KR20230067316A - CRISPR-Cas9 시스템을 활용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주 및 박테리오파지 유전자 조작 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 CRISPR-Cas9 시스템을 활용하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주 및 박테리오파지의 유전자를 제거 또는 치환할 수 있는 방법에 관한 것으로, 본 발명에서 새롭게 구축한 플라스미드 및 유전자 조작 방법은 클로스트리디움 퍼프린젠스와 이를 감염시키는 박테리오파지의 유전자를 쉽게 조작할 수 있는데, 식품, 의약 및 동물 의약 산업 등에 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 CRISPR-Cas9 시스템을 활용하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주 및 박테리오파지의 유전자를 제거 또는 치환할 수 있는 방법에 관한 것이다.
CRISPR-Cas9 시스템은 유전자 가위라 불리는 게놈 편집 방법으로, 자르고자 하는 특정 염기서열에 상보적으로 결합하는 RNA와 가위 역할을 하는 Cas9 뉴클레아제로 구성된다. 이러한 시스템을 세포나 동물에 벡터 형태로 도입하면 특정 유전자의 기능을 억제할 수 있는 녹-아웃 (knock-out)이 가능하고, 추가적으로 세포 자체의 상동성 재조합 (homologous recombination) 시스템을 활용하여 원하는 위치에 유전자 삽입이 가능하다.
한편, 박테리오파지는 박테리아 막의 특정 구성 물질을 인식하여 박테리아 세포막에 부착한다. 박테리오파지가 인식하는 막의 구성 물질로는 크게 세포막에 존재하는 다당류, 선모, 편모 등이 있으며, 파지마다 인식하는 구성 물질이 다르므로 숙주 특이성을 갖는다. 이처럼 박테리오파지는 특정 균주에만 감염하기 때문에 유익균에는 피해를 입히지 않고, 박테리아가 아닌 사람과 동물을 포함한 진핵생물에는 작용하지 않아 합성항생제와 같은 부작용을 줄일 수 있다. 또한, 항생제 감수성 세균 및 내성세균 모두에 작용한다는 면에 발전 가능성이 높은 분야라고 할 수 있다.
본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스의 생물학적 방제제로서 역할을 할 수 있는 박테리오파지와 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주의 유전자 조작 방법을 제시하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens)에서 복제가 가능하게 하는 복제원점, 락토오스 유도성 프로모터인 bgaR, 항생제 내성 유전자로 Chloramphenicol acetyltransferase을 암호화하는 catP 유전자, 가이드 RNA인 crRNA 및 tracrRNA 및 Cas9 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터로서, 서열번호 1에 기재된 핵산 서열로 구성된 플라스미드 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 균주의 유전자 제거 또는 치환 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 감염 박테리오파지의 유전자 제거 또는 치환 방법을 제공한다.
본 발명에서 새롭게 구축한 플라스미드 및 유전자 조작 방법은 클로스트리디움 퍼프린젠스와 이를 감염시키는 박테리오파지의 유전자를 쉽게 조작할 수 있는데, 식품, 의약 및 동물 의약 산업 등에 활용될 수 있다.
도 1은 Clostridium perfringens 균주의 벡터 삽입 조건 확립을 위해 수행한 실험 결과이다.
도 2는 본 발명 서열번호 1에 기재된 플라스미드의 벡터 맵이다.
도 3의 C. perfringens 균주의 CPF_0486의 위치 및 crRNA의 목표 서열과 위치를 표시한 도면이다.
도 4는 RISPR-Cas9 system을 활용하여 Clostridium perfringens 균주의 CPF_0486 유전자가 제거됨을 확인시켜 주는 결과이다.
도 5는 CRISPR-Cas9 system의 C. perfringens 박테리오파지 제거능을 확인하기 위하여 구축한 플라스미드의 벡터맵이다.
도 6은 CRISPR-Cas9 system의 C. perfringens 박테리오파지 제거능을 확인시켜주는 실험 결과이다.
