KR20190138274A - 클로스트리디움 박테리아의 변형을 위한 최적화된 유전 툴 - Google Patents

클로스트리디움 박테리아의 변형을 위한 최적화된 유전 툴 Download PDF

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KR20190138274A
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Abstract

본 발명은 클로스트리디움 속 박테리아, 전형적으로 용매생성 박테리아의 동종 재조합에 의한 형질전환 및 변형을 용이하게하기위해 최적화된 2개 이상의 별개의 핵산을 포함하는 유전 툴에 관한 것 이다.

Description

클로스트리디움 박테리아의 변형을 위한 최적화된 유전 툴{OPTIMIZED GENETIC TOOL FOR MODIFYING CLOSTRIDIUM BACTERIA}
본 발명은 전형적으로 클로스트리디움 속(Clostridium genus) 속의 용매생성 박테리아(solventogenic bacterium)의 클로스트리디움 속의 박테리아의 동종 재조합에 의해 형질전환 및 변형을 촉진시키도록 최적화된 적어도 2개의 구별되는 핵산을 포함하는 유전 툴(genetic tool)에 관한 것이다.
기술적 배경
후벽균(Firmicutes) 문(phylum)의 클로스트리디움 속에 속하는 박테리아는 그람-양성의, 완전 혐기성인, 내생포자-형성 박테리아이다. 이러한 속은 이들의 병원성 또는 이들의 산업적 및 의학적 관심으로 인하여 연구된 많은 종을 함유한다. 예를 들면, 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens) 및 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile)는 각각 파상풍, 보툴리누스 식중독(botulism), 가스 괴저(gas gangrene) 및 거짓막 대장염(pseudomembranous colitis)에 관여하는 제제이다. 클로스트리디움 노바이(Clostridium novyi) 및 클로스트리디움 스포로게네스(Clostridium sporogenes)는 암 치료요법을 개발하기 위한 연구에서 사용되어 왔다. 동시에, 사람에게 병원성이 아닌 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) 및 클로스트리디움 베이제린키이(Clostridium beijerinckii)가 발효에 사용되고 있다.
소위 산업 목적의 클로스트리디움 종은 글루코즈로부터 셀룰로즈에 이르는 범위의 광범위한 당 및 기질로부터 산 및 용매와 같은 목적한 화합물을 생산할 수 있따. 용매를 생산하는 클로스트리디움 박테리아 ("용매생성 박테리아(solventogenic bacteria)")의 성장은 이상성(biphasic)으로 불린다. 산(아세트산 및 부티르산)은 대수적 성장기 동안에 생산된다. 이후에, 세포 성장이 정지되면 박테리아는 정체기로 도입되어, 용매를 생산한다.
클로스트리디움의 대부분의 용매생성 균주는 최종 생성물로서 아세톤, 부탄올 및 에탄올을 생산한다. 이러한 균주는 "ABE 균주"로 불린다. 이는 예를 들면, 씨. 아세토부틸리쿰(C.　acetobutylicum) DSM 792(또한 ATCC 824 또는 LMG 5710으로 공지됨) 및 씨. 베이제린키이(C. beijerinckii) NCIMB 8052의 경우이다. 다른 균주는 또한 아세톤 모두 또는 일부를 이소프로판올로 환원시킬 수 있으며 "IBE 균주"로 불린다. 이는 예를 들면, 씨. 베이제린키이 DSM 6423(또한 NRRL B-593, LMG 7814, LMG 7815로서 공지됨) 균주의 경우이며, 이는 아세톤을 이소프로판올로 환원시키는 1급/2급 알코올 데하이드로게나제를 암호화하는 adh 유전자를 이의 게놈 내에 갖는다.
1세기 이상 동안 산업에서 사용되었지만, 클로스트리디움 속에 속하는 박테리아에 대한 지식은 이들을 유전적으로 변형시키는데 있어서 직면한 곤란성으로 인하여 제한되어 왔다. 다양한 유전 툴이 최근 수년 동안 개발되어 이러한 속의 균주를 최적화시켜 왔으며, 가장 최근의 생성은 CRISPR(집단화하여 일정하게 분포하는 짧은 팔린드롬 반복체: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-관련 단백질) 기술을 기반으로 한다. 이러한 방법은 뉴클레아제(전형적으로 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 Cas9 단백질과 같은 Cas 뉴클레아제)로 불리는 효소의 사용을 기반으로 하며, 이는 RNA 분자에 의해 가이드되어 DNA 분자(목적한 표적 서열) 내에서 이중 가닥 절단물(double-stranded cut)을 만든다. 가이드 RNA(gRNA) 서열은 이를 매우 고 특이성으로 되도록 하는, 뉴클레아제 절단 부위를 결정할 것이다(도 1).
필수적인 DNA 분자내에서 이중-가닥 절단물은 유기체에 대해 치명적이므로, 이의 생존은 이를 복구하는 이의 능력에 의존할 것이다(참고: 예를 들면, Cui & Bikard, 2016). 클로스트리디움 속의 박테리아에서, 이중-가닥 절단물의 복구는 절단된 서열(cleaved sequence)의 완전한 카피를 필요로 하는 동종 재조합 메카니즘에 의존한다. 원래의 서열을 변형시키면서 이의 복구를 수행하도록 하는 DNA 단편을 지닌 박테리아를 제공함으로써, 미생물이 이의 게놈 내에 목적한 변화를 통합하도록 하는 것이 가능하다. 수행된 변형은 표적 서열 또는 PAM 부위의 변형을 경유하여 Cas9-gRNA 리보뉴클레오단백질 복합체에 의한 게놈 DNA의 표적화를 더이상 허용하지 않아야만 한다(도 2).
클로스트리디움 박테리아에서 기능성인 이러한 유전 툴을 제조하기 위한 상이한 시도가 기술되어 왔다. 이러한 미생물은 이들의 낮은 형질전환 및 동종 재조합 빈도로 인하여 유전적으로 변형시키기 어려운 것으로 알려져 있다. 몇가지 시도는 씨. 베이제린키이 및 씨. 르정다흘리이(C.　ljungdahlii)에서(Wang et al., 2015; Huang et al., 2016) 또는 씨. 베이제린키이, 씨, 사카로페르부틸아세토니쿰(C.　saccharoperbutylacetonicum) 및 씨. 오토에타노게눔(C.　authoethanogenum)(Wang et al., 2016; Nagaraju et al., 2016; Wang et al., 2017)에서 유도성 프로모터의 제어 하에서 구성적으로 발현된, Cas9의 사용을 기반으로 한다. 다른 저자는 뉴클레아제의 변형된 버젼인, Cas9n의 용도를 기술하여 왔으며, 이는 게놈내에서 이중-가닥 절단보다는 단일-가닥 절단을 이룬다(Xu et al., 2015; Li et al., 2016). 이러한 선택은 Cas9의 독성이 시험한 실험 조건 하에서 클로스트리디움 박테리아에서 이를 사용하기에 너무 높다는 관찰에 기인한다. 상술된 모든 툴은 단일 플라스미드의 사용을 기반으로 한다. 최종적으로, 예를 들면, 씨. 파스테리아눔(C.　pasteurianum)에서와 같이, 미생물의 게놈 내에서 내인성 CRISPR/Cas 시스템이 확인된 경우 이를 사용하는 것이 가능하다(Pyne et al., 2016).
이들이 변형시킬 균주의 내인성 기구(endogenous machinery)를 사용하지 않는다면(상술한 마지막 경우에서와 같이), CRISPR 기술을 기반으로 한 툴은 박테리아 게놈(Xu et al., 2015에 따라 최대 약 1.8 kb)으로 삽입될 수 있는 목적한 핵산의 크기(및 따라서 다수의 암호화 서열 또는 유전자의 수)를 유의적으로 제한하는 주요 단점을 갖는다.
본 발명자는 2개의 구별되는 핵산, 전형적으로 2개의 플라스미드의 사용을 기반으로, 클로스트리디움 박테리아에 대해 적응된(adapted), 박테리아를 변형시키기 위한 보다 효율적인 유전 툴을 최근에 개발하여 기술하여 왔으며(WO2017064439, Wasels et al., 2017 및 도 3), 이는 이러한 문제를 해결한다. 특수한 구현예에서, 이러한 툴의 제1의 핵산은 cas9 및 제2 핵산이, 이루어질 변형에 대해 특이적이 되도록 하며, 하나 이상의 gRNA 발현 카세트 및 목적한 서열에 의해 Cas9로 표적화된 박테리아 DNA의 일부의 대체를 가능하게 하는 복구 주형(repair template)을 함유한다. 시스템의 독성은 유도성 프로모터의 제어 하에서 cas9 및/또는 gRNA 발현 카세트(들)을 위치시킴으로써 제한된다.
본 발명자는 또한 아주 최근에 박테리아가 상기 항생제(들)에 대해 민감하게 되도록 하기 위하여 박테리아에게 하나 이상의 항생제에 대한 내성을 제공하는, 야생형 상태에서 유전자를 사용하여 박테리아를 유전적으로 변형시키는데 성공하였으며, 이는 적어도 2개의 핵산의 사용을 기반으로 하여 이들의 유전 툴의 사용을 촉진시킬 수 있도록 하였다. 따라서, 이들은 이소프로판올의 천연 생산자인 균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423을 유전적으로 변형시킬 수 있었다. 특히, 이들은 본 명세서에서 "pNF2"(참고: FR18/73492)로서 확인된, 균주에 대해 필수적이지 않는 천연 플라스미드를 이러한 균주로부터 제거하는데 성공하였다. 본 발명자는 또한 이러한 플라스미드 pNF2의 제거가 본 발명의 맥락에서 이를 가능하도록 하여, 유전 물질 도입 효능(즉, 형질전환 효능)이 약 101 내지 5 x 103를 포함한 인자까지 증가된 씨. 제이제린키이 DSM 6423을 수득하는 것이 가능하도록 함을 발견하고 본원에 나타내었다.
본 발명자는 본 내용에서 클로스트리디움 속의 박테리아의 형질전환 효능을 매우 유의적으로 증가시킬 수 있음으로써, 수 및 유용한 양(특히 산업적 규모의 생산을 위한 강력한 균주를 선택하는 맥락에서)으로, 수득된 목적한 돌연변이체(유전적으로 변형된) 박테리아를 수득할 수 있도록 하는 클로스트리디움 속의 박테리아를 변형시키기 위한 개선된 유전 툴을 기술한다. 하기 설명한 바와 같이, 본 발명자는 특히 플라스미드 pNF2의 일부를 사용하여 박테리아의 유전 물질을 변형시키고/시키거나 박테리아 내에서 상기 박테리아의 야생형 버젼 속에 존재하는 유전 물질로부터 존재하지 않는 DNA 서열을 발현시키기 위한 서열을 수반하는 특이적인 핵산을 설계하기 위해, 본 발명에 따른 유전 툴을 개선시키는 것에 성공하였다. 이러한 핵산 및 새로운 툴은 박테리아의 형질전환 효능, 특히 이들이 야생형 상태에서 함유한 천연 플라스미드(들)이 처음 세척된 박테리아의 형질전환 효능을 현저히 개선시킨다.
따라서, 본 발명은 특히 산업적인 규모로 이러한 박테리아의 형질전환 효능 및 용도를 매우 유리하게 촉진시킨다.
발명의 요지
본 발명자는 본 발명의 맥락에서 및 최초로, 최적화된 형질전환, 및 클로스트리디움 속의 박테리아의 동종 재조합에 의한 유전적 변형 및/또는 야생형 상태에서 상기 박테리아의 유전 물질로부터 부분적으로 또는 전체적으로 부재된 DNA 서열의 상기 박테리아내 발현을 기술한다. 이러한 툴은 전형적으로 i) 이것이:
- 적어도 하나의 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들면, Cas9 효소를 암호화하는 "제1" 핵산(여기서 DNA 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열은 프로모터의 제어 하에 있다), 및
- 동종 재조합 메카니즘에 의해, 목적한 서열에 의한 엔도뉴클레아제에 의해 표적화된 박테리아 DNA의 일부의 대체를 가능하게 하는 복구 주형을 포함하는 적어도 "제2의" 핵산을 포함하고,
ii) 상기 핵산 중 적어도 하나는 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA)를 추가로 암호화하거나, 유전 툴이 하나 이상의 가이드 RNA를 추가로 포함하고, 각각의 가이드 RNA는 DNA-엔도뉴클레아제-결합 RNA 구조 및 박테리아 DNA의 표적화된 부위에 대해 상보성인 서열을 포함하며,
iii) 상기 핵산 중 적어도 하나는 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 항-CRISPR 단백질을 추가로 암호화하는 서열을 추가로 포함하거나, 또는 유전 툴이 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 항-CRISPR 단백질을 암호화하는 "제3의" 핵산을 추가로 포함함을 특징으로 한다.
이러한 개선된 툴에서, 적어도 하나의 핵산은 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 항-CRISPR 단백질("acr")을 암호화하는 서열을 포함한다. 이러한 항-CRISPR 단백질은 DNA 엔도뉴클레아제/가이드 RNA 복합체의 활성을 억제한다. 단백질의 발현은 박테리아의 형질전환 단계 동안에만 이의 발현을 허용하도록 조절된다.
선행 기술의 툴과 비교하여, 이러한 툴은 클로스트리디움 박테리아의 형질전환을 현저하게 촉진시키는 정점을 가짐으로써 목적한 유전적으로 변형된 박테리아를 산업적 규모에서의 수 및 유용한 양으로 생산하는 이점을 갖는다.
본 발명자는 또한, 본 발명의 맥락에서 및 최초로, 박테리아의 형질전환(상기 박테리아내에서 도입된 모든 유전 물질의 유지를 증진시킴으로써)을 촉진시키는 핵산(또한 본 내용에서 "OPT" 핵산으로 확인됨)을 기술한다. OPT 핵산은 i) 서열 번호: 126의 서열 모두 또는 일부 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아내에서 상기 박테리아의 야생형 버젼 내에 존재하는 유전 물질로부터 부분적으로 또는 전체적으로 부재한 DNA 서열의 발현을 가능하게 하는 서열을 포함한다. 서열 번호: 126의 서열은 또한 본 내용에서 "OREP" 핵산으로 확인된다.
본 발명자는 특히 상기 박테리아내에서 OREP 서열을 결실시키고 유리하게는 이러한 OREP 서열의 전부 또는 일부를 사용함으로써 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아 내에서 상기 박테리아의 야생형 버젼내에 존재하는 유전 물질로부터 부분적으로 또는 전체적으로 부재된 DNA 서열의 발현을 가능하게 하는 유전 툴을 사용함으로써, 박테리아 씨. 베이제린키이 DSM 6423내 핵산의 형질전환 빈도를 증진시키는데 성공하였다.
OREP 서열은 목적한 OPT 핵산의 복제에 포함된 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 127)을 포함한다. 복제에 포함된 이러한 단백질은 또한 본 내용에서 "REP" 단백질(서열 번호: 128 - "MNNNNTESEELKEQSQLLLDKCTKKKKKNPKFSSYIEPLVSKKLSERIKECGDFLQMLSDLNLENSKLHRASFCGNRFCPMCSWRIACKDSLEISILMEHLRKEESKEFIFLTLTTPNVKGADLDNSIKAYNKAFKKLMERKEVKSIVKGYIRKLEVTYNLDKSSKSYNTYHPHFHVVLAVNRSYFKKQNLYINHHRWLSLWQESTGDYSITQVDVRKAKINDYKEVYELAKYSAKDSDYLINREVFTVFYKSLKGKQVLVFSGLFKDAHKMYKNGELDLYKKLDTIEYAYMVSYNWLKKKYDTSNIRELTEEEKQKFNKNLIEDVDIE")로서 확인된다. REP 단백질은 서열 번호: 129의 서열의 "COG 5655"(플라스미드 롤링-서클 복제 개시인자(플라스미드 rolling-circle replication initiator) 단백질 REP)로 불리는, 후벽균내 보존된 도메인을 갖는다.
특히, 본 발명은 따라서 적어도:
- 적어도 하나의 DNA 엔도뉴클레아제를 암호화하는 "제1의" 핵산(여기서, DNA 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열은 프로모터의 제어 하에 있다), 및
- "OREP 핵산 서열"을 포함하거나, 이로 이루어진, 즉, i) 서열 번호: 126의 서열 모두 또는 일부 및 ii) 상기 박테리아 내에서 상기 박테리아의 야생형 버젼내에 존재하는 유전 물질로부터 부분적으로 또는 전체적으로 부재된 DNA 서열의 발현을 가능하게 하는 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 "기타" 핵산을 포함하는 유전 툴을 기술한다. 특수한 구현예에서, 상술한 바와 같은 "복구 주형을 포함하는 제2의 핵산"은 이러한 "기타 핵산"을 포함한다.
예를 들면, 동종 재조합에 의해, 클로스트리디움 속의 박테리아, 전형적으로 클로스트리디움 속의 용매생성 박테리아를 형질전환시키고, 전형적으로 유전적으로 변형시키는 방법 뿐만 아니라 이러한 방법에 의해 수득된 박테리아 또는 박테리아들(형질전환되고 전형적으로 유전적으로 변형됨)이 또한 기술되어 있다. 이러한 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 박테리아 내로 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자(inducer)의 존재하에서 본 발명에 따른 유전 툴을 도입시키는 단계, 및
b) 단계 a)의 말기에 수득된 형질전환된 박테리아를 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자를 함유하지 않는 배지 상에서 배양하고 전형적으로 DNA 엔도뉴클레아제/gRNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 발현을 가능하게 하는 단계.
이러한 공정의 예는 유리하게는 박테리아 내로 본 발명의 내용에 기술된 바와 같은 유전 툴의 모두 또는 일부, 특히, i) 서열 서열 번호: 126의 모두 또는 일부 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아 내에서 상기 박테리아의 야생형 버젼에서 존재하는 유전 물질로부터 부분적으로 또는 전체적으로 부재된 DNA 서열의 발현을 가능하게 하는 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 핵산("OPT 핵산")을 도입함으로써 박테리아를 형질전환시키는 단계를 포함한다.
본 발명자는 또한 클로스트리디움 속의 박테리아를 형질전환하고, 바람직하게는 유전적으로 변형시키거나, 클로스트리디움 속의 박테리아를 사용하여, 적어도 하나의 용매, 예를 들면, 용매의 혼합물을 생산하기 위한 키트(kit)를 기술한다. 이러한 키트는 본 내용에 기술된 바와 같은 핵산 또는 본 내용에 기술된 바와 같은 유전 툴의 성분, 및 툴내에 사용된 선택된 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도성 프로모터에 적응된 적어도 하나의 유도인자를 포함한다. 특수한 구현예에서, 키트는 본 내용에 기술된 바와 같은 유전 툴의 성분 중 모두 또는 일부를 포함한다.
클로스트리디움 속의 박테리아, 예를 들면, 야생형 상태에서 박테리아 염색체 및 염색체 DNA로부터 구별된 적어도 하나의 DNA 분자(대표적으로 천연 플라스미드) 둘 다를 갖는 클로스트리디움 속의 박테리아를 형질전환시키고 임의로 유전적으로 변형시키기 위한, 본 내용에서 처음으로 개시된 핵산 또는 유전 툴의 용도가 또한 기술되어 있다.
또한 본 내용에서 첫번째로 개시된, 용매 또는 용매의 혼합물, 바람직하게는 아세톤, 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이의 혼합물, 대표적으로 이소프로판올/부탄올, 부탄올/에탄올 또는 이소프로판올/에탄올 혼합물의 생산, 바람직하게는 산업적 규모로의 생산을 가능하도록 하는, 핵산 또는 유전 툴, 전형적으로 동종 재조합에 의해, 클로스트리디움 속의 박테리아를 형질전환시키고 바람직하게는 유전적으로 변형시키는 공정, 상기 공정에 의해 수득된 박테리아, 및/또는 키트의 용도가 기술되어 있다.
발명의 상세한 설명
1세기 이상 동안 산업에서 사용되었지만, 용매생성 박테리아, 특히, 클로스트리디움 속에 속하는 것들의 지식은 이들을 유전적으로 변형시키는데 있어서 직면한 곤란성에 의해서 제한되어 있다. 예를 들면, 이소프로판올을 천연적으로 생산하고, 전형적으로 이들의 게놈 내에 아세톤을 이소프로판올로 환원시키는 1급/2급 알코올 데하이드로게나제를 암호화하는 adh 유전자를 갖는, 천연적으로 이소프로판올을 생산하는 클로스트리디움 속의 박테리아는 천연 상태에서 ABE 발효가 가능한 박테리아과는 유전적으로 및 기능적으로 둘 다 구별된다.
본 내용에 기술된 유전 툴은 이의 특성을 개선시키기 위하여 목적한 서열에 의한 클로스트리디움 속의 박테리아의 형질전환을 상당히 촉진시키는 이점을 갖는다.
이러한 툴은 전형적으로
i) - 적어도 하나의 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들면, Cas9 효소를 암호화하는 "제1" 핵산(여기서 DNA 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열은 프로모터의 제어 하에 있다), 및
- 동종 재조합 메카니즘에 의해, 목적한 서열에 의한 엔도뉴클레아제에 의해 표적화된 박테리아 DNA의 일부의 대체를 가능하게 하는 복구 주형을 포함하는 적어도 "제2의" 핵산,을 포함하고,
ii) 상기 핵산 중 적어도 하나는 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA)를 추가로 암호화하거나, 유전 툴이 하나 이상의 가이드 RNA를 추가로 포함하고, 각각의 가이드 RNA는 DNA-엔도뉴클레아제-결합 RNA 구조 및, 박테리아 DNA의 표적화된 부위에 대해 상보성인 서열을 포함하며,
iii) 상기 핵산 중 적어도 하나는 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 항-CRISPR 단백질을 암호화하는 서열을 추가로 포함하거나, 또는 유전 툴이 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 항-CRISPR 단백질을 암호화하는 "제3의" 핵산을 추가로 포함함을 특징으로 한다.
이러한 툴은 핵산 서열의 거대 단편의 삽입을 허용한다.
본 발명자가 기술한 툴을 사용하여 목적한 박테리아, 전형적으로 클로스트리디움 속에 속하는 본 내용에 기술된 바와 같은 박테리아, 바람직하게는 이소프로판올을 천연적으로 생산할 수 있고(즉, 야생형 상태에서 가능), 특히 천연적으로 IBE 발효할 수 있는, 클로스트리디움 속의 박테리아, 바람직하게는 씨. 베이제린키이와 같은, 하나 이상의 항생제에 대해 천연적으로 내성인 박테리아를 형질전환하고/하거나 유전적으로 변형시킬 수 있다. 바람직한 박테리아는 야생형 상태에서 박테리아 염색체 및, 염색체 DNA와는 구별되는 적어도 하나의 DNA 분자 둘 다를 갖는다.
표현 "클로스트리디움 속의 박테리아"는 특히 소위 산업적 목적의 클로스트리디움 종, 전형적으로 클로스트리디움 속의 용매생성 또는 아세토게닉 박테리아(acetogenic bacteria)을 지칭한다. 표현 "클로스트리디움 속의 박테리아"는 야생형 박테리아뿐 만 아니라 CRISPR 시스템에 대해 노출되지 않고도 이들의 성능(예를 들면, ctfA, ctfB 및 adc 유전자를 과발현하는)을 개선시키도록 유전적으로 변형된 이로부터 기원한 균주를 포함한다.
표현 "산업적 목적의 클로스트리디움 종"은 발효에 의해, 부티르산 또는 아세트산과 같은 산 및 용매를 당 또는 당당류, 전형적으로 크실로즈, 아라비노즈 또는 프럭토즈와 같은 5-탄당, 글루코즈 또는 만노즈와 같은 6탄당, 셀룰로즈 또는 헤미셀룰로즈와 같은 다당류 및/또는 클로스트리디움 속의 박테리아에 의해 소화되거나 사용될 수 있는 임의의 다른 탄소원(예를 들면, CO, CO2 및 메탄올)으로부터 생산할 수 있는 클로스트리디움 종을 지칭한다. 목적한 용매생성 박테리아의 예는 문헌에 "ABE 균주"로서 확인된 균주[발효를 통해 아세톤, 부탄올 및 에탄올을 생산하는 균주] 및 "IBE 균주"[발효를 통해 이소프로판올(아세톤을 환원시킴으로써), 부탄올 및 에탄올을 생산하는 균주]로서 확인된 균주와 같이, 아세톤, 에탄올 및/또는 이소프로판올을 생산하는 클로스트리디움 속의 박테리아이다. 클로스트리디움 속의 용매생성 박테리아는 씨. 아세토부틸리쿰(C.　 acetobutylicum), 씨, 셀룰롤리티쿰(C.　cellulolyticum), 씨. 파이토페르멘탄스(C.　 phytofermentans), 씨. 베이제린키이, 씨, 사카로부틸리쿰(C.　 saccharobutylicum), 씨. 사카로페르부틸아세토니쿰( C.　 saccharoperbutylacetonicum), 씨. 스포로게네스(C.　 sporogenes), 씨. 부티리쿰(C.　butyricum), 씨. 아우란티부티리쿰(C.　 aurantibutyricum) 및 씨. 타이로부티리쿰(C.　tyrobutyricum)으로부터, 바람직하게는 씨. 아세토부틸리쿰, 씨. 베이제린키이, 씨. 부티리쿰, 씨. 타이로부티리쿰 및 씨. 셀룰롤리티쿰, 및 심지어 보다 바람직하게는 씨. 아세토부틸리툼 및 씨. 베이제린키이로부터 선택될 수 있다.
야생형 상태에서 이소프로판올을 생산할 수 있는, 특히 야생형 상태에서 IBE 발효할수 있는 박테리아는 예를 들면, 씨 베이제린키이, 씨. 디올리스(C.　 diolis), 씨. 푸니세움(C.　 puniceum), 씨. 부티리쿰(C.　 butyricum), 씨. 사카로페르부틸아세토니쿰(C.　saccharoperbutylacetonicum), 씨. 보툴리눔(C.　 botulinum), 씨. 드라케이(C.　drakei), 씨. 스카톨로게네스(C.　 scatologenes), 씨. 페르프릴겐스(C.　perfringens) 및 씨. 투니시엔세(C.　tunisiense)로부터 선택된 박테리아, 바람직하게는 씨. 베이지린키이, 씨. 디올리스, 씨. 푸니세움 및 씨. 사카로페르부틸아세토니툼으로부터 선택된 박테리아일 수 있다. 이소프로판올을 천연적으로 생산할 수 있고, 특히 야생형 상태에서 IBE 발효할 수 있는, 특히 바람직한 박테리아는 씨. 베이제린키이이다.
목적한 아세토게닉 박테리아는 CO2 및 H2로부터 산 및/또는 용매를 생산하는 박테리아이다. 클로스트리디움 속의 아세토게닉 박테리아는 예를 들면, 씨. 아세티쿰(C.　aceticum), 씨. 써모아세티쿰(C.　 thermoaceticum), 씨. 르정다흘리이, 씨. 오토에타노게눔, 씨. 디피실레, 씨. 스카톨로게네스 및 씨. 카복시디보란스(C.　carboxydivorans)로부터 선택될 수 있다.
특수한 구현예에서, 관련된 클로스트리디움 속의 박테리아는 "ABE 균주", 바람직하게는 균주 씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792(또한 ATCC 824 또는 LMG 5710으로서 공지됨) 또는 균주 씨. 베이제린키이 NCIMB 8052이다.
다른 특수한 구현예에서, 관련된 클로스트리디움 속의 박테리아는 "IBE 균주", 바람직하게는 DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593, NCCB 27006으로부터 선택된 씨. 베이제린키이의 아속, 또는 씨. 아우란티부티리쿰(C.　aurantibutyricum) DSZM 793(Georges et al., 1983), 및 균주 DSM 6423과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성(identity)을 갖는 이러한 씨. 베이제린키이 또는 씨. 아우란티부티리쿰 박테리아의 아속(subclade)이다. 특히 바람직한 씨. 베이제린키이 박테리아, 또는 씨. 베이제린키이 박테리아의 아속은 플라스미드 pNF2를 갖지 않는다.
한편, 아속 LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593 및 NCCB 27006의 각각의 게놈, 및 다른 한편 DSZM 793은 아속 DSM6423의 게놈과 적어도 97%의 서열 동일성 퍼센트(sequence identity percentage)를 갖는다.
본 발명자는 아속 DSM 6423, LMG 7815 및 NCCB 27006의 씨. 베이제린키이 박테리아가 야생형 상태에서 이소프로판올을 생산할 수 있음을 확인하는 발효 시험을 수행하였다 (참고: 표 1).
Figure pat00001
천연적으로 이소프로판올-생산 균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423, LMG 7815 및 NCCB 27006을 사용한 글루코즈 발효 시험의 요약. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 씨. 베이제린키이 박테리아는 아속 DSM 6423의 박테리아이다. 본 발명의 여전히 다른 바람직한 구현예에서, 씨. 베이제린키이 박테리아는 씨. 베이제린키이 IFP963 △ catB △pNF2 (2019년 2월 20일자로 기탁 번호 LMG P-31277 하에 BCCM-LMG 컬렉션에 등록됨) 균주이다.
CRISPR/DNA 엔도뉴클레아제 시스템은 2개의 구별되는 필수 성분, 즉, i) 엔도뉴클레아제, 본 경우에 CRISPR 시스템과 관련된 뉴클레아제(Cas 또는 "CRISPR-관련 단백질"), 전형적으로 Cas9, 및 ii) 가이드 RNA를 함유한다. 가이드 RNA는 박테리아 CRISPR RNA(crRNA) 및 tracrRNA(트랜스-활성화 CRISPR RNA)의 조합으로 이루어진 키메라 RNA이다(Jinek et al., Science 2012). gRNA는 Cas 단백질을 가이드하는 "스페이서 서열"에 상응하는 crRNA의 표적화 특이성 및 tracrRNA의 구조적 특성을 단일 전사체 내에서 조합한다. gRNA 및 Cas 단백질이 세포내에서 동시에 발현되는 경우, 표적 게놈 서열은 제공된 복구 주형을 사용하여 영구적으로 변형시킬 수 있다.
최근의 실험에서, 본 발명자는 이소프로판올을 천연적으로 생산하는 클로스트리디움 속의 박테리아, 박테리아 씨. 베이제린키이 DSM 6423 뿐만 아니라, 참고 균주 씨. 아세토부티리쿰 DSM 792를 형질전환하고 유전적으로 변형시키는데 성공하였다.
실험 단락에 기술된 작업 중 일부는 IBE 발효할 수 있는 균주, 즉, 씨. 베이제린키이 DSM 6423 내에서 수행하였으며, 이의 게놈 및 전사체 분석(transcriptomic analysis)은 본 발명자에 의해 최근에 기술되었다(Mate de Gerando et al., 2018).
이러한 균주의 게놈의 조립 동안에, 본 발명자는, 염색체 외에, 이동하는 유전 성분(기탁 번호 PRJEB11626 - https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB11626): 2개의 천연 플라스미드(pNF1 및 pNF2) 및 선형의 박테리오파아지(Φ6423)의 존재를 발견하였다.
균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423은 천연적으로 에리쓰로마이신-민감성이지만 티암페니콜-내성이다. 특허원 제FR18/73492호는 티오페니콜-민감성으로 만들어진 특수한 균주인, 균주, 씨. 베이지린키이 DSM 6423 catB를 기술한다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 본 발명자는 균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423으로부터 이의 천연 pNF2 플라스미드를 제거하는데 성공하였고 균주 씨. 베이제린키이 DSM6423 △ catB △pNF2를 수득하였다. 이러한 균주는 2019년 2월 20일자로 기탁 번호 LMG P-31277 하에 BCCM-LMG 컬렉션에 등록되었다. 설명은 또한 임의의 유도된 박테리아, 클론, 돌연변이체 또는 유전적으로 변형된 이의 버젼에 관한 것이다. 이는 또한 보다 일반적으로 야생형 상태에서 박테리아 염색체 및 일반적으로 본 내용에서 기술된 핵산 및/또는 유전 툴을 사용하여 유전적으로 변형됨으로써, 더 이상 이의 비-염색체 DNA 분자 중 적어도 하나, 전형적으로 이의 비염색체 DNA 분자 중 몇가지(예를 들면, 2개, 3개 또는 4개의 비-염색체 DNA 분자), 바람직하게는, 모든 이의 비-염색체 DNA 분자를 포함하지 않는, 염색체 DNA와는 구별되는 적어도 하나의 DNA 분자(본 내용에서 "비-염색체(박테리아) DNA" 또는 "천연(박테리아) 플라스미드"로 확인됨) 둘 다를 갖는 임의의 박테리아에 관한 것이다.
본 발명자는 천연의 pNF2 플라스미드의 제거가 추가의 천연 또는 합성의 유전 성분(예를 들면, 발현 카세트(들) 또는 발현 플라스미드 벡터(들))의 도입 및 유지에 유의적으로 유리함을 관찰하였다. 따라서 균주 DSM 6423 △ catB △ pNF2는 이의 야생형 대응부보다 또는 균주 DSM 6423 △catB보다 10 내지 5 x 103배 더 높은 효능으로 형질전환될 수 있다.
따라서, 본 발명자는 이소프로판올을 천연적으로 생산할 수 있는(즉, 야생형 상태에서 가능), 특히 천연적으로 IBE 발효할 수 있는 클로스트리디움 속의 박테리아를 기술하며, 이는 유전적으로 변형되어 있고, 이러한 유전적 변형의 결과로서, 특히 적어도 하나의 천연 플라스미드(즉, 상기 박테리아의 야생형 버젼에 천연적으로 존재하는 플라스미드), 바람직하게는 모든 이의 천연 플라스미드 뿐만 아니라, 이를 수득하는데 사용된 툴, 특히 유전 툴을 갖는다.
이러한 툴은 박테리아의 형질전환 및 유전적 변형을 현저히 촉진시키는 장점을 갖는다. 본 발명자에 의해 수행된 실험은 툴 및, 보다 일반적으로 클로스트리디움 속의 박테리아, 특히 야생형 상태에서 이소프로판올을 생산할 수 있는, 특히 IBE 발효를 수행할 수 있는 클로스트리디움 속의 박테리아, 특히 항생제에 대한 내성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자, 특히 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 예를 들면, 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제 또는 티오암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자를 수반하는 박테리아를 유전적으로 변형시키기 위해 본 내용에 기술된 기술의 가능한 사용을 입증하였다.
특수한 구현예에서, 본 발명자는 암페니콜 부류의 항생제에 대한 내성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자를 천연적으로 수반하는(야생형 상태에서 수반함) 박테리아를 암페니콜 부류의 항생제에 대해 내성이 되도록 하는데 성공하였다.
다른 바람직한 박테리아는, 야생형 상태에서 박테리아 염색체 및, 염색체 DNA와는 구별되는 적어도 하나의 DNA 분자를 함유한다.
또한 바람직한 박테리아는 야생형 상태에서, 박테리아 염색체 및, 염색체 DNA와는 구별되는 적어도 하나의 DNA 분자뿐만 아니라, 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자를 함유한다. 특수한 구현예에서, 이러한 유전자는 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 예를 들면, 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제 또는 티암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 암호화한다.
형질전환되도록, 및 바람직하게는 유전적으로 변형되도록 의도된 특수한 박테리아는 바람직하게는 제1 단계의 형질전환 및 야생형 상태에서 박테리아내에 천연적으로 존재하는 적어도 하나의 염색체외 DNA 분자(전형적으로 적어도 하나의 플라스미드)를 제거하는 것을 가능하도록 하는 본 발명에 따른 핵산 또는 유전 툴을 사용한 제1 단계의 유전 변형에 노출된 박테리아이다.
본 발명자가 기술한 목적은 핵산(본 내용에서 "OPT" 핵산으로서 확인됨)에 관한 것이며, 이는 유리하게는 박테리아내에서 도입된 유전 물질 모두의 유지를 개선시킴으로써 상기 박테리아의 형질전환을 촉진시키는데 사용될 수 있다. 이러한 OPT 핵산은 i) 서열 번호: 126의 서열("OREP" 서열)의 모두 또는 일부 또는 이의 기능적 변이체 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아내에서 상기 박테리아의 야생형 버젼내에 존재하는 유전 물질로부터 부분적으로 또는 전체적으로 부재된 DNA 서열의 발현을 가능하게 하는 서열(또한 본 내용에서 "목적한 서열"로서 확인됨)을 포함한다.
OREP 서열(서열 번호: 126)은 서열 번호: 127의 서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열 번호: 127의 서열은 바람직하게는 OPT 핵산의 복제에 포함된 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다. 복제에 포함된 것으로 고려된 단백질은 또한 본 내용에서 "REP" 단백질(서열 번호: 128)로 확인된다. REP 단백질은 서열 번호: 129의 서열의 "COG 5655"라고 불리는 후벽균내에에 보존된 도메인을 갖는다.
특수한 구현예에서, OPT 핵산은 OREP 서열의 일부(서열 번호: 126), 전형적으로 OREP 서열의 하나 이상의 단편, 바람직하게는 적어도 REP 단백질을 암호화하는 서열(서열 번호: 128) 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편(즉, 복제에 포함된 단편), 대표적으로 REP 단백질 내에서, OPT 핵산의 복제에 포함된 단편을 암호화하는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. OPT 핵산의 복제에 포함된, REP 단백질내에 존재하는, 단편을 암호화하는 OREP 서열의 기능성 단편은 서열 번호: 129의 서열의 도메인을 포함한다. REP 단백질의 기능성 단편을 암호화하는 이러한 핵산, 및 이의 변이체의 예는 기술자가 용이하게 제조할 수 있다. 변이체의 대표적인 예는 서열 번호: 127의 서열과 70% 내지 100%, 바람직하게는 85 내지 99%, 보다 바람직하게는 95 내지 99%, 예를 들면, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성(sequence homology)을 갖는다.
바람직한 구현예에서, OREP 서열의 기능성 변이체 또는 단편은 OPT 핵산의 복제시 포함된 단백질을 암호화한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, OREP 서열의 기능성 변이체 또는 단편은 OPT 핵산(예를 들면, 플라스미드-유사 유전 작제물)의 복제에 포함된 단백질(예를 들면 REP 단백질) 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편 외에, 1 내지 150개 염기의 부위, 바람직하게는 1 내지 15개 염기의 부위, 예를 들면 A 및 T 염기가 풍부한 서열(Rajewska et al.), 바람직하게는 서열 번호: 118의 서열의 pNF2 플라스미드내에 존재하는 부위를 포함함으로써, OPT 핵산의 복제를 가능하게 하는 단백질의 결합을 허용한다.
박테리아의 유전 물질의 변형을 가능하게 하는 목적한 서열은 대표적으로 예를 들면 동종 재조합 메카니즘에 의해, 박테리아의 유전 물질의 일부를 목적한 서열로 대체하도록 하는 변형 주형(modification template)이다. 박테리아의 유전 물질의 변형을 가능하게 하는 목적한 서열은 또한 i) 표적 서열, ii) 표적 서열의 전사를 제어하는 서열, 또는 iii) 표적 서열을 플랭킹하는 서열의 인지 서열(recognition sequence)(적어도 부분적으로 결합하는), 및 바람직하게는 이들을 표적화하는, 즉, 목적한 박테리아의 게놈내 절단을 인식하고 이를 가능하게 하는 인지 서열일 수 있다.
상기 박테리아내에서 상기 박테리아의 야생형 버젼에 존재하는 유전 물질로부터 부분적으로 또는 전체적으로 부재된 DNA 서열의 발현을 가능하게 하는 목적한 서열은 전형적으로 야생형 상태에서 발현할 수 없거나, 충분한 양으로 발현할 수 없는 하나 이상의 단백질을 발현하도록 한다.
특수한 양태에 따라서, "OPT 핵산"은 또한 iii) DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들면 Cas9를 암호화하는 서열, 및/또는 iv) 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA)를 포함하며, 각각의 gRNA는 DNA-엔도뉴클레아제-결합 RNA 구조 및, 박테리아 유전 물질의 표적화된 부위에 대해 상보성인 서열을 포함한다.
다른 특수한 양태에 따라서, "OPT 핵산"은 Dam 및 Dcm 메틸트랜스퍼라제에 의해 인식된 모티프(motif)에서 메틸화를 갖지 않는다.
바람직하게는, "OPT 핵산"은 발현 카세트 및 벡터로부터 선택되며, 바람직하게는 플라스미드, 예를 들면 서열 번호: 119, 서열 번호: 123, 서열 번호: 124 및 서열 번호: 125로부터 선택된 서열을 갖는 플라스미드이다.
따라서, 특히 적어도:
- 적어도 하나의 DNA 엔도뉴클레아제를 암호화하는 제1의 핵산(여기서 DNA 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열은 프로모터의 제어하에 있다), 및
- "OPT" 핵산 서열, 즉, i) 서열 번호: 126의 서열("OREP") 중 모두 또는 일부 및 ii) 상기 박테리아 내에서 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아의 야생형 버젼에 존재하는 유전 물질로부터 부분적으로 또는 전체적으로 부재된 DNA 서열의 발현을 가능하게 하는 서열, 바람직하게는 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 항-CRISPR 단백질을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 이러한 특수한 유전 툴의 상기 핵산 중 적어도 하나, 또는 바람직하게는 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 항-CRISPR 단백질을 암호화하는 제3의 핵산을 추가로 포함하는 상기 특수한 유전 툴을 포함하는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 다른 핵산(또는 "n번째 핵산")을 포함하는 유전 툴이 기술되어 있다.
특수한 구현예에서 상술한 바와 같이 "제2" 또는 "복구 주형을 포함하는 n번째 핵산"은 이러한 "다른 핵산"을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 특수한 구현예에서, "제1의 핵산"은 또한 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA)를 암호화한다.
본 발명의 의미에서, 용어 "핵산"은 임의로 화학적으로 변형되거나(즉, 비-천연 염기, 예를 들면 변형된 결합, 변형된 염기 및/또는 변형된 당을 갖는 변형된 뉴클레오타이드를 포함함), 암호화 서열로부터 합성된 전사체의 코돈(codon)이 여기에 사용하기 위하여 클로스트리디움 속의 박테리아내에서 가장 흔히 발견된 코돈인, 임의의 천연, 합성, 반-합성 또는 재조합 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 클로스트리디움 속의 경우에, 최적화된 코돈은 전형적으로 아데닌("A") 및 티민("T") 염기가 풍부한 코돈이다.
본 발명에 따른 유전 툴은 적어도 하나의 엔도뉴클레아제, 전형적으로 Cas 뉴클레아제, 예를 들면 Cas9 또는 MAD7을 암호화하는 제1의 핵산을 포함한다. "Cas9"는 Cas9(또한 CRISPR-관련된 단백질 9, Csn1 또는 Csx12로 불림) 단백질 또는 즉, 가이드 RNA(들)과 상호작용하여 이것이 표적 게놈의 DNA 내에서 이중-가닥 절단을 이루도록 하는 효소(뉴클레아제) 활성을 수행할 수 있는, 이의 기능성 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 따라서,"Cas9"는 예를 들면, 단백질의 예정된 기능에 필수적이지 않는 단백질 도메인을 제거하기 위해 트렁케이트된(truncated), 변형된 단백질, 특히 gRNA(들)와의 상호작용에 필수적이지 않은 도메인을 지칭할 수 있다.
또한, "Cas12" 또는 "Cpf1"로서 확인된 MAD7 뉴클레아제(서열 번호: 72의 서열에 상응하는 아미노산 서열)는 다른 경우에는 이를 기술자에게 이러한 뉴클레아제에 대해 결합할 수 있는 것으로 알려진 하나 이상의 gRNA와 결합시킴으로써 본 발명의 내용에서 유리하게 사용될 수 있다(참고: Garcia-Doval et al., 2017 및 Stella S. et al., 2017).
특수한 양태에 따라서, MAD7 뉴클레아제를 암호화하는 서열은 클로스트리디움 균주내에서 용이하게 발현되도록 최적화된 서열, 바람직하게는 서열 번호: 71의 서열이다.
본 발명의 내용에서 사용된 바와 같은 Cas9를 암호화하는 서열(전체 단백질 또는 이의 단편)은 임의의 공지된 Cas9 단백질로부터 수득될 수 있다(Makarova et al., 2011). 본 발명에서 사용될 수 있는 Cas9 단백질의 예는 에스. 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 파스퇴렐ㄹ라 멀토시다(Pasteurella multocida), 프란키셀라 노비시다(Francisella novicida), 나이쎄리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 나이쎄리아 락타미카( Neisseria lactamica), 및 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila)로부터의 Cas9 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(참고: Fonfara et al., 2013; Makarova et al., 2015).
특수한 구현예에서, 본 발명에 다른 유전 툴의 핵산 중 하나에 의해 암호화된 Cas9 단백질, 또는 이의 기능성 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편은 서열 번호: 75의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60% 동일성을 갖고, 서열 번호: 75의 아미노산 서열의 10번 위치("D10") 및 840번 위치("D840")를 점유하는 적어도 2개의 아스파르트산("D")를 포함하는 임의의 다른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 구현예에서, Cas9는 에스. 피오게네스 M1 GAS (NCBI 수탁 번호: NC_002737.2 SPy_1046, 서열 번호: 76) 균주로부터의 cas9 유전자에 의해 암호화된, Cas9 단백질(NCBI 수탁 번호: WP_010922251.1, 서열 번호: 75), 또는 클로스트리디움 속의 박테리아에 의해 우선적으로 사용된 코돈, 전형적으로 아데닌("A") 및 티민("T") 염기가 풍부한 코돈을 함유함으로써, 이러한 박테리아 속 내에서 Cas9 단백질의 촉진된 발현을 가능하게 하는 전사체를 생성하는 최적화("최적화된 버젼")을 겪는 이의 버젼을 포함하거나, 이로 이루어진다. 이러한 최적화된 코돈은 각각의 박테리아 균주에 대해 특이적인, 기술자에게 잘 공지된, 코돈 사용 편향성(codon usage bias)과 관련된다.
본 서류에 기술된 펩타이드 서열에서, 아미노산은 다음의 명명법에 따라 이들의 단-문자 코드(single-letter code)로 나타낸다: C: 시스테인; D: 아스파르트산; E: 글루탐산; F: 페닐알라닌; G: 글리신; H: 히스티딘; I: 이소루이신; K: 라이신; L: 루이신; M: 메티오닌; N: 아스파라긴; P: 프롤린; Q: 글루타민; R: 아르기닌; S: 세린; T: 트레오닌; V: 발린; W: 트립토판 및 Y: 타이로신.
특수한 구현예에 따라서, Cas9 도메인은 전체 Cas9 단백질, 바람직하게는 에스. 피오게네스 Cas9 단백질 또는 이의 최적화된 버젼으로 이루어진다.
본 발명에 따른 유전 툴의 핵산 중 하나 내에 존재하는, DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들면 Cas9를 암호화하는 서열은 프로모터의 제어하에 있다. 이러한 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 바람직한 구현예에서, Cas9 발현을 제어하는 프로모터는 유도성 프로모터이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 구성적 프로모터의 예는 thl 유전자, ptb 유전자, adc 유전자, BCS 오페론, 또는 이의 유도체, 바람직하게는 씨. 아세토부틸리쿰(C.　acetobutylicum)으로부터의 thl 유전자 프로모터의 "miniPthl" 유도체와 같은 기능성이지만 보다 짧은(트렁케이트된) 유도체(Dong et al., 2012), 또는 클로스트리디움 속의 박테리아 내에서 단백질의 발현을 가능하게 하는, 기술자에게 잘 알려진 임의의 다른 프로모터로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 내용에서 사용될 수 있는 유도성 프로모터의 예는 예를 들면, 이의 발현이 전사 리프레서(transcriptional repressor) TetR에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들면, tetA 유전자(이. 콜라이(E. coli) 트랜스포존(transposon) Tn10 상에 원래 존재하는 테트라사이클린 내성 유전자)의 프로모터; 바람직하게는 ARAi 시스템(Zhang et al., 2015)을 작제하기 위해 씨. 아세토부틸리쿰의 araR 조절인자 발현 카세트와 함께, 이의 발현이 L-아라비노즈에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들면 ptk 유전자 프로모터(Zhang et al., 2015); 바람직하게는 리프레서 유전자 glyR3 및 목적한 유전자(Mearls et al., 2015)에 바로 이어서 이의 발현이 라미나리비오즈(β-1,3 글루코즈 이량체)에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들면, celC 유전자 프로모터, 또는 celC 유전자 프로모터(Newcomb et al., 2011); 이의 발현이 락토즈에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들면 bgaL 유전자 프로모터(Banerjee et al., 2014); 이의 발현이 크실로즈에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들면 xylB 유전자 프로모터(Nariya et al., 2011); 및 이의 발현이 UV 노출에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들면, bcn 유전자 프로모터(Dupuy et al., 2005)로부터 선택될 수 있다.
상술한 프로모터 중 하나로부터 기원한 프로모터, 바람직하게는 기능성이지만 보다 짧은(트렁케이트된) 유도체를 또한 본 발명에 내용에서 사용할 수 있다.
본 발명이 내용에서 사용될 수 있는 다른 유도성 프로모터는 또한 예를 들면, Ransom et al. (2015), Currie et al. (2013) 및 Hartman et al. (2011)의 논문에 기술되어 있다.
바람직한 유도성 프로모터는 Pcm-2tetO1 및 Pcm-2tetO2/1로부터 선택된, tetA로부터 기원한 안하이드로테트라사이클린(aTc)-유도성 프로모터(aTc는 테트라사이클린보다는 덜 독성이고 보다 낮은 농도에서 전사 리프레서 TetR의 억제를 방출할 수 있다)이다(Dong et al., 2012).
다른 바람직한 유도성 프로모터는 크실로즈-유도성 프로모터, 예를 들면 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile) 630으로부터의 xylB 프로모터이다(Nariya et al., 2011).
여전히 다른 바람직한 유도성 프로모터는 락토즈-유도성 프로모터, 예를 들면, bgaL 유전자의 프로모터이다(Banerjee et al., 2014).
특수한 목적한 핵산, 대표적으로 발현 카세트 또는 벡터는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하고, 각각의 카세트는 gRNA(가이드 RNA)를 암호화한다.
용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 본 발명의 의미내에서 Cas9과 같은 DNA 엔도뉴클레아제와 상호작용할 수 있어 이를 박테리아 염색체의 표적 영역에 안내하는 RNA 분자를 지칭한다. 절단의 특이성은 gRNA에 의해 결정된다. 상기 설명한 바와 같이, 각각의 gRNA는 2개의 영역을 포함한다:
- gRNA의 5' 말단에서, 표적 염색체 영역에 대해 상보성이고 내인성 CRISPR 시스템 crRNA를 모사하는 제1 영역(일반적으로 "SDS" 영역으로 불림), 및
- gRNA의 3' 말단에서, tracrRNA(트랜스-작용하는 crRNA)과 내인성 CRISPR 시스템 crRNA 사이에 염기-쌍화 상호작용을 모사(mimic)하고 3' 방향으로 필수적으로 단일 가닥 서열을 지닌 이중-가덕 스템-루프 구조(stem-loop structure)를 갖는 제2 영역(일반적으로 "핸들(handle)" 영역으로 불림). 이러한 제2 영역은 gRNA를 DNA 엔도뉴클레아제에 결합시키는데 필수적이다.
gRNA의 제1 영역("SDS" 영역)은 표적화된 염색체 서열에 따라 변한다.
표적 염색체 영역에 대해 상보성인, gRNA의 "SDS" 영역은 적어도 1개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드, 대표적으로 1 내지 40개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 영역은 길이가 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오타이드이다.
gRNA의 제2 영역("핸들" 영역)은 스템-루프(또는 헤어핀(hairpin)) 구조를 갖는다. 상이한 gRNA의 핸들 영역은 선택된 염색체 표적에 의존하지 않는다.
특수한 구현예에 따라서, "핸들" 영역은 적어도 1개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 1, 50, 100, 200, 500 및 1000개의 뉴클레오타이드, 대표적으로 1 내지 1000개의 뉴클레오타이드의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직하게는, 이러한 영역은 길이가 40 내지 120개 뉴클레오타이드이다.
gRNA의 전체적인 길이는 일반적으로 50 내지 1000개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 80 내지 200개의 뉴클레오타이드, 및 보다 특히 바람직하게는 90 내지 120개의 뉴클레오타이드이다. 특수한 구현예에 따라서, 본 발명에서 사용된 바와 같은 gRNA는 95 내지 110개 뉴클레오타이드를 포함하는 길이, 예를 들면, 약 100 또는 약 110개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
숙련가는 잘 공지된 기술을 사용하여 표적화될 염색체 영역에 따른 gRNA의 서열 및 구조를 용이하게 정의할 수 있다(참고: 예를 들면 DiCarlo et al., 2013의 문헌).
박테리아 염색체내에서 표적화된 DNA 영역/부위/서열은 비-암호화 DNA의 일부 또는 암호화 DNA의 일부에 상응할 수 있다.
제공된 서열을 변형하는 것으로 이루어진 특수한 구현예에서, 박테리아 DNA의 표적화된 부위는 박테리아 생존에 필수적이다. 이는 예를 들면, 박테리아 염색체의 임의의 영역 또는 비-염색체 DNA, 예를 들면, 특수한 성장 조건 하에서 미생물의 생존에 필수적인 이동성 유전 성분 상에 위치한 임의의 영역, 예를 들면, 예측된 성장 조건이 박테리아를 상기 항생제의 존재하에서 성장시키는데 필요한 경우 항생제 내성 마커를 포함하는 플라스미드에 상응한다.
미생물의 배양과 관련된 특수한 성장 조건 하에서 필수적이지 않은 유전 성분을 제거하는 것을 목적으로 하는 다른 특수한 구현예에서, 박테리아 DNA의 표적화된 부위는 상기 비-염색체 박테리아 DNA, 예를 들면, 상기 이동성 유전 성분의 임의의 영역에 상응할 수 있다.
클로스트리디움 속의 박테리아내에서 표적화된 DNA 부위의 특수한 예는 실험 단락의 실시예 1에 사용된 서열이다. 이들은, 예를 들면, bdhA(서열 번호: 77) 및 bdhB(서열 번호: 78) 유전자를 암호화하는 서열이다. 표적화된 DNA 영역/부위/서열은 Cas9 결합에 포함된 광스페이서 인접한 모티프(protospacer adjacent motif)("PAM") 서열에 이어서 존재한다.
제공된 gRNA의 "SDS" 영역은 박테리아 염색체내 표적화된 DNA 영역/부위/서열에 대해 동일(100%)하거나 적어도 80% 동일하거나, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고 상기 영역/부위/서열의 상보성 서열 중 모두 또는 일부, 대표적으로 적어도 1개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드, 대표적으로 1 내지 40개의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열, 바람직하게는 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열과 하이브리드화할 수 있다.
본 발명에 따른 공정에서, 서열("표적 서열", "표적화된 서열" 또는 "인식된 서열")을 표적화하는 하나 이상의 gRNA를 동시에 사용할 수 있다. 이러한 상이한 gRNA는 염색체 영역, 또는 미생물 내에 존재할 수 있는 비-염색체 박테리아 DNA(예를 들면, 이동성 유전 성분)을 표적화할 수 있으며, 이는 동일하거나 상이할 수 있다.
gRNA는 gRNA 분자로서(성숙한 또는 전구체), 전구체로서 또는 상기 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 핵산으로서 박테리아 세포내로 도입될 수 있다. gRNA는 바람직하게는 상기 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 핵산으로서 박테리아 세포내로 도입된다.
하나 이상의 gRNA가 RNA 분자로서 직접 세포내로 도입되는 경우, 이러한 gRNA(성숙한 또는 전구체)는 변형된 뉴클레오타이드 또는 이들이, 예를 들면, 뉴클레아제에 대한 이들의 내성을 증가시킴으로써 세포내에서 이들의 수명을 증가시키도록 하는 화학적 변형을 함유할 수 있다. 특히, 이들은 예를 들면, 이노신, 메틸-5-데옥시사이티딘, 디메틸아미노-5-데옥시우리딘, 데옥시우리딘, 디아미노-2,6-푸린, 브로모-5-데옥시우리딘 또는 하이브리드화를 가능하게 하는 임의의 다른 변형된 염기와 같은 변형된 염기를 지닌 뉴클레오타이드와 같은 적어도 하나의 변형되거나 비천연의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 gRNA는 또한 포스포로티오에이트, H-포스포네이트 또는 알킬-포스포네이트와 같은 뉴클레오타이드간 결합의 수준에서; 또는 알파-올리고뉴클레오타이드, 2'-O-알킬 리보오스 또는 펩타이드 핵산(PNA)와 같은 골격(backbone)의 수준에서 변형될 수 있다(Egholm et al., 1992).
gRNA는 천연 RNA, 합성 RNA, 또는 재조합 기술에 의해 생산된 RNA일 수 있다. 이러한 gRNA는 예를 들면, 화학적 합성, 생체내(in vivo) 전사 또는 변형 기술과 같은 기술자에게 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다.
gRNA를 박테리아 세포내로 하나 이상의 핵산으로서 도입하는 경우, gRNA(들)을 암호화하는 서열(들)을 발현 프로모터의 제어 하에 둘 수 있다. 이러한 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
수개의 gRNA를 사용하는 경우, 각각의 gRNA의 발현은 상이한 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 바람직하게는, 사용된 프로모터는 모든 gRNA에 대해 동일하다. 동일한 프로모터는 특수한 구현예에서 수개, 예를 들면, 단지 몇개, 또는 다시 말해서 모든 또는 일부 gRNA가 발현되도록 하기 위해 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, gRNA의 발현을 제어하는 프로모터(들)은 유도성 프로모터이다.
본 발명의 내용에서 사용될 수 있는 구성적 프로모터의 예는 thl 유전자, ptb 유전자 또는 BCS 오페론의 프로모터, 또는 이의 유도체, 바람직하게는 miniPthl, 또는 클로스트리디움내에서 RNA(암호화 또는 비-암호화)의 합성을 가능하게 하는 것으로 기술자에게 잘 알려진 임의의 다른 프로모터로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 내용에서 사용될 수 있는 유도성 프로모터의 예는 tetA 유전자, xylA 유전자, lacI 유전자, 또는 bgaL 유전자의 프로모터, 또는 이의 유도체, 바람직하게는 2tetO1 또는 tetO2/1로부터 선택될 수 있다. 바람직한 유도성 프로모터는 2tetO1이다.
DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들면 Cas9, 및 gRNA(들)의 발현을 제어하는 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있으며 구성적 또는 유도성일 수 있다. 본 발명의 특수한 및 바람직한 구현예에서, DNA 엔도뉴클레아제 또는 gRNA(들)의 발현을 각각 제어하는 프로모터는 상이한 프로모터이지만 동일한 유도인자에 의해 유도성이다.
상술된 바와 같은 유도성 프로모터는 DNA 엔도뉴클레아제/gRNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 작용을 유리하게 제어할 수 있고 목적한 유전적 변형을 겪은 형질전환체의 선택을 용이하도록 한다.
본 발명에 따른 유전 툴은 유리하게는 적어도 하나의 항-CRISPR 단백질(또한 본 내용에서 "항-CRISPR/DNA 엔도뉴클레아제 단백질" 또는 "항-CRISPR/Cas9 단백질"로서 확인됨), 즉, Cas의 작용을 억제하거나 방지하고/중화할 수 있는 단백질, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템, 예를 들면, 뉴클레아제가 Cas9 뉴클레아제인 경우 CRISPR/Cas 제II형 시스템의 작용을 억제하거나 방지/중화시킬 수 있는 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다. 이러한 서열은 전형적으로 DNA 엔도뉴클레아제 및/또는 gRNA(들)의 발현을 제어하는 프로모터와는 상이한 유도성 프로모터의 제어 하에 위치하고, 다른 유도인자에 의해 유도될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항-CRISPR 단백질을 암호화하는 서열은 또한 전형적으로 유전 툴내에 존재하는 적어도 2개의 핵산 중 하나에 위치한다. 특수한 구현예에서, 항-CRISPR 단백질을 암호화하는 서열은 처음 2개와는 구별되는 핵산(전형적으로 "제3의 핵산") 위에 위치한다. 여전히 다른 특수한 구현예에서, 항-CRISPR 단백질을 암호화하는 서열 및 상기 항-CRISPR 단백질의 전사 리프레서를 암호화하는 서열 모두는 박테리아 염색체내로 통합된다.
바람직한 구현예에서, 항-CRISPR 단백질을 암호화하는 서열은 유전 툴 내에서, DNA 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산(또한 본 내용에서 "제1의 핵산"으로서 확인됨) 위에 위치한다. 다른 구현예에서, 항-CRISPR 단백질을 암호화하는 서열은 유전 툴 내에 DNA 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 이외의 상이한 핵산, 예를 들면, 본 내용에서 "제2의 핵산"으로 확인된 핵산 또는 유전 툴내에 임의로 포함된 "n번째"(전형적으로 "제3") 핵산 위에 위치한다.
항-CRISPR 단백질은 전형적으로 "항-Cas9" 단백질, 즉, Cas9의 작용을 억제하거나 방지/중화할 수 있는 단백질, 및/또는 CRISPR/Cas9 제II형 스템의 작용을 억제하거나 방지/중화할 수 있는 단백질이다.
항-CRISPR 단백질은 유리하게는 "항-Cas9" 단백질 또는 "항-MAD7" 단백질, 즉, Cas9 또는 CAS7의 작용을 억제하거나 방지/중화할 수 있는 단백질이다.
항-CRISPR 단백질은 유리하게는 예를 들면 AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3, AcrIIA4, AcrIIA5, AcrIIC1, AcrIIC2 및 AcrIIC3로부터 선택된 "항-Cas9" 단백질이다(Pawluk et al., 2018). 바람직하게는 "항-Cas9" 단백질은 AcrIIA2 또는 AcrIIA4이다. 보다 바람직하게는 "항-Cas9" 단백질은 AcrIIA4이다. 이러한 단백질은 전형적으로 예를 들면, Cas9 효소에 결합함으로써, Cas9의 작용을 유의적으로 제한하고, 이상적으로 방지할 수 있다(Dong et al., 2017; Rauch et al., 2017).
다른 유리하게 유용한 항-CRISPR 단백질은 "항-MAD7" 단백질, 예를 들면 AcrVA1이다(Marino et al., 2018).
바람직한 구현예에서, 항-CRISPR 단백질은 바람직하게는 유전 툴로부터의 핵산 서열을 목적한 박테리아 균주내로 도입하는 상 동안에, DNA 엔도뉴클레아제의 작용을 억제하고, 바람직하게는 중화할 수 있다.
항-CRISPR 단백질을 암호화하는 서열의 발현을 제어하는 프로모터는 바람직하게는 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터는 전형적으로 상기 유도성 프로모터로부터의 전사 억제(transcriptional repression)를 가능하게 하는 단백질의 발현에 관여하는, 구성적으로 발현된 유전자와 관련되어 있다. 이러한 프로모터는 예를 들면, tetA 유전자, xylA 유전자, lacI 유전자, 또는 bgaL 유전자, 또는 이의 유도체의 프로모터로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 내용에서 사용될 수 있는 유도성 프로모터의 예는 유전 툴내 및 구성적으로 발현된 bgaR 유전자를 따라, 동일한 핵산 위에 존재하고 이의 발현 생성물이 Pbgal로부터 전사 억제를 가능하게 하는 Pbgal 프로모터(락토즈-유도성)이다. 유도인자인, 락토즈의 존재하에서, Pbgal 프로모터의 전사 억제가 해제되어 이의 하부에 위치한 유전자의 전사가 허용된다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 하부에 위치한 유전자는 항-CRISPR 단백질, 예를 들면 acrIIA4를 암호화하는 유전자에 상응한다.
항-CRISPR 단백질의 발현을 제어하는 프로모터는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들면, Cas9 효소의 작용을 유리하게 제어할 수 있도록 함으로써, 클로스트리디움 속의 박테리아의 형질전환 및 목적한 유전적 변형을 겪은 형질전환체의 생산을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 의미에서, 용어 "핵산"은 임의로 화학적으로 변형(즉, 비-천연 염기, 예를 들면, 변형된 결합, 변형된 염기 및/또는 변형된 당을 지닌 변형된 뉴클레오타이드를 포함함)되거나, 암호화 서열로부터 합성된 전사체의 코돈이 여기서 이를 사용하기 위한 순서로 클로스트리디움 속의 박테리아내에서 가장 흔히 발견된 코돈이도록 최적화된, 임의의 천연의, 합성의, 반-합성의 또는 재조합 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 상술한 바와 같이, 클로스트리디움 속의 경우에, 최적화된 코돈은 전형적으로 아데닌("A") 및 티민("T") 염기가 풍부한 코돈이다.
본 발명에 따른 유전 툴내에 존재하는 각각의 핵산, 전형적으로 "제1" 핵산 및 "제2" 또는 "n번째" 핵산은 구별되는 실체로 이루어지고, 예를 들면, i) 목적한 하나 이상의 서열(암호화)에, 전형적으로 이의 발현 생성물이 박테리아 내에서 목적한 작용의 수행에 기여하는 몇가지의 목적한 암호화 서열을 포함하는 오페론에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 전사 프로모터를 포함하는 핵산, 또는 활성화 서열 및/또는 전사 터미네이터를 추가로 포함하는 핵산과 같은 발현 카세트(또는 "작제물"); 또는 ii) 상술한 바와 같은 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 환형 또는 선형의, 단일 가닥 또는 이중 가닥 벡터, 예를 들면, 플라스미드, 파아지, 코스미드, 인공 또는 합성 염색체에 상응한다. 바람직하게는, 벡터는 플라스미드이다.
목적한 핵산, 전형적으로 발현 카세트 및 벡터는 기술자에게 잘 공지된 통상의 기술에 의해 작제할 수 있으며 하나 이상의 프로모터, 박테리아의 복제 오리진(ORI 서열), 종결 서열, 선택 유전자, 예를 들면, 항생제-내성 유전자, 및 카세트 또는 벡터의 표적화된 삽입을 가능하게 하는 서열("플랭킹 영역")을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 카세트 및 발현 벡터는 기술자에게 잘 공지된 기술을 사용하여 게놈내로 통합시킬 수 있다.
목적한 ORI 서열은 pIP404, pAMβ1, repH (씨. 아세토부틸리쿰의 복제 오리진), ColE1 또는 rep(이. 콜라이내 복제 오리진), 또는 벡터, 전형적으로 플라스미드가 클로스트리디움 세포내에서 유지되도록 하는 임의의 다른 복제 오리진으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 바람직한 ORI 서열은 플라스미드 pNF2(서열 번호: 118)의 OREP 서열(서열 번호: 126)내에 존재하는 것이다.
목적한 종결 서열은 adc 또는 thl 유전자, bcs 오페론, 또는 클로스트리디움 내에서 전사가 정지되도록 하는 것으로, 기술자에게 잘 알려진 임의의 다른 터미네이터의 것으로부터 선택될 수 있따.
목적한 선택 유전자(내성 유전자)는 ermB, catP, bla, tetA, tetM, 및/또는 암피실린, 에리쓰로마이신, 클로람페니콜, 티암페니콜, 스펙티노마이신, 테트라사이클린 또는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지된 클로스트리디움 속의 박테리아를 선택하는데 사용될 수 있는 임의의 다른 항생제에 대한 내성을 위한 임의의 다른 유전자로부터 선택될 수 있다.
특수한 벡터는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하며, 각각의 카세트는 gRNA를 암호화한다.
특수한 구현예에서, 본 발명은 청구범위에서 확인된 바와 같은 "제1" 핵산으로서 이의 서열이 서열 번호: 23의 것인 플라스미드를 포함하는 유전 툴에 관한 것이다.
특수한 구현예에서, 본 발명은 "제2" 또는 "n번째" 핵산으로서 이의 서열이 서열 서열 번호: 79, 서열 번호: 80, 서열 번호: 119, 서열 번호: 123, 서열 번호: 124 및 서열 번호: 125 중 하나로부터 선택된 플라스미드 벡터를 포함하는 유전 툴에 관한 것이다.
여전히 다른 특수한 구현예에서, 본 발명은 "OPT 핵산"으로서 이의 서열이 서열 번호: 119, 서열 번호: 123, 서열 번호: 124 및 서열 번호: 125의 서열 중 하나로부터 선택된 플라스미드 벡터를 포함하는 유전 툴에 관한 것이다. 다른 특수한 구현예에서, 유전 툴은 서열 번호: 23, 79, 80, 119, 123, 124 및 125 중에서 수개(예를 들면, 적어도 2개 또는 3개)의 서열을 포함하며, 상기 서열은 서로 상이하다.
목적한 서열은 선택된 복구 주형(CRISPR 기술에 따름)에 의해 안내된 동종 재조합 메카니즘을 통해 박테리아 게놈내로 도입된다. 목적한 서열은 박테리아 게놈 내에서 표적화된 부위를 대체한다. 따라서, 재조합 공정은 박테리아의 게놈내 표적화된 부위의 전체적이거나 부분적인 변형 또는 결실을 허용하거나 박테리아의 게놈 내로 핵산 단편(특수한 구현예에서 큰 단편)의 삽입을 허용한다. 선택된 복구 주형은 박테리아 게놈의 표적화된 서열 중 모두 또는 일부 또는 목적한 형질전환의 특성에 따른 이의 다소 변형된 버젼을 포함할 수 있다. DNA의 표적화된 부위와 유사하게, 주형 자체는 따라서 천연 및/또는 합성, 암호화 및/또는 비-암호화 서열에 상응하는 하나 이상의 핵산 서열 또는 핵산 서열 부위를 포함할 수 있다. 주형은 또한 하나 이상의 "외부" 서열, 즉 클로스트리디움 속에 속하는 박테리아의 게놈으로부터 또는 상기 속의 특수한 종의 게놈으로부터 천연적으로 부재된 서열을 포함할 수 있따. 주형은 또한 상술한 바와 같은 서열의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 유전 툴은 복구 주형이 클로스트리디움 속의 박테리아의 박테리아 게놈내로 목적한 핵산, 전형적으로 적어도 1개의 염기쌍(bp), 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 1,000, 10,000, 100,000 또는 1,000,000　bp, 전형적으로 1　bp 내지 20　kb 또는 1　bp 내지 10　kb, 바람직하게는 10　bp 내지 10　kb 또는 1　kb 내지 10　kb, 예를 들면, 1　bp 내지 5　kb, 2　kb 내지 5　kb, 또는 2.5 또는 3　kb 내지 5　kb를 포함하는 DNA 서열 또는 서열 부위의 혼입을 안내하도록 한다.
본 발명자는 박테리아 내에서 상기 박테리아의 야생형 버젼에 존재하는 유전 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 부재된 DNA 서열의 발현을 가능하게 하는, 목적한 핵산, 전형적으로 목적한 DNA 서열의 예를 기술한다.
특수한 구현예에서, 목적한 DNA 서열의 발현은 클로스트리디움 속의 박테리아가 수개의 상이한 당, 예를 들면, 적어도 2개의 상이한 당, 전형적으로 5-탄당(예를 들면, 글루코즈 또는 만노즈) 및/또는 6-탄당(예를 들면, 크실로즈, 아라비노즈 또는 푸럭토즈) 중에서 적어도 2개의 상이한 당, 바람직하게는 예를 들면, 글루코즈, 크실로즈 및 만노즈로부터 선택된 적어도 3개의 상이한 당; 및 글루코즈, 크실로즈 및 아라비노즈를 발효하도록 한다.
다른 특수한 구현예에서, 목적한 DNA 서열은 적어도 하나의 목적한 생성물, 바람직하게는 클로스트리디움 속의 박테리아에 의한 용매 생산을 촉진하는 생성물, 전형적으로 적어도 하나의 목적한 단백질, 예를 들면, 효소; 트랜스포터와 같은 막 단백질; 다른 단백질(차페론 단백질)의 성숙 단백질; 전사 인자; 또는 이의 조합을 암호화한다.
바람직한 구현예에서, 목적한 DNA 서열은 i) 효소, 예를 들면, 알데하이드의 알코올로의 전환에 포함된 효소를 암호화하는 서열, 예를 들면, 알코올 데하이드로게나제를 암호화하는 서열(예를 들면, adh, adhE, adhE1, adhE2, bdhA, bdhB 및 bdhC로부터 선택된 서열), 트랜스퍼라제를 암호화하는 서열(예를 들면, ctfA, ctfB, atoA 및 atoB로부터 선택된 서열), 데카복실라제를 암호화하는 서열(예를 들면, adc), 하이드로게나제를 암호화하는 서열(예를 들면, etfA, etfB 및 hydA로부터 선택된 서열), 및 이의 조합을 암호화하는 서열, ii) 막 단백질, 예를 들면, 포스포트랜스퍼라제(예를 들면, glcG, bglC, cbe4532, cbe4533, cbe4982, cbe4983, cbe0751로부터 선택된 서열)을 암호화하는 서열, iii) 전사 인자(예를 들면, sigE, sigF, sigG, sigH, sigK로부터 선택된 서열)를 암호화하는 서열 및 iv) 이의 조합으로부터 선택된다.
본 발명자는 또한 박테리아의 게놈 내에서, i) 표적 서열, ii) 표적 서열의 전사를 제어하는 서열, 또는 iii) 표적 서열을 플랭킹(flanking)하는 서열의 적어도 하나의 가닥을 인식(적어도 부분적으로 결합)하고 바람직하게는 이를 표적화하는, 즉, 이를 인식하여 절단시키는 목적한 핵산의 예를 기술한다.
인식된 서열은 또한 본 내용에서 "표적 서열" 또는 "표적화된 서열"로서 확인된다.
이러한 목적한 핵산을 포함하거나 이로 이루어진 유전 툴이 또한 기술되어 있다. 이러한 경우에, 목적한 핵산은 본 내용에 기술된 바와 같은 유전 툴의 "제2" 또는 "n번째" 핵산 내에 존재한다.
목적한 핵산은 본 설명의 맥락에서 박테리아의 게놈으로부터 인식된 서열을 제거하거나 이의 발현을 변형시키기 위해, 예를 들면, 이의 발현을 조정/조절하기 위해, 특히 이를 억제하기 위해, 바람직하게는 이를 변형시켜 상기 박테리아가 상기 서열로부터, 단백질, 특히 기능성 단백질을 발현할 수 없도록 하기 위해 사용된다.
표적 서열이 목적한 박테리아가 내성을 부여하는 항생제를 포함하는 배양 배지에서 성장하도록 하는 효소를 암호화하는 서열, 이러한 서열의 전사를 제어하는 서열 또는 이러한 서열을 플랭킹하는 서열인 경우, 항생제는 전형적으로 암페니콜의 부류에 속하는 항생제이다. 본 명세서의 맥락에서 목적한 암페니콜의 예는 클로람페니콜, 티암페니콜, 아지담페니콜 및 플로르페니콜(Schwarz S. et al., 2004), 특히 클로람페니콜 및 티암페니콜이다.
특수한 구현예에서, 목적한 핵산은 박테리아 게놈 내에서 표적화된 DNA 영역/부위/서열에 대해 100% 동일하거나 적어도 80% 동일한, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 서열에 대해 상보성이고 상기 영역/부위/서열의 상보성 서열 중 모두 또는 일부, 전형적으로 적어도 1개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 14, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드, 전형적으로 1, 10 또는 20 및 1000개의 뉴클레오타이드, 예를 들면 1, 10 또는 20 내지 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 또는 200개의 뉴클레오타이드, 1, 10 또는 20 내지 100개의 뉴클레오타이드, 1, 10 또는 20 내지 50개의 뉴클레오타이드, 또는 1, 10 또는 20 내지 40개의 뉴클레오타이드, 예를 들면, 10 내지 40개의 뉴클레오타이드, 10 내지 30개의 뉴클레오타이드, 10 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20 내지 30개의 뉴클레오타이드, 15 내지 40개의 뉴클레오타이드, 15 내지 30개의 뉴클레오타이드 또는 15 내지 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열, 바람직하게는 14, 15, 16, 17, 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 대해 하이브리드화할 수 있는 적어도 하나의 영역을 포함한다. 목적한 핵산 내에 존재하는 표적 서열의 상보성 영역은 본 내용에서 기술된 바와 같은 CRISPR 툴에 사용된 가이드 RNA(gRNA)의 "SDS" 영역에 상응할 수 있다.
기술된 다른 특수한 구현예에서, 목적한 핵산은 적어도 2개의 상보성 영역을 포함하며 표적 서열 각각은 박테리아 게놈내 상기 표적화된 DNA 영역/부위/서열에 대해 100% 동일하거나 적어도 80% 동일하거나, 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 이러한 영역은 상기 영역/부위/서열의 상보성 서열 중 일부 또는 부분에 대해, 전형적으로 적어도 적어도 1개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 100개의 뉴클레오타이드, 전형적으로 100 내지 1000개의 뉴클레오타이드를 포함하는 상술한 바와 같은 서열에 대해 하이브리드화할 수 있다. 목적한 핵산내에 존재하는 표적 서열에 대해 상보성인 영역은 본 내용에서 기술된 바와 같은 유전 변형 툴내 표적 서열의 5' 및 3' 플랭킹 영역을 인식하고, 바람직하게는 표적화할 수 있다.
특수한 양태에 따라서, 표적 서열은 암페니콜, 예를 들면, 클로람페니콜 및/또는 티암페니콜의 부류에 속하는 하나 이상의 항생제를 포함하는 배양 배지 속에서 성장할 수 있는 목적한 박테리아, 예를 들면, 클로스트리디움 속의 게놈내에서 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 예를 들면 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제 또는 티암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하고, 이러한 서열의 전사를 제어하거나 이러한 서열을 플랭킹하는 서열이다.
인식된 서열은 예를 들면, 씨. 베이제린키이 DSM 6423으로부터의 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 catB 유전자(CIBE△3859)에 상응하는 서열 번호: 18의 서열 또는 상기 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 18의 서열 중 모두 또는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하는 서열이다. 다시 말하면, 인식된 서열은 적어도 1개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드, 전형적으로 1 내지 40개의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열, 바람직하게는 서열 번호: 18의 서열의 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열일 수 있다.
서열 번호:18의 서열에 의해 암호화된 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제에 대해 적어도 70% 동일한 아미노산 서열의 예는 다음의 참고 하에 NCBI 데이타베이스에서 확인된 서열에 상응한다: WP_077843937.1, 서열 번호: 44(WP_063843219.1), 서열 번호: 45(WP_078116092.1), 서열 번호: 46(WP_077840383.1), 서열 번호: 47(WP_077307770.1), 서열 번호: 48(WP_103699368.1), 서열 번호: 49(WP_087701812.1), 서열 번호: 50(WP_017210112.1), 서열 번호: 51(WP_077831818.1), 서열 번호: 52(WP_012059398.1), 서열 번호: 53(WP_077363893.1), 서열 번호: 54(WP_015393553.1), 서열 번호: 55(WP_023973814.1), 서열 번호: 56(WP_026887895.1), 서열 번호　 57 (AWK51568.1), 서열 번호: 58(WP_003359882.1), 서열 번호: 59(WP_091687918.1), 서열 번호: 60(WP_055668544.1), 서열 번호: 61 (KGK90159.1), 서열 번호: 62(WP_032079033.1), 서열 번호: 63(WP_029163167.1), 서열 번호: 64(WP_017414356.1), 서열 번호: 65(WP_073285202.1), 서열 번호: 66(WP_063843220.1), 및 서열 번호: 67(WP_021281995.1).
서열 번호: 18에 의해 암호화된 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제에 대해 적어도 75% 동일한 아미노산 서열의 예는 서열 WP_077843937.1, WP_063843219.1, WP_078116092.1, WP_077840383.1, WP_077307770.1, WP_103699368.1, WP_087701812.1, WP_017210112.1, WP_077831818.1, WP_012059398.1, WP_077363893.1, WP_015393553.1, WP_023973814.1, WP_026887895.1 AWK51568.1, WP_003359882.1, WP_091687918.1, WP_055668544.1 및 KGK90159.1에 상응한다.
서열 번호: 18에 의해 암호화된 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열의 예는 WP_077843937.1, WP_063843219.1, WP_078116092.1, WP_077840383.1, WP_077307770.1, WP_103699368.1, WP_087701812.1, WP_017210112.1, WP_077831818.1, WP_012059398.1, WP_077363893.1, WP_015393553.1, WP_023973814.1, WP_026887895.1 및 AWK51568.1이다.
서열 번호: 18에 의해 암호화된 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열의 예는 서열 WP_077843937.1, WP_063843219.1, WP_078116092.1, WP_077840383.1, WP_077307770.1, WP_103699368.1, WP_087701812.1, WP_017210112.1, WP_077831818.1, WP_012059398.1, WP_077363893.1, WP_015393553.1, WP_023973814.1, 및 WP_02688787895.1에 상응한다.
서열 번호: 18에 의해 암호화된 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제에 대해 적어도 99% 동일한 바람직한 아미노산 서열은 WP_077843937.1, 서열 번호: 44(WP_063843219.1) 및 서열 번호: 45(WP_078116092.1)이다.
서열 번호: 18과 동일한 특수한 서열은 WP_077843937.1와 같이 NCBI 데이타베이스에서 확인된 서열이다.
특수한 예에 따라서, 표적 서열은 씨. 페르프린겐스로부터의 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 catQ 유전자에 상응하는 서열 번호:68의 서열이며 이의 아미노산 서열은 서열 번호: 66(WP_063843220.1), 또는 상기 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열, 또는 서열 번호: 68의 서열 중 모두 또는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하는 서열에 상응한다.
다시 말해서, 인식된 서열은 서열 번호: 68의 적어도 1개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드, 전형적으로 1 내지 40개의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열, 바람직하게는 서열 번호:68의 서열의 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열일 수 있다.
여전히 다른 특수한 예에 따라서, 인식된 서열은 박테리아내에 천연적으로 존재하거나 상기 박테리아내로 인공적으로 도입된, 기술자에게 공지된 핵산 서열 catB(서열 번호: 18), catQ(서열 번호: 68), catD(서열 번호: 69, Schwarz S. et al., 2004) 또는 catP(서열 번호: 70, Schwarz S. et al., 2004)일 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 다른 특수한 예에 따라서, 표적 서열은 상술한 바와 같은 암호화 서열(목적한 박테리아가 이에 대해 내성을 부여하는 항생제를 포함하는 배양 배지 속에서 상기 박테리아가 성장하도록 하는 효소를 암호화하는)의 전사를 제어하는 서열, 전형적으로, 프로모터 서열, 예를 들면, catB 유전자의 프로모터 서열(서열 번호: 73) 또는 catQ 유전자의 프로모터 서열(서열 번호: 74)일 수 있다.
이후에 목적한 핵산은 상술한 바와 같은 암호화 서열의 전사를 제어하는 서열을 인식하므로, 전형적으로 이에 결합할 수 있다.
다른 특수한 예에 따라서, 표적 서열은 상술한 바와 같은 암호화 서열을 플랭킹하는 서열, 예를 들면 서열 번호: 18 서열의 catB 유전자를 플랭킹하는 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일한 서열일 수 있다. 이러한 플랭킹 서열은 전형적으로 1, 10 또는 20 내지 1000개의 뉴클레오타이드, 예를 들면 1, 10 또는 20 내지 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 또는 200개의 뉴클레오타이드, 1, 10 또는 20 내지 100개의 뉴클레오타이드, 1, 10 또는 20 내지 50개의 뉴클레오타이드, 또는 1, 10 또는 20 내지 40개의 뉴클레오타이드, 예를 들면, 10 내지 40개의 뉴클레오타이드, 10 내지 30개의 뉴클레오타이드, 10 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20 내지 30개의 뉴클레오타이드, 15 내지 40개의 뉴클레오타이드, 15 내지 30개의 뉴클레오타이드 또는 15 내지 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
특수한 양태에 따라서, 표적 서열은 이러한 암호화 서열을 플랭킹하는 서열의 쌍에 상응하며, 각각의 플랭킹 서열은 전형적으로 적어도 20개의 뉴클레오타이드, 전형적으로 100 내지 1000개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 200 내지 800개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 설명의 내용에서, 목적한 박테리아를 형질전환하고/하거나 유전적으로 변형시키는데 사용된, 목적한 핵산의 특수한 예는 i) 암호화 서열을 인지하거나, ii) 암호화 서열의 전사를 제어하거나, iii) 박테리아, 예를 들면, 상술한 바와 같은 클로스트리디움 속의 박테리아내에서 암호화 서열, 목적한 효소, 바람직하게는 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 예를 들면, 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제 또는 티암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 플랭킹하는 DNA 단편이다.
본 발명에 따른 목적한 핵산의 예는 박테리아 게놈으로부터 인식된 서열("표적 서열")을 제거하거나 이의 발현을 변형시킬 수 있고, 예를 들면, 이를 조절할 수 있으며, 특히, 이를 억제할 수 있고, 바람직하게는 이를 변형시켜 상기 박테리아가 단백질, 예를 들면, 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 특히 기능성 단백질을 상기 서열로부터 발현할 수 없도록 할 수 있다.
효소를 암호화하는 인식된 서열이 클로람페니콜 및/또는 티암페니콜에 대해 박테리아 내성을 부여하는 서열인 특수한 구현예에서, 사용된 선택 유전자는 클로람페니콜 및/또는 티암페니콜 내성 유전자가 아니고, 바람직하게는 catB, catQ, catD 또는 catP 유전자가 아니다.
특수한 구현예에서, 목적한 핵산은 암호화 서열을 표적화하거나, 암호화 서열의 전사를 제어하거나, 암호화 서열을 플랭킹하는 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA), 목적한 효소, 특히 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 및/또는 변형 주형(또한 "편집 주형"으로서 본 내용에서 확인됨), 예를 들면, 표적 서열 중 모두 또는 일부를 제거하거나 변형시키기 위한, 바람직하게는 표적 서열의 발현을 억제하거나 억압할 목적의 변형 주형, 전형적으로 상술한 표적 서열의 상부 및 하부에 위치한 서열에 대한 서열 동족체(이에 상응하는) 서열, 전형적으로 각각 10 또는 20개의 염기쌍 및 1000, 1500 또는 2000개의 염기쌍, 예를 들면, 100, 200, 300, 400 또는 500개의 염기쌍 및 1000, 1200, 1300, 1400 또는 1500개의 염기쌍, 바람직하게는 100 내지 1500개 또는 100 내지 및 1000개의 염기쌍, 및 심지어 보다 바람직하게는 500 내지 1000개의 염기쌍 또는 200 내지 800개의 염기쌍을 포함하는 서열(표적 서열의 상부 및 하부에 위치한 상기 서열에 대해 상동성인)을 포함하는 주형을 포함한다.
특수한 구현예에서, 목적한 박테리아를 형질전환시키고/시키거나 유전적으로 변형시키는데 사용된 목적한 핵산은 Dam 및 Dcm 메틸트랜스퍼라제(dam- dcm- 유전형을 가진 에스케리키아 콜라이 박테리아으로부터 제조)에 의해 인식된 모티프에서 메틸화를 갖지 않는 핵산이다.
형질전환되고/되거나 유전적으로 변형된 목적한 박테리아가 특히, 하위분기군 DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593 및 NCCB 27006 중 하나에 속하는 씨. 베이제린키이 박테리아인 경우, 유전 툴로서 사용된 목적한 핵산, 예를 들어, 플라스미드는 Dam 및 Dcm 메틸트랜스퍼라제에 의해 인식된 모티프에서 메틸화를 갖지 않는 핵산, 전형적으로 GATC 모티프의 아데노신("A") 및/또는 CCWGG 모티프(W는 아데노신("A") 또는 티민("T")에 상응한다)의 제2의 사이토신("C")이 탈메틸화된 핵산이다.
Dam 및 Dcm 메틸트랜스퍼라제에 의해 인식된 모티프에서 메틸화를 갖지 않는 핵산은 전형적으로 dam - dcm - 유전형을 지닌 에스케리키아 콜라이(예를 들면, 에스케리키아 콜라이 INV 110, Invitrogen)으로부터 제조될 수 있다. 동일한 핵산은 예를 들면, EcoKI 메틸트랜스퍼라제에 의한 다른 메틸화를 가질 수 있으며, 후자는 모티프 AAC(N6)GTGC 및 GCAC(N6)GTT(N은 임의의 염기에 상응할 수 있다)의 아데닌("A")을 표적화한다.
특수한 구현예에서, 표적화된 서열은 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 예를 들면, catB 유전자와 같은 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 서열, 이러한 유전자의 전사를 제어하는 서열, 또는 이러한 유전자를 플랭킹하는 서열에 상응한다.
본 발명자에 의해 기술된 목적한 특수한 핵산은 예를 들면, 벡터, 바람직하게는 플라스미드, 예를 들면, 본 설명의 실험 단락에 기술된 서열 번호: 21의 서열의 플라스미드 pCas9ind-△catB 또는 서열 번호: 38의 서열의 플라스미드 pCas9ind-gRNA△catB(실시예 2 참고), 특히 Dam 및 Dcm 메틸트랜스퍼라제에 의해 인식된 모티프에서 메틸화를 갖지 않는 상기 서열의 버젼이다.
본 설명은 또한 본 내용에 기술된 바와 같은 목적한 박테리아를 형질전환 및/또는 유전적으로 변형시키는 목적한 핵산의 용도를 포함한다.
본 발명은 또한 동종 재조합에 의해, 클로스트리디움 속의 박테리아, 바람직하게는 클로스트리디움 속의 용매생성 박테리아를 형질전환시키고, 전형적으로 유전적으로 변형시키기 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 유리하게는 상기 박테리아내에 본 출원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 유전 툴, 바람직하게는 i) 서열 번호: 126의 서열(OREP) 중 모두 또는 일부 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아내에서 상기 박테리아의 야생형 버젼에 존재하는 유전 물질로부터 부분적으로 또는 전체적으로 부재된 DNA 서열의 발현을 가능하게 하는 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 "OPT 핵산"을 도입함으로써 박테리아를 형질전환시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 또한 형질전환된 박테리아, 즉, 목적한 재조합(들)/변형(들)/최적화(들)을 갖는 박테리아를 수득하거나, 회수하거나, 선택하거나 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 전형적으로 클로스트리디움 속의 박테리아를 형질전환시키고, 바람직하게는 유전적으로 변형시키기 위해 선택된 유전 변형 툴이 씨. 베이제린키이와 같은 박테리아, 하나 이상의 항생제에 대한 내성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 야생형 상태의 담체 및/또는 적어도 하나의 염색체외 DNA 서열의 야생형 상태의 담체에서 사용되도록 의도된 경우 유리하게 실행되며, 상기 유전 툴의 실행은 상기 박테리아를 상기 박테리아가 이에 대해 야생형 상태에서 내성인 항생제에 대한 내성의 마커의 발현을 가능하게 하는 핵산을 사용하여 형질전환시키는 단계 및/또는 형질전환되고/되거나 유전적으로 변형된 박테리아를 상기 항생제(이에 대해 박테리아는 야생형 상태에서 내성이다)를 사용하여 선택하는, 바람직하게는 상기 염색체외 DNA 서열을 상실한 박테리아를 상기 박테리아 중에서 선택하는 단계를 포함한다.
전형적으로 CRISPR 유전 변형 툴을 사용하여, 본 발명으로 유리하게 달성가능한 변형은 목적하지 않은 서열, 예를 들면, 하나 이상의 항생제에 대해 박테리아 내성을 제공하는 효소를 암호화하는 서열을 제거하거나, 목적하지 않은 서열이 비-기능성이 되도록 하는 것으로 이루어진다. 본 발명을 통해 유리하게 달성가능한 다른 변형은 박테리아를 유전적으로 변형시켜 이의 성능, 예를 들면, 목적한 용매 또는 용매의 혼합물의 생산에 있어서 이의 성능을 증진시키는 것으로 이루어지며, 상기 박테리아는 이것이 야생형 상태에서 내성이었던 항생제에 대해 민감성이 되고/되거나 이것이 상기 박테리아의 야생형에서 존재하는 염색체외 DNA 서열을 청소(cleaning)하도록 본 발명을 통해 이미 먼저 변형된다.
본 발명에 따른 공정은 CRISPR(집단화하여 일정하게 분포하는 짧은 팔린드롬 반복체) 유전 툴/기술, 특히 CRISPR/Cas(CRISPR-관련된 단백질) 유전 툴의 사용을 기반으로 한다.
본 발명은 Wang et al. (2015)에 의해 기술된 바와 같은 뉴클레아제, gRNA 및복구 주형을 포함하는 단일 플라스미드를 사용한 통상의 CRISPR/Cas 유전 툴을 사용하여 실행될 수 있다.
gRNA의 서열 및 구조는 잘 공지된 기술을 사용하여 표적화될 염색체 영역 또는 이동성 유전 성분에 따라 기술자에 의해 용이하게 정의될 수 있다(참고: 예를 들면, 문헌, DiCarlo et al., 2013).
본 발명자는 2개의 플라스미드의 사용을 기반으로 하는, 본 발명의 내용에서 또한 사용될 수 있는, 클로스트리디움 속의 박테리아에 대해 적응된, 박테리아를 변형시키기 위한 유전 툴을 개발하고 기술하여 왔다(참고: WO2017/064439, Wasels et al., 2017, 및 본 명세서와 관련된 도 15).
특수한 구현예에서, 이러한 툴의 "제1" 플라스미드는 Cas 뉴클레아제의 발현을 허용하며, 수행될 변형에 대해 특이적인 "제2" 플라스미드는 하나 이상의 gRNA 발현 카세트(전형적으로 박테리아 DNA의 상이한 영역을 표적화하는)뿐만 아니라 동종 재조합 메카니즘에 의해 Cas에 의해 표적화된 박테리아 DNA의 일부의 목적한 서열로의 교체를 가능하게 하는 복구 주형을 함유한다. cas 유전자 및/또는 gRNA 발현 카세트(들)는 구성적 또는 유도성 발현 프로모터, 바람직하게는 기술자에게 공지된(예를 들면, 출원 제WO2017/064439호에 기술되고 본 설명에 참고로 포함된) 유도성 발현 프로모터이고, 바람직하게는 상이하지만 동일한 유도인자에 의해 유도성 프로모터의 제어 하에 위치한다.
사용될 수 있는 gRNA는 본 내용에서 상술한 바와 같은 gRNA에 상응한다.
동종 재조합에 의해 클로스트리디움 속의 용매생성 박테리아를 형질전환시키고, 전형적으로 유전적으로 변형시키기 위한 본 발명에 따른 특수한 공정은 다음 단계를 이러한 순서대로 포함한다:
a) 박테리아내로 본 출원에 기술된 바와 같은 핵산 또는 유전 툴을 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자의 존재하에서 도입하는 단계, 및
b) 단계 a)의 말단에서 수득된 형질전환된 박테리아를 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자를 함유하지 않는 배지(또는 포함하지 않는 조건 하에서) 위에서 배양하여, 전형적으로 DNA 엔도뉴클레아제/gRNA 리보뉴클레오단백질 복합체, 전형적으로 Cas/gRNA(상기 항-CRISPR 단백질의 생산을 정지하고 엔도뉴클레아제의 작용을 허용하기 위하여)의 발현을 가능하게 하는 단계.
본 발명에 따른 유전 툴의 성분(핵산 또는 gRNA)은 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 직접 또는 간접적으로, 예를 들면, 형질전환, 접합, 미세주입, 형질감염, 전기천공(electroporation) 등에 의해, 바람직하게는 전기천공에 의해 도입된다(Mermelstein et al., 1993).
항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자는 상기 발현을 유도하기에 충분한 양으로 존재한다. Pbgal 프로모터의 경우, 유도인자인, 락토즈는 BgaR 단백질의 발현과 연결된 항-CRISPR 단백질의 발현의 억제(전사 억제)를 해제한다.
항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자는 바람직하게는 약 1　mM 내지 약 1　M, 바람직하게는 약 10　mM 내지 약 100　mM, 예를 들면, 약 40　mM을 포함하는 농도에서 사용된다.
바람직한 구현예에서, 항-CRISPR 단백질은 바람직하게는 유전 툴의 핵산 서열을 목적한 박테리아 균주내로 도입하는 단계 동안에 뉴클레아제의 작용을 억제, 바람직하게는 중화시킬 수 있다.
실험 단락에서 입증된 바와 같이, 본 발명은 유리하게는 Cas9 발현 카세트 및 AcrIIA4와 같은 항-CRISPR 단백질에 대한 발현 카세트를 포함하는 클로스트리디움 속의 박테리아를 gRNA 발현 카세트를 포함하는 임의의 핵산으로 형질전환시킨다.
상술한 공정의 단계 a)의 말기에 수득된 형질전환된 박테리아는 이후에 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자를 함유하지 않는 배지(상기 항-CRISPR 단백질의 생산을 중지하고 뉴클레아제의 작용을 허용하기 위하여)에서 성장시킨다.
특수한 구현예에서, 공정은 단계 b) 동안 또는 후에, 이러한 프로모터(들)이 유전 툴내에 존재하는 경우 뉴클레아제 및/또는 가이드 RNA(들)의 발현을 제어하는 유도성 프로모터(들)의 발현을 유도시켜, 일단 상기 유전 툴이 상기 박테리아내로 도입되면 목적한 유전적 변형을 허용하도록 하는 단계를 추가로 포함한다. 유도는 전형적으로 선택된 유도성 프로모터와 관련된 발현의 억제를 해제하는 물질을 사용하여 수행된다.
존재하는 경우, 유도 단계는 표적 박테리아내로 본 발명에 따른 유전 툴을 도입한 후 기술자에게 공지된 DNA 엔도뉴클레아제/gRNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 발현을 가능하게 하는 배지 상에서 임의의 배양 방법으로 수행할 수 있다. 이는 예를 들면, 박테리아를 충분한 양으로 존재하는 적합한 물질과 접촉시키거나, UV 광에 노출시킴으로써 수행된다. 이러한 물질은 선택된 유도성 프로모터와 관련된 발현의 억제를 해제한다. 선택된 프로모터가 Pcm-2tetO1 및 Pcm-tetO2/1로부터 선택된, 안하이드로테트라사이클린(aTc)-유도성 프로모터인 경우, aTc는 바람직하게는 약 1　ng/mL 내지 약 5000　ng/mL, 바람직하게는 약 10 ng/mL 내지 1000 ng/mL, 10 ng/mL 내지 800 ng/mL, 10 ng/mL 내지 500 ng/mL, 100 ng/mL 또는 200 ng/mL 내지 약 800 ng/mL 또는 1000 ng/mL, 또는 약 100 ng/mL 또는 200 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 600 ng/mL 또는 700 ng/mL, 예를 들면, 약 50 ng/mL, 100 ng/mL, 150 ng/mL, 200 ng/mL, 250 ng/mL, 300 ng/mL, 350 ng/mL, 400 ng/mL, 450 ng/mL, 500 ng/mL, 550 ng/mL, 600 ng/mL, 650 ng/mL, 700 ng/mL, 750 ng/mL 또는 800 ng/mL로 포함된 농도에서 사용된다. 특수한 구현예에서, aTc는 바람직하게는 약 200 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL 또는 약 200 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 예를 들면, 약 500 ng/mL로 포함된 농도에서 사용된다.
특수한 구현예에서, 방법은 복구 주형을 포함하는 핵산을 제거(박테리아 세포는 상기 핵산을 "청소하는" 것으로서 고려된다)하고/하거나 단계 a) 동안 유전 툴와 함께 도입된 가이드 RNA(들) 또는 가이드 RNA(들)을 암호화하는 서열을 제거하는 추가의 단계 c)를 포함한다.
다른 특수한 구현예에서, 공정은 단계 b) 또는 단계 c) 이후에, n번째―예를 들면, 제3, 제4, 제5 등의―이미 도입된 것(들)과는 구별되는 복구 주형을 포함하는 핵산을 포함하는 핵산 및 상기 구별되는 복구 주형내에 포함된 목적한 서열이 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자의 존재하에서, 박테리아 게놈의 표적화된 영역내로 통합되도록 하는 하나 이상의 가이드 RNA 발현 카세트를 도입하는 하나 이상의 추가의 단계를 포함하며, 각각의 추가의 단계에 이어서 이렇게 형질전환된 박테리아를 전형적으로 Cas/gRNA 리보뉴클레오단백질 복합체, 예를 들면 Cas9/gRNA의 발현을 가능하게 하는, 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자를 함유하지 않는 배지에서 배양하는 단계가 수반된다.
본 발명에 따른 공정의 특수한 구현예에서, 박테리아는 목적한 표적 서열 중 적어도 하나의 가닥을 절단하는데 관여하는 효소를 사용하는(예를 들면, 암호화하는), 상술한 것과 같은 핵산 또는 유전 툴을 사용하여 형질전환되며, 여기서 효소는 특수한 구현예에서 뉴클레아제, 바람직하게는 Cas9 효소 및 MAD7 효소로부터 우선적으로 선택된 Cas 뉴클레아제이다. 예시적인 구현예에서, 목적한 표적 서열은 하나 이상의 항생제, 바람직하게는 암페니콜의 부류, 전형적으로 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제와 같은 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제에 속하는 하나 이상의 항생제에 대한 내성을 박테리아에게 부여하는 효소를 암호화하는, 예를 들면 catB 유전자를 암호화하는 서열, 암호화 서열의 전사를 제어하는 서열 또는 상기 암호화 서열을 플랭킹하는 서열이다.
사용된 경우, 항-CRISPR 단백질은 전형적으로 상술한 바와 같은 "항-Cas" 단백질이다. 항-CRISPR 단백질은 유리하게는 "항-Cas9" 단백질 또는 "항-MAD7" 단백질이다.
표적화된 DNA 부위("인식된 서열")와 같이, 편집/복구 주형은 자체적으로 하나 이상의 핵산 서열 또는 천연 및/또는 합성의, 암호화 및/또는 비-암호화 서열에 상응하는 핵산 서열의 부위를 포함할 수 있다. 주형은 또한 즉, 클로스트리디움 속에 속하는 박테리아의 게놈으로부터, 또는 상기 속의 특수한 종의 게놈으로부터 천연적으로 부재된, 하나 이상의 "외부" 서열을 포함할 수 있다. 주형은 또한 서열의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 유전 툴은 복구 주형이 목적한 핵산의 박테리아 게놈내로, 전형적으로 적어도 1개의 염기쌍(bp), 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 1000, 10,000, 100,000 또는 1,000,000 bp, 전형적으로 1 bp 내지 20 kb, 예를 들면 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 kb, 또는 1 bp 내지 10 kb, 바람직하게는 10 bp 및 10 kb 또는 1 kb 내지 10 kb, 예를 들면 1 bp 내지 5 kb, 2 kb 내지 5 kb, 또는 2.5 또는 3 kb 내지 5 kb를 포함하는 DNA 서열 또는 서열 부위의 혼입을 안내하도록 한다.
특수한 구현예에서, 목적한 DNA 서열의 발현은 필룸 피르미쿠테스(phylum Firmicutes), 특히 클로스트리디움 속, 바실러스 속(genus Bacillus) 또는 락토바실러스 속(genus Lactobacillus)에 속하는 박테리아가 수개의 상이한 당, 예를 들면 적어도 2개의 상이한 당, 전형적으로 5-탄당(예를 들면, 글루코즈 또는 만노즈) 및/또는 6-탄당(예를 들면, 크실로즈, 아라비노즈 또는 프럭토즈) 중에서 적어도 2개의 상이한 당, 바람직하게는 예를 들면, 글루코즈, 크실로즈 및 만노즈로부터 선택된 적어도 3개의 상이한 당; 글루코즈, 아라비노즈 및 만노즈; 및 글루코즈, 크실로즈 및 아라비노즈를 발효(전형적으로 동시에)하도록 한다.
다른 특수한 구현예에서, 목적한 DNA 서열은 적어도 하나의 목적한 생성물, 바람직하게는 변형된 박테리아에 의해 용매 생산을 촉진하는 생성물, 전형적으로 적어도 하나의 목적한 단백질, 예를 들면, 효소; 트랜스포터와 같은 막 단백질; 다른 단백질(차페론 단백질)의 성숙 단백질; 전사 인자; 또는 이의 조합을 암호화한다.
특히 유리하게는, 본 발명에 따른 유전 툴은 목적한 작은 및 큰 서열 둘 다를 1 단계로, 즉, 단일 핵산(전형적으로, 본 내용에 기술된 바와 같은 "OPT 핵산", "제2" 또는 "n번째" 핵산)을 사용하여, 또는 수개의 단계로, 즉, 수개의 핵산(전형적으로 본 내용에서 기술한 바와 같이, "제2" 및 "n번째" 핵산)을 사용하여, 바람직하게는 1 단계로 도입되도록 한다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 이러한 "n번째" 핵산과 같은 핵산 및 본 내용에 기술된 유전 툴은 박테리아 DNA의 표적화된 부위가 제거되거나 보다 짧은(예를 들면, 이로부터 적어도 하나의 염기쌍이 결실된 서열에 의해) 및/또는 비-기능성인 서열로 대체되도록 한다. 본 발명의 특수한 바람직한 구현예에서, "제2" 또는 "n번째" 핵산은 유리하게는 박테리아 내로, 예를 들면, 박테리아 게놈내로, 적어도 하나의 염기 쌍, 및 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15　kb 이하를 포함하는 목적한 핵산을 도입시킨다.
목적한 핵산은 사용된 gRNA에 따라서 동일하거나 상이한 영역내에서 박테리아 염색체내로 삽입시킬 수 있다.
본 발명에 의해, 전형적으로 본 발명에 따른 유전 툴 및 방법에 의해, 이제 클로스트리디움 속의 박테리아를 전신계적으로, 효과적으로(고 빈도의 동종 재조합), 실질적으로(박테리아 게놈내로 목적한 큰 핵산의 가능한 도입) 및 안정하게(항생제와 접촉된 형질전환된 박테리아를 유지시킬 필요없이) 형질전환시켜 목적한 형질전환된 박테리아, 예를 들면, 이들이 기원한 박테리아과 비교하여 유전형 또는 표현형 차이를 지닌 개선된 돌연변이체, 전형적으로 산업적으로 유용한 박테리아, 예를 들면, 용매 또는 바이오연료(biofuel)의 생산에 유용한 박테리아를 수득할 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 공정을 사용하여 수득되고/되거나 본 발명에 따른 유전 툴을 사용하여 형질전환되고 이상적으로는 유전적으로 변형된 클로스트리디움 속의 박테리아, 전형적으로 클로스트리디움 속의 용매생성 박테리아뿐만 아니라 이의 임의의 기원한 박테리아, 클론, 돌연변이체, 또는 유전적으로 변형된 버젼에 관한 것이다. 이러한 박테리아는 복구 주형을 사용한 동종 재조합에 의해 이의 게놈내로 도입된 목적한 핵산(들)을 발현한다. 이러한 박테리아는 본 발명에 따른 유전 툴 중 모두 또는 일부, 전형적으로 Cas9와 같은 뉴클레아제 또는 Cas9와 같은 뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에 의해 형질전환되고/되거나 유전적으로 변형된 예시적인 박테리아는 하나 이상의 항생제에 대한 내성을 박테리아에게 제공하는 효소를 더 이상 발현하지 않는 박테리아, 특히, 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 발현하지 않는 박테리아, 예를 들면, 야생형 상태에서 catB 유전자를 발현하고, 일단 본 발명에 의해 형질전환 및/또는 유전적으로 변형되면 상기 catB 유전자를 결여하거나 상기 catB 유전자를 발현하지 않는 박테리아이다. 본 발명을 통해 이렇게 형질전환되고/되거나 유전적으로 변형된 박테리아는 암페니콜, 예를 들면, 본 내용에 기술된 바와 같은 암페니콜, 특히 클로람페니콜 또는 티암페니콜에 대해 민간성이 된다.
본 발명에 따른 바람직한 유전적으로 변형된 박테리아의 특수한 예는 본 설명에서 기탁 번호 LMG P-31151 하에 벨기에의 미생물 공동 기탁기관(Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms)("BCCM", 벨기에 베-9000 겐트 칼.엘. 레데강크슈트라트 35, B-9000 소재)에 2018년 12월 6일자로 등록된, 씨. 베이제린키이 IFP962 △catB (또한 씨. 베이제린키이 DSM6423 △catB로서 확인됨)이다.
본 발명에 따른 바람직한 유전적으로 변형된 박테리아의 다른 특수한 예는 본 설명에서 씨. 베이제린키이로 확인된 박테리아이며, 이는 기탁 번호 LMG P-31277로서 BCCM-LMG 기탁기관(collection)에 2019년 2월 20일자로 등록된 균주 씨. 베이제린키이 IFP963 △ catB △ pNF2이다.
이러한 설명은 또한 상기 박테리아 중 하나의 임의의 유도된 박테리아, 클론, 돌연변이체 또는 유전적으로 변형된 버젼, 예를 들면, 티암페니콜 및/또는 클로람페니콜과 같은 암페니콜에 대해 민감성으로 남아있는 임의의 유도된 박테리아, 클론, 돌연변이체 또는 유전적으로 변형된 버젼에 관한 것이다.
특수한 구현예에 따라서, 본 발명에 따라 형질전환되고/되거나 유전적으로 변형된 박테리아, 예를 들면 씨. 베이제린키이 DSM 6423 △catB 또는 씨. 베이제린키이 DSM6423 △ catB △ pNF2은 여전히 형질전환될 수 있고, 바람직하게는 유전적으로 변형될 수 있다. 이는 핵산, 예를 들면, 본 설명, 예를 들면, 실험 단락에 기술된 바와 같은 플라스미드를 사용하여 수행할 수 있다. 유리하게 사용될 수 있는 예시적인 핵산은 서열 번호: 23의 서열(본 설명의 실험 단락에 기술됨)의 플라스미드 pCas9acr 또는 pCas9ind(서열 번호: 22), pCas9cond(서열 번호: 133) 및 pMAD7(서열 번호: 134)로부터 선택된 플라스미드이다.
본 발명의 특수한 양태는 본 내용에 기술된 유전적으로 변형된 박테리아, 바람직하게는 번호 LMG P-31151 하에 기탁된 박테리아 씨. 베이제린키이 IFP962 △catB, 보다 바람직하게는 번호 LMG P-31277 하에 기탁된 씨. 베이제린키이 IFP963 △catB △ pNF2, 또는 예를 들면, 본 내용에 기술된 핵산, 유전 툴 또는 공정 중 하나를 사용하여, 이의 게놈내로 의도적으로 도입된 목적한 핵산(들)의 발현 덕분에, 하나 이상의 용매, 바람직하게는 적어도 이소프로판올을, 바람직하게는 산업적 규모로 생성하기 위한 용도에 관한 것이다.
특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법 및 유전 툴을 사용하여 수득된, 본 발명에 따른 클로스트리디움 속의 박테리아는 이의 게놈내로 의도적으로 도입된 목적한 핵산 또는 산의 발현 덕분만으로 하나 이상의 용매를 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 본 내용에 기술된 바와 같은 유전 툴의 성분 중 모두 또는 일부, 전형적으로 i) Cas9와 같은 하나의 DNA 엔도뉴클레아제를 암호화하는 제1의 핵산(여기서 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열은 프로모터의 제어 하에 위치한다), 및 ii) 동종 재조합 메카니즘에 의해, 엔도뉴클레아제에 의해 표적화된 박테리아 DNA의 일부를 목적한 서열로 대체하도록 하는 복구 주형, 및 툴내에서 사용된 선택된 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도성 프로모터에 대해 적응된 적어도 하나의 유도인자를 암호화하는 적어도 제2의 핵산을 포함하는 클로스트리디움 속의 박테리아를 형질전환시키고, 전형적으로는 유전적으로 변형시키기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 또한 엔도뉴클레아제 및/또는 하나 이상의 가이드 RNA의 발현을 제어하기 위한 툴내에서 임의로 사용된 선택된 유도성 프로모터(들)에 대해 적응된 하나 이상의 유도인자를 포함할 수 있다.
또한 (i) 본 내용에 기술된 바와 같은 핵산, 예를 들면, 본 내용에 기술된 바와 같은 박테리아내 표적 서열을 인식하는 "OPT 핵산" 또는 DNA 단편, 및 (ii) 상기 박테리아의 개선된 변이체; gRNA로서의 핵산; 복구 매트릭스로서의 핵산; "OPT 핵산"; 프라이머의 적어도 하나의 쌍, 예를 들면, 본 발명의 내용에 기술된 바와 같은 프라이머의 쌍; 및 상기 툴에 의해 암호화된 단백질을 발현하기 위한 유도인자, 예를 들면, Cas9 또는 MAD7 뉴클레아제를 생산하기 위하여, 이러한 박테리아를 형질전환시키고, 전형적으로 유전적으로 변형시키기 위한 본 내용에 기술된 바와 같은 유전 변형 툴의 성분으로부터 선택된 적어도 하나의 툴, 바람직하게는 수개의 툴을 포함하는 키트가 기술되어 있다.
본 내용에 기술된 바와 같은 박테리아를 형질전환하고, 전형적으로 유전적으로 변형시키기 위한 유전 변형 툴은 예를 들면, 상기 설명된 바와 같은, "OPT 핵산", CRISPR 툴, 제II형 인트론의 사용을 기반으로 한 툴 및 대립형질 교환 툴로부터 선택될 수 있다.
특수한 구현예에서, 키트는 본 내용에 기술된 바와 같은 유전 툴의 성분 중 모두 또는 일부를 포함한다.
본 내용에 기술된 바와 같은 필룸 피르미쿠테스에 속하는 박테리아를 형질전환시키고, 바람직하게는 유전적으로 변형시키기 위한, 또는 이러한 박테리아를 사용하여, 적어도 하나의 용매, 예를 들면, 용매의 혼합물을 생산하기 위한 특수한 키트는 i) 서열 번호: 126의 서열 중 모두 또는 일부 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아의 야생형 버젼에 존재하는 유전 물질로부터 부분적으로 또는 전체적으로 부재된 DNA 서열; 및 본 내용에 기술된 유전 툴내에서 사용된 선택된 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도성 프로모터에 대해 적응된 적어도 하나의 유도인자의 상기 박테리아내 발현을 가능하게 하는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함한다.
키트는 사용된 뉴클레아제 및/또는 하나 이상의 가이드 RNA의 발현을 제어하기 위해 유전 툴내에서 임의로 사용된 선택된 유도성 프로모터(들)에 적응된 하나 이상의 유도인자를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 특수한 키트는 엔도뉴클레아제, 예를 들면, Cas9 또는 tag를 포함하는 MAD7 단백질의 발현을 허용한다.
본 발명에 따른 키트는 배양 배지, 클로스트리디움 속의 적어도 하나의 컴피턴트(competent) 박테리아(즉, 형질전환을 위해 패키지된), 적어도 하나의 gRNA, 뉴클레아제, 예를 들면, Cas9 또는 MAD7 단백질, 하나 이상의 선택 분자, 또는 설명서 세트와 같은 하나 이상의 소비재를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 전형적으로 본 내용에 기술된 형질전환 및 이상적으로 유전적 변형의 공정을 수행하기 위한, 및/또는 용매(들)(적어도 하나의 용매)를 클로스트리디움 속의 박테리아를 사용하여 생산하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 클로스트리디움 속의 박테리아, 전형적으로 클로스트리디움 속의 용매생성 박테리아를 형질전환시키고, 전형적으로 유전적으로 변형시키기 위한, 예를 들면, 클로스트리디움 속의 박테리아의 개선된 변이체를 생성하기 위한 본 발명에 따른 핵산, 유전 툴, 공정, 또는 키트의 잠재적인 용도에 관한 것이다.
설명은 특히 본 내용에 기술된 바와 같은 박테리아, 전형적으로 클로스트리디움 속(예를 들면, 번호 LMG P-31151 하에 기탁된 씨. 베이제린키이 IFP962 △catB)의 박테리아, 바람직하게는 박테리아 염색체 및 염색체 DNA와 구별되는 적어도 하나의 DNA 분자(전형적으로 천연 플라스미드)를 가진 박테리아, 가장 바람직하게는 번호 LMG P-31277 하에 기탁된 박테리아 씨. 베이제린키이 IFP963 △ catB △pNF2 박테리아의, 본 내용에 기술된 형질전환 공정, 및 이상적으로 유전적 변형을 실행하기 위한, 본 발명에 따른 키트, 또는 이러한 키트의 하나 이상의 성분의 용도에 관한 것이다.
최종적으로, 본 발명은 특히 용매(들) 또는 바이오연료(들), 또는 이의 혼합물을 산업적 규모로 생산할 수 있도록 하는, 본 발명에 따라 형질전환된 클로스트리디움 속의 핵산, 유전 툴, 공정, 키트 또는 박테리아의 잠재적인 용도에 관한 것이다. 생산될 수 있는 용매는 전형적으로 아세톤, 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이의 혼합물, 전형적으로 에탄올/이소프로판올, 부탄올/이소프로판올, 또는 에탄올/부탄올 혼합물, 바람직하게는 이소프로판올/부탄올 혼합물이다.
특수한 구현예에서, 에탄올/이소프로판올 혼합물의 비는 적어도 1/4와 동일하다. 이러한 비는 바람직하게는 1/3 내지 1에 포함되고, 보다 바람직하게는 1과 동일하다.
특수한 구현예에서, 에탄올/부탄올 혼합물의 비는 적어도 1/4과 동일하다. 이러한 비는 바람직하게는 1/3 내지 1에 포함되고, 보다 바람직하게는 1과 동일하다.
특수한 구현예에서, 이소프로판올/부탄올 혼합물의 비는 적어도 1/4과 동일하다. 이러한 비는 바람직하게는 1/3 내지 1에 포함되고, 보다 바람직하게는 1과 동일하다.
본 발명에 따른 형질전환된 박테리아의 용도는 산업적 규모의 적어도 100톤의 아세톤, 적어도 100톤의 에탄올, 적어도 1000톤의 이소프로판올, 적어도 1800톤의 부탄올, 또는 적어도 40,000톤의 이의 혼합물의 매년 산업적 생산을 전형적으로 허용한다.
다음의 실시예 및 도면은 본 발명을 이의 영역을 제한하지 않고 보다 완전히 나타내기 위해 의도된다.
도 1: Cas9 뉴클레아제를 사용하여, gRNA에 의해 지시된 게놈 DNA내에 하나 이상의 이중 가닥 절단물을 생성하기 위한 유전 툴로서 게놈 편집(genome editing)을 위해 사용된 CRISPR/Cas9 시스템.
gRNA, 가이드 RNA; PAM, 광스페이서(photospacer) 인접한 모티프. 도는 Jinek et al., 2012로부터 변형되었다.
도 2: 동종 재조합에 의한 Cas9-유도된 이중 가닥 절단물의 복구. PAM, 광스페이서 인접한 모티프.
도 3: 클로스트리디움에서 CRISPR/Cas9의 용도.
ermB, 에리쓰로마이신 내성 유전자; catP (서열 번호: 70), 티암페니콜/클로람페니콜 내성 유전자; tetR, 이의 발현 생성물이 Pcm-tetO2/1로부터의 전사를 억제하는 유전자; Pcm-2tetO1 및 Pcm-tetO2/1, 안하이드로테트라사이클린 (aTc)-유도성 프로모터(Dong et al., 2012); miniPthl, 구성적 프로모터(Dong et al., 2012).
도 4: pCas9acr 플라스미드 맵(서열 번호: 23).
ermB, 에리쓰로마이신 내성 유전자; rep, 이. 콜라이내 복제 오리진; repH, 씨. 아세토부틸리쿰내 복제 오리진; Tthl, 티올라제 터미네이터; miniPthl, 구성적 프로모터(Dong et al., 2012); Pcm-tetO2/1, tetR의 생성물에 의해 억제되고 안하이드로테트라사이클린(aTc)에 의해 유도성인 프로모터(Dong et al., 2012); Pbgal, lacR의 생성물에 의해 억제되고 락토즈에 의해 유도성인 프로모터(Hartman et al., 2011); acrIIA4 , 항-CRISPR 단백질 AcrII14를 암호화하는 유전자; bgaR, 이의 발현 생성물이 Pbgal로부터의 전사를 억제하는 유전자.
도 5: pCas9ind(서열 번호: 22) 또는 pCas9acr(서열 번호: 23)을 포함하는 씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792의 상대적인 형질전환 비율. 빈도는 pEC750C(서열 번호: 106)의 형질전환 빈도와 관련하여, 형질전환에 사용된 DNA의 μg당 수득된 형질전환체의 수로서 나타내며, 적어도 2개의 독립된 실험의 평균을 나타낸다.
도 6: pCas9acr 및 (서열 번호: 79 및 서열 번호: 80)의 존재하에서 또는 (서열 번호: 105) 복구 주형의 부재하에서 bdhB를 표적화하는 gRNA에 대한 발현 플라스미드를 포함하는 균주 DSM 792 형질전환체내에서 CRISPR/Cas9 시스템의 유도. Em, 에리쓰로마이신; Tm, 티암페니콜; aTc, 안하이드로테트라사이클린; ND, 희석되지 않음.
도 7: CRISPR/DNA 엔도뉴클레아제 시스템을 통한 씨. 아세토부틸리쿰 DSM792의 bdh 유전자자리의 변형.
A, bdh 유전자자리의 유전적 구조화. 복구 주형과 게놈성 DNA 사이의 상동성은 연회색 평행사변형으로 나타낸다. 프라이머 V1 및 V2의 하이브리드화 부위가 또한 나타나 있다.
B, 프라이머 V1 및 V2를 사용한 bdh 유전자자리의 증폭. M, 2-로그 크기 마커(NEB); P, pGRNA-△bdhA △ bdhB 플라스미드; WT, 야생형 균주.
도 8: Poehlein et al., 2017에 따른, 30개의 용매생성 클로스트리디움 균주의 분류. 하위분기군 씨. 베이제린키이 NRRL B-593이 문헌에서 씨. 베이제린키이 DSM 6423으로 확인되어 있음에 주목하라.
도 9: pCas9ind-△catB 플라스미드 맵(plasmid map).
도 10: pCas9acr 플라스미드 맵.
도 11: pEC750S-uppHR 플라스미드 맵.
도 12: pEX-A2-gRNA-upp 플라스미드 맵.
도 13: pEC750S-△upp 플라스미드 맵.
도 14: pEC750C-△upp 플라스미드 맵.
도 15: pGRNA-pNF2 맵.
도 16: 균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423의 박테리아 형질전환으로부터 유도된 클론내 catB 유전자의 PCR 증폭.
균주가 여전히 catB 유전자를 가진 경우 약 1.5 kb, 또는 이러한 유전자가 결실된 경우 약 900 bp의 증폭.
도 17: 2YTG 배지 및 2YTG 티암페니콜 선택성 배지에서 균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423 WT 및 △catB의 성장.
도 18: 복구 매트릭스의 존재 또는 부재하에서, pCas9acr 및, upp를 표적화하는 gRNA에 대한 발현 플라스미드를 포함하는 균주 씨. 베린제린키이 DSM 6423의 형질전환체내에서 CRISPR/Cas9acr 시스템의 유도. 범례: Em, 에리쓰로마이신; Tm, 티암페니콜; aTc, 안하이드로테트라사이클린; ND, 희석되지 않음.
도 19: 도 19의 A는 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 씨. 베이제린키이 DSM 6423의 upp 유전자자리의 변형을 나타낸다. 도 19의 A는 게놈 DNA내에서 상응하는 상동성 영역과 관련된, upp 유전자자리: 유전자, gRNA 표적 부위 및 복구 매트릭스의 유전적 구조화를 나타낸다. PCR 검증을 위한 프라이머의 하이브리드화 부위(RH010 및 RH011)가 또한 나타나 있다.
도 19의 B는 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 씨. 베이제린키이 DSM 6423의 upp 유전자자리의 변형을 나타낸다. 도 19의 B는 프라이머 RH010 및 RH011을 사용하는 upp 유전자자리의 증폭을 나타낸다. 1680 bp의 증폭은 변형된 upp 유전자에 대한 1090 bp와 비교하여, 야생형 유전자의 경우에 예측된다. M, 100 bp 내지 3 kb 크기의 마커(Lonza); WT, 야생형 균주.
도 20: 균주 씨. 베이제린키이 6423 △catB 내에서 플라스미드 pCas9ind의 존재를 입증하는 PCR 증폭.
도 21: CRISPR-Cas9 시스템으로부터 aTc를 포함하는 배지 상에서 유도 전(양성 대조군 1 및 2) 및 이후 유도 후 천연의 pNF2 플라스미드의 존재 또는 부재를 입증하는 PCR 증폭(△900 bp).
도 22: 2개의 플라스미드의 사용을 기반으로 한, 클로스트리디움 속의 박테리아에 대해 적응된, 박테리아를 변형시키기 위한 유전 툴(참고: WO2017/064439, Wasels et al., 2017).
도 23: pCas9ind-gRNA△catB 플라스미드 맵.
도 24: 균주 씨. 베이제린키이 DSM6423내에서 20 μg의 pCas9ind 플라스미드에 대한 형질전환 효능(형질전환된 DNA의 μg당 관찰된 콜로니 내). 오차 바아(error bar)는 생물학적 3회에 대한 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 25: pNF3 플라스미드 맵.
도 26: pEC751S 플라스미드 맵.
도 27: pNF3S 플라스미드 맵.
도 28: pNF3E 플라스미드 맵.
도 29: pNF3C 플라스미드 맵.
도 30: 씨. 베이제린키이 DSM 6423의 3개의 균주내 플라스미드 pCas9ind의 형질전환 효능(형질전환된 DNA의 μg 당 관찰된 콜로니 내). 오차 바아는 생물학적 3회의 평균의 표준 오차에 상응한다.
도 31: 씨. 베이제린키이 DSM 6423으로부터 유도된 2개의 균주내에서 플라스미드 pEC750C의 형질전환 효능(형질전환된 DNA의 μg당 관찰된 코로니내).
도 32: 균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423△catB △pNF2내 플라스미드 pEC750C, pNF3C, pFW01 및 pNF3E의 형질전환 효능(형질전환된 DNA의 μg당 관찰된 코로니내). 오차 받아는 생물학적 3회에 대한 평균의 표준 편차에 상응한다.
도 33: 균주 씨. 베이제린키이 NCIMB 8052의 플라스미드 pFW01, pNF3E 및 pNF3S의 형질전환 효능(형질전환된 DNA의 μg당 관찰된 콜로니 내).
실시예
실시예 1
물질 및 방법
성장 조건
씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792를 2YTG 배지(16　g/l 트립톤, 10　g/l 효모 추출물, 5　g/l 글루코즈, 4　g/l NaCl) 속에서 성장시켰다. 이. 콜라이 NEB10B를 LB 배지(10　g/l 트립톤, 5　g/l 효모 추출물, 5　g/l NaCl) 속에서 성장시켰다. 고체 배지는 15　g/l 아가로즈를 액체 배지에 첨가하여 제조하였다. 에리쓰로마이신(2YTG 또는 LB 배지 속에서 각각 40 또는 500　mg/l의 농도에서), 클로람페니콜(고체 또는 액체 LB 속에서 각각 25 또는 12.5　mg/l의 농도) 및 티암페니콜(2YTG 배지 속에서 15　mg/l)을 필요한 경우 사용하였다.
핵산의 사용
사용된 모든 효소 및 키트는 제공자의 추천에 따라 그와 같이 수행하였다.
플라스미드 작제
도 4에 나타낸 pCas9acr 플라스미드(서열 번호: 23)는 bgaR 및 acrIIA4를 포함하는 단편(서열 번호: 1)을 Eurofins Genomics가 합성한 Pbgal 프로모터의 제어하에서 pCas9ind 벡터의 SacI 부위에서 클로닝함으로써 작제하였다(Wasels et al., 2017).
pGRNAind 플라스미드(서열 번호: 82)는 gRNA용의 발현 카세트(서열 번호: 83)를 Eurofins Genomics가 합성한 프로모터 Pcm-2tetO1 (Dong et al., 2012)의 제어 하에서pEC750C 벡터(서열 번호: 106)의 SacI 부위에 클로닝함으로써 작제하였다(Wasels et al., 2017).
pGRNA-xylB(서열 번호: 102), pGRNA-xylR(서열 번호: 103), pGRNA-glcG(서열 번호: 104) 및 pGRNA-bdhB(서열 번호: 105) 플라스미드는 각각의 프라이머 쌍 5'-TCATGATTTCTCCATATTAGCTAG-3' 및 5'-AAACCTAGCTAATATGGAGAAATC-3', 5'-TCATGTTACACTTGGAACAGGCGT-3' 및 5'-AAACACGCCTGTTCCAAGTGTAAC-3', 5'-TCATTTCCGGCAGTAGGATCCCCA-3' 및 5'-AAACTGGGGATCCTACTGCCGGAA-3', 5'-TCATGCTTATTACGACATAACACA-3' 및 5'-AAACTGTGTTATGTCGTAATAAGC-3'를 BsaI으로 분해한 pGRNAind 플라스미드(서열 번호: 82) 내에 클로닝함으로써 작제하였다.
pGRNA-△bdhB 플라스미드(서열 번호: 79)는 한편으로는 프라이머 5'-ATGCATGGATCCAAACGAACCCAAAAAGAAAGTTTC-3' 및 5'-GGTTGATTTCAAATCTGTGTAAACCTACCG-3', 다른 한편으로는 5'-ACACAGATTTGAAATCAACCACTTTAACCC-3' 및 5'-ATGCATGTCGACTCTTAAGAACATGTATAAAGTATGG-3'를 사용하여 수득된 PCR 생성물의 PCR 조립체를 오버랩핑(overlapping)함으로써 수득된 DNA 단편을 BamHI 및 SacI으로 분해한 pGRNA-bdhB 벡터내에서 클로닝함으로써 작제하였다.
pGRNA-△bdhA △ bdhB 플라스미드(서열 번호: 80)는 한편으로는 5'-ATGCATGGATCCAAACGAACCCAAAAAGAAAGTTTC-3' 및 5'-GCTAAGTTTTAAATCTGTGTAAACCTACCG-3', 다른 한편으로는 5'-ACACAGATTTAAAACTTAGCATACTTCTTACC-3' 및 5'-ATGCATGTCGACCTTCTAATCTCCTCTACTATTTTAG-3'를 사용하여 수득된 PCR 생성물의 PCR 조립체를 오버랩핑함으로써 수득된 DNA 단편을 BamHI 및 SacI으로 분해한 pGRNA-bdhB 벡터내에서 클로닝함으로써 작제하였다.
형질전환
씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792는 Mermelstein et al., 1993에 기술된 프로토콜에 따라서 형질전환하였다. gRNA 발현 카세트를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 이미 Cas9 발현 플라스미드(pCas9ind 또는 pCas9acr)를 포함하는 씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792 형질전환체의 선택은 에리쓰로마이신(40　mg/l), 티암페니콜(15　mg/l) 및 락토즈(40 nM)를 포함하는 고체 2YTG 배지 상에서 수행하였다.
cas9 발현의 유도
cas9 발현의 유도는 에리쓰로마이신(40　mg/l), 티암페니콜(15　mg/l) 및, cas9 및 gRNA의발현의 유도인자인, aTc(1　mg/l)을 포함하는 고체 2YTG 배지에서 수득된 형질전환체의 성장을 통해 달성하였다.
bdh 유전자자리의 증폭
bdhA 및 bdhB 유전자 유전자자리에서 씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792 게놈의 편집의 입증은 Q5® 고-정확도(High-Fidelity) DNA 폴리머라제(NEB) 효소와 프라이머 V1 (5'-ACACATTGAAGGGAGCTTTT-3') 및 V2(5'-GGCAACAACATCAGGCCTTT-3')를 사용하는 PCR로 수행하였다.
결과
형질전환 효능
cas9 발현 플라스미드의 형질전환 빈도에 있어서 acrIIA4 유전자의 삽입의 영향을 평가하기 위하여, 상이한 gRNA 발현 플라스미드를 pCas9ind(서열 번호: 22) 또는 pCas9acr(서열 번호: 23)를 포함하는 균주 DSM 792내에서 형질전환시키고, 형질전환체를 락토즈가 보충된 배지 상에서 선택하였다. 수득된 형질전환 빈도는 도 5에 나타낸다.
△ bdhB 및 △ bdhA △ bdhB 돌연변이체의 생성
bdhB를 표적화하는 gRNA에 대한 발현 카세트를 포함하는 표적화 플라스미드(pGRNA-bdhB - 서열 번호: 105) 뿐만 아니라 bdhB 유전자 단독(pGRNA-△bdhB - 서열 번호: 79) 또는 bdhA 및 bdhB 유전자(pGRNA-△bdhA △ bdhB - 서열 번호: 80)를 포함하는 2개의 유도된 플라스미드를 pCas9ind(서열 번호: 22) 또는 pCas9acr(서열 번호: 23)를 포함하는 균주 DSM 792 내에서 형질전환시켰다. 수득되는 형질전환 빈도는 표 2에 나타낸다:
Figure pat00002
표 2: bdhB 를 표적화하는 플라스미드를 사용한 pCas9ind 또는 pCas9ind을 함유하는 균주 DSM 792의 형질전환 빈도. 빈도는 형질전환에 사용된 DNA 의 μg 당 수득된 형질전환체의 수로 나타내며, 적어도 2개의 독립된 실험의 평균을 나타낸다.
수득된 형질전환체는 안하이드로테트라사이클린(aTc)이 보충된 배지 상에서 계대배양을 통해 CRISPR/Cas9 시스템의 발현의 유도 기를 겪었다(도 6).
바람직한 변형은 2개이 aTc-내성 콜로니의 게놈 DNA에서 PCR로 확인하였다(도 7).
결론
Wasels et al. (2017)에 기술된 CRISPR/Cas9-기반 유전 툴은 2개의 플라스미드를 사용한다:
- 제1 플라스미드, pCas9ind는 aTc-유도성 프로모터의 제어 하에서 cas9를 함유한다.
- pEC750C로부터 유도된 제2 플라스미드는 gRNA에 대한 발현 카세트(제2의 aTc-유도성 프로모터의 제어 하에 위치함)뿐만 아니라 시스템에 의해 유도된 이중 가닥 브레이크(break)를 보수하는 편집 주형을 함유한다.
그러나, 본 발명자들은 일부 gRNA가 이들의 발현의 제어 뿐만 아니라 aTc-유도성 프로모터를 사용한 Cas9의 제어에도 불구하고 여전히 너무 독성인 것으로 여겨짐을 관찰하였으므로, 유전 툴에 의한 및 따라서 염색체 변형에 의해 박테리아 형질전환 효능을 제한하였음을 관찰하였다.
이러한 유전 툴을 개선시키기 위하여, cas9 발현 플라스미드를 락토즈-유도성 프로모터의 제어하에서, 항-CRISPR 유전자, acrIIA4의 삽입을 통해 변형시켰다. 따라서, 상이한 gRNA 발현 플라스미드의 형질전환 효능은 유의적으로 개선되어 시험한 모든 플라스미드에 대해 형질전환체가 수득되도록 하였다.
pCas9ind를 포함하는 균주 DSM 792내로 도입되지 않을 수 있는 플라스미드를 사용한 씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792 게놈내에서 bdhB 유전자자리를 편집하는 것이 또한 가능하였다. 관찰된 변형 빈도는 앞서 관찰한 바와 동일하며(Wasels et al., 2017), 시험한 콜로니의 100%가 변형되었다.
결론적으로, cas9 발현 플라스미드의 변형은 Cas9-gRNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 보다 우수한 제어를 허용함으로써 Cas9의 작용이 목적한 돌연변이체를 수득하기 위해 개시될 수 있는 형질전환체의 생산을 유리하게 촉진하였다.
실시예 2
물질 및 방법
성장 조건
씨. 베이제린키이 DSM 6423을 2YTG 배지(16 g/l 트립톤, 10 g/l 효모 추출물, 5 g/l 글루코즈, 4 g/l NaCl)내에서 성장시켰다. 이. 콜라이 NEB 10-베타 및 INV110을 LB 배지(10 g/l 트립톤, 5 g/l 효모 추출물, 5 g/l NaCl) 속에서 성장시켰다. 고체 배지는 15 g/l 아가로즈를 액체 배지에 가함으로써 제조하였다. 에리쓰로마이신(2YTG 또는 LB 배지 속에서 각각 20 또는 500 mg/l의 농도), 클로람페니콜(고체 또는 액체 LB 속에서 각각 25 또는 12.5 mg/l), 티암페니콜(2YTG 배지 속에서 15 mg/l) 또는 스펙티노마이신(LB 또는 2YTG 배지 속에서 각각 100 또는 650 mg/l의 농도에서)를 필요할 경우 사용하였다.
핵산 및 플라스미드 벡터
사용된 모든 효소 및 키트는 제공업자의 추천에 따라 사용하였다.
콜로니 PCR 시험은 다음의 프로토콜에 따랐다:
단리된 씨. 베이제린키이 DSM 6423 콜로니를 100 μL의 10 mM 트리스, pH 7.5, 5 mM EDTA 속에서 재현탁시켰다. 이러한 용액을 98℃까지 10분 동안 교반없이 가열하였다. 0.5 μL의 이러한 박테리아 분해물을 이후에 Phire(Thermo Scientific), Phusion(Thermo Scientific), Q5(NEB) 또는 KAPA2G Robust(Sigma-Aldrich) 폴리머라제가 들어있는 10 μL의 반응물 속에서 PCR 매트릭스로서 사용할 수 있다.
모든 작제를 위해 사용된 프라이머의 목록(명칭/DNA 서열)은 하기에 상세히 기술된다:
△catB△fwd: TGTTATGGATTATAAGCGGCTCGAGGACGTCAAACCATGTTAATCATTGC
△catB△rev: AATCTATCACTGATAGGGACTCGAGCAATTTCACCAAAGAATTCGCTAGC
△catB△gRNA△rev AATCTATCACTGATAGGGACTCGAGGGGCAAAAGTGTAAAGACAAGCTTC
RH076: CATATAATAAAAGGAAACCTCTTGATCG
RH077: ATTGCCAGCCTAACACTTGG
RH001: ATCTCCATGGACGCGTGACGTCGACATAAGGTACCAGGAATTAGAGCAGC
RH002: TCTATCTCCAGCTCTAGACCATTATTATTCCTCCAAGTTTGCT
RH003: ATAATGGTCTAGAGCTGGAGATAGATTATTTGGTACTAAG
RH004: TATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGAAGCGCTTATTATTGCATTAGC
pEX-fwd: CAGATTGTACTGAGAGTGCACC
pEX-rev: GTGAGCGGATAACAATTTCACAC
pEC750C-fwd: CAATATTCCACAATATTATATTATAAGCTAGC
M13-rev: CAGGAAACAGCTATGAC
RH010: CGGATATTGCATTACCAGTAGC
RH011: TTATCAATCTCTTACACATGGAGC
RH025: TAGTATGCCGCCATTATTACGACA
RH134: GTCGACGTGGAATTGTGAGC
pNF2△fwd: GGGCGCACTTATACACCACC
pNF2△rev: TGCTACGCACCCCCTAAAGG
RH021 ACTTGGGTCGACCACGATAAAACAAGGTTTTAAGG
RH022 TACCAGGGATCCGTATTAATGTAACTATGATATCAATTCTTG
aad9-fwd2 ATGCATGGTCCCAATGAATAGGTTTACACTTACTTTAGTTTTATGG
aad9-rev ATGCGAGTTAACAACTTCTAAAATCTGATTACCAATTAG
RH031 ATGCATGGATCCCAATGAATAGGTTTACACTTACTTTAGTTTTATGG
RH032 ATGCGAGAGCTCAACTTCTAAAATCTGATTACCAATTAG
RH138 ATGCATGGATCCGTCTGACAGTTACCAGGTCC
RH139 ATGCGAGAGCTCCAATTGTTCAAAAAAATAATGGCGGAG
RH140 ATGCATGGATCCCGGCAGTTTTTCTTTTTCGG
RH141 ATGCGAGAGCTCGGTTAAATACTAGTTTTTAGTTACAGAC
다음의 플라스미드 벡터를 제조하였다:
- 플라스미드 1번: pEX-A258-△catB (서열 번호: 17)
이는 플라스미드 pEX-A258내로 클로닝된 합성된 DNA의 △catB 단편을 함유한다. 이러한 △catB 단편은 i) 안하이드로테트라사이클린-유도성 프로모터(발현 카세트: 서열 번호: 19)의 제어 하에서 씨. 베이제린키이 DSM6423으로부터의 catB 유전자(클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 클로람페니콜 내성 유전자 - 서열 번호: 18)를 표적화하는 가이드 RNA에 대한 발현 카세트 및 ii) catB 유전자의 상부 및 하부에 위치한 400개의 상동성 bp를 포함하는 편집 매트릭스(서열 번호: 20)를 포함한다.
- 플라스미드 2번: pCas9ind-△catB(참고: 도 9 및 서열 번호: 21)
이는 제한 효소 XhoI에 의한 상이한 DNA의 분해 후 PCR에 의해 증폭되고 pCas9ind(특허원 WO2017/064439에 기술됨 - 서열 번호: 22)내로 클로닝된 △catB 단편(프라이머 △ catB △fwd 및 △catB △rev)을 함유한다.
- 플라스미드 3번: pCas9acr(참고: 도 10 및 서열 번호: 23)
- 플라스미드 4번: pEC750S-uppHR(참고: 도 11 및 서열 번호: 24)
이는 upp 유전자의 결실에 사용되고 upp 유전자의 상부 및 하부의 2개의 상동성 DNA 단편(각각의 크기: 500(서열 번호: 26) 및 377(서열 번호: 27)개 염기쌍)으로 이루어진 복구 매트릭스(서열 번호: 25)를 함유한다. 이러한 조합물은 Gibson 클로닝 시스템(New England Biolabs, Gibson assembly Master Mix 2X)을 사용하여 수득되었다. 이러한 목표를 위하여, 상부 및 하부 부분을 균주 DSM 6423(참고: Mate de Gerando et al., 2018 및 수탁 번호 PRJEB11626 (https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB11626))의 게놈성 DNA로부터 각각의 프라이머 RH001/RH002 및 RH003/RH004를 사용한 PCR로 증폭시켰다. 이러한 2개의 단편을 이후에 앞서 선형화된 pEC750S내에서 효소적 제한(SalI 및 SacI 제한 효소)에 의해 조립하였다.
- 플라스미드 5번: pEX-A2-gRNA-upp(참고: 도 12 및 서열 번호: 28)
이러한 플라스미드는 pEX-A2로 명명된 복제 플라스미드내로 삽입된 구성 프로모터(서열 번호: 30의 서열의 비-암호화 RNA)의 제어 하에서 upp 유전자(광스페이서 표적화 upp(서열 번호: 31))를 표적화하는 가이드 RNA에 대한 발현 카세트(서열 번호: 29)에 상응하는 gRNA-upp DNA 단편을 포함한다.
- 플라스미드 6번: pEC750S-△upp(참고: 도 13 및 서열 번호: 32)
이는 플라스미드 pEC750S-uppHR(서열 번호: 24)를 기반으로 하며 구성 프로모터의 제어 하에서 upp 유전자를 표적화하는 가이드 RNA에 대한 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 추가로 함유한다.
이러한 단편을 pEX-A2-gRNA-upp로 불리는 pEX-A2 내로 삽입하였다. 이후에, 삽입체를 PCR에 의해 프라이머 pEX-fwd 및 pEX-rev를 사용하여 증폭시킨 후 제한 효소 XhoI 및 NcoI으로 분해하였다. 최종적으로, 이러한 단편을 동일한 제한 효소로 우선 분해한 pEC750S-uppHR 내로 연결함으로써 클로닝하여 pEC750S-△upp를 수득하였다.
- 플라스미드 7번: pEC750C-△upp(참고: 도 14 및 서열 번호: 33)
가이드 RNA 및 복구 매트릭스를 지닌 카세트를 이후에 프라이머 pEC750C-fwd 및 M13-rev로 증폭시켰다. 앰플리콘을 효소 XhoI 및 SacI을 사용한 효소적 제한으로 분해한 후, pEC750C내로 효소적 연결에 의해 클로닝하여 pEC750C-△upp를 수득하였다.
- 플라스미드 8번: pGRNA-pNF2(참고: 도 15 및 서열 번호: 34)
이러한 플라스미드는 pEC750C를 기반으로 하며 플라스미드 pNF2(서열 번호: 118)를 표적화하는 가이드 RNA에 대한 발현 카세트를 함유한다.
- 플라스미드 9번: pCas9ind-gRNA△catB(참고: 도 23 및 서열 번호: 38).
이는 PCR(프라이머 △catB△fwd 및 △catB△gRNA△rev)에 의해 증폭되고 제한 효소 XhoI에 의한 상이한 DNA의 분해 및 연결 후 pCas9ind(특허원 WO2017/064439에 기술됨) 내로 클로닝된 catB 유전자자리를 표적화하는 가이드 RNA를 암호화하는 서열을 함유한다.
- 플라스미드 10번: pNF3(참고: 도 25 및 서열 번호: 119)
이는 복제 오리진 및 프라이머 RH021 및 RH022를 사용하여 증폭시킨, 플라스미드 복제 단백질(CIBE△p20001)을 암호화하는 유전자를 포함하는 pNF2의 일부를 함유한다. 이러한 PCR 생성물은 이후에 플라스미드 pUC19(서열 번호: 117) 내에서 SalI 및 BamHI 제한 부위에 클로닝되었다.
- 플라스미드 11번: pEC751S(참고: 도 26 및 서열 번호: 121)
이는 클로람페니콜 내성 유전자 catP(서열 번호: 70)를 제외하고는, pEC750C(서열 번호: 106)의 모든 성분을 함유한다. 후자는 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)의 aad9 유전자(서열 번호: 130)에 의해 대체되며, 이는 스텍티노마이신에 대한 내성을 부여한다. 이러한 성분을 플라스미드 pMTL007S-E1(서열 번호: 120)로부터의 프라이머 aad9-fwd2 및 aad9-rev로 증폭시키고 catP 유전자(서열 번호: 70) 대신에 pEC750C의 AvaII 및 HpaI 부위내로 클로닝하였다.
- 플라스미드 12번: pNF3S(참고: 도 27 및 서열 번호: 123)
이는 BamHI와 SacI 부위 사이에 aad9 유전자(pEC751S로부터 프라이머 RH031 및 RH032로 증폭됨)가 삽입된, pNF3의 모든 성분을 함유한다.
- 플라스미드 13번: pNF3E(참고: 도 28 및 서열 번호: 124)
이는 miniPthl 프로모터의 제어 하에서 클로스트리디움 디피실레의 ermB 유전자(서열 번호:131)가 삽입된 pNF3의 모든 성분을 함유한다. 이러한 성분은 pFW01으로부터 프라이머 RH138 및 RH139를 사용하여 증폭된 후 pNF3E의 BamHI와 SacI 사이에 클로닝된다.
- 플라스미드 14번: pNF3C(참고: 도 29 및 서열 번호: 125)
이는 클로스트리디움 페르프링겐스의 catP 유전자(서열 번호: 70)가 삽입된 pNF3의 모든 성분을 함유한다. 이러한 성분은 pEC750C로부터 프라이머 RH140 및 RH141를 사용하여 증폭되었으며 pNF3E의 BamHI와 SacI 사이에 클로닝되었다.
결과 1
씨. 베이제린키이 DSM 6423의 프로세싱
플라스미드를 이. 콜라이 dam - dcm - 균주(INV110, Invitrogen) 내로 도입시키고 복제하였다. 이는 다음의 변형과 함께 Mermelstein et al. (1993)에 의해 기술된 프로토콜에 따라, 균주 DSM 6423내로 형질전환시킴으로서 이를 도입하기 전에 pCas9ind-catB 플라스미드 상에서 Dam 및 Dcm 메틸화의 제거를 허용한다: 균주는 0.8의 OD600를 지닌, 다량의 플라스미드(20　μg)로, 및 다음의 전기천공 매개변수를 사용하여 형질전환된다: 100 Ω, 25 μF, 1400　V. 에리쓰로마이신(20 μg/mL)을 포함하는 페트리 디쉬 상에서의 스트리킹(streaking)은 pCas9ind-△catB 플라스미드를 포함하는 씨. 베이제린키이 DSM 6423 형질전환체를 생산하였다.
cas9 발현의 도입 및 균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423 △ catB 의 생산
수개의 에리쓰로마이신-내성 콜로니를 이후에 100 μL의 배양 배지(2YTG) 속에 취하고 배양 배지 속에서 104의 희석 인자가지 일련 희석하였다. 각각의 콜로니에 대해, 8 μL의 각각의 희석물을 에리쓰로마이신 및 안하이드로테트라사이클린(200 ng/mL)을 포함하는 페트리 디쉬 상에 침착시켜 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하였다.
게놈 DNA의 추출 후, 디쉬에서 성장시킨 클론내 catB 유전자의 결실을 프라이머 RH076 및 RH077를 사용하여, PCR로 입증하였다(참고: 도 16).
균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423 △ catB 의 티암페니콜에 대한 민감성의 입증
catB 유전자의 결실이 티암페니콜에 대한 새로운 민감성을 실제로 부여함을 보증하기 위하여, 아가 배지(agar medium) 상에서 비교 분석을 수행하였다. 씨. 베이제린키이 DSM 6423 및 씨. 베이제린키이 DSM 6423 catB의 예비배양물을 2YTG 배지 상에서 제조한 후 100 μL의 이러한 예비배양물을 15　mg/L의 농도에서 티암페니콜이 임의로 보충된 2YTG 아가 배지 상에 스프레딩하였다. 도 17은 초기의 씨. 베이제린키이 DSM 6423 균주만이 티암페니콜 보충된 배지상에서 성장할 수 있음을 나타낸다.
균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423 △ catB 내에서 CRISPR - Cas9 툴에 의한 upp 유전자의 결실
균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423 △catB의 클론을 dam 및 dcm 메틸트랜스퍼라제에 의해 인식된 모티프에서 메틸화를 가지지 않은 pCas9acr 벡터(dam - dcm - 유전형을 지닌 에스케리키아 콜라이 박테리아으로부터 제조)로 우선 형질전환시켰다. 균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423내에 유지된 플라스미드 pCas9acr의 존재의 입증은 프라이머 RH025 및 RH134를 지닌 콜로니 PCR로 입증하였다.
에리쓰로마이신-내성 클론을 이후에 먼저 탈메틸화된 pEC750C-△upp로 형질전환시켰다. 이렇게 수득된 콜로니를 에리쓰모마이신(20　μg/mL), 티암페니콜(15　μg/mL) 및 락토즈(40 mM)를 포함하는 배지 상에서 선택하였다.
이후에 수개의 이러한 콜로니를 100 μL의 배양 배지(2YTG)에 재현탁시키고 일련의 배양 배지(104의 희석 인자까지) 일련 희석시켰다. 5 마이크로리터의 각각의 희석물을 에리쓰로마이신, 티암페니콜 및 안하이드로테트라사이클린(200 ng/mL)을 포함하는 페트리 디쉬 위에 두었다(참고: 도 18).
각각의 클론에 대해, 2개의 aTc-내성 콜로니를 upp 유전자자리를 증폭시키기 위한 프라이머를 사용한 콜로니 PCR로 시험하였다(참고: 도 19).
균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423 △ catB 내에서 CRISPR - Cas9 툴에 의한 천연 pNF2 플라스미드의 결실
균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423 △catB의 클론을 우선 Dam 및 Dcm 메틸트랜스퍼라제(dam - dcm 유전형을 지닌 에스케리치아 콜라이 박테리아으로부터 제조)에 의해 인식된 모티프에서 메틸화를 갖지 않는 벡터 pCas9ind로 형질전환시켰다. 균주 씨. 베이제린키이 DSM6423 내에서 플라스미드 pCas9ind의 존재는 프라이머 pCas9ind △fwd(서열 번호: 42) 및 pCas9ind △rev(서열 번호: 43)를 사용한 PCR로 입증하였다(참고: 도 20).
이후에 에리쓰로마이신-내성 클론을 사용하여 dam - dcm - 유전형을 지닌 에스케리키아 콜라이 박테리아으로부터 제조된 pGRNA-pNF2를 형질전환시켰다.
에리쓰로마이신(20 μg/mL) 및 티암페니콜(15 μg/mL)을 포함하는 배지 상에서 수득된 몇개의 콜로니를 배양 배지 속에서 재현탁시키고 104의 희석인자로 일련 희석하였다. 8 마이크로리터의 각각의 희석물을 에리쓰로마이신, 티암페니콜 및 안하이드로테트라사이클린(200 ng/mL)을 포함하는 페트리 디쉬에 두어 CRISPR/Cas9 시스템의 발현을 유도하였다.
천연 pNF2 플라스미드의 부재는 프라이머 pNF2△fwd(서열 번호: 39) 및 pNF2△rev(서열 번호: 40)를 사용한 PCR로 입증하였다(참고: 도 21).
결론
이러한 작업 동안, 본 발명자는 균주클로스트리디움 베이제린키이 DSM 6423내에 상이한 플라스미드를 도입하여 유지시키는데 성공하였다. 이들은 단일 플라스미드의 사용을 기반으로 하는 CRISPR-Cas9 툴을 사용하여 catB 유전자를 제거할 수 있었다. 수득된 재조합 균주의 티암페니콜에 대한 민감성을 아가 배지에서 시험하여 확인하였다.
이러한 결실은 이들이 특허원 FR1854835에 기술된 2개의 플라스미드를 필요로 하는 CRISPR-Cas9 툴을 보다 효과적으로 사용하도록 하였다. 2개의 실시예를 수행하여 본 출원의 목적: upp 유전자의 결실 및 균주 클로스트리디움 베이제린키이DSM 6423에 대해 필수적이지 않은 천연 플라스미드의 제거를 입증하였다.
결과 2
씨. 베이제린키이 균주의 형질전환
균주 이. 콜라이 NEB 10-베타내에서 제조된 플라스미드를 또한 사용하여 균주 씨. 베이제린키이 NCIMB 8052를 형질전환시켰다. 대조적으로, 씨. 베이제린키이 DSM 6423의 경우, 플라스미드를 우선 이. 콜라이 dam - dcm - 균주(INV110, Invitrogen)내로 도입하고 복제시켰다. 이는 균주 DSM 6423내로 형질전환시킴으로써 이들의 도입 전에 목적한 플라스미드 상에 Dam 및 Dcm 메틸화의 제거를 허용한다.
형질전환은 또한 각각의 균주에 대해, 즉, 다음의 변형과 함께 Mermelstein et al. 1992에 기술된 프로토콜에 따라 유사하에 수행한다: 균주를 0.6 내지 0.8의 OD600로 다량의 플라스미드 (5-20 μg)를 사용하여 형질전환시키며, 전기천공 매개변수는 100 Ω, 25 μF, 1400 V이다. 2YTG내에서 3시간 재생 후, 박테리아를 목적한 항생제(에리쓰로마이신: 20-40 μg/mL; 티암페니콜: 15 μg/mL; 스펙티노마이신: 650 μg/mL)을 포함하는 페트리 디쉬(2YTG 아가) 상에서 스트리킹한다.
씨. 베이제린키이 DSM 6423 균주의 형질전환 효능의 비교
형질전환을 다음의 씨. 베이제린키이 균주: DSM 6423 야생형, DSM 6423 catB 및 DSM 6423 △ catB △ pNF2에서 생물학적 복제를 수행하였다(도 30). 이러한 목적을 위해, pCas9ind 벡터가 양호한 형질전환 효능을 허용하지 않으므로 박테리아를 변형시키는데 사용하기에 특히 어려운, pCas9ind 벡터를 사용하였다. 이는 또한 이에 대해 모든 3개의 균주가 민감성인 항생제인, 에리쓰로마이신에 대한 균주 내성을 제공하는 유전자를 함유한다.
결과는 천연의 pNF2 플라스미드의 손실로 인한 약 15 내지 20의 인자까지 형질전환 효능에 있어서의 증가를 나타낸다.
형질전환 효능을 또한 플라스미드 pEC750C에 대해 시험하였으며, 이는 균주 DSM 6423 catB 및 DSM 6423 △catB △pNF2에서만 티암페니콜 내성을 부여하는데, 이는 야생형 균주가 이러한 항생제에 대해 내성이기 때문이다(도 31). 이러한 플라스미드의 경우, 형질전환 효능에 있어서의 획득은 보다 더 명백하다(약 2000 인자까지 증가).
pNF3 플라스미드와 다른 플라스미드의 형질전환의 비교
천연의 pNF2 플라스미드의 복제 오리진을 포함하는 플라스미드의 형질전환 효능을 측정하기 위하여, 플라스미드 pNF3E 및 pNF3C를 균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423 △ catB △ pNF2내로 도입하였다. 에리쓰로마이신 또는 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 벡터의 사용은 벡터의 형질전환 효능을 내성 유전자의 특성에 따라 비교되도록 한다. 플라스미드 pFW01 및 pEC750C를 또한 형질전환하였다. 이러한 2개의 플라스미드는 상이한 항생제(에리쓰로마이신 및 티암페니콜 각각)에 대한 내성 유전자를 함유하며 일반적으로 씨. 베이제린키이 및 씨. 아세토부틸리쿰을 형질전환하는데 사용하였다.
도 32에 나타낸 바와 같이, pNF3을 기반으로 하는 벡터는 탁월한 형질전환 효능을 가지며, 씨. 베이제린키이 DSM 6423 △ catB △ pNF2에서 사용하기에 특히 적합하다. 특히, pNF3E(이는 에리쓰로마이신 내성 유전자를 함유한다)는 pFW01보다 유의적으로 더 높은 형질전환 효능을 나타내며, 이는 동일한 내성 유전자를 갖는다. 이러한 동일한 플라스미드는 야생형 씨. 베이제린키이 DSM 6423 균주내로 도입될 수 없었으며(생물학적 복제물내로 형질전환된 5 μg의 플라스미드를 사용하여 0개의 콜로니 수득), 이는 천연 pNF2 플라스미드의 존재의 영향을 입증한다.
다른 균주/종에서 pNF3 플라스미드의 형질전환능의 입증
다른 용매생성 클로스트리디움 균주내에서 이러한 새로운 플라스미드를 사용하는 가능성을 나타내기 위하여, 본 발명자는 ABE 균주 씨. 베이제린키이 NCIMB 8052내에서 플라스미드 pFW01, pNF3E 및 pNF3S의 형질전환 효능의 비교 분석을 수행하였다(도 33). 균주 NCIMB 8052는 티암페니콜에 대해 천연적으로 내성이므로, 스펙티노마이신에 대한 내성을 부여하는 pNF3S를 pNF3C 대신에 사용하였다.
결과는 균주 NCIMB 8052가 pNF3을 기반으로 한 플라스미드로 형질전환될 수 있음을 나타내며, 이는 이러한 벡터가 광범위한 의미에서 씨. 베이제린키이 종에 적용가능함을 입증한다.
pNF3을 기반으로 한 합성 벡터의 세트의 적용가능성을 또한 참고 균주 씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792에서 시험하였다. 따라서, 형질전환 시험은 플라스미드 pNF3C를 사용한 이러한 균주의 형질전환 가능성(플라스미드 pEC750C에 대해 120 콜로니/μg와 비교하여 형질전환된 DNA의 μg 당 관찰된 3개의 콜로니의 형질전환 효능)을 나타내었다.
출원 FR18/73492에 기술된 유전 툴을 사용한 pNF3 플라스미드의 적합성(compatibility)의 입증
특허원 FR18/73492는 catB 균주 및 에리쓰로마이신 내성 유전자 및 티암페니콜 내성 유전자의 사용을 필요로 하는 2개-플라스미드 CRISPR/Cas9 시스템의 용도를 기술하고 있다. pNF3 플라스미드의 새로운 세트의 이점을 입증하기 위하여, 벡터 pNF3C를 pCas9acr 플라스미드를 이미 포함하는 균주 catB내에서 형질전환시켰다. 2회 수행된 형질전환은 0.625 ± 0.125개의 콜로니/μg DNA(평균 ± 표준 오차)의 형질전환 효능을 나타내었으며, 이는 pNF3C를 기반으로 한 벡터가 catB 균주내에서 pCas9acr와 함께 사용될 수 있음을 입증한다.
이러한 결과와 동반하여, 이러한 복제 오리진을 포함하는 플라스미드 pNF2의 일부(서열 번호: 118)를 성공적으로 재사용하여 요구하는 바와 같이 변형가능한, 셔틀 벡터(shuttle vector)의 새로운 세트(서열 번호: 119, 123, 124 및 125)를 생성함으로써 특히 이. 콜라이내에서 이들의 복제뿐만 아니라 씨. 베이제린키이 DSM 6423 내로 이들의 재도입을 허용할 수 있었다. 이러한 새로운 벡터는 예를 들면, 씨. 베이제린키이 DSM 6423 및 이의 유도체내에서, 특히 2개의 상이한 핵산을 포함하는 CRISPR/Cas9 툴을 사용하는, 유전 편집을 위한 유리한 형질전환 효능을 갖는다.
이러한 새로운 벡터는 또한 다른 씨. 베이제린키이 균주(NCIMB 8052), 및 클로스트리디움 종(특히 씨. 아세토부틸리쿰)내에서 성공적으로 시험되어, 필룸 피르미쿠테스의 다른 유기체내에서 이들의 적용능을 입증하였다. 시험은 또한 바실러스에서 수행한다.
결론
이러한 결과는 천연의 pNF2 플라스미드의 억제가 이를 함유한 박테리아의 형질전환 빈도를 유의적으로 증가시킴을 나타낸다(pFW01의 경우 약 15의 인자까지 및 pEC750C의 경우 약 2000의 인자까지). 이러한 결과는 형질전환하기 어려운 것으로 알려진 클로스트리디움 속의 박테리아의 경우, 및 특히 천연적으로 낮은 형질전환 효능(5개 미만의 콜로니/μg의 플라스미드)으로 고생하는 균주 씨. 베이제린키이 DSM 6423의 경우 특히 흥미롭다.
REFERENCES
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Figure pat00004
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Figure pat00006
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<213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RH025 <400> 15 tagtatgccg ccattattac gaca 24 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RH134 <400> 16 gtcgacgtgg aattgtgagc 20 <210> 17 <211> 3658 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pEX-A258-deltacatB <400> 17 ctcgagctgc agcaaaaaaa gcaccgactc ggtgccactt tttcaagttg ataacggact 60 agccttattt taacttgcta tttctagctc taaaactgtg gtctctcttt tcgttgatgg 120 tggaatgata agggtttgca ccttaatttc tcctattgag aaaatcgtct cttctcagac 180 gtcaaaccat gttaatcatt gcttttatca aaaataggat ccactctatc attgatagag 240 tttgaaactc tatcattgat agagtataat atctttgttc atgtacatca tgctatctgt 300 gagttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa 360 gtggcaccga gtcggtgctt tttttgaagc ttgtctttac acttttgccc attaattttt 420 gagttcctta tttttaggga gcttttatta tttttatcat gaaaatttca taaaatactc 480 ataaactaag gatgtcttca taatcagatt agtactccat tttcaatcca tttaatctgg 540 gaatatgata ttttaattac gtattattta agatatatta acgtgtaata taataccccg 600 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caatctaaaa atggatatgc 1080 tggatatata gacggtggag caagtcaaga agagttttat aaatttataa agcctatttt 1140 agaaaaaatg gatggaactg aagaattact tgttaaactt aacagagaag atttacttag 1200 aaaacaaaga acttttgata atggttcaat tcctcaccaa attcatttag gagaattaca 1260 tgctatacta agaagacaag aagattttta tccatttctt aaagataata gagaaaaaat 1320 tgaaaaaatt ttaactttta gaataccata ttatgtagga ccacttgcaa ggggaaattc 1380 aagatttgca tggatgacta gaaaatcaga agaaactata accccgtgga attttgaaga 1440 agtagtagat aaaggagcta gtgctcaatc atttatagaa agaatgacaa attttgataa 1500 gaatcttcct aacgaaaagg ttttgccaaa gcatagcctt ctttatgagt attttacagt 1560 ttataatgag cttactaaag taaaatacgt tacagaagga atgagaaaac cagcattttt 1620 gtctggtgaa caaaagaaag caatagtaga cctattattt aaaacaaata ggaaggttac 1680 cgtaaagcaa cttaaagaag attacttcaa aaaaattgaa tgctttgata gtgttgaaat 1740 atcaggagtt gaagatagat ttaatgcttc acttggtaca tatcacgatc tcttaaaaat 1800 tataaaagat aaggattttt tagataatga agaaaatgaa gatattcttg aagatatagt 1860 attaacattg acactttttg aagatagaga aatgatagaa gaaagattaa aaacatatgc 1920 acatcttttt gatgataagg ttatgaagca acttaaaaga agaagatata caggttgggg 1980 acgtttgtca agaaagctaa ttaatggtat tagagataaa caatcaggaa agactattct 2040 cgattttctt aaatcagatg gatttgctaa tagaaacttt atgcaattaa ttcatgatga 2100 ttctcttact ttcaaagagg atattcaaaa ggctcaagtt tctggacaag gcgatagctt 2160 acacgaacac attgctaacc ttgcagggag ccccgctatc aaaaaaggaa ttttacaaac 2220 agttaaagtt gtagatgaac ttgttaaagt tatgggaaga cacaaacctg agaatatagt 2280 tatagaaatg gccagagaaa atcaaacaac acaaaaagga caaaaaaatt ctagagagag 2340 aatgaagaga attgaagaag gaataaaaga gctaggatca caaatattaa aagaacatcc 2400 agttgaaaat actcaattgc aaaatgaaaa gttatatttg tattacttac aaaatggaag 2460 agatatgtat gttgatcaag aactcgatat taatagatta agtgactatg atgttgatca 2520 tattgttcct caatcatttt taaaagatga ttcaatcgat aacaaagtat taactagatc 2580 agataaaaat agaggaaagt cagataatgt accatctgaa gaagttgtta aaaaaatgaa 2640 gaactattgg agacaacttt taaatgcaaa gctaattaca caaagaaaat ttgacaattt 2700 aacaaaagca gaaagaggag gattaagcga attagacaaa 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Clostridium beijerinckii <400> 51 Met Asn Phe Asn Leu Ile Asp Ile Asn Asn Trp Ser Arg Lys Pro Tyr 1 5 10 15 Phe Glu His Tyr Leu Asn Asn Val Lys Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala 20 25 30 Asn Ile Glu Ile Thr Asp Leu Leu Tyr Glu Ile Lys Leu Lys Asn Ile 35 40 45 Lys Phe Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Met Ile Ala Asn Val Val Asn Asn 50 55 60 His Lys Glu Phe Arg Ile Cys Phe Asp His Glu Gly Ser Leu Gly Tyr 65 70 75 80 Trp Asp Ser Met Asn Pro Ser Tyr Thr Ile Phe His Lys Glu Asn Glu 85 90 95 Thr Phe Ser Ser Ile Trp Thr Glu Tyr Asn Glu Ser Phe Leu Arg Phe 100 105 110 Tyr Ser Asp Tyr Leu Asp Asp Ile Lys Asn Tyr Gly Asn Ile Met Lys 115 120 125 Phe Thr Pro Lys Ser Asn Glu Pro Asp Asn Thr Phe Pro Val Ser Ser 130 135 140 Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Val Tyr Asn Glu 145 150 155 160 Gly Thr Tyr Leu Ile Pro Ile Phe Thr Ala Gly Lys Tyr Phe Lys Gln 165 170 175 Gly Asn Lys Ile Phe Ile Pro Ile Ser Ile Gln Val His His Ala Ile 180 185 190 Cys Asp Gly Tyr His Ala Ser Arg Phe Ile Asn Glu Met Gln Glu Leu 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<220> <223> Desnuesiella massiliensis <400> 60 Met Lys Phe Asn Leu Ile Asp Ile Glu His Trp Asn Arg Lys Pro Tyr 1 5 10 15 Phe Glu His Tyr Leu Asn Ser Val Arg Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala 20 25 30 Asn Ile Glu Ile Thr Asn Leu Leu His Asp Ile Lys Leu Lys Lys Leu 35 40 45 Lys Leu Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Ile Ile Ala Thr Val Val Asn Asn 50 55 60 His Glu Glu Phe Arg Thr Cys Phe Tyr Glu Asn Gly Asn Leu Gly Tyr 65 70 75 80 Trp Asp Ser Met Ser Pro Ser Tyr Thr Ile Phe His Lys Asp Asn Glu 85 90 95 Thr Phe Ser Glu Ile Trp Ser Glu Tyr Asp Glu Ser Phe Ser Cys Phe 100 105 110 Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Asp Ile Lys Asn Tyr Gly Asp Ile Met Arg 115 120 125 Phe Thr Pro Lys Leu Asn Glu Pro Ala Asn Thr Phe Pro Ile Ser Cys 130 135 140 Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Val Tyr Asn Asp 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Leu Val Pro Ile Phe Thr Ile Gly Lys Tyr Phe Glu Gln 165 170 175 Asn Asn Lys Ile Phe Ile Pro Met Ser Ile Gln Val His His Ala Val 180 185 190 Cys Asp Gly Tyr His Thr Ser Arg Phe Ile Asn Glu Val 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HMP27 <400> 61 Met Lys Phe Asn Leu Ile Asp Thr Glu His Trp Asn Arg Lys Pro Tyr 1 5 10 15 Phe Glu His Tyr Leu Asn Ser Val Arg Cys Thr Tyr Ser Ile Thr Ala 20 25 30 Asn Ile Glu Ile Thr Asn Leu Leu His Asp Ile Lys Gln Lys Lys Leu 35 40 45 Lys Leu Tyr Pro Thr Phe Ile Tyr Ile Ile Ala Thr Val Val Asn Thr 50 55 60 His Lys Glu Phe Arg Thr Cys Phe Asp Glu Ser Gly Asn Leu Gly Tyr 65 70 75 80 Trp Asp Ser Met Ser Pro Ser Tyr Thr Ile Phe His Lys Asp Asn Glu 85 90 95 Thr Phe Ser Ser Ile Trp Thr Glu Tyr Asp Lys Ser Phe Ser Cys Phe 100 105 110 Tyr Ser Lys Tyr Leu His Asp Ile Lys Asn Tyr Gly Asp Ile Met Ser 115 120 125 Phe Thr Pro Lys Leu Asn Glu Pro Ala Asn Thr Phe Pro Ile Ser Cys 130 135 140 Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Ile Tyr Asn Asp 145 150 155 160 Gly Thr Tyr Leu Val Pro Ile Phe Thr Ile Gly Lys Tyr Phe Lys Gln 165 170 175 Ala Asp Lys Ile Leu Ile Pro Ile Ser Ile Gln Val His His Ala Val 180 185 190 Cys Asp Gly Tyr His Thr Ser Arg Phe Ile Asn Glu Val Gln Glu Leu 195 200 205 Ile Leu 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BL8 <400> 67 Met Lys Phe Asn Leu Ile Asp Ile Asp Gln Trp Asp Arg Lys Pro Tyr 1 5 10 15 Phe Glu His Tyr Phe Asn Ser Val Lys Cys Thr Tyr Ser Ile Thr Ala 20 25 30 Asn Ile Glu Ile Thr Asn Leu Leu Lys Asp Ile Lys Ile Thr Lys Leu 35 40 45 Lys Leu Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Ile Ile Ala Thr Val Ile Asn Asn 50 55 60 His Glu Glu Phe Arg Thr Cys Phe Asp Glu Asn Asn Asn Leu Gly Tyr 65 70 75 80 Trp Asp Ser Met Ser Pro Asn Tyr Thr Ile Phe His Glu Glu Thr Lys 85 90 95 Thr Phe Ser Asn Ile Trp Thr Glu Tyr Asp Lys Ser Phe Ser Gly Phe 100 105 110 Tyr Asn Lys Tyr Val Glu Asp Asn Lys Asn Tyr Gly Asn Ile Met Asn 115 120 125 Phe Asp Pro Lys Leu Asn Glu Pro Ala Asn Thr Phe Pro Ile Ser Cys 130 135 140 Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Ile Gln Asp His 145 150 155 160 Gly Thr Tyr Leu Thr Pro Ile Phe Thr Leu Gly Lys Tyr Phe Glu Glu 165 170 175 Asn Asn Lys Val Phe Ile Pro Met Ser Ile Gln Val His His Ala Val 180 185 190 Cys Asp Gly Tyr His Thr Ser Arg Phe Ile Asn Glu Val Gln Glu Leu 195 200 205 Ala Ser 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tgaccactac 60 tttgcaagtg taccttgtac atacagcatg accgttaaag tggatatcac acaaataaag 120 gaaaagggaa tgaaactata tcctgcaatg ctttattata ttgcaatgat tgtaaaccgc 180 cattcagagt ttaggacggc aatcaatcaa gatggtgaat tggggatata tgatgagatg 240 ataccaagct atacaatatt tcacaatgat actgaaacat tttccagcct ttggactgag 300 tgtaagtctg actttaaatc atttttagca gattatgaaa gtgatacgca acggtatgga 360 aacaatcata gaatggaagg aaagccaaat gctccggaaa acatttttaa tgtatctatg 420 ataccgtggt caaccttcga tggctttaat ctgaatttgc agaaaggata tgattatttg 480 attcctattt ttactatggg gaaatattat aaagaagata acaaaattat acttcctttg 540 gcaattcaag ttcatcacgc agtatgtgac ggatttcaca tttgccgttt tgtaaacgaa 600 ttgcaggaat tgataaatag ttaa 624 <210> 70 <211> 624 <212> DNA <213> Clostridium perfringens <400> 70 atggtatttg aaaaaattga taaaaatagt tggaacagaa aagagtattt tgaccactac 60 tttgcaagtg taccttgtac atacagcatg accgttaaag tggatatcac acaaataaag 120 gaaaagggaa tgaaactata tcctgcaatg ctttattata ttgcaatgat tgtaaaccgc 180 cattcagagt ttaggacggc aatcaatcaa gatggtgaat tggggatata tgatgagatg 240 ataccaagct atacaatatt tcacaatgat actgaaacat tttccagcct ttggactgag 300 tgtaagtctg actttaaatc atttttagca gattatgaaa gtgatacgca acggtatgga 360 aacaatcata gaatggaagg aaagccaaat gctccggaaa acatttttaa tgtatctatg 420 ataccgtggt caaccttcga tggctttaat ctgaatttgc agaaaggata tgattatttg 480 attcctattt ttactatggg gaaatattat aaagaagata acaaaattat acttcctttg 540 gcaattcaag ttcatcacgc agtatgtgac ggatttcaca tttgccgttt tgtaaacgaa 600 ttgcaggaat tgataaatag ttaa 624 <210> 71 <211> 3897 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAD7 optimis? <400> 71 ctcgagtccc tatcagtgat agattgaaac tctatcattg atagagtata atatctttgt 60 tcattagagc gataaacttg aatttgagag ggaacttaga tgaacaacgg cacaaataat 120 tttcagaact tcatagggat atcaagtttg cagaaaacgt taagaaatgc tttaataccc 180 acggaaacca cgcaacagtt catagttaag aacggaataa ttaaagaaga tgagttaaga 240 ggcgagaaca gacagatttt aaaagatata atggatgact actacagagg attcatatct 300 gagactttaa gttctattga tgacatagat tggactagct tattcgaaaa aatggaaatt 360 cagttaaaaa atggtgataa taaagatacc ttaattaagg aacagacaga gtatagaaaa 420 gcaatacata aaaaatttgc gaacgacgat agatttaaga acatgtttag cgccaaatta 480 attagtgaca tattacctga atttgttata cacaacaata attattcggc atcagagaaa 540 gaggaaaaaa cccaggtgat aaaattgttt tcgagatttg cgactagctt taaagattac 600 ttcaagaaca gagcaaattg cttttcagcg gacgatattt catcaagcag ctgccataga 660 atagttaacg acaatgcaga gatattcttt tcaaatgcgt tagtttacag aagaatagta 720 aaatcgttaa gcaatgacga tataaacaaa atttcgggcg atatgaaaga ttcattaaaa 780 gaaatgagtt tagaagaaat atattcttac gagaagtatg gggaatttat tacccaggaa 840 ggcattagct tctataatga tatatgtggg aaagtgaatt cttttatgaa cttatattgt 900 cagaaaaata aagaaaacaa aaatttatac aaacttcaga aacttcacaa acagattcta 960 tgcattgcgg acactagcta tgaggttccg tataaatttg aaagtgacga ggaagtgtac 1020 caatcagtta acggcttcct tgataacatt agcagcaaac atatagttga aagattaaga 1080 aaaataggcg ataactataa cggctacaac ttagataaaa tttatatagt gtccaaattt 1140 tacgagagcg ttagccaaaa aacctacaga gactgggaaa caattaatac cgccttagaa 1200 attcattaca ataatatatt gccgggtaac ggtaaaagta aagccgacaa agtaaaaaaa 1260 gcggttaaga atgatttaca gaaatccata accgaaataa atgaactagt gtcaaactat 1320 aagttatgca gtgacgacaa cataaaagcg gagacttata tacatgagat tagccatata 1380 ttgaataact ttgaagcaca ggaattgaaa tacaatccgg aaattcacct agttgaatcc 1440 gagttaaaag cgagtgagct taaaaacgtg ttagacgtga taatgaatgc gtttcattgg 1500 tgttcggttt ttatgactga ggaacttgtt gataaagaca acaattttta tgcggaatta 1560 gaggagattt acgatgaaat ttatccagta attagtttat acaacttagt tagaaactac 1620 gttacccaga aaccgtacag cacgaaaaag attaaattga actttggaat accgacgtta 1680 gcagacggtt ggtcaaagtc caaagagtat tctaataacg ctataatatt aatgagagac 1740 aatttatatt atttaggcat atttaatgcg aagaataaac cggacaagaa gattatagag 1800 ggtaatacgt cagaaaataa gggtgactac aaaaagatga tttataattt gttaccgggt 1860 cccaacaaaa tgataccgaa agttttcttg agcagcaaga cgggggtgga aacgtataaa 1920 ccgagcgcct atatactaga ggggtataaa cagaataaac atataaagtc ttcaaaagac 1980 tttgatataa ctttctgtca tgatttaata gactacttca aaaactgtat tgcaattcat 2040 cccgagtgga aaaacttcgg ttttgatttt agcgacacca gtacttatga agacatttcc 2100 gggttttata gagaggtaga gttacaaggt tacaagattg attggacata cattagcgaa 2160 aaagacattg atttattaca ggaaaaaggt caattatatt tattccagat atataacaaa 2220 gatttttcga aaaaatcaac cgggaatgac aaccttcaca ccatgtactt aaaaaatctt 2280 ttctcagaag aaaatcttaa ggatatagtt ttaaaactta acggcgaagc ggaaatattc 2340 ttcaggaaga gcagcataaa gaacccaata attcataaaa aaggctcgat tttagttaac 2400 agaacctacg aagcagaaga aaaagaccag tttggcaaca ttcaaattgt gagaaaaaat 2460 attccggaaa acatttatca ggagttatac aaatacttca acgataaaag cgacaaagag 2520 ttatctgatg aagcagccaa attaaagaat gtagtgggac accacgaggc agcgacgaat 2580 atagttaagg actatagata cacgtatgat aaatacttcc ttcatatgcc tattacgata 2640 aatttcaaag ccaataaaac gggttttatt aatgatagga tattacagta tatagctaaa 2700 gaaaaagact tacatgtgat aggcattgat agaggcgaga gaaacttaat atacgtgtcc 2760 gtgattgata cttgtggtaa tatagttgaa cagaaaagct ttaacattgt aaacggctac 2820 gactatcaga taaaattaaa acaacaggag ggcgctagac agattgcgag aaaagaatgg 2880 aaagaaattg gtaaaattaa agagataaaa gagggctact taagcttagt aatacacgag 2940 atatctaaaa tggtaataaa atacaatgca attatagcga tggaggattt gtcttatggt 3000 tttaaaaaag ggagatttaa ggttgaaaga caagtttacc agaaatttga aaccatgtta 3060 ataaataaat taaactattt agtatttaaa gatatttcga ttaccgagaa tggcggttta 3120 ttaaaaggtt atcagttaac atacattcct gataaactta aaaacgtggg tcatcagtgc 3180 ggctgcattt tttatgtgcc tgctgcatac acgagcaaaa ttgatccgac caccggcttt 3240 gtgaatatat ttaaatttaa agacttaaca gtggacgcaa aaagagaatt cattaaaaaa 3300 tttgactcaa ttagatatga cagtgaaaaa aatttattct gctttacatt tgactacaat 3360 aactttatta cgcaaaacac ggttatgagc aaatcatcgt ggagtgtgta tacatacggc 3420 gtgagaataa aaagaagatt tgtgaacggc agattctcaa acgaaagtga taccattgac 3480 ataaccaaag atatggagaa aacgttggaa atgacggaca ttaactggag agatggccac 3540 gatcttagac aagacattat agattatgaa attgttcagc acatattcga aattttcaga 3600 ttaacagtgc aaatgagaaa ctccttgtct gaattagagg acagagatta cgatagatta 3660 atttcacctg tattaaacga aaataacatt ttttatgaca gcgcgaaagc gggggatgca 3720 cttcctaagg atgccgatgc 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cgctttagag tatggtgaat taaagatgga gcgggcttat 60 cgattctcag aggatattga aggctactgc actggtaagg atgcatttgt aaagcaacta 120 gaaaaggatg ctttgcgatg gtggcaaact gtctgttagg aggttattct caaaggattg 180 caagaagcag ttgaggataa tccgtataac taactattac acattcttaa cattgctggt 240 ttgtatcggt agaataacac gaattaacaa aggatatatt ttgtagtagc aagtgtattt 300 gttttatatt ctatgaacct at 322 <210> 75 <211> 1368 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 75 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val 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1620 aataaaggaa tgtggtgact ttttgcagat gttatctgat ttaaaccttg aaaattcgaa 1680 actgcataga gcaagttttt gtggtaacag attttgtcct atgtgtagct ggcgtattgc 1740 ttgtaaggat agtttggaaa tatctattct catggagcat ttacgcaaag aggaaagcaa 1800 agaatttatc tttttgacct taacaactcc aaatgtgaaa ggtgcggacc ttgataattc 1860 cataaaagca tacaataaag catttaaaaa gttaatggaa cgcaaagagg tcaagagcat 1920 agtaaaaggc tacataagaa agctagaagt aacctataat ttggacaaga gttccaaatc 1980 atataatact tatcacccac atttccatgt ggtactagca gtcaatagaa gttactttaa 2040 aaagcaaaat ctatatataa accatcatag atggcttagt ttgtggcaag agtcaactgg 2100 tgattattcg ataactcaag ttgatgtaag aaaggctaaa attaacgatt ataaagaggt 2160 ttatgagctt gctaagtatt cggctaagga ttccgactat ttaatcaata gagaagtgtt 2220 tacggtattc tacaaatctt taaagggtaa acaggtactt gtatttagtg gattatttaa 2280 agacgctcat aaaatgtata agaatggaga gctagatctg tataagaagt tggatactat 2340 cgaatatgct tatatggtaa gttataactg gcttaaaaag aagtatgata cttcaaatat 2400 tagagaatta actgaggaag aaaagcagaa attcaataaa aatttaatcg aagatgtgga 2460 tattgagtag gtgggattat atctcacctt ttttattgtc ttttcatgtt gaaattttga 2520 cgcttaatgc atgaagtatt gacaagttta aaaattacgg tttttaatcc ttagttgatt 2580 agcaggatta tggccggaat gctccgtcca gtcctgttaa ggaattaaaa ttccctaaaa 2640 cccttggcta tgatttatag cgagaatcgt caattaaaaa tttaataggt gctatgaaag 2700 tcgattaata attaatttta aaatgcaata tgaaacataa ttacaagaat ttgactttta 2760 atacaagaat tgatatcata gttacattaa tac 2793 <210> 127 <211> 2793 <212> DNA <213> Clostridium beijerinckii <400> 127 cacgataaaa caaggtttta aggataagaa aagtcatgag atttatagta aatcttgtga 60 ctttttttat tgaatagtag agagagttcg gaagtataac acgctatatt cttgatattt 120 ttagaatagc aagcattgga tttgtcctga cactttccca aaaattaagg agttattcct 180 taaaccaaaa agattaatgt gggaacaaat ttagtgtatc catttttgaa gggcgcactt 240 atacaccacc aaaatggtgt gtgcgaaatc tttaaaaaag atttatcaaa aagctttttt 300 aaagctggga catttagaaa atcaataatg ttttttgccc aatacgctag tcttaaaatc 360 tgcaaggttg ataactattt agtcccaggt attagaatgg ggcatatata tacaaagtat 420 atatatgcgt aaatatatgt gggactgtgg 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Pro Leu Leu 100 105 110 Lys Trp Lys His Leu Lys Leu Asn Leu Lys Asn Val Glu Asp Gly Asp 115 120 125 Leu Leu Asn Lys Ser Leu Asp Glu Met Ala Leu Gly Phe Lys Arg Thr 130 135 140 Met Gly Phe Lys Lys Ile Ala Lys Asn Phe Val Gly Phe Met Lys Ser 145 150 155 160 Thr Glu Ile Thr Tyr Asn Glu Lys Asp Asn Ser Tyr Asn Gln His Met 165 170 175 His Val Leu Phe Cys Ser Glu Gln Thr Tyr Phe Lys Asn Phe Ile Asn 180 185 190 Asn Thr Pro Gln Glu Phe Trp Asn Lys Arg Trp Ser Lys Ala Met Lys 195 200 205 Leu Asp Tyr Asp Pro Gln Val Met Lys Leu Trp Thr Met Tyr Lys Lys 210 215 220 Glu Ile Lys Asn Tyr Ile Gln Thr Ala Leu Gln Glu Thr Ala Lys Tyr 225 230 235 240 Asp Val Lys Asp Met Asp Ser Ala Thr Ile Asp Asp Glu Lys Ser Leu 245 250 255 <210> 130 <211> 768 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 130 gtgaggagga tatatttgaa tacatacgaa caaattaata aagtgaaaaa aatacttcgg 60 aaacatttaa aaaataacct tattggtact tacatgtttg gatcaggagt tgagagtgga 120 ctaaaaccaa atagtgatct tgacttttta gtcgtcgtat ctgaaccatt gacagatcaa 180 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ttaaaactga atactcgtgt cactttaatt 240 caccaagata ttctacagtt tcaattccct aacaaacaga ggtataaaat tgttgggagt 300 attccttacc atttaagcac acaaattatt aaaaaagtgg tttttgaaag ccatgcgtct 360 gacatctatc tgattgttga agaaggattc tacaagcgta ccttggatat tcaccgaaca 420 ctagggttgc tcttgcacac tcaagtctcg attcagcaat tgcttaagct gccagcggaa 480 tgctttcatc ctaaaccaaa agtaaacagt gtcttaataa aacttacccg ccataccaca 540 gatgttccag ataaatattg gaagctatat acgtactttg tttcaaaatg ggtcaatcga 600 gaatatcgtc aactgtttac taaaaatcag tttcatcaag caatgaaaca cgccaaagta 660 aacaatttaa gtaccgttac ttatgagcaa gtattgtcta tttttaatag ttatctatta 720 tttaacggga ggaaataa 738 <210> 132 <211> 3792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized Mad7 CDS for B. subtilis <400> 132 atgaacaacg gcacaaataa ttttcagaac tttattggca tttcatcatt gcagaaaacg 60 ttaagaaatg ctttaattcc gacggaaaca acgcaacagt ttattgttaa aaacggaatt 120 attaaagaag atgaattaag aggcgaaaac agacagattt taaaagatat tatggatgac 180 tactacagag gatttatttc tgaaacatta tcatctattg atgacattga ttggacaagc 240 ttatttgaaa aaatggaaat tcagttaaaa aatggtgata ataaagatac attaattaaa 300 gaacagacag aatatagaaa agcaattcat aaaaaatttg cgaacgacga tagatttaaa 360 aacatgttta gcgccaaatt aatttcagac attttacctg aatttgttat tcataacaat 420 aattattcag catcagaaaa agaagaaaaa acacaggtga ttaaattgtt ttcaagattt 480 gcgacaagct ttaaagatta ctttaaaaac agagcaaatt gcttttcagc ggacgatatt 540 tcatcaagca gctgccatag aattgttaac gacaatgcag aaattttttt ttcaaatgcg 600 ttagtttaca gaagaattgt aaaatcatta agcaatgacg atattaacaa aatttcaggc 660 gatatgaaag attcattaaa agaaatgtca ttagaagaaa tttattctta cgaaaaatat 720 ggcgaattta ttacacagga aggcattagc ttttataatg atatttgtgg caaagtgaat 780 tcttttatga acttatattg tcagaaaaat aaagaaaaca aaaatttata caaacttcag 840 aaacttcata aacagattct gtgcattgcg gacacaagct atgaagttcc gtataaattt 900 gaatcagacg aagaagtgta ccaatcagtt aacggctttc ttgataacat tagcagcaaa 960 catattgttg aaagattaag aaaaattggc gataactata acggctacaa cttagataaa 1020 atttatattg tgtccaaatt ttacgaaagc gttagccaaa aaacatacag agactgggaa 1080 acaattaata cagccttaga aattcattac aataatattt tgccgggtaa cggtaaatca 1140 aaagccgaca aagtaaaaaa agcggttaaa aatgatttac agaaatccat tacagaaatt 1200 aatgaactgg tgtcaaacta taaattatgc tcagacgaca acattaaagc ggaaacatat 1260 attcatgaaa ttagccatat tttgaataac tttgaagcac aggaattgaa atacaatccg 1320 gaaattcatc tggttgaatc cgaattaaaa gcgtcagaac ttaaaaacgt gttagacgtg 1380 attatgaatg cgtttcattg gtgttcagtt tttatgacag aagaacttgt tgataaagac 1440 aacaattttt atgcggaatt agaagaaatt tacgatgaaa tttatccggt aatttcatta 1500 tacaacttag ttagaaacta cgttacacag aaaccgtaca gcacgaaaaa aattaaattg 1560 aactttggaa ttccgacgtt agcagacggt tggtcaaaat ccaaagaata ttctaataac 1620 gctattattt taatgagaga caatttatat tatttaggca tttttaatgc gaaaaataaa 1680 ccggacaaaa aaattattga aggtaatacg tcagaaaata aaggtgacta caaaaaaatg 1740 atttataatt tgttaccggg tccgaacaaa atgattccga aagttttttt gagcagcaaa 1800 acgggcgtgg aaacgtataa accgagcgcc tatattctgg aaggctataa acagaataaa 1860 catattaaat cttcaaaaga ctttgatatt acattttgtc atgatttaat tgactacttt 1920 aaaaactgta ttgcaattca tccggaatgg aaaaactttg gttttgattt tagcgacaca 1980 tcaacatatg aagacatttc cggcttttat agagaagtag aattacaagg ttacaaaatt 2040 gattggacat acattagcga aaaagacatt gatttattac aggaaaaagg tcaattatat 2100 ttatttcaga tttataacaa agatttttca aaaaaatcaa caggcaatga caaccttcat 2160 acaatgtact taaaaaatct tttttcagaa gaaaatctta aagatattgt tttaaaactt 2220 aacggcgaag cggaaatttt ttttagaaaa agcagcatta aaaacccgat tattcataaa 2280 aaaggctcaa ttttagttaa cagaacatac gaagcagaag aaaaagacca gtttggcaac 2340 attcaaattg tgagaaaaaa tattccggaa aacatttatc aggaattata caaatacttt 2400 aacgataaaa gcgacaaaga attatctgat gaagcagcca aattaaaaaa tgtagtggga 2460 catcatgaag cagcgacgaa tattgttaaa gactatagat acacgtatga taaatacttt 2520 cttcatatgc ctattacgat taattttaaa gccaataaaa cgggttttat taatgataga 2580 attttacagt atattgctaa agaaaaagac ttacatgtga ttggcattga tagaggcgaa 2640 agaaacttaa tttacgtgtc cgtgattgat acatgtggta atattgttga acagaaaagc 2700 tttaacattg taaacggcta cgactatcag attaaattaa aacaacagga aggcgctaga 2760 cagattgcga gaaaagaatg gaaagaaatt ggtaaaatta aagaaattaa agaaggctac 2820 ttaagcttag taattcatga aatttctaaa atggtaatta aatacaatgc aattattgcg 2880 atggaagatt tgtcttatgg ttttaaaaaa ggcagattta aagttgaaag acaagtttac 2940 cagaaatttg aaacaatgtt aattaataaa ttaaactatt tagtatttaa agatatttca 3000 attacagaaa atggcggttt attaaaaggt tatcagttaa catacattcc tgataaactt 3060 aaaaacgtgg gtcatcagtg cggctgcatt ttttatgtgc ctgctgcata cacgagcaaa 3120 attgatccga caacaggctt tgtgaatatt tttaaattta aagacttaac agtggacgca 3180 aaaagagaat ttattaaaaa atttgactca attagatatg actcagaaaa aaatttattt 3240 tgctttacat ttgactacaa taactttatt acgcaaaaca cggttatgag caaatcatca 3300 tggtcagtgt atacatacgg cgtgagaatt aaaagaagat ttgtgaacgg cagattttca 3360 aacgaatcag atacaattga cattacaaaa gatatggaaa aaacgttgga aatgacggac 3420 attaactgga gagatggcca tgatcttaga caagacatta ttgattatga aattgttcag 3480 catatttttg aaatttttag attaacagtg caaatgagaa actccttgtc tgaattagaa 3540 gacagagatt acgatagatt aatttcacct gtattaaacg aaaataacat tttttatgac 3600 agcgcgaaag cgggcgatgc acttcctaaa gatgccgatg caaatggtgc gtattgtatt 3660 gcattaaaag gcttatatga aattaaacaa attacagaaa attggaaaga agatggtaaa 3720 ttttcaagag ataaattaaa aattagcaat aaagattggt ttgactttat tcagaataaa 3780 agatatttat aa 3792 <210> 133 <211> 10469 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCas9cond <400> 133 catggataaa aagtacagta ttggtctaga cataggaact aactctgttg ggtgggctgt 60 tataacagat gaatataaag ttccatcaaa aaaatttaaa gtattaggaa acactgatag 120 acattcaata aaaaaaaact tgataggtgc tttattattc gattcaggag agactgctga 180 agctacacgt ttaaaaagaa cagctagacg tagatataca agaagaaaaa ataggatatg 240 ttatcttcaa gaaattttta gtaatgaaat ggcaaaagtt gatgattcat tctttcacag 300 actagaagaa agtttcttag ttgaagaaga taagaagcat gaaagacacc ctatttttgg 360 taatatcgta gatgaagtag catatcatga gaagtatcca actatctatc atttaagaaa 420 gaaattagtt gattctacag ataaagctga tctgagatta atatatttag ctttagctca 480 tatgattaaa tttagaggac attttttaat agaaggtgat ttaaacccag acaacagcga 540 tgtagataaa ttatttatcc aattagttca aacttataat caattattcg aagagaatcc 600 aattaatgca agtggtgtag acgctaaggc tatattatca gctagattat caaaatctag 660 aagattagaa aatctaatag ctcaacttcc tggagaaaag aaaaatggac tttttgggaa 720 cctaatagct ctctcactcg gactaacacc aaattttaaa agcaattttg atcttgctga 780 agacgcaaag ttacaactat caaaggatac atacgatgat gatttagata atttgttagc 840 tcaaataggt gatcaatatg ctgatttgtt tcttgcagca aaaaacttaa gtgatgcaat 900 tttactatca gatatactta gagtaaatac agaaataaca aaggctcctt tatcagcaag 960 tatgattaaa cgatatgatg agcatcatca agatttaaca ttattaaagg cacttgtaag 1020 acaacaatta ccagaaaaat ataaagaaat tttctttgat caatctaaaa atggatatgc 1080 tggatatata gacggtggag caagtcaaga agagttttat aaatttataa agcctatttt 1140 agaaaaaatg gatggaactg aagaattact tgttaaactt aacagagaag atttacttag 1200 aaaacaaaga acttttgata atggttcaat tcctcaccaa attcatttag gagaattaca 1260 tgctatacta agaagacaag aagattttta tccatttctt aaagataata gagaaaaaat 1320 tgaaaaaatt ttaactttta gaataccata ttatgtagga ccacttgcaa ggggaaattc 1380 aagatttgca tggatgacta gaaaatcaga agaaactata accccgtgga attttgaaga 1440 agtagtagat aaaggagcta gtgctcaatc atttatagaa agaatgacaa attttgataa 1500 gaatcttcct aacgaaaagg ttttgccaaa gcatagcctt ctttatgagt attttacagt 1560 ttataatgag cttactaaag taaaatacgt tacagaagga atgagaaaac cagcattttt 1620 gtctggtgaa caaaagaaag caatagtaga cctattattt aaaacaaata ggaaggttac 1680 cgtaaagcaa cttaaagaag attacttcaa aaaaattgaa tgctttgata gtgttgaaat 1740 atcaggagtt gaagatagat ttaatgcttc acttggtaca tatcacgatc tcttaaaaat 1800 tataaaagat aaggattttt tagataatga agaaaatgaa gatattcttg aagatatagt 1860 attaacattg acactttttg aagatagaga aatgatagaa gaaagattaa aaacatatgc 1920 acatcttttt gatgataagg ttatgaagca acttaaaaga agaagatata caggttgggg 1980 acgtttgtca agaaagctaa ttaatggtat tagagataaa caatcaggaa agactattct 2040 cgattttctt aaatcagatg gatttgctaa tagaaacttt atgcaattaa ttcatgatga 2100 ttctcttact ttcaaagagg atattcaaaa ggctcaagtt tctggacaag gcgatagctt 2160 acacgaacac attgctaacc ttgcagggag ccccgctatc aaaaaaggaa ttttacaaac 2220 agttaaagtt gtagatgaac ttgttaaagt tatgggaaga cacaaacctg agaatatagt 2280 tatagaaatg gccagagaaa atcaaacaac acaaaaagga caaaaaaatt ctagagagag 2340 aatgaagaga attgaagaag gaataaaaga gctaggatca caaatattaa aagaacatcc 2400 agttgaaaat actcaattgc aaaatgaaaa gttatatttg tattacttac aaaatggaag 2460 agatatgtat gttgatcaag aactcgatat taatagatta agtgactatg atgttgatca 2520 tattgttcct caatcatttt taaaagatga ttcaatcgat aacaaagtat taactagatc 2580 agataaaaat agaggaaagt cagataatgt accatctgaa gaagttgtta aaaaaatgaa 2640 gaactattgg agacaacttt taaatgcaaa gctaattaca caaagaaaat ttgacaattt 2700 aacaaaagca gaaagaggag gattaagcga attagacaaa gctggattta taaaaagaca 2760 acttgttgag acaagacaaa taactaagca tgttgctcaa atacttgatt caagaatgaa 2820 tacaaaatat gatgaaaatg ataaattaat cagagaagta aaagtaataa cattaaagtc 2880 aaaattagta tcagatttca gaaaggattt tcaattttac aaagttcgtg aaataaataa 2940 ctatcatcat gctcatgatg catacttaaa tgctgttgta ggaactgctc ttattaagaa 3000 atatcctaaa ctagaaagcg aatttgttta tggagattat aaagtttatg atgtgcgcaa 3060 aatgatcgcg aaatccgaac aagaaatcgg taaggctaca gcaaaatatt tcttttatag 3120 taatataatg aattttttta agacagaaat aactttggct aatggtgaaa tcagaaaaag 3180 accacttatc gaaacaaatg gagagacagg agaaatagta tgggataaag gaagagattt 3240 tgctactgtt agaaaagtac taagtatgcc acaagtaaat atcgtaaaga aaactgaagt 3300 tcaaactgga ggtttctcta aggaatcaat tttacctaag agaaattcag ataagttaat 3360 tgcaaggaaa aaagattggg acccaaaaaa atacggtggt tttgatagtc caacagttgc 3420 ctatagtgtt cttgtagtag cgaaagttga gaaaggtaag tcaaaaaagt tgaaaagcgt 3480 aaaagaactt cttggtatca caattatgga aagatcttca tttgaaaaaa atccaattga 3540 ctttttagaa gctaagggtt ataaagaagt taaaaaggat ttaatcataa aactaccaaa 3600 gtatagtcta tttgaactcg aaaacggaag aaaacgaatg ctcgctagcg caggagaact 3660 tcaaaaagga aatgaacttg cgctgccatc aaagtatgta aatttcttat atttagcttc 3720 tcattatgag aaattaaaag gatcaccaga ggataatgaa caaaagcaac tatttgtaga 3780 acaacacaaa cattatttag atgaaataat agaacaaata tctgaatttt ctaaaagagt 3840 tatacttgcc gacgcaaatc tagataaggt gctttcagcg tataataaac acagagataa 3900 accaataaga gaacaagcag aaaacattat ccatcttttt acattaacta atcttggtgc 3960 accagctgca tttaagtact ttgatacaac aatagataga aaaagataca catctactaa 4020 agaagtatta gacgcaactt taatacatca atctattaca gggctttatg aaacaagaat 4080 tgatttaagt caactaggcg gagattaagt cgacaaagta ttgttaaaaa taactctgta 4140 gaattataaa ttagttctac agagttattt tttgacccgg gtaccgagct cgaattcgta 4200 atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat 4260 acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt 4320 aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 4380 atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc 4440 gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 4500 ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 4560 aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 4620 ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 4680 aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 4740 gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 4800 tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 4860 tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 4920 gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 4980 cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 5040 cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 5100 agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 5160 caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 5220 ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 5280 aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 5340 tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 5400 agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 5460 gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 5520 accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 5580 tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 5640 tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 5700 acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 5760 atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 5820 aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 5880 tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 5940 agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 6000 gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 6060 ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 6120 atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 6180 tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt 6240 tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 6300 tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 6360 ctgccgggcc tcttgcggga tcaaaagaaa aacgaaatga tacaccaatc agtgcaaaaa 6420 aagatataat gggagataag acggttcgtg ttcgtgctga cttgcaccat atcataaaaa 6480 tcgaaacagc aaagaatggc ggaaacgtaa aagaagttat ggaaataaga cttagaagca 6540 aacttaagag tgtgttgata gtgcagtatc ttaaaatttt gtataatagg aattgaagtt 6600 aaattagatg ctaaaaattt gtaattaaga aggagtgatt acatgaacaa aaatataaaa 6660 tattctcaaa actttttaac gagtgaaaaa gtactcaacc aaataataaa acaattgaat 6720 ttaaaagaaa ccgataccgt ttacgaaatt ggaacaggta aagggcattt aacgacgaaa 6780 ctggctaaaa taagtaaaca ggtaacgtct attgaattag acagtcatct attcaactta 6840 tcgtcagaaa aattaaaact gaatactcgt gtcactttaa ttcaccaaga tattctacag 6900 tttcaattcc ctaacaaaca gaggtataaa attgttggga gtattcctta ccatttaagc 6960 acacaaatta ttaaaaaagt ggtttttgaa agccatgcgt ctgacatcta tctgattgtt 7020 gaagaaggat tctacaagcg taccttggat attcaccgaa cactagggtt gctcttgcac 7080 actcaagtct cgattcagca attgcttaag ctgccagcgg aatgctttca tcctaaacca 7140 aaagtaaaca gtgtcttaat aaaacttacc cgccatacca cagatgttcc agataaatat 7200 tggaagctat atacgtactt tgtttcaaaa tgggtcaatc gagaatatcg tcaactgttt 7260 actaaaaatc agtttcatca agcaatgaaa cacgccaaag taaacaattt 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Claims (14)

  1. 동종 재조합에 의한 클로스트리디움 속(Clostridium geuns)의 박테리아(bacterium)의 형질전환 및 유전적 변형을 가능하게 하는 유전 툴(genetic tool)로서,
    i) 하기를 포함하고:
    - 적어도 Cas9를 암호화하는 제1의 핵산으로, 상기 Cas9를 암호화하는 서열이 프로모터의 제어 하에 있는, 핵산, 및
    - 동종 재조합 메카니즘(homologous recombination mechanism)에 의해 목적한 서열에 의한 Cas9에 의해 표적화된 박테리아 DNA의 일부의 대체를 가능하게 하는 복구 주형(repair template)을 포함하는 적어도 제2의 핵산,
    ii) 상기 핵산들 중 적어도 하나가 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA)를 추가로 암호화하거나, 상기 유전 툴이 하나 이상의 가이드 RNA를 추가로 포함하고, 각각의 가이드 RNA는 Cas-효소-결합 RNA 구조 및 박테리아 DNA의 표적화된 부위에 대해 상보성인 서열을 포함하며, 및
    iii) 상기 핵산들 중 적어도 하나가 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 항-CRISPR 단백질을 암호화하는 서열을 추가로 포함하거나, 상기 유전 툴이 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 항-CRISPR 단백질을 암호화하는 제3의 핵산을 추가로 포함함을 특징으로 하는 유전 툴.
  2. 제1항에 있어서, 클로스트리디움 속의 박테리아가, 씨. 아세토부틸리쿰(C.　acetobutylicum), 씨, 셀룰롤리티쿰(C.　 cellulolyticum), 씨. 파이토페르멘탄스(C.　phytofermentans), 씨. 베이제린키이(C. beijerinckii), 씨, 사카로부틸리쿰(C.　saccharobutylicum), 씨. 사카로페르부틸아세토니쿰( C.　saccharoperbutylacetonicum), 씨. 스포로게네스(C.　 sporogenes), 씨. 부티리쿰(C.　butyricum), 씨. 아우란티부티리쿰(C.　 aurantibutyricum) 및 씨. 타이로부티리쿰(C.　tyrobutyricum)으로부터 선택된 용매생성 박테리아(solventogenic bacterium)인 유전 툴.
  3. 제2항에 있어서, 박테리아가 씨. 아세토부틸리쿰이고, 상기 씨. 아세토부틸리쿰 박테리아가 균주 DSM 792 (ATCC 824 또는 LMG 5710으로도 공지됨)이며, 상기 용매생성 박테리아가 씨. 베이제린키이인 경우 상기 씨. 베이제린키이 박테리아가 균주 NCIMB 8052 또는 균주 DSM 6423 (NRRL B-593, LMG 7814, LMG 7815로도 공지됨)임을 특징으로 하는, 유전 툴.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CRISPR 단백질을 암호화하는 서열이 제1의 핵산에 의해 수반되는 유전 툴.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CRISPR 단백질이 단백질 AcrIIA2 또는 단백질 AcrIIA4임을 특징으로 하는 유전 툴.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 목적한 DNA 서열의 발현이 클로스트리디움 속의 박테리아가 6-탄당 및/또는 5-탄당 중 적어도 2개의 상이한 당을 발효하도록 하는 유전 툴.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 목적한 서열이 글로스트리디움 속의 박테리아에 의한 용매 생산을 촉진하는 적어도 하나의 생성물, 예를 들면, 알데하이드의 알코올로의 전환에 포함된 적어도 하나의 효소, 막 단백질, 전사 인자, 또는 이의 조합을 암호화함을 특징으로 하는 유전 툴.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 툴 내에 존재하는 각각의 핵산이 구별되는 발현 카세트 또는 구별되는 벡터, 예를 들면, 플라스미드에 속하는 유전 툴.
  9. 동종 재조합에 의해, 클로스트리디움 속의 박테리아를 형질전환 및 유전적으로 변형시키는 방법으로서, 상기 방법이 상기 박테리아 내로 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 유전 툴을 도입시킴으로써 상기 박테리아를 형질전환시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 다음의 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법:
    a) 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자의 존재하에서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 유전 툴을 박테리아 내로 도입시키는 단계, 및
    b) 단계 a)의 말기에서 수득된 형질전환된 박테리아를 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자를 함유하지 않는 배지 상에서 배양하는 단계.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 복구 주형 및/또는 가이드 RNA(들)를 포함하는 핵산 또는 단계 a) 동안 유전 툴을 사용하여 도입된 가이드 RNA(들)을 암호화하는 서열을 제거하는 추가의 단계 c)를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 또는 단계 c) 이후에, 이미 도입된 것과는 구별되는 복구 주형 및 상기 구별된 복구 주형내에 포함된 목적한 서열이 박테리아 게놈의 표적화된 영역내로 통합되도록 하는 가이드 RNA에 대한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 n번째 핵산을 항-CRISP 단백질의 발현의 유도인자의 존재하에서 도입하는 하나 이상의 추가의 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법으로서, 각각의 추가의 단계가 이렇게 형질전환된 박테리아를 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자를 함유하지 않고 Cas9/gRNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 발현을 가능하게 하는 배지에서 배양하는 단계를 수반하는 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나에 기술된 바와 같은 유전 툴의 성분 및 툴내에 사용된 선택된 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도성 프로모터에 적응된 적어도 하나의 유도인자를 포함하는, 클로스트리디움 속의 박테리아를 형질전환 및 바람직하게는 유전적으로 변형시키거나, 클로스트리디움 속의 박테리아를 사용하여 적어도 하나의 용매를 생산하기 위한 키트(kit).
  14. 용매 또는 용매의 혼합물, 바람직하게는 아세톤, 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이의 혼합물, 전형적으로 이소프로판올/부탄올 혼합물을 산업적 규모로 생산할 수 있도록 하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 유전 툴, 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 제13항에 따른 키트의 용도.
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