtggtcca gttgctgaag 900

atggtattac tgcagaaatt ggtccaattc aaggttgggt taatttgatc ggtagagtta 960

gaagagaatt tccagatcat ggtagaggtg actttagaat accagctttt caattgcaac 1020

aagcatctgg tacaactgtt acagatttca gatacaaatc acatgaagtt gttgaaggta 1080

aaccaggttt gccaggttta ccatctactt ttggtgaagc tgatgatgtt tcaacattag 1140

ttgttagaat gtacgataac tactcttcaa tcgctgttga tttgtcttac tcaatcttcc 1200

caaagtacga tgcagttgtt agatcagtta acatcactaa ccgtggtaac gctacagtta 1260

atttgaagag agtttcttca tggtctgttg atttgcaaca agataatttg gatttgatcg 1320

aaatcagagg tgactgggca agagaaggca tgagagttag aagaaaagtt gattttggta 1380

ctcaaggttt tcaatcttca acaggttatt cttctcattt gcataaccca tttttggctt 1440

tagttgcatc tacaactaca gaaactcaag gtgaagcttg gggtttttct ttggtttaca 1500

caggttcatt tgcagttgat gttgaaaaat cttcacaagg tttgactaga gctattttag 1560

gtgttaattc tttggatttc tcatggccat tgaaaccagg tcaaactttt actactccag 1620

aagttgtttc tgttttctct aataagggtg ttggtggtat gtcaagacaa ttccatagat 1680

tatacagaaa gcatttgatg aagtctaagt acgcagaaga aactagacca gttttgttaa 1740

attcatggga aggtttaggt ttcgaaatta atgaaacagc tatcgaaaag attgctaagc 1800

aatctgcaga tttgggtatt aaattgttcg ttatggatga tggttggttc ggtaataagt 1860

acccaagagt taacgattca gctggtttgg gtgactggca accaaataag gaaagatttc 1920

cagatggttt aactccattg gttgaaaaca tcacagaatt gagaatcgct aacgcatctg 1980

atgatttgaa gttcggtatc tggttcgaac cagaaatggt taacccaaag tctgatttgt 2040

acgataagca tccagattgg gctattcatg caggttcata cccaagaact gaaacaagaa 2100

accaattggt tttgaatgtt gctttgccag aagttcaaga gtttattatc gattctgttt 2160

caaaaatttt gagagaatct ccaatctcat acgttaagtg ggataacaac agaggtattc 2220

atgaaactcc agatccaaca ttaaactaca agtacatgtt gggtttatac catgttttcg 2280

aaactttaac ttcaagattc ccagatgttt tgtgggaagg ttgtgcttct ggtggtggta 2340

gatttgatcc aggtgttttg caatggtttc cacaaatttg gacttctgat gatacagatg 2400

ctgttgaaag aatcgcaatc caattcggta cttctttagc ttacccacca tcagctatgg 2460

gtgcacattt gtctcatgtt ccaaacggta acactcaaag aatcacatca gtcaagttta 2520

gagctcatgt tgcaatgatg ggtggttctt ttggtgttga attagatcca tcagatttgg 2580

aaccagaaga aagagaacaa atcccaggtt tgatcgaatt gtctgaaaag attaatccaa 2640

tcgttatcac tggtgacttc tacagattgg ctttaccaga agaaacaaat tacccagcag 2700

gtcaattcat ttcagaagat ggtaaaaagg ttgttttgtt cgctttccaa actagagcaa 2760

caattaataa ctcttggcca tggttcagat tgcaaggttt agatgcttca gcaaagtaca 2820

gagttgataa caaccaaact gtttctggtt caacattaat gaacatgggt attcaattga 2880

cttttgaggg tgactacgat tctcatgttt tgatgatcga aaagcaataa ggcgcgccct 2940

cgagagcttt tgattaagcc ttctagtcca aaaaacacgt ttttttgtca tttatttcat 3000

tttcttagaa tagtttagtt tattcatttt atagtcacga atgttttatg attctatata 3060

gggttgcaaa caagcatttt tcattttatg ttaaaacaat ttcaggttta ccttttattc 3120

tgcttgtggt gacgcgtgta tccgcccgct cttttggtca cccatgtatt taattgcata 3180

aataattctt aaaagtggag ctagtctatt tctatttaca tacctctcat ttctcatttc 3240

ctcctaatgt gtcaatgatc atattcttaa ctggaccgat cttattcgtc agattcaaac 3300

caaaagttct tagggctacc acaggaggaa aattagtgtg atataattta aataatttat 3360

ccgccattcc taatagaacg ttgttcgacg gatatctttc tgcccaaaag ggttctaagc 3420

tcaatgaaga gccaatgtct aaacctcttt gcggccgcaa gctaattcgc gcgaagctag 3480

cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact 3540

taatcgcctt gcagcacatc cccccttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 3600

cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt 3660

tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatagga gatctaagct ctggcgtaat 3720

agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 3780

cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catagggtaa 3840

taactgatat aattaaattg aagctctaat ttgtgagttt agtatacatg catttactta 3900

taatacagtt ttttagtttt gctggccgca tcttctcaaa tatgcttccc agcctgcttt 3960

tctgtaacgt tcaccctcta ccttagcatc ccttcccttt gcaaatagtc ctcttccaac 4020

aataataatg tcagatcctg tagagaccac atcatccacg gttctatact gttgacccaa 4080

tgcgtctccc ttgtcatcta aacccacacc gggtgtcata atcaaccaat cgtaaccttc 4140

atctcttcca cccatgtctc tttgagcaat aaagccgata acaaaatctt tgtcgctctt 4200

cgcaatgtca acagtaccct tagtatattc tccagtagat agggagccct tgcatgacaa 4260

ttctgctaac atcaaaaggc ctctaggttc ctttgttact tcttctgccg cctgcttcaa 4320

accgctaaca atacctgggc ccaccacacc gtgtgcattc gtaatgtctg cccattctgc 4380

tattctgtat acacccgcag agtactgcaa tttgactgta ttaccaatgt cagcaaattt 4440

tctgtcttcg aagagtaaaa aattgtactt ggcggataat gcctttagcg gcttaactgt 4500

gccctccatg gaaaaatcag tcaagatatc cacatgtgtt tttagtaaac aaattttggg 4560

acctaatgct tcaactaact ccagtaattc cttggtggta cgaacatcca atgaagcaca 4620

caagtttgtt tgcttttcgt gcatgatatt aaatagcttg gcagcaacag gactaggatg 4680

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gtatatatac caatctaagt ctgtgctcct tccttcgttc ttccttctgt tcggagatta 4860

ccgaatcaaa aaaatttcaa agaaaccgaa atcaaaaaaa agaataaaaa aaaaatgatg 4920

aattgaaaag ctcttgttac ccatcattga attttgaaca tccgaacctg ggagttttcc 4980

ctgaaacaga tagtatattt gaacctgtat aataatatat agtctagcgc tttacggaag 5040

acaatgtatg tatttcggtt cctggagaaa ctattgcatc tattgcatag gtaatcttgc 5100

acgtcgcatc cccggttcat tttctgcgtt tccatcttgc acttcaatag catatctttg 5160

ttaacgaagc atctgtgctt cattttgtag aacaaaaatg caacgcgaga gcgctaattt 5220

ttcaaacaaa gaatctgagc tgcattttta cagaacagaa atgcaacgcg aaagcgctat 5280

tttaccaacg aagaatctgt gcttcatttt tgtaaaacaa aaatgcaacg cgagagcgct 5340

aatttttcaa acaaagaatc tgagctgcat ttttacagaa cagaaatgca acgcgagagc 5400

gctattttac caacaaagaa tctatacttc ttttttgttc tacaaaaatg catcccgaga 5460

gcgctatttt tctaacaaag catcttagat tacttttttt ctcctttgtg cgctctataa 5520

tgcagtctct tgataacttt ttgcactgta ggtccgttaa ggttagaaga aggctacttt 5580

ggtgtctatt ttctcttcca taaaaaaagc ctgactccac ttcccgcgtt tactgattac 5640

tagcgaagct gcgggtgcat tttttcaaga taaaggcatc cccgattata ttctataccg 5700

atgtggattg cgcatacttt gtgaacagaa agtgatagcg ttgatgattc ttcattggtc 5760

agaaaattat gaacggtttc ttctattttg tctctatata ctacgtatag gaaatgttta 5820

cattttcgta ttgttttcga ttcactctat gaatagttct tactacaatt tttttgtcta 5880

aagagtaata ctagagataa acataaaaaa tgtagaggtc gagtttagat gcaagttcaa 5940

ggagcgaaag gtggatgggt aggttatata gggatatagc acagagatat atagcaaaga 6000

gatacttttg agcaatgttt gtggaagcgg tattcgcaat attttagtag ctcgttacag 6060

tccggtgcgt ttttggtttt ttgaaagtgc gtcttcagag cgcttttggt tttcaaaagc 6120

gctctgaagt tcctatactt tctagctaga gaataggaac ttcggaatag gaacttcaaa 6180

gcgtttccga aaacgagcgc ttccgaaaat gcaacgcgag ctgcgcacat acagctcact 6240

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atagtgcgtg tttatgctta aatgcgttat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 6360

ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 6420

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agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat 6540

ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg 6600

gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 6660

tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 6720

ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 6780

ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 6840

gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac 6900

gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg 6960

acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 7020

actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 7080

ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 7140

cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 7200

gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag 7260

caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 7320

aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 7380

ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 7440

tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 7500

ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 7560

ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 7620

ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 7680

tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 7740

cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 7800

taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 7860

gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 7920

acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 7980

ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 8040

ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 8100

cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg 8160

aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 8220

gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 8280

gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 8340

gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 8400

ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 8460

ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 8520

caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatc 8566

<210> 19

<211> 7777

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pMIE-020_AfGal27, ligation of NoName* into pMIE-005*

<400> 19

caggatccca attaatgtga gttacctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 60

gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 120

ctatgaccat gattacgaat taattcgagc tcggtacccg gggatcgatc cactagtctt 180

ctaggcgggt tatctactga tccgagcttc cactaggata gcacccaaac acctgcatat 240

ttggacgacc tttacttaca ccaccaaaaa ccactttcgc ctctcccgcc cctgataacg 300

tccactaatt gagcgattac ctgagcggtc ctcttttgtt tgcagcatga gacttgcata 360

ctgcaaatcg taagtagcaa cgtctcaagg tcaaaactgt atggaaacct tgtcacctca 420

cttaattcta gctagcctac cctgcaagtc aagaggtctc cgtgattcct agccacctca 480

aggtatgcct ctccccggaa actgtggcct tttctggcac acatgatctc cacgatttca 540

acatataaat agcttttgat aatggcaata ttaatcaaat ttattttact tctttcttgt 600

aacatctctc ttgtaatccc ttattccttc tagctatttt tcataaaaaa ccaagcaact 660

gcttatcaac acacaaacac taaatcaaag aattcatggg tttgtcttca ttgttattgt 720

cagctgcatt gttcggttta aaagcatctg ctttgaacaa cggtttagca agaactccac 780

aaatgggttg gaatacatgg aactcttttg cttgtgaatt aaacgaaact gttattttga 840

acgctgcaga aagaatcgtt tctttgggtt ttagagattt gggttacgaa tacgttgttt 900

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agttcccaaa cggtatcgca catttggctg ataaagttca tgaattgggt ttaaagatcg 1020

gtatatattc ttctgcaggt acttggacat gtgctagata tgaaggttca ttgggttacg 1080

aagaaaaaga tgctgcatta tgggcatctt ggggtatcga ctatttgaag tacgataact 1140

gttacaacga aggtgaagaa ggtactccaa agttgtcatt cgatagatac aacgctatgt 1200

tcaaagcatt gaatgctaca ggtagaccaa tgttgtactc tttgtgtaac tggggtgttg 1260

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ctaatgtttg ggatagagat gatgttaatt gtccatgttc tgaattggaa ggtttagatt 1380

gtaaaactcc aggttacaag tgttcaatca tgaacgtttt gaataaggca gtttattacc 1440

catctaaagc aattccaggt gcttggaacg atttggatat gttgcaagtt ggtaacggtg 1500

gtttaacaga tgatgaatca atcgctcata tgtctttgtg ggctgcattg aaatcaccat 1560

tattgatgac taacgttatg acaaagatcg atccaccaac tttgtctatc ttgcaaaacc 1620

cagcagtttt agctgtttca caagatccag ttgcttctac accagttaga caatggagat 1680

acttcgttga tgatgttgat gaaaacggta aaggtgaaat ccaaatgtac tctggtccat 1740

tgtctggtgg tgaccaattg gttttgttgt tgaacgcagg ttcaaaggct agagaaatga 1800

acgctacttt ggttgatatt ttctgggaat ctggtccaaa aggtacagca aagcaagtta 1860

agcaacattg ggatgtttac gatttgtggg ctaatagaat gtctaatgaa gatgctgcag 1920

ctattattaa cggtactttt acaggtccat caccatataa tttgactgca atgggtggtg 1980

ctcatgaagt ttattcaaga ccattgccat ctaattcaaa ggttttgatg ggttctaaag 2040

ttggttcagt tcaaccatct ggtactgtta cagctcatgt tagaccacat ggtattgcaa 2100

tgttgagatt aagagctaca gataagaaag atgaattata aggcgcgccc tcgagagctt 2160

ttgattaagc cttctagtcc aaaaaacacg tttttttgtc atttatttca ttttcttaga 2220

atagtttagt ttattcattt tatagtcacg aatgttttat gattctatat agggttgcaa 2280

acaagcattt ttcattttat gttaaaacaa tttcaggttt accttttatt ctgcttgtgg 2340

tgacgcgtgt atccgcccgc tcttttggtc acccatgtat ttaattgcat aaataattct 2400

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cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatagggta ataactgata 3060

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ttcaccctct accttagcat cccttccctt tgcaaatagt cctcttccaa caataataat 3240

gtcagatcct gtagagacca catcatccac ggttctatac tgttgaccca atgcgtctcc 3300

cttgtcatct aaacccacac cgggtgtcat aatcaaccaa tcgtaacctt catctcttcc 3360

acccatgtct ctttgagcaa taaagccgat aacaaaatct ttgtcgctct tcgcaatgtc 3420

aacagtaccc ttagtatatt ctccagtaga tagggagccc ttgcatgaca attctgctaa 3480

catcaaaagg cctctaggtt cctttgttac ttcttctgcc gcctgcttca aaccgctaac 3540

aatacctggg cccaccacac cgtgtgcatt cgtaatgtct gcccattctg ctattctgta 3600

tacacccgca gagtactgca atttgactgt attaccaatg tcagcaaatt ttctgtcttc 3660

gaagagtaaa aaattgtact tggcggataa tgcctttagc ggcttaactg tgccctccat 3720

ggaaaaatca gtcaagatat ccacatgtgt ttttagtaaa caaattttgg gacctaatgc 3780

ttcaactaac tccagtaatt ccttggtggt acgaacatcc aatgaagcac acaagtttgt 3840

ttgcttttcg tgcatgatat taaatagctt ggcagcaaca ggactaggat gagtagcagc 3900

acgttcctta tatgtagctt tcgacatgat ttatcttcgt ttcggttttt gttctgtgca 3960

gttgggttaa gaatactggg caatttcatg tttcttcaac actacatatg cgtatatata 4020

ccaatctaag tctgtgctcc ttccttcgtt cttccttctg ttcggagatt accgaatcaa 4080

aaaaatttca aagaaaccga aatcaaaaaa aagaataaaa aaaaaatgat gaattgaaaa 4140

gctcttgtta cccatcattg aattttgaac atccgaacct gggagttttc cctgaaacag 4200

atagtatatt tgaacctgta taataatata tagtctagcg ctttacggaa gacaatgtat 4260

gtatttcggt tcctggagaa actattgcat ctattgcata ggtaatcttg cacgtcgcat 4320

ccccggttca ttttctgcgt ttccatcttg cacttcaata gcatatcttt gttaacgaag 4380

catctgtgct tcattttgta gaacaaaaat gcaacgcgag agcgctaatt tttcaaacaa 4440

agaatctgag ctgcattttt acagaacaga aatgcaacgc gaaagcgcta ttttaccaac 4500

gaagaatctg tgcttcattt ttgtaaaaca aaaatgcaac gcgagagcgc taatttttca 4560

aacaaagaat ctgagctgca tttttacaga acagaaatgc aacgcgagag cgctatttta 4620

ccaacaaaga atctatactt cttttttgtt ctacaaaaat gcatcccgag agcgctattt 4680

ttctaacaaa gcatcttaga ttactttttt tctcctttgt gcgctctata atgcagtctc 4740

ttgataactt tttgcactgt aggtccgtta aggttagaag aaggctactt tggtgtctat 4800

tttctcttcc ataaaaaaag cctgactcca cttcccgcgt ttactgatta ctagcgaagc 4860

tgcgggtgca ttttttcaag ataaaggcat ccccgattat attctatacc gatgtggatt 4920

gcgcatactt tgtgaacaga aagtgatagc gttgatgatt cttcattggt cagaaaatta 4980

tgaacggttt cttctatttt gtctctatat actacgtata ggaaatgttt acattttcgt 5040

attgttttcg attcactcta tgaatagttc ttactacaat ttttttgtct aaagagtaat 5100

actagagata aacataaaaa atgtagaggt cgagtttaga tgcaagttca aggagcgaaa 5160

ggtggatggg taggttatat agggatatag cacagagata tatagcaaag agatactttt 5220

gagcaatgtt tgtggaagcg gtattcgcaa tattttagta gctcgttaca gtccggtgcg 5280

tttttggttt tttgaaagtg cgtcttcaga gcgcttttgg ttttcaaaag cgctctgaag 5340

ttcctatact ttctagctag agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa agcgtttccg 5400

aaaacgagcg cttccgaaaa tgcaacgcga gctgcgcaca tacagctcac tgttcacgtc 5460

gcacctatat ctgcgtgttg cctgtatata tatatacatg agaagaacgg catagtgcgt 5520

gtttatgctt aaatgcgtta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt 5580

taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc 5640

cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt 5700

caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg 5760

ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc 5820

gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 5880

aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 5940

tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 6000

aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 6060

aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 6120

tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc 6180

aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag 6240

tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa 6300

ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc 6360

taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg 6420

agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa 6480

caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 6540

tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg 6600

gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag 6660

cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 6720

caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt 6780

ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 6840

aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 6900

gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 6960

atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 7020

tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 7080

gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 7140

actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 7200

gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 7260

agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 7320

ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 7380

aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 7440

cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 7500

gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 7560

cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 7620

cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 7680

gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca 7740

aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatc 7777

<210> 20

<211> 7747

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pMIE-005, ligation of i-pMLV18 (B3661)** into pMI529**

<400> 20

caggatccca attaatgtga gttacctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 60

gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 120

ctatgaccat gattacgaat taattcgagc tcggtacccg gggatcgatc cactagtctt 180

ctaggcgggt tatctactga tccgagcttc cactaggata gcacccaaac acctgcatat 240

ttggacgacc tttacttaca ccaccaaaaa ccactttcgc ctctcccgcc cctgataacg 300

tccactaatt gagcgattac ctgagcggtc ctcttttgtt tgcagcatga gacttgcata 360

ctgcaaatcg taagtagcaa cgtctcaagg tcaaaactgt atggaaacct tgtcacctca 420

cttaattcta gctagcctac cctgcaagtc aagaggtctc cgtgattcct agccacctca 480

aggtatgcct ctccccggaa actgtggcct tttctggcac acatgatctc cacgatttca 540

acatataaat agcttttgat aatggcaata ttaatcaaat ttattttact tctttcttgt 600

aacatctctc ttgtaatccc ttattccttc tagctatttt tcataaaaaa ccaagcaact 660

gcttatcaac acacaaacac taaatcaaag aattcatgtt tgctttctac tttctcaccg 720

catgcaccac tttgaagggt gttttcggag tttctccgag ttacaatggt cttggtctca 780

ccccacagat gggttgggac agctggaata cgtttgcctg cgatgtcagt gaacagctac 840

ttctagacac tgctgataga atttctgact tggggctaaa ggatatgggt tacaagtatg 900

tcatcctaga tgactgttgg tctagcggca gggattccga cggtttcctc gttgcagaca 960

agcacaaatt tcccaacggt atgggccatg ttgcagacca cctgcataat aacagctttc 1020

ttttcggtat gtattcgtct gctggtgagt acacctgtgc tgggtaccct gggtctctgg 1080

ggcgtgagga agaagatgct caattctttg caaataaccg cgttgactac ttgaagtatg 1140

ataattgtta caataaaggt caatttggta caccagacgt ttcttaccac cgttacaagg 1200

ccatgtcaga tgctttgaat aaaactggta ggcctatttt ctattctcta tgtaactggg 1260

gtcaggattt gacattttac tggggctctg gtatcgccaa ttcttggaga atgagcggag 1320

atattactgc tgagttcacc cgtccagata gcagatgtcc ctgtgacggt gacgaatatg 1380

attgcaagta cgccggtttc cattgttcta ttatgaatat tcttaacaag gcagctccaa 1440

tggggcaaaa tgcaggtgtt ggtggttgga acgatctgga caatctagag gtcggagtcg 1500

gtaatttgac tgacgatgag gaaaaggccc atttctctat gtgggcaatg gtaaagtccc 1560

cacttatcat tggtgccgac gtgaatcact taaaggcatc ttcgtactcg atctacagtc 1620

aagcctctgt catcgcaatt aatcaagatc caaagggtat tccagccaca agagtctgga 1680

gatattatgt ttcagacacc gatgaatatg gacaaggtga aattcaaatg tggagtggtc 1740

cgcttgacaa tggtgaccaa gtggttgctt tattgaatgg aggaagcgta gcaagaccaa 1800

tgaacacgac cttggaagag attttctttg acagcaattt gggttcaaag gaactgacat 1860

cgacttggga tatttacgac ttatgggcca acagagttga caactctacg gcgtctgcta 1920

tccttgaaca gaataaggca gccaccggta ttctctacaa tgctacagag cagtcttata 1980

aagacggttt gtctaagaat gatacaagac tgtttggcca gaaaattggt agtctttctc 2040

caaatgctat acttaacaca actgttccag ctcatggtat cgccttctat aggttgagac 2100

cctcggctta aggcgcgccc tcgagagctt ttgattaagc cttctagtcc aaaaaacacg 2160

tttttttgtc atttatttca ttttcttaga atagtttagt ttattcattt tatagtcacg 2220

aatgttttat gattctatat agggttgcaa acaagcattt ttcattttat gttaaaacaa 2280

tttcaggttt accttttatt ctgcttgtgg tgacgcgtgt atccgcccgc tcttttggtc 2340

acccatgtat ttaattgcat aaataattct taaaagtgga gctagtctat ttctatttac 2400

atacctctca tttctcattt cctcctaatg tgtcaatgat catattctta actggaccga 2460

tcttattcgt cagattcaaa ccaaaagttc ttagggctac cacaggagga aaattagtgt 2520

gatataattt aaataattta tccgccattc ctaatagaac gttgttcgac ggatatcttt 2580

ctgcccaaaa gggttctaag ctcaatgaag agccaatgtc taaacctctt tgcggccgca 2640

agctaattcg cgcgaagcta gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga 2700

aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccccttcg ccagctggcg 2760

taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga 2820

atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatagg 2880

agatctaagc tctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg 2940

cgcagcctga atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 3000

atttcacacc gcatagggta ataactgata taattaaatt gaagctctaa tttgtgagtt 3060

tagtatacat gcatttactt ataatacagt tttttagttt tgctggccgc atcttctcaa 3120

atatgcttcc cagcctgctt ttctgtaacg ttcaccctct accttagcat cccttccctt 3180

tgcaaatagt cctcttccaa caataataat gtcagatcct gtagagacca catcatccac 3240

ggttctatac tgttgaccca atgcgtctcc cttgtcatct aaacccacac cgggtgtcat 3300

aatcaaccaa tcgtaacctt catctcttcc acccatgtct ctttgagcaa taaagccgat 3360

aacaaaatct ttgtcgctct tcgcaatgtc aacagtaccc ttagtatatt ctccagtaga 3420

tagggagccc ttgcatgaca attctgctaa catcaaaagg cctctaggtt cctttgttac 3480

ttcttctgcc gcctgcttca aaccgctaac aatacctggg cccaccacac cgtgtgcatt 3540

cgtaatgtct gcccattctg ctattctgta tacacccgca gagtactgca atttgactgt 3600

attaccaatg tcagcaaatt ttctgtcttc gaagagtaaa aaattgtact tggcggataa 3660

tgcctttagc ggcttaactg tgccctccat ggaaaaatca gtcaagatat ccacatgtgt 3720

ttttagtaaa caaattttgg gacctaatgc ttcaactaac tccagtaatt ccttggtggt 3780

acgaacatcc aatgaagcac acaagtttgt ttgcttttcg tgcatgatat taaatagctt 3840

ggcagcaaca ggactaggat gagtagcagc acgttcctta tatgtagctt tcgacatgat 3900

ttatcttcgt ttcggttttt gttctgtgca gttgggttaa gaatactggg caatttcatg 3960

tttcttcaac actacatatg cgtatatata ccaatctaag tctgtgctcc ttccttcgtt 4020

cttccttctg ttcggagatt accgaatcaa aaaaatttca aagaaaccga aatcaaaaaa 4080

aagaataaaa aaaaaatgat gaattgaaaa gctcttgtta cccatcattg aattttgaac 4140

atccgaacct gggagttttc cctgaaacag atagtatatt tgaacctgta taataatata 4200

tagtctagcg ctttacggaa gacaatgtat gtatttcggt tcctggagaa actattgcat 4260

ctattgcata ggtaatcttg cacgtcgcat ccccggttca ttttctgcgt ttccatcttg 4320

cacttcaata gcatatcttt gttaacgaag catctgtgct tcattttgta gaacaaaaat 4380

gcaacgcgag agcgctaatt tttcaaacaa agaatctgag ctgcattttt acagaacaga 4440

aatgcaacgc gaaagcgcta ttttaccaac gaagaatctg tgcttcattt ttgtaaaaca 4500

aaaatgcaac gcgagagcgc taatttttca aacaaagaat ctgagctgca tttttacaga 4560

acagaaatgc aacgcgagag cgctatttta ccaacaaaga atctatactt cttttttgtt 4620

ctacaaaaat gcatcccgag agcgctattt ttctaacaaa gcatcttaga ttactttttt 4680

tctcctttgt gcgctctata atgcagtctc ttgataactt tttgcactgt aggtccgtta 4740

aggttagaag aaggctactt tggtgtctat tttctcttcc ataaaaaaag cctgactcca 4800

cttcccgcgt ttactgatta ctagcgaagc tgcgggtgca ttttttcaag ataaaggcat 4860

ccccgattat attctatacc gatgtggatt gcgcatactt tgtgaacaga aagtgatagc 4920

gttgatgatt cttcattggt cagaaaatta tgaacggttt cttctatttt gtctctatat 4980

actacgtata ggaaatgttt acattttcgt attgttttcg attcactcta tgaatagttc 5040

ttactacaat ttttttgtct aaagagtaat actagagata aacataaaaa atgtagaggt 5100

cgagtttaga tgcaagttca aggagcgaaa ggtggatggg taggttatat agggatatag 5160

cacagagata tatagcaaag agatactttt gagcaatgtt tgtggaagcg gtattcgcaa 5220

tattttagta gctcgttaca gtccggtgcg tttttggttt tttgaaagtg cgtcttcaga 5280

gcgcttttgg ttttcaaaag cgctctgaag ttcctatact ttctagctag agaataggaa 5340

cttcggaata ggaacttcaa agcgtttccg aaaacgagcg cttccgaaaa tgcaacgcga 5400

gctgcgcaca tacagctcac tgttcacgtc gcacctatat ctgcgtgttg cctgtatata 5460

tatatacatg agaagaacgg catagtgcgt gtttatgctt aaatgcgtta tggtgcactc 5520

tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg 5580

ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 5640

tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa 5700

agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga 5760

cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 5820

tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 5880

gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg 5940

cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag 6000

atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg 6060

agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg 6120

gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt 6180

ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga 6240

cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac 6300

ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc 6360

atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc 6420

gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac 6480

tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag 6540

gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg 6600

gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta 6660

tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg 6720

ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata 6780

tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt 6840

ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc 6900

ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 6960

tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa 7020

ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag 7080

tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc 7140

tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg 7200

actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 7260

cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt 7320

gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg 7380

tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 7440

ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc 7500

ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc 7560

cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg 7620

cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga 7680

gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc 7740

attaatc 7747

<210> 21

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> oligonucleotide 2ScADH1 -150F

<400> 21

gtttgctgtc ttgctatcaa gtataaatag acctgcaatt attaatcttt tgtttcctcg 60

tcgcacttcg tacgctgcag gtcgacaacc 90

<210> 22

<211> 88

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> oligonucleotide 5ScADH1 stopR

<400> 22

atcataaatc ataagaaatt cgcttattta gaagtgtcaa caacgtatct accaacgatt 60

tgacggccac tagtggatct gatatcac 88

<210> 23

<211> 7488

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pMIE-021B

<400> 23

gtcttgtatc attcttagac aaaccgtctt tataagactg ctctgtagca ttgtagagaa 60

taccggtggc tgccttattc tgttcaagga tagcagacgc cgtagagttg tcaactctgt 120

tggcccataa gtcgtaaata tcccaagtcg atgtcagttc ctttgaaccc aaattgctgt 180

caaagaaaat ctcttccaag gtcgtgttca ttggtcttgc tacgcttcct ccattcaata 240

aagcaaccac ttggtcacca ttgtcaagcg gaccactcca catttgaatt tcaccttgtc 300

catattcatc ggtgtctgaa acataatatc tccagactct tgtggctgga ataccctttg 360

gatcttgatt aattgcgatg acagaggctt gactgtagat cgagtacgaa gatgccttta 420

agtgattcac gtcggcacca atgataagtg gggactttac cattgcccac atagagaaat 480

gggccttttc ctcatcgtca gtcaaattac cgactccgac ctctagattg tccagatcgt 540

tccaaccacc aacacctgca ttttgcccca ttggagctgc cttgttaaga atattcataa 600

tagaacaatg gaaaccggcg tacttgcaat catattcgtc accgtcacag ggacatctgc 660

tatctggacg ggtgaactca gcagtaatat ctccgctcat tctccaagaa ttggcgatac 720

cagagcccca gtaaaatgtc aaatcctgac cccagttaca tagagaatag aaaataggcc 780

taccagtttt attcaaagca tctgacatgg ccttgtaacg gtggtaagaa acgtctggtg 840

taccaaattg acctttattg taacaattat catacttcaa gtagtcaacg cggttatttg 900

caaagaattg agcatcttct tcctcacgcc ccagagaccc agggtaccca gcacaggtgt 960

actcaccagc agacgaatac ataccgaaaa gaaagctgtt attatgcagg tggtctgcaa 1020

catggcccat accgttggga aatttgtgct tgtctgcaac gaggaaaccg tcggaatccc 1080

tgccgctaga ccaacagtca tctaggatga catacttgta acccatatcc tttagcccca 1140

agtcagaaat tctatcagca gtgtctagaa gtagctgttc actgacatcg caggcaaacg 1200

tattccagct gtcccaaccc atctgtgggg tgagaccaag accattgtaa ctcggagaaa 1260

ctccgaaaac acccttcaaa gtggtgcatg cggtgagaaa gtagaaagca aacatgaatt 1320

ctttgattta gtgtttgtgt gttgataagc agttgcttgg ttttttatga aaaatagcta 1380

gaaggaataa gggattacaa gagagatgtt acaagaaaga agtaaaataa atttgattaa 1440

tattgccatt atcaaaagct atttatatgt tgaaatcgtg gagatcatgt gtgccagaaa 1500

aggccacagt ttccggggag aggcatacct tgaggtggct aggaatcacg gagacctctt 1560

gacttgcagg gtaggctagc tagaattaag tgaggtgaca aggtttccat acagttttga 1620

ccttgagacg ttgctactta cgatttgcag tatgcaagtc tcatgctgca aacaaaagag 1680

gaccgctcag gtaatcgctc aattagtgga cgttatcagg ggcgggagag gcgaaagtgg 1740

tttttggtgg tgtaagtaaa ggtcgtccaa atatgcaggt gtttgggtgc tatcctagtg 1800

gaagctcgga tcagtagata acccgcctag aagactagtg gatcgatccc catcacctaa 1860

taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatattaagg gttctcgact ctagaggatc 1920

cgtgtggaag aacgattaca acaggtgttg tcctctgagg acataaaata cacaccgaga 1980

ttcatcaact cattgctgga gttagcatat ctacaattgg gtgaaatggg gagcgatttg 2040

caggcatttg ctcggcatgc cggtagaggt gtggtcaata agagcgacct catgctatac 2100

ctgagaaagc aacctgacct acaggaaaga gttactcaag aataagaatt ttcgttttaa 2160

aacctaagag tcactttaaa atttgtatac acttattttt tttataactt atttaataat 2220

aaaaatcata aatcataaga aattcgctta tttagaagtg tcactgatta gaaaaactca 2280

tcgagcatca aatgaaactg caatttattc atatcaggat tatcaatacc atatttttga 2340

aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga 2400

tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc 2460

tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga atccggtgag 2520

aatggcaaaa gcttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg 2580

tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga 2640

cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc 2700

aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat caggatattc ttctaatacc 2760

tggaatgctg ttttgccggg gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg 2820

ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca gccagtttag tctgaccatc 2880

tcatctgtaa catcattggc aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca 2940

tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc 3000

catttatacc catataaatc agcatccatg ttggaattta atcgcggcct cgaaacgtga 3060

gtcttttcct tacccatggt tgtttatgtt cggatgtgat gtgagaactg tatcctagca 3120

agattttaaa aggaagtata tgaaagaaga acctcagtgg caaatcctaa ccttttatat 3180

ttctctacag gggcgcggcg tggggacaat tcaacgcgtc tgtgagggga gcgtttccct 3240

gctcgcaggt ctgcagcgag gagccgtaat ttttgcttcg cgccgtgcgg ccatcaaaat 3300

gtatggatgc aaatgattat acatggggat gtatgggcta aatgtacggg cgacagtcac 3360

atcatgcccc tgagctgcgc acgtcaagac tgtcaaggag ggtattctgg gcctccatgt 3420

cgctggccgg gtgacccggc ggggacgagg caagctaaac agatctctag acctaataac 3480

ttcgtatagc atacattata cgaagttata ttaagggttg tcgacctgca gcgtacgaag 3540

cttcagctgg cggccgctct agaactagag cggccgcgtg acagaatatg ccaaagaacc 3600

cataaataaa tatgatataa gagcgcccac tgggccggcg ttggtcagag gtgtggataa 3660

accaatgaaa agacctgtac caatagtacc accaagggca atcataccaa tatgtctttg 3720

cttaagctct ctcttcactt cagcgttctg tacttctcct tcatcttcat cacctatgcc 3780

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ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 5820

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aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 5940

atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 6000

tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt 6060

tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 6120

tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 6180

gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 6240

tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 6300

ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 6360

gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 6420

aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 6480

ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 6540

tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 6600

ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 6660

aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg 6720

ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 6780

ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 6840

agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 6900

tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 6960

ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgcgccctg tagcggcgca 7020

ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta 7080

gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt 7140

caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac 7200

cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt 7260

tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 7320

acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 7380

gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata 7440

ttaacgctta caatttccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg 7500

tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa 7560

gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgaattgt 7620

aatacgactc actatagggc gaattgggta ccaataacgg aatccaactg ggccggtaac 7680

cccagcacca caaaccatac aaaaacagta tattagaaac ccgataatgg ctaaaacttt 7740

gatggaagcg acccagaact cgaattcacc gtaatatttg acagggaaca agttcattat 7800

tgtgataatt acccaaaaaa tactaatcca tgccgccagt ggaactttgt acgtccaaaa 7860

ttgaatgact tggaaattat atcacactaa ttttcctcct gtggtagccc taagaacttt 7920

tggtttgaat ctgacgaata agatcggtcc agttaagaat atgatcattg acacattagg 7980

aggaaatgag aaatgagagg tatgtaaata gaaatagact agctccactt ttaagaatta 8040

tttatgcaat taaatacatg ggtgaccaaa agagcgggcg gatacacgcg tcaccacaag 8100

cagaataaaa ggtaaacctg aaattgtttt aacataaaat gaaaaatgct tgtttgcaac 8160

cctatataga atcataaaac attcgtgact ataaaatgaa taaactaaac tattctaaga 8220

aaatgaaata aatgacaaaa aaacgtgttt tttggactag aaggcttaat caaaagctct 8280

cgagggcgcg ccttattgct tttcgatcat caaaacatga gaatcgtagt caccctcaaa 8340

agtcaattga atacccatgt tcattaatgt tgaaccagaa acagtttggt tgt 8393

<210> 29

<211> 7604

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pMIE-034, can1::AfGAL Hyg

<400> 29

ctttagaacc catcaaaacc tttgaattag atggcaatgg tcttgaataa acttcatgag 60

caccacccat tgcagtcaaa ttatatggtg atggacctgt aaaagtaccg ttaataatag 120

ctgcagcatc ttcattagac attctattag cccacaaatc gtaaacatcc caatgttgct 180

taacttgctt tgctgtacct tttggaccag attcccagaa aatatcaacc aaagtagcgt 240

tcatttctct agcctttgaa cctgcgttca acaacaaaac caattggtca ccaccagaca 300

atggaccaga gtacatttgg atttcacctt taccgttttc atcaacatca tcaacgaagt 360

atctccattg tctaactggt gtagaagcaa ctggatcttg tgaaacagct aaaactgctg 420

ggttttgcaa gatagacaaa gttggtggat cgatctttgt cataacgtta gtcatcaata 480

atggtgattt caatgcagcc cacaaagaca tatgagcgat tgattcatca tctgttaaac 540

caccgttacc aacttgcaac atatccaaat cgttccaagc acctggaatt gctttagatg 600

ggtaataaac tgccttattc aaaacgttca tgattgaaca cttgtaacct ggagttttac 660

aatctaaacc ttccaattca gaacatggac aattaacatc atctctatcc caaacattag 720

acaagtcacc agctgttctc catgaattag caatagttgg tgcaaaattc catggaccat 780

caacacccca gttacacaaa gagtacaaca ttggtctacc tgtagcattc aatgctttga 840

acatagcgtt gtatctatcg aatgacaact ttggagtacc ttcttcacct tcgttgtaac 900

agttatcgta cttcaaatag tcgatacccc aagatgccca taatgcagca tctttttctt 960

cgtaacccaa tgaaccttca tatctagcac atgtccaagt acctgcagaa gaatatatac 1020

cgatctttaa acccaattca tgaactttat cagccaaatg tgcgataccg tttgggaact 1080

tttcagaatc agcgatcaaa taacctgaag aatttctacc tgctgaccaa caatcatcta 1140

aaacaacgta ttcgtaaccc aaatctctaa aacccaaaga aacgattctt tctgcagcgt 1200

tcaaaataac agtttcgttt aattcacaag caaaagagtt ccatgtattc caacccattt 1260

gtggagttct tgctaaaccg ttgttcaaag cagatgcttt taaaccgaac aatgcagctg 1320

acaataacaa tgaagacaaa cccatgaatt ctttgattta gtgtttgtgt gttgataagc 1380

agttgcttgg ttttttatga aaaatagcta gaaggaataa gggattacaa gagagatgtt 1440

acaagaaaga agtaaaataa atttgattaa tattgccatt atcaaaagct atttatatgt 1500

tgaaatcgtg gagatcatgt gtgccagaaa aggccacagt ttccggggag aggcatacct 1560

tgaggtggct aggaatcacg gagacctctt gacttgcagg gtaggctagc tagaattaag 1620

tgaggtgaca aggtttccat acagttttga ccttgagacg ttgctactta cgatttgcag 1680

tatgcaagtc tcatgctgca aacaaaagag gaccgctcag gtaatcgctc aattagtgga 1740

cgttatcagg ggcgggagag gcgaaagtgg tttttggtgg tgtaagtaaa ggtcgtccaa 1800

atatgcaggt gtttgggtgc tatcctagtg gaagctcgga tcagtagata acccgcctag 1860

aagactagtg gatctgatat cacctaataa cttcgtatag catacattat acgaagttat 1920

attaagggtt ctcgagagct cgttttcgac actggatggc ggcgttagta tcgaatcgac 1980

agcagtatag cgaccagcat tcacatacga ttgacgcatg atattacttt ctgcgcactt 2040

aacttcgcat ctgggcagat gatgtcgagg cgaaaaaaaa tataaatcac gctaacattt 2100

gattaaaata gaacaactac aatataaaaa aactatacaa atgacaagtt cttgaaaaca 2160

agaatctttt tattgtcagt actgattact actctattcc tttgccctcg gacgagtgct 2220

ggggcgtcgg tttccactat cggcgagtac ttctacacag ccatcggtcc agacggccgc 2280

gcttctgcgg gcgatttgtg tacgcccgac agtcccggct ccggatcgga cgattgcgtc 2340

gcatcgaccc tgcgcccaag ctgcatcatc gaaattgccg tcaaccaagc tctgatagag 2400

ttggtcaaga ccaatgcgga gcatatacgc ccggagccgc ggcgatcctg caagctccgg 2460

atgcctccgc tcgaagtagc gcgtctgctg ctccatacaa gccaaccacg gcctccagaa 2520

gaagatgttg gcgacctcgt attgggaatc cccgaacatc gcctcgctcc agtcaatgac 2580

cgctgttatg cggccattgt ccgtcaggac attgttggag ccgaaatccg cgtgcacgag 2640

gtgccggact tcggggcagt cctcggccca aagcatcagc tcatcgagag cctgcgcgac 2700

ggacgcactg acggtgtcgt ccatcacagt ttgccagtga tacacatggg gatcagcaat 2760

cgcgcatatg aaatcacgcc atgtagtgta ttgaccgatt ccttgcggtc cgaatgggcc 2820

gaacccgctc gtctggctaa gatcggccgc agcgatcgca tccatggcct ccgcgaccgg 2880

ctgcagaaca gcgggcagtt cggtttcagg caggtcttgc aacgtgacac cctgtgcacg 2940

gcgggagatg caataggtca ggctctcgct gaattcccca atgtcaagca cttccggaat 3000

cgggagcgcg gccgatgcaa agtgccgata aacataacga tctttgtaga aaccatcggc 3060

gcagctattt acccgcagga catatccacg ccctcctaca tcgaagctga aagcacgaga 3120

ttcttcgccc tccgagagct gcatcaggtc ggagacgctg tcgaactttt cgatcagaaa 3180

cttctcgaca gacgtcgcgg tgagttcagg catggttgtt tatgttcgga tgtgatgtga 3240

gaactgtatc ctagcaagat tttaaaagga agtatatgaa agaagaacct cagtggcaaa 3300

tcctaacctt ttatatttct ctacaggggc gcggcgtggg gacaattcaa cgcgtctgtg 3360

aggggagcgt ttccctgctc gcaggtctgc agcgaggagc cgtaattttt gcttcgcgcc 3420

gtgcggccat caaaatgtat ggatgcaaat gattatacat ggggatgtat gggctaaatg 3480

tacgggcgac agtcacatca tgcccctgag ctgcgcacgt caagactgtc aaggagggta 3540

ttctgggcct ccatgtcgct ggccgggtga cccggcgggg acgaggcaag ctaaacagat 3600

ctctagacct aataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatattaa gggttgtcga 3660

cctgcagcgt acgaagcttc agctggcggc cgcgtgacag aatatgccaa agaacccata 3720

aataaatatg atataagagc gcccactggg ccggcgttgg tcagaggtgt ggataaacca 3780

atgaaaagac ctgtaccaat agtaccacca agggcaatca taccaatatg tctttgctta 3840

agctctctct tcacttcagc gttctgtact tctccttcat cttcatcacc tatgccatcc 3900

tccatagaga acgtatcctc gccatttact ctcgtcggga aagagcgcaa tggatacaat 3960

tctttacttt tctcatcttt caatggtatt gacccgcggt ggagctccag cttttgttcc 4020

ctttagtgag ggttaatttc gagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga 4080

aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 4140

tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 4200

cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 4260

ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 4320

cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 4380

ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 4440

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 4500

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 4560

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 4620

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 4680

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 4740

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 4800

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 4860

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 4920

gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 4980

accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 5040

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 5100

tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 5160

aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 5220

taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 5280

gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 5340

agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 5400

cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 5460

tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 5520

gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 5580

agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 5640

gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 5700

atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 5760

gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 5820

tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 5880

atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 5940

agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 6000

gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 6060

cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 6120

tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 6180

ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg 6240

gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct 6300

cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta 6360

aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa 6420

cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct 6480

ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc 6540

aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 6600

ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt 6660

acaatttcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct 6720

cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 6780

cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattg taatacgact 6840

cactataggg cgaattgggt accaataacg gaatccaact gggccggtaa ccccagcacc 6900

acaaaccata caaaaacagt atattagaaa cccgataatg gctaaaactt tgatggaagc 6960

gacccagaac tcgaattcac cgtaatattt gacagggaac aagttcatta ttgtgataat 7020

tacccaaaaa atactaatcc atgccgccag tggaactttg tacgtccaaa attgaatgac 7080

ttggaaatta tatcacacta attttcctcc tgtggtagcc ctaagaactt ttggtttgaa 7140

tctgacgaat aagatcggtc cagttaagaa tatgatcatt gacacattag gaggaaatga 7200

gaaatgagag gtatgtaaat agaaatagac tagctccact tttaagaatt atttatgcaa 7260

ttaaatacat gggtgaccaa aagagcgggc ggatacacgc gtcaccacaa gcagaataaa 7320

aggtaaacct gaaattgttt taacataaaa tgaaaaatgc ttgtttgcaa ccctatatag 7380

aatcataaaa cattcgtgac tataaaatga ataaactaaa ctattctaag aaaatgaaat 7440

aaatgacaaa aaaacgtgtt ttttggacta gaaggcttaa tcaaaagctc tcgagggcgc 7500

gccttataat tcatctttct tatctgtagc tcttaatctc aacattgcaa taccatgtgg 7560

tctaacatga gctgtaacag taccagatgg ttgaactgaa ccaa 7604

<210> 30

<211> 89

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> oligonucleotide 3ScPDC5 -210F

<400> 30

ctaatacgta aacctgcatt aaggtaagat tatatcagaa aatgtgttgc aagaaatgca 60

ttatgttcgt acgctgcagg tcgacaacc 89

<210> 31

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> oligonucleotide 6ScPDC5 stopR

<400> 31

tacacaaacg ttgaatcatg agttttatgt taattagctt attgtttagc gttagtagcg 60

gcagtcggcc actagtggat ctgatatcac 90

<210> 32

<211> 88

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> oligonucleotide 4ScPDC5 -136F

<400> 32

gattatgaca atctctcgaa agaaatttca tatgatgaga cttgaataat gcagcggcgc 60

ttgcttcgta cgctgcaggt cgacaacc 88

<210> 33

<211> 6935

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pMIE-008, LDH into ScPDC1

<400> 33

atatgtattt cttgcattga ccaatttatg caagtttata tatatgtaaa tgtaagtttc 60

acgaggttct actaaactaa accaccccct tggttagaag aaaagagtgt gtgagaacag 120

gctgttgttg tcacacgatt cggacaattc tgtttgaaag agagagagta acagtacgat 180

cgaacgaact ttgctctgga gatcacagtg ggcatcatag catgtggtac taaacccttt 240

cccgccattc cagaaccttc gattgcttgt tacaaaacct gtgagccgtc gctaggacct 300

tgttgtgtga cgaaattgga agctgcaatc aataggaaga caggaagtcg agcgtgtctg 360

ggttttttca gttttgttct ttttgcaaac aaatcacgag cgacggtaat ttctttctcg 420

ataagaggcc acgtgcttta tgagggtaac atcaattcaa gaaggaggga aacacttcct 480

ttttctggcc ctgataatag tatgagggtg aagccaaaat aaaggattcg cgcccaaatc 540

ggcatcttta aatgcaggta tgcgatagtt cctcactctt tccttactca cgtcgacaac 600

ccttaatata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta ttaggtctag agatctgttt 660

agcttgcctc gtccccgccg ggtcacccgg ccagcgacat ggaggcccag aataccctcc 720

ttgacagtct tgacgtgcgc agctcagggg catgatgtga ctgtcgcccg tacatttagc 780

ccatacatcc ccatgtataa tcatttgcat ccatacattt tgatggccgc acggcgcgaa 840

gcaaaaatta cggctcctcg ctgcagacct gcgagcaggg aaacgctccc ctcacagacg 900

cgttgaattg tccccacgcc gcgcccctgt agagaaatat aaaaggttag gatttgccac 960

tgaggttctt ctttcatata cttcctttta aaatcttgct aggatacagt tctcacatca 1020

catccgaaca taaacaacca tgcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga agtttctgat 1080

cgaaaagttc gacagcgtct ccgacctgat gcagctctcg gagggcgaag aatctcgtgc 1140

tttcagcttc gatgtaggag ggcgtggata tgtcctgcgg gtaaatagct gcgccgatgg 1200

tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc cgattccgga 1260

agtgcttgac attggggaat tcagcgagag cctgacctat tgcatctccc gccgtgcaca 1320

gggtgtcacg ttgcaagacc tgcctgaaac cgaactgccc gctgttctgc agccggtcgc 1380

ggaggccatg gatgcgatcg ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt tcggcccatt 1440

cggaccgcaa ggaatcggtc aatacactac atggcgtgat ttcatatgcg cgattgctga 1500

tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt ccgtcgcgca 1560

ggctctcgat gagctgatgc tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc acctcgtgca 1620

cgcggatttc ggctccaaca atgtcctgac ggacaatggc cgcataacag cggtcattga 1680

ctggagcgag gcgatgttcg gggattccca atacgaggtc gccaacatct tcttctggag 1740

gccgtggttg gcttgtatgg agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc atccggagct 1800

tgcaggatcg ccgcggctcc gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc aactctatca 1860

gagcttggtt gacggcaatt tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat gcgacgcaat 1920

cgtccgatcc ggagccggga ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa gcgcggccgt 1980

ctggaccgat ggctgtgtag aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc ccagcactcg 2040

tccgagggca aaggaataga gtagtaatca gtactgacaa taaaaagatt cttgttttca 2100

agaacttgtc atttgtatag tttttttata ttgtagttgt tctattttaa tcaaatgtta 2160

gcgtgattta tatttttttt cgcctcgaca tcatctgccc agatgcgaag ttaagtgcgc 2220

agaaagtaat atcatgcgtc aatcgtatgt gaatgctggt cgctatactg ctgtcgattc 2280

gatactaacg ccgccatcca gtgtcgaaaa cgagctctcg agaaccctta atataacttc 2340

gtataatgta tgctatacga agttattagg tgatatccca gtcttcgatg ctccacaaaa 2400

cttggttgaa caagctaagt tgactgctgc taccaacgct aagcaataag cgatttaatc 2460

tctaattatt agttaaagtt ttataagcat ttttatgtaa cgaaaaataa attggttcat 2520

attattactg cactgtcact agtggcctat gcggccgcgg atctgccggt ctccctatag 2580

tgagtcgtat taatttcgat aagccaggtt aacctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 2640

gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 2700

tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 2760

acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 2820

aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 2880

cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 2940

gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 3000

tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg 3060

tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 3120

cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 3180

gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 3240

ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt 3300

ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 3360

ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 3420

agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 3480

aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 3540

atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 3600

tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt 3660

tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 3720

tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 3780

gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 3840

tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 3900

ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 3960

gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 4020

aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 4080

ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 4140

tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 4200

ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 4260

aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg 4320

ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 4380

ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 4440

agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 4500

tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 4560

ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt 4620

atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc 4680

ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg 4740

taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt 4800

cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatggac 4860

atattgtcgt tagaacgcgg ctacaattaa tacataacct tatgtatcat acacatacga 4920

tttaggtgac actatagaac gcggccgcca gctgcgattc cgcccgctaa acgcatattt 4980

ttgttgcctg gtggcatttg caaaatgcat aacctatgca tttaaaagat tatgtatgct 5040

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caattttgtg ttgttacggt attttactat ggaataatca atcaattgag gattttatgc 5160

aaatatcgtt tgaatatttt tccgaccctt tgagtacttt tcttcataat tgcataatat 5220

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accttatttt ctaactattt tttttttagc tcatttgaat cagcttatgg tgatggcaca 5340

tttttgcata aacctagctg tcctcgttga acatagggat ccgtgtggaa gaacgattac 5400

aacaggtgtt gtcctctgag gacataaaat acacaccgag attcatcaac tcattgctgg 5460

agttagcata tctacaattg ggtgaaatgg ggagcgattt gcaggcattt gctcggcatg 5520

ccggtagagg tgtggtcaat aagagcgacc tcatgctata cctgagaaag caacctgacc 5580

tacaggaaag agttactcaa gaataagaat tttcgtttta aaacctaaga gtcactttaa 5640

aatttgtata cacttatttt ttttataact tatttaataa taaaaatcat aaatcataag 5700

aaattcgctt atttagaagt gtcaacaacg tatctaccaa cgatttgacc cttttccatc 5760

ttttcgtaaa tttctggcaa ggtagacaag ccgacaacct tgattggaga cttgaccaaa 5820

cctctggcga agaagtccaa agcttggaag atcttcattg acgaacctta acgccagttt 5880

ctttgaaggc cttgtccata accttcttta attgatctgc tgaagcagtc attaattctt 5940

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caggagtacc gatgtgaaga tcgtgtaaac catattcacc atccattggt actgaaagtg 6060

gaagtacacg gtgttcatcg ttcaagatag ccttagcgat cattgctgaa gcagtaccga 6120

taccgtagaa ggtagcacct ttcttgttaa taatgtcgta agccatgtcc ttaacttctt 6180

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ttacgccagc aacattgttg tagctccatg ctggaaattc agtatcaccg tgttcaccaa 6300

gcatgtatgc attaactgaa cttgggtcaa cgttttccat tttaccaata actttttgaa 6360

gacgaccagt atcaagtgaa gtacctgaac cgataacacg atccttaggg aagcctgaca 6420

ttctccaagt tgcgtgagtt aagatatcaa ctgggttagc aactactaag aaaatacctt 6480

caaaacctga ttcaacaact ggttcaacga ttgatgataa aatcttcaag ttcttgttaa 6540

caagatcaag acgagtttcg cctggctttt gtggagcacc agcagtaata acaactaagt 6600

cagcatcctt acaatctggg tagtcagctg cgtaaatgtt ctttggagaa gtccaaggag 6660

ttgcgtcagc taaatcgatt gcgtcacctt caacgtgttc cttagcgata tcgataatac 6720

ctaattcttc agcgatacct tgttgtacca ttgaaaatgc aaaggtagaa cctacagcac 6780

catcaccgac taaaataact ttacgaggtt tttcctctct tgccatggtt ttatatttgt 6840

tgtaaaaagt agataattac ttccttgatg atctgtaaaa aagagaaaaa gaaagcatct 6900

aagaacttga aaaactaaga attagaaaag accaa 6935

<210> 34

<211> 532

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 34

Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys

1 5 10 15

Ile Ser Ala Ser Met Thr Asn Glu Thr Ser Asp Arg Pro Leu Val His

20 25 30

Phe Thr Pro Asn Lys Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Trp Tyr

35 40 45

Asp Glu Lys Asp Ala Lys Trp His Leu Tyr Phe Gln Tyr Asn Pro Asn

50 55 60

Asp Thr Val Trp Gly Thr Pro Leu Phe Trp Gly His Ala Thr Ser Asp

65 70 75 80

Asp Leu Thr Asn Trp Glu Asp Gln Pro Ile Ala Ile Ala Pro Lys Arg

85 90 95

Asn Asp Ser Gly Ala Phe Ser Gly Ser Met Val Val Asp Tyr Asn Asn

100 105 110

Thr Ser Gly Phe Phe Asn Asp Thr Ile Asp Pro Arg Gln Arg Cys Val

115 120 125

Ala Ile Trp Thr Tyr Asn Thr Pro Glu Ser Glu Glu Gln Tyr Ile Ser

130 135 140

Tyr Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Gln Lys Asn Pro

145 150 155 160

Val Leu Ala Ala Asn Ser Thr Gln Phe Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp

165 170 175

Tyr Glu Pro Ser Gln Lys Trp Ile Met Thr Ala Ala Lys Ser Gln Asp

180 185 190

Tyr Lys Ile Glu Ile Tyr Ser Ser Asp Asp Leu Lys Ser Trp Lys Leu

195 200 205

Glu Ser Ala Phe Ala Asn Glu Gly Phe Leu Gly Tyr Gln Tyr Glu Cys

210 215 220

Pro Gly Leu Ile Glu Val Pro Thr Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Tyr

225 230 235 240

Trp Val Met Phe Ile Ser Ile Asn Pro Gly Ala Pro Ala Gly Gly Ser

245 250 255

Phe Asn Gln Tyr Phe Val Gly Ser Phe Asn Gly Thr His Phe Glu Ala

260 265 270

Phe Asp Asn Gln Ser Arg Val Val Asp Phe Gly Lys Asp Tyr Tyr Ala

275 280 285

Leu Gln Thr Phe Phe Asn Thr Asp Pro Thr Tyr Gly Ser Ala Leu Gly

290 295 300

Ile Ala Trp Ala Ser Asn Trp Glu Tyr Ser Ala Phe Val Pro Thr Asn

305 310 315 320

Pro Trp Arg Ser Ser Met Ser Leu Val Arg Lys Phe Ser Leu Asn Thr

325 330 335

Glu Tyr Gln Ala Asn Pro Glu Thr Glu Leu Ile Asn Leu Lys Ala Glu

340 345 350

Pro Ile Leu Asn Ile Ser Asn Ala Gly Pro Trp Ser Arg Phe Ala Thr

355 360 365

Asn Thr Thr Leu Thr Lys Ala Asn Ser Tyr Asn Val Asp Leu Ser Asn

370 375 380

Ser Thr Gly Thr Leu Glu Phe Glu Leu Val Tyr Ala Val Asn Thr Thr

385 390 395 400

Gln Thr Ile Ser Lys Ser Val Phe Ala Asp Leu Ser Leu Trp Phe Lys

405 410 415

Gly Leu Glu Asp Pro Glu Glu Tyr Leu Arg Met Gly Phe Glu Val Ser

420 425 430

Ala Ser Ser Phe Phe Leu Asp Arg Gly Asn Ser Lys Val Lys Phe Val

435 440 445

Lys Glu Asn Pro Tyr Phe Thr Asn Arg Met Ser Val Asn Asn Gln Pro

450 455 460

Phe Lys Ser Glu Asn Asp Leu Ser Tyr Tyr Lys Val Tyr Gly Leu Leu

465 470 475 480

Asp Gln Asn Ile Leu Glu Leu Tyr Phe Asn Asp Gly Asp Val Val Ser

485 490 495

Thr Asn Thr Tyr Phe Met Thr Thr Gly Asn Ala Leu Gly Ser Val Asn

500 505 510

Met Thr Thr Gly Val Asp Asn Leu Phe Tyr Ile Asp Lys Phe Gln Val

515 520 525

Arg Glu Val Lys

530

<210> 35

<211> 1599

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 35

atgcttttgc aagctttcct tttccttttg gctggttttg cagccaaaat atctgcatca 60

atgacaaacg aaactagcga tagacctttg gtccacttca cacccaacaa gggctggatg 120

aatgacccaa atgggttgtg gtacgatgaa aaagatgcca aatggcatct gtactttcaa 180

tacaacccaa atgacaccgt atggggtacg ccattgtttt ggggccatgc tacttccgat 240

gatttgacta attgggaaga tcaacccatt gctatcgctc ccaagcgtaa cgattcaggt 300

gctttctctg gctccatggt ggttgattac aacaacacga gtgggttttt caatgatact 360

attgatccaa gacaaagatg cgttgcgatt tggacttata acactcctga aagtgaagag 420

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gttttagctg ccaactccac tcaattcaga gatccaaagg tgttctggta tgaaccttct 540

caaaaatgga ttatgacggc tgccaaatca caagactaca aaattgaaat ttactcctct 600

gatgacttga agtcctggaa gctagaatct gcatttgcca atgaaggttt cttaggctac 660

caatacgaat gtccaggttt gattgaagtc ccaactgagc aagatccttc caaatcttat 720

tgggtcatgt ttatttctat caacccaggt gcacctgctg gcggttcctt caaccaatat 780

tttgttggat ccttcaatgg tactcatttt gaagcgtttg acaatcaatc tagagtggta 840

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aatccagaga ctgaattgat caatttgaaa gccgaaccaa tattgaacat tagtaatgct 1080

ggtccctggt ctcgttttgc tactaacaca actctaacta aggccaattc ttacaatgtc 1140

gatttgagca actcgactgg taccctagag tttgagttgg tttacgctgt taacaccaca 1200

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cctgaagaat atttgagaat gggttttgaa gtcagtgctt cttccttctt tttggaccgt 1320

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<210> 36

<211> 8066

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pMIPk124

<220>

<221> misc_feature

<222> (1121)..(1121)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4736)..(4736)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 36

ttctaaataa gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa 60

aataagtgta tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt 120

gagtaactct ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctcttat 180

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caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 1500

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tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 1740

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agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 2040

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 2100

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 2160

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gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 2280

tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 2340

gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 2400

ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 2460

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tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 2640

cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 2700

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gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 3060

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tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 3180

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ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 3360

acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt 3420

gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg 3480

caccatatgg acatattgtc gttagaacgc ggctacaatt aatacataac cttatgtatc 3540

atacacatac gatttaggtg acactataga acgcggccgc gagctctaag ttttaatggc 3600

ccagggaatc attacttttt tttctcaatc cttgatggat aaaagtatta catacgtaca 3660

ggattgtgta ttagtgtatt tcgttatatg attaaacaaa gtttatagat tgtaaagtag 3720

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ttagagttga tttcatcaga taatttagct tgagcaacca agatttctgg agcatcgaat 3840

tcatccaaga ataattcaat gactctaatc ttatcttcct tgttgaatgc ttcatccttc 3900

atcaaagcgt ccaagtcctt agcggattta acaacatggt tttcatattg ggtcttgtca 3960

gcaaagagct tcaataacaa ttggtgatcc catggttgaa tttggttgta gtcctcatga 4020

cgaccgtgga tcaacttttc gatagtgtaa cctctgttgt ttaagatgaa gatgtatggc 4080

ttgatgttcc atcttgcagc atctgagatt gattggacag tcaattgtaa agaaccatca 4140

ccaataaaca aaacagttct tctttcttgt tcgccagttt gtttgtgtgc atcttcagca 4200

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tcagcttcga tgtaggaggg cgtggatatg tcctgcgggt aaatagctgc gccgatggtt 5160

tctacaaaga tcgttatgtt tatcggcact ttgcatcggc cgcgctcccg attccggaag 5220

tgcttgacat tggggaattc agcgagagcc tgacctattg catctcccgc cgtgcacagg 5280

gtgtcacgtt gcaagacctg cctgaaaccg aactgcccgc tgttctgcag ccggtcgcgg 5340

aggccatgga tgcgatcgct gcggccgatc ttagccagac gagcgggttc ggcccattcg 5400

gaccgcaagg aatcggtcaa tacactacat ggcgtgattt catatgcgcg attgctgatc 5460

cccatgtgta tcactggcaa actgtgatgg acgacaccgt cagtgcgtcc gtcgcgcagg 5520

ctctcgatga gctgatgctt tgggccgagg actgccccga agtccggcac ctcgtgcacg 5580

cggatttcgg ctccaacaat gtcctgacgg acaatggccg cataacagcg gtcattgact 5640

ggagcgaggc gatgttcggg gattcccaat acgaggtcgc caacatcttc ttctggaggc 5700

cgtggttggc ttgtatggag cagcagacgc gctacttcga gcggaggcat ccggagcttg 5760

caggatcgcc gcggctccgg gcgtatatgc tccgcattgg tcttgaccaa ctctatcaga 5820

gcttggttga cggcaatttc gatgatgcag cttgggcgca gggtcgatgc gacgcaatcg 5880

tccgatccgg agccgggact gtcgggcgta cacaaatcgc ccgcagaagc gcggccgtct 5940

ggaccgatgg ctgtgtagaa gtactcgccg atagtggaaa ccgacgcccc agcactcgtc 6000

cgagggcaaa ggaatagagt agtaagctca atgttgagca aagcaggacg agaaaaaaaa 6060

aaataatgat tgttaagaag ttcatgaaaa aaaaaaggaa aaatactcaa atacttataa 6120

cagagtgatt aaataataaa cggcagtata ccctatcagg tattgagata gttttatttt 6180

tgtaggtata taatctgaag cctttgaact attttctcgt atatatcatg gagtatacat 6240

tgcattagca acattacata ctaggatctc tagacctaat aacttcgtat agcatacatt 6300

atacgaagtt atattaaggg ttgtcgacgg atccttgctg caacggcaac atcaatgtcc 6360

acgtttacac acctacattt atatctatat ttatatttat atttatttat ttatgctact 6420

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cgacagtctg ttgaattggc ctggttaggc ttaagtctgg gtccgcttct ttacaaattt 3480

ggagaatttc tcttaaacga tatgtatatt cttttcgttg gaaaagattt cttccaaaaa 3540

aaaaaccgat gaattagtgg aaccaaggaa aaaaaaagag gtatccttga ttaaggaaca 3600

ctgtttaaac agtgtggttt ccaaaaccct gaaactgcat tagtgtaata caagactaga 3660

cacctcgata caaataatgg ttactcaatt caaaactgcc tttgaaacat catgaaaact 3720

gtttcaccct ctgtgaagca taaacactag aaagccaatg aagagctcta caagcctcat 3780

atgggttcaa tgggtctgca atgaccgcat acgggcttgg acaattacct tctattgaat 3840

ttctgagaag agatacatct gaccagcaat gtaagcagac aatcccaatt ctgtaaacaa 3900

cctctttgtc cataattccc catcagaaga gtgaaaaatg ccctcaaaat gcatgcgcca 3960

ctcccacctc tcaactgcac tgcgccacct ctgagggtcc tttcaggggt cgactacccc 4020

ggacacctcg cagaggagcg aggtcacgta cttttaaaat ggcagagacg cgcagtttct 4080

tgaagaaagg ataaaaatga aatggtgcgg aaatgcgaaa atgatgaaaa attttcttgg 4140

tggcgaggaa attgagtgca ataattggca cgaggttgtt gccacccgag tgtgagtata 4200

tatcctagtt tctgcacttt tcttcttctt ttctttgcgt tttcttttca actttttttt 4260

actttttcct tcaacagaca aatctaactt atatagatct atgcttttgc aagctttcct 4320

tttccttttg gctggttttg cagccaaaat atctgcatca atgacaaacg aaactagcga 4380

tagacctttg gtccacttca cacccaacaa gggctggatg aatgacccaa atgggttgtg 4440

gtacgatgaa aaagatgcca aatggcatct gtactttcaa tacaacccaa atgacaccgt 4500

atggggtacg ccattgtttt ggggccatgc tacttccgat gatttgacta attgggaaga 4560

tcaacccatt gctatcgctc ccaagcgtaa cgattcaggt gctttctctg gctccatggt 4620

ggttgattac aacaacacga gtgggttttt caatgatact attgatccaa gacaaagatg 4680

cgttgcgatt tggacttata acactcctga aagtgaagag caatacatta gctattctct 4740

tgatggtggt tacactttta ctgaatacca aaagaaccct gttttagctg ccaactccac 4800

tcaattcaga gatccaaagg tgttctggta tgaaccttct caaaaatgga ttatgacggc 4860

tgccaaatca caagactaca aaattgaaat ttactcctct gatgacttga agtcctggaa 4920

gctagaatct gcatttgcca atgaaggttt cttaggctac caatacgaat gtccaggttt 4980

gattgaagtc ccaactgagc aagatccttc caaatcttat tgggtcatgt ttatttctat 5040

caacccaggt gcacctgctg gcggttcctt caaccaatat tttgttggat ccttcaatgg 5100

tactcatttt gaagcgtttg acaatcaatc tagagtggta gattttggta aggactacta 5160

tgccttgcaa actttcttca acactgaccc aacctacggt tcagcattag gtattgcctg 5220

ggcttcaaac tgggagtaca gtgcctttgt cccaactaac ccatggagat catccatgtc 5280

tttggtccgc aagttttctt tgaacactga atatcaagct aatccagaga ctgaattgat 5340

caatttgaaa gccgaaccaa tattgaacat tagtaatgct ggtccctggt ctcgttttgc 5400

tactaacaca actctaacta aggccaattc ttacaatgtc gatttgagca actcgactgg 5460

taccctagag tttgagttgg tttacgctgt taacaccaca caaaccatat ccaaatccgt 5520

ctttgccgac ttatcacttt ggttcaaggg tttagaagat cctgaagaat atttgagaat 5580

gggttttgaa gtcagtgctt cttccttctt tttggaccgt ggtaactcta aggtcaagtt 5640

tgtcaaggag aacccatatt tcacaaacag aatgtctgtc aacaaccaac cattcaagtc 5700

tgagaacgac ctaagttact ataaagtgta cggcctactg gatcaaaaca tcttggaatt 5760

gtacttcaac gatggagatg tggtttctac aaatacctac ttcatgacca ccggtaacgc 5820

tctaggatct gtgaacatga ccactggtgt cgataatttg ttctacattg acaagttcca 5880

agtaagggaa gtaaaataga gatctgttaa ttcaaattaa ttgatatagt tttttaatga 5940

gtattgaatc tgtttagaaa taatggaata ttatttttat ttatttattt atattattgg 6000

tcggctcttt tcttctgaag gtcaatgaca aaatgatatg aaggaaataa tgatttctaa 6060

aattttacaa cgtaagatat ttttacaaaa gcctagctca tcttttgtca tgcactattt 6120

tactcacgct tgaaattaac ggccagtcca ctgcggagtc atttcaaagt catcctaatc 6180

gatctatcgt ttttgatagc tcattgatat cgtcaaggct gtccaagagg caaccaatgg 6240

tggtccacat ggtgtcatca atgtctctgt ctctgaagct gcaatttctc aatcttgtga 6300

atacgttaga cctctaggta aggttgttct tgttggttta ccagcaggcg cacaagtcaa 6360

aactggtgtc tttgaagccg ttgtcaagtc tattgaaatt aagggttctt atgtcggtaa 6420

cagaaaggat accgccgaag cacttgactt ctacactaga ggcttggtca agtctccatt 6480

caagattgtc ggtttatccg aattgccaaa agtctttgaa ctcatggaac agggtaagat 6540

tttaggtaga atggtcttag acacctccaa ataagtctag agagtgtata cctccccgct 6600

tttgctgcta ctaattaata cccactatta atttccttct attacaaaac gcctctcaga 6660

ctcccacaca cacacttaca ctagtggcct atgcggccgc ggatctgccg gtctccctat 6720

agtgagtcgt attaatttcg ataagccagg ttaacctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 6780

cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 6840

gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 6900

ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 6960

ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 7020

atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 7080

aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 7140

gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc tcacgctgta 7200

ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 7260

ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 7320

acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 7380

gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 7440

ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 7500

ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 7560

gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 7620

ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 7680

agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 7740

ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 7800

gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 7860

catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 7920

cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 7980

cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 8040

gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 8100

tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 8160

gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 8220

tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 8280

gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 8340

gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 8400

taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 8460

tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 8520

ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 8580

taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 8640

tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 8700

aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta 8760

ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt 8820

tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc 8880

tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt 8940

gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgg 9000

acatattgtc gttagaacgc ggctacaatt aatacataac cttatgtatc atacacatac 9060

gatttaggtg acactataga ac 9082

Claims

1.一种生产乳酸和/或乳酸酯的方法，所述方法包括

提供被遗传修饰以便过度表达编码乳酸脱氢酶的基因和编码α-半乳糖苷酶的基因的真菌，

在包含有包含低聚半乳糖的碳源物的培养基中培养所述真菌以便获得乳酸和/或乳酸酯，其中所述碳源物包含大豆糖蜜。

2.如权利要求1或2所述的方法，其还包括从所述培养基中回收所得乳酸和/或乳酸酯。

3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括分离和/或纯化乳酸和/或乳酸酯。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳酸是光学纯乳酸异构体，任选地L-乳酸异构体。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括从所获得的乳酸中制备聚乳酸。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述碳源物包含占所述碳源物中的总碳水化合物的至少约10重量％、20重量％、30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、或90％重量的低聚半乳糖。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述低聚半乳糖选自由以下组成的组：蜜二糖、甘露三糖、甘露四糖、蜜三糖、水苏糖、毛蕊花糖、ajucose、半乳糖肌醇、双半乳糖基肌醇、半乳糖松醇A、半乳糖松醇B、鹰嘴豆糖醇、荞麦醇B1、荞麦醇B2和其任何组合。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述碳源物包含葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、纤维素和/或其任何组合。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述碳源物包括来自豆类、大豆、蚕豆、豌豆、鹰嘴豆、玉米、甘蔗、甜菜、木质纤维素或其任何组合的碳源物；所述碳源物包含甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜和/或柑橘糖蜜；且/或所述培养基或碳源物包含5-100重量％大豆糖蜜。

10.一种用于从包含大豆糖蜜的碳源物中生产乳酸和/或乳酸酯的遗传修饰真菌，其中所述真菌被遗传修饰以便过度表达编码乳酸脱氢酶的基因和编码α-半乳糖苷酶的基因。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法或遗传修饰真菌，其中所述α-半乳糖苷酶是异源α-半乳糖苷酶。

12.如权利要求11所述的方法或遗传修饰真菌，其中所述异源α-半乳糖苷酶是例如选自以下属类的酵母或丝状真菌的α-半乳糖苷酶：曲霉(Aspergillus)、赤霉菌(Gibberella)、小克银汉霉(Cunninghamella)、镰刀菌(Fusarium)、球囊霉(Glomus)、腐质霉(Humicola)、被孢霉(Mortierella)、毛霉菌(Mucor)、青霉菌(Penicillium)、腐霉(Pythium)、根毛霉(Rhizomucor)、根霉(Rhizopus)、木霉(Trichoderma)和酵母属(Saccharomyces)，尤其由以下组成的组：玉米赤霉(Gibberella zeae)、中间赤霉(Gibberella intermdia)、串珠状赤霉(Gibberella moniliformis)、藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、尼加迈赤霉(Gibberella nygamai)、赤霉菌属F75、镰刀菌属2F75、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、芒果镰刀菌(Fusarium mangiferae)、层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)、轮状镰刀菌(Fusarium verticilloides)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、土曲霉(Aspergillusterreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、费氏曲霉(Aspergillus fischeri)、米黑根霉(Rhizopus miehei)、米黑根毛霉菌(Rhizomucor miehei)、米根霉(Rhizopus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

13.如前述权利要求中任一项所述的方法或遗传修饰真菌，其中所述乳酸脱氢酶是异源乳酸脱氢酶。

14.如权利要求13所述的方法或遗传修饰真菌，其中所述异源乳酸脱氢酶来自生物体、微生物、真菌、单细胞原生动物寄生虫、或细菌，任选地来自牛属(Bos)、克鲁维斯酵母(Kluyveromyces)、根霉(Rhizopus)、疟原虫(Plasmodium)、乳杆菌(Lactobacillus)、片球菌(Pediococcus)或芽孢杆菌(Bacillus)。

15.如前述权利要求中任一项所述的方法或遗传修饰真菌，其中所述修饰真菌包含编码乳酸脱氢酶的基因和/或编码α-半乳糖苷酶的基因的一或多个拷贝。

16.如前述权利要求中任一项所述的方法或遗传修饰真菌，其中所述编码乳酸脱氢酶的基因选自由以下组成的组：ldh1、ldh2、ldh3、ldh4、ldh5、ldh6A、ldh6B、ldhA、ldhB、ldhC和ldhL，且/或

所述编码α-半乳糖苷酶的基因选自由以下组成的组：agl1、agl2、agl3、aglA、aglB、aglC、aglD、MEL1、MEL2、MEL5、和MEL6。

17.如前述权利要求中任一项所述的方法或真菌，其中所述真菌进一步遗传修饰来降低乙醇生产。

18.如权利要求17所述的方法或真菌，其中所述真菌被遗传修饰以便通过修饰或缺失与乙醇生产相关的基因的至少一部分或通过灭活与乙醇生产相关的基因来降低乙醇生产，并且任选地与乙醇生产相关的基因选自由以下组成的组：PDC1、PDC5、PDC6、ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、和ADH5、和其任何组合。

19.如前述权利要求中任一项所述的方法或真菌，其中所述真菌还包含选自由以下组成的组的一种或多种基因的遗传修饰：CYB2、GPD1、GPD2、GPP1、GPP2和其任何组合。

20.如前述权利要求中任一项所述的方法或真菌，其中所述真菌是酵母或丝状真菌。

21.如前述权利要求中任一项所述的方法或真菌，其中所述真菌是选自以下属类的酵母或丝状真菌：曲霉、酵母属、克鲁维斯酵母、毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、假丝酵母(Candida)、丝孢酵母属(Trichosporon)、根霉、圆孢菌(Torulaspora)、伊萨酵母(Issatchenkia)和舍弗氏菌(Scheffersomyces)，例如尤其来自由以下组成的组：酿酒酵母、葡萄汁酵母(S.uvarum)、耐热克鲁维斯酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、乳酸克鲁维斯酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维斯酵母(K.marxianus)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、树干舍弗氏菌(Scheffersomyces stipitis)、米根霉、比勒陀利亚圆孢菌(Torulaspora pretoriensis)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、盔状毕赤酵母(P.galeiformis)、沙漠毕赤酵母(P.deserticola)、膜醭毕赤酵母(P.membranifaciens)、杰丁毕赤酵母(P.jadinii)、库德毕赤酵母(P.kudriavzevii)、异常毕赤酵母(P.anomala)、乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)、索诺拉假丝酵母(C.sonorensis)和蜜生假丝酵母(C.apicola)。

22.如前述权利要求中任一项所述的方法或真菌，其中所述真菌在登录号VTT C-191026或VTT C-201040下寄存于VTT保藏。

23.如权利要求10-22中任一项所述的制备遗传修饰真菌的方法，其中所述方法包括提供真菌和遗传修饰所述真菌来过度表达编码乳酸脱氢酶的基因和编码α-半乳糖苷酶的基因。

24.一种如权利要求10-22中任一项所述的真菌用于从包含大豆糖蜜的碳源物中生产乳酸和/或乳酸酯或用于生产聚合物，任选地聚酯或聚乳酸的用途。

25.一种生产选自由聚合物、聚酯和聚乳酸组成的组的一种或多种产物的方法，所述方法包括在含有低聚半乳糖的培养基中培养如权利要求10-22中任一项所述的遗传修饰真菌以便从包含大豆糖蜜的碳源物中生产乳酸，回收所得乳酸和使用回收的乳酸来生产聚合物、聚酯和/或聚乳酸。