도 7은 치환되지 않은 LysCPD7을 가지고 있는 야생형 CPD7의 DNA를 자르기 위해, 'crRNA에 존재하는 서열을 Bsa1 제한 효소를 처리한 후 ligation을 통해 5' - AAAACGTTAAAGTTTCATAAGGACAGTTTT - 3' 서열로 치환한 도 5의 벡터'에 LysCPD7의 187번째 아미노산이 글루탐산에서 라이신으로 치환된 LysCPD7*의 염기서열이 추가 삽입된 재조합 벡터 pJIR750::CRISPR_Cas9::LysCPD7*의 벡터맵이다.
도 8은 LysCPD7에 돌연변이가 일어난 박테리오파지 CPD7의 plaque이다.
도 9는 LysCPD7에 돌연변이가 일어난 박테리오파지 CPD7의 유전자 시퀀싱 결과이다.
도 2는 본 발명 서열번호 1에 기재된 플라스미드의 벡터 맵이다.
도 3의 C. perfringens 균주의 CPF_0486의 위치 및 crRNA의 목표 서열과 위치를 표시한 도면이다.
도 4는 RISPR-Cas9 system을 활용하여 Clostridium perfringens 균주의 CPF_0486 유전자가 제거됨을 확인시켜 주는 결과이다.
도 5는 CRISPR-Cas9 system의 C. perfringens 박테리오파지 제거능을 확인하기 위하여 구축한 플라스미드의 벡터맵이다.
도 6은 CRISPR-Cas9 system의 C. perfringens 박테리오파지 제거능을 확인시켜주는 실험 결과이다.
도 7은 치환되지 않은 LysCPD7을 가지고 있는 야생형 CPD7의 DNA를 자르기 위해, 'crRNA에 존재하는 서열을 Bsa1 제한 효소를 처리한 후 ligation을 통해 5' - AAAACGTTAAAGTTTCATAAGGACAGTTTT - 3' 서열로 치환한 도 5의 벡터'에 LysCPD7의 187번째 아미노산이 글루탐산에서 라이신으로 치환된 LysCPD7*의 염기서열이 추가 삽입된 재조합 벡터 pJIR750::CRISPR_Cas9::LysCPD7*의 벡터맵이다.
도 8은 LysCPD7에 돌연변이가 일어난 박테리오파지 CPD7의 plaque이다.
도 9는 LysCPD7에 돌연변이가 일어난 박테리오파지 CPD7의 유전자 시퀀싱 결과이다.
본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens)에서 복제가 가능하게 하는 복제원점, 락토오스 유도성 프로모터인 bgaR, 항생제 내성 유전자로 Chloramphenicol acetyltransferase을 암호화하는 catP 유전자, 가이드 RNA인 crRNA 및 tracrRNA 및 Cas9 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터로서, 서열번호 1에 기재된 핵산 서열로 구성된 플라스미드 벡터를 제공한다. 본 발명은 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는 플라스미드를 사용한다.
서열번호 1의 핵산 서열을 갖는 본 발명의 플라스미드는 클로스트리디움 퍼프린젠스에서 효율적인 CRISPR-Cas9 시스템 발현을 위해 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는, 락토오스 유도성 프로모터라 알려진 bgaR 유전자가 삽입되어 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 균주의 유전자 제거 또는 치환 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 감염 박테리오파지의 유전자 제거 또는 치환 방법을 제공한다.
클로스트리디움 퍼프린젠스 균주 안에서 본 발명의 유전자 조작 시스템이 작동하는지 확인하기 위하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 박테리오파지 CPS1의 파지 수용체라 알려진 CPF_0486 유전자를 해당 시스템으로 녹-아웃 하였다. 이후 CPS1을 감염시켜 본 결과, 클로스트리디움 퍼프린젠스에 박테리오파지 저항성이 생김을 확인하였다.
또한, 본 발명의 플라스미드가 클로스트리디움 퍼프린젠스 박테리오파지에도 작동하는지 확인하기 위해, 박테리오파지 CPD7의 엔도라이신 LysCPD7의 C 말단 부위를 목표로 하는 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 crRNA를 해당 플라스미드에 삽입하였다. 플라스미드가 삽입된 재조합 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주에 CPD7을 감염킨 결과, CPD7의 수가 대폭 감소함을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 crRNA가 엔도라이신 LysCPD7의 C 말단 부위에 잘 결합하여 cas9 단백질이 해당 서열을 포함하는 박테리오파지의 DNA를 잘라내어 박테리오파지의 수가 감소한 것으로, 이 결과는 CRISPR-Cas9 system이 잘 작동하는 것을 의미한다.
한편, LysCPD7의 C 말단 부위를 돌연변이 시키기 위해 앞서 제작한 플라스미드에 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 DNA를 삽입하였다. 해당 플라스미드가 삽입된 균주에 CPD7을 감염시킨 후, 생성된 박테리오파지를 스크리닝하여 LysCPD7의 C 말단 부위가 돌연변이된 박테리오파지를 얻었다. 이를 통해 본 발명의 플라스미드 벡터를 사용하여 유전자 치환도 가능함을 확인할 수 있었다.
기존에 클로스트리디움 퍼프린젠스 박테리오파지는 물론 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주를 대상으로 유전자를 조작하는 것은 매우 힘들다고 알려져 있었다. 하지만, 본 발명의 플라스미드를 이용할 경우, 클로스트리디움 퍼프린젠스 숙주와 클로스트리디움 퍼프린젠스 박테리오파지 '모두'를 유전적으로 쉽게 조작 (유전자 제거 또는 유전자 치환)할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1:
Clostridium perfringens
균주의 벡터 삽입 조건 확립]
클로스트리디움 퍼프린젠스 균주의 유전자를 제거하기에 앞서 pJIR750 벡터(vector)를 사용하여 C. perfringens ATCC 13124를 모델 균주로 삼아 전기 천공 법(electroporation) 조건을 최적화하였다.
전기 천공법을 위해 Biorad Gene Pulser apparatus (Biorad Laboratories, USA)를 사용하였고 25 μF, 200 Ω, 1.5 kV 조건에서 0.2 cm의 큐벳을 사용하여 실험을 진행하였다. 모델 균주를 BHI 배지 50 mL에 접종하고 30℃에서 OD600 값이 0.23~0.27이 될 때까지 정치 배양하였다. 이를 원심분리 (7,000 x g, 10분, 25℃)를 통해 가라앉히고, 다시 이를 SMP 버퍼 (272 mM sucrose, 0.7 mM sodium phosphate pH 7.4, 1 mM MgCl2) 5 mL에 현탁 후 다시 원심분리 하였다. 원심분리한 균주를 동일 버퍼로 재 현탁하였다. 현탁한 균주 400 μL 에 pJIR750 벡터를 처리한 뒤 상온에서 5분간 반응하고 전기 천공을 진행하였다. 전기 천공된 균주는 BHI 리커버리 배지 (BHI regeneration broth) 10 mL 에 접종한 뒤 37℃에서 세시간 배양하였다. 배양한 균주를 클로람페니콜 (chloramphenicol) 항생제가 들어간 BHI 배지에 키운 후 콜로니 개수를 측정하였다.
실험 결과, 300 bp 크기의 작은 단편 DNA(short noncoding DNA fragment) 1.5 μg 을 pJIR750 벡터 2 μg 과 함께 처리하게 되면 벡터가 해당 균주에 잘 삽입되는 것을 확인하였다 (도 1). 도 1은 Clostridium perfringens 균주의 벡터 삽입 조건 확립을 위해 수행한 실험 결과이다.
[실시예 2:
C. perfringens
균주에서 작동하는 CRISPR-Cas9 벡터의 제조 ]
클로스트리디움 퍼프린젠스 균주의 유전자를 제거할 수 있는 벡터를 구축하고자 하였다. addgene에서 구입한 pCas9 (Plasmid #42876)로부터 cas9과 tracRNA, crRNA를 PCR한 후 overlap PCR을 통해 pJIR750 벡터와 조합하였다. Cas9 단백질은 균주에 독성을 가질 수 있기 때문에 발현량을 조절하고자 하였다. 락토오스 유도성 프로모터 (lactose inducible promoter)라 알려진 bgaR 유전자를 C. perfringens ATCC 13124 균주로부터 PCR 한 후 Gibbson assembly 방법을 통해 벡터와 조합하였다.
이를 통해 본 발명의 벡터를 제작할 수 있었고, 이 벡터는 서열번호 1에 기재된 핵산서열을 가진다. 도 2는 본 발명 서열번호 1에 기재된 플라스미드의 벡터 맵이다.
[실시예 3: CRISPR-Cas9 system을 활용한
Clostridium perfringens
균주의 유전자 제거]
상기 실시예 2에서 만들어진 벡터 pJIR750::CRISPR_Cas9가 C. perfringens의 유전자를 효과적으로 제거할 수 있는지를 확인하기 위해 박테리오파지에 저항성을 갖는 유전자 CPF_0486 를 지워보았다.
C. perfringens 13124에 존재하는 CPF_0486 유전자를 제거하면 박테리오파지 CPS1은 C. perfringens 13124를 감염하지 못함이 알려져 있다. 해당 유전자를 제거하기 위해 서열번호 1의 벡터에서 crRNA에 존재하는 서열을 Bsa1 제한 효소를 처리한 후 ligation을 통해 5' - AAACTCCAGTTGGAGCTCATGAAAGTGGATTAATGTTTT - 3' 서열 (서열번호 3) 로 치환하였다. 도 3 은 C. perfringens 균주의 CPF_0486의 위치 및 crRNA의 목표 서열과 위치를 표시한 도면이다. 치환된 벡터를 C. perfringens 13124에 transformation 하였다.
삽입된 벡터가 C. perfringens 13124 내에서 crRNA가 target하는 유전자를 제거했는지 확인해보기 위하여 overnight으로 키운 C. perfringens 13124를 클로람페니콜이 첨가된 BHI 배지에 spreading 하여 배양하였다. 이후 형성된 콜로니를 분리하여 다시 클로람페니콜이 첨가된 BHI midium에 overnight으로 키웠다. 분리한 균주가 박테리오파지 CPS1에 목표한 대로 저항성을 갖는지 확인하기 위해 박테리오파지 CPS1을 활용한 assay를 진행하였다. 우선 형질 전환된 C. perfringens 13124를 클로람페니콜이 첨가된 BHI medium에 overnight으로 배양하였다. 이후 BHI agar에 배양된 균주 200 uL와 0.7% D.W. soft agar 5 mL을 혼합하여 부어 굳혔다. 굳힌 agar에 박테리오파지 CPS1을 dotting 하였다.
실험 결과, 박테리오파지 CPS1은 형질 전환된 C. perfringens 13124 에서 plaque을 형성하지 못함을 알 수 있었다 (도 4). 도 4는 RISPR-Cas9 system을 활용하여 Clostridium perfringens 균주의 CPF_0486 유전자가 제거됨을 확인시켜 주는 결과이다.
이 결과로부터 도 2의 벡터는 C. perfringens 의 유전자를 효과적으로 제거할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 4: CRISPR-Cas9 system의
C. perfringens
박테리오파지 제거능 확인]
pJIR750::CRISPR_Cas9 벡터가 C. perfringens 균주를 숙주로 하는 박테리오파지의 DNA를 절단하여 박테리오파지를 제거할 수 있는지를 확인하기 위해 박테리오파지 CPD7으로 실험을 진행하였다.
박테리오파지 CPD7의 DNA를 절단하기 위해 도 2의 벡터에서 crRNA에 존재하는 서열을 Bsa1 제한 효소를 처리한 후 ligation을 통해 5' - AAAACGTTAAAGTTTCATAAGGACAGTTTT - 3' 서열로 치환하였다 (서열번호 4, 도 5). 도 5는 CRISPR-Cas9 system의 C. perfringens 박테리오파지 제거능을 확인하기 위하여 구축한 플라스미드의 벡터맵이다.
그 후, CPD7의 숙주인 C. perfringens FORC_25 균주에 해당 벡터를 삽입하였다. 도 5 벡터가 삽입된 C. perfringens FORC_25 균주를 overnight 배양한 후 균주 200 uL와 105 PFU에 해당하는 박테리오파지 CPD7 lysate, 10 mM 락토오즈를 첨가한 0.7% D.W. soft agar 5 mL을 혼합하여 클로람페니콜이 첨가된 BHI 배지에 부어 굳혔다. 대조군에는 락토오즈를 넣지 않았다. 그 결과, 락토오즈를 넣어 Cas9을 발현한 균주에서는 CPD7이 plaque을 형성하지 않았고, 락토오즈를 넣지 않은 대조군에서는 CPD7이 plaque을 형성하였다 (도 6). 도 6은 CRISPR-Cas9 system의 C. perfringens 박테리오파지 제거능을 확인시켜주는 실험 결과이다.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명에서 구축한 벡터가 박테리오파지를 목표로 해도 잘 작동함을 알 수 있었다.
[실시예 5:
C. perfringens
박테리오파지의 유전자 조작]
pJIR750::CRISPR_Cas9 벡터로 박테리오파지의 제거뿐만 아니라 형질 전환도 할 수 있는지 확인해 보고자 하였다.
실험을 위해 박테리오파지 CPD7의 유전자 중 하나인 엔도라이신 LysCPD7의 187번째 아미노산인 글루탐산을 라이신으로 바꿔보고자 하였다. 이를 위해 기존에 만들어진 도 5의 벡터에, 'LysCPD7의 187번째 아미노산이 글루탐산에서 라이신으로 치환된 LysCPD7*'의 염기서열이 추가 삽입된 재조합 벡터 pJIR750::CRISPR_Cas9::LysCPD7*를 만들었다 (도 7).
도 7은 치환되지 않은 LysCPD7을 가지고 있는 야생형 CPD7의 DNA를 자르기 위해, 'crRNA에 존재하는 서열을 Bsa1 제한 효소를 처리한 후 ligation을 통해 5' - AAAACGTTAAAGTTTCATAAGGACAGTTTT - 3' 서열로 치환한 도 5의 벡터'에 LysCPD7의 187번째 아미노산이 글루탐산에서 라이신으로 치환된 LysCPD7*의 염기서열이 추가 삽입된 재조합 벡터 pJIR750::CRISPR_Cas9::LysCPD7*의 벡터맵이다.
야생형 CPD7의 LysCPD7을 LysCPD7*로 치환하기 위해 실시예 1의 방법을 사용하여 CPD7의 숙주 균주인 C. perfringens FORC_25에 pJIR750::CRISPR_Cas9::LysCPD7* 를 삽입하였다.
도 7 벡터가 삽입된 C. perfringens FORC_25 균주를 overnight 배양한 후 균주 200 uL와 105 PFU에 해당하는 박테리오파지 CPD7 lysate, 10 mM 락토오즈를 첨가한 0.7% D.W. soft agar 5 mL을 혼합하여 클로람페니콜이 첨가된 BHI 배지에 부어 굳혔다. 이후, 다음날 생성된 plaque 들을 팁으로 조심스럽게 picking 하여 각각 100 uL 의 SM buffer에 풀어 plaque을 형성한 박테리오파지들을 확보하였다.
확보한 박테리오파지들은 엔도라이신이 치환된 박테리오파지도 있지만, 치환되지 않은 박테리오파지도 섞여있다. 엔도라이신이 치환되지 않은 야생형 박테리오파지를 제거하기 위해, 도 7 벡터에서 "HR::LysCPD7*::HR region"이 없는 벡터 (도 5)가 삽입된 C. perfringens FORC_25 균주를 overnight 배양한 후 균주 200 uL 와 0.7% DW soft agar 5 mL을 혼합하여 클로람페니콜이 첨가된 BHI 배지에 부어 굳혔다. 이어서, 상기에서 확보한 박테리오파지 lysate를 10 uL 씩 agar에 dotting 하여 키움으로써 섞여 있는 야생형 CPD7을 제거하였다.
그 결과 plaque 8 개를 얻을 수 있었다. (도 8). 도 8은 LysCPD7에 돌연변이가 일어난 박테리오파지 CPD7의 plaque이다. 그 중 5, 6, 7, 8 번에 해당하는 plaque을 선택하여 LysCPD7 region을 PCR하여 sanger sequencing을 통해 돌연변이가 일어났는지 확인하였다 (도 9). 그 중 5, 7, 8번에 해당하는 박테리오파지가 LysCPD7이 LysCPD7*로 치환된 것을 확인하였다.
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bacteriophage by CRISPR-Cas9 system
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<223> pJIR750::CRISPR-Cas9
<400> 1
gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc 60
actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 120
ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 180
cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc ctgatgcggt attttctcct 240
tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 300
tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc 360
ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 420
tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct 480
atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg 540
gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 600
gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag 660
tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt 720
tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt 780
gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga 840
acgttttcca atgatgagca cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaaact tcatttttaa 900
tttaaattaa aaatgaagtt ttatcaaaaa aatttccaat aatcccactc taagccacaa 960
acacgcccta taaaatcccg ctttaatccc actttgagac acatgtaata ttactttacg 1020
ccctagtata gtgataattt tttacattca atgccacgca aaaaaataaa ggggcactat 1080
aataaaagtt ccttcggaac taactaaagt aaaaaattat ctttacaacc tccccaaaaa 1140
aaagaacagg tacaaagtac cctataatac aagcgtaaaa aaatgagggt aaaaataaaa 1200
aaataaaaaa ataaaaaaat aaaaaaataa aaaaaataaa aaaataaaaa aataaaaaaa 1260
taaaaaaata aaaaaataaa aaaataaaaa aataaaaaaa tataaaaata aaaaaatata 1320
aaaataaaaa aatataaaaa taaaaaaata taaaaataaa aaaataaaaa aatataaaaa 1380
taaaaaaata aaaaaatata aaaatatttt ttatttaaag tttgaaaaaa atttttttat 1440
attatataat ctttgaagaa aagaatataa aaaatgagcc tttataaaag cccatttttt 1500
ttcatatacg taatatgacg ttctaatgtt tttattggta cttctaacat tagagtaatt 1560
tctttatttt taaagccttt ttctttaagg gcttttattt tttttcttaa tacatttaat 1620
tcctcttttt ttgttgcttt tcctttagct tttaattgct cttgataatt ttttttacct 1680
ctaatatttt ctcttctctt atattccttt ttagaaatta ttattgtcat atatttttgt 1740
tcttcttctg taatttctaa taactctata agagtttcat tcttatactt atattgctta 1800
tttttatcta aataacatct ttcagcactt ctagttgctc ttataacttc tctttcactt 1860
aaatgttgtc taaacatact attaagttct aaaacatcat ttaatgcctt ctcaatgtct 1920
tctgtaaagc tacaaagata atatctatat aaaaataata taagctctct gtgtcctttt 1980
aaatcatatt ctcttagttc acaaagtttt attatgtctt gtattcttcc ataatataaa 2040
cttctttctc tataaatata atttattttg cttggtctac cctttttcct ttcatatggt 2100
tttaattcag gtaaaaatcc attttgtatt tctcttaagt cataaatata ttcgtactca 2160
tctaatatat tgactactgt ttttgattta gagtttatac ttcctggaac tcttaatatt 2220
ctggttgcat ctaaggcttg tctatctgct ccaaagtatt ttaattgatt atataaatat 2280
tcttgaaccg ctttccataa tggtaatgct ttactaggta ctgcatttat tatccatatt 2340
aaatacattc ctcttccact atctattaca tagtttggta taggaatact ttgattaaaa 2400
taattctttt ctaagtccat taatacctgg tctttagttt tgccagtttt ataataatcc 2460
aagtctataa acagtgtatt taactctttt atattttcta atcgcctaca cggcttataa 2520
aaggtattta gagttatata gatattttca tcactcatat ctaaatcttt taattcagcg 2580
tatttatagt gccattggct atatcctttt ttatctataa cgctcctggt tatccaccct 2640
ttacttctac tatgaatatt atctatatag ttctttttat tcagctttaa tgcgtttctc 2700
acttattcac ctccccttct gtaaaactaa gaaaattata tcatattttc aataattatt 2760
aactattctt aaactcttaa taaaaaatag agtaagtccc caattgaaac ttaatctatt 2820
ttttatgttt taatttatta tttttattaa aatattttaa actaaattaa atgattcttt 2880
ttaatttttt actatttcat tccataatat attactataa ttatttacaa ataatatttc 2940
ttcatttgta atatttagat gatttactaa ttttagtttt tatatattaa ataattaatg 3000
tataatttat ataaaaaatc aaaggagctt ataaattatg attatttcca aagatactaa 3060
agatttaatt ttttcaattt taacaatact ttttgtaata ttatgtttaa atttaattgt 3120
atttttttca tataataaag ccgttgaagt aaaccaatcc attttcctta tgatgttatt 3180
attaaattta agttttataa taatatcttt attatattta ttgtttttaa aaaaactagt 3240
gaaatttccg gctttattaa acttattttt aggaatttta ttttcatttt catctttaca 3300
ggatttgatt atatctttaa atatgtttta tcaaatatta tctttttcta aatttatata 3360
tatttttatt atatttatta ttatatatat tttattttta agtttctttc taacagctat 3420
taaaaagaaa cttaaaaata aaaacacgta ctctaaacca ataaataaaa ctatttttat 3480
tattgctgcc ttgattggaa tagtttttag taaaattaat ttcaatattc cacaatatta 3540
tattataagc tagctttgca ttgtactttt caatcgcttc acgaatgcgg ttatctccga 3600
aagataaagt cttttcatct tccttgatga agataagatt ttctccgtct ccgccggcag 3660
aattgaagcg gggtactacg gtatcgtctg cgtcatcttc cgttgtctga tagatgatag 3720
tcataggctc attttcttcc gtttcggtaa aggggatagg ttcgcccttt gagagcaggg 3780
cggcgatgga aagcattaac ttgcttttcc catcgcccgg atctccctgc aatagcgtaa 3840
ctttgccaaa cggaatatac ggataccaca gccactttac ttctttcggc tcgatttcac 3900
ttgccttgat gatttcaaga ggtacgctga aattcatttc gttttcattt agtttcattt 3960
tttcttgttc tccttttctc tgaaaatata aaaaccacag attgatacta aaaccttggt 4020
tgtgttgctt ttcggggctt aaatcaagga aaaatccttg ttttaagcct ttcaaaaaga 4080
aacacaaggt ctttgtacta acctgtggtt atgtataaaa ttgtagattt tagggtaaca 4140
aaaaacaccg tatttctacg atgtttttgc ttaaatactt gtttttagtt acagacaaac 4200
ctgaagttaa ctatttatca attcctgcaa ttcgtttaca aaacggcaaa tgtgaaatcc 4260
gtcacatact gcgtgatgaa cttgaattgc caaaggaagt ataattttgt tatcttcttt 4320
ataatatttc cccatagtaa aaataggaat caaataatca tatcctttct gcaaattcag 4380
attaaagcca tcgaaggttg accacggtat catagataca ttaaaaatgt tttccggagc 4440
atttggcttt ccttccattc tatgattgtt tccataccgt tgcgtatcac tttcataatc 4500
tgctaaaaat gatttaaagt cagacttaca ctcagtccaa aggctggaaa atgtttcagt 4560
atcattgtga aatattgtat agcttggtat catctcatca tatatcccca attcaccatc 4620
ttgattgatt gccgtcctaa actctgaatg gcggtttaca atcattgcaa tataataaag 4680
cattgcagga tatagtttca ttcccttttc ctttatttgt gtgatatcca ctttaacggt 4740
catgctgtat gtacaaggta cacttgcaaa gtagtggtca aaatactctt ttctgttcca 4800
actattttta tcaatttttt caaataccat ctaagttccc tctcaaattc aagtttatcg 4860
ctctaatgaa caaagatatt ataccacatt tttgtgaatt tttcaacttg cccacttcga 4920
ctgcactccc gacttaataa cttcttgaac acttgccgaa aaagaaaaac taaaaagcac 4980
cgactcggtg ccactttttc aagttgataa cggactagcc ttattttaac ttgctatgct 5040
gttttgaatg gttccaacaa gattatttta taacttttat aacaaataat caaggagaaa 5100
ttcaaagaaa tttatcagcc ataaaacaat acttaatact atagaatgat aacaaaataa 5160
actacttttt aaaagaattt tgtgtcatta atatgaaaag tataagagct aatttagata 5220
ttaatactaa attaagtgaa attaatatag taattatatt aaaagtctaa ttgagatttt 5280
agaaaataaa tttcatataa ttttaattct tataaaagat ttaaaaagta taacagaggt 5340
tttaatttac gcctctgtta tactttttat ttttgaaatt tttttgtttt aaagctgtat 5400
tttaaattta tatacttgtt ttatttactt gattatttct gtaatttagt ggagacattg 5460
aaaaatgttt tgaaaaagtt tttgaaaata atagtgaatc actatagcct acactacttg 5520
caacttcacc tatgggaagt ttagtgcctt ttagtaaaag agtggctttg tacattctaa 5580
gatttattaa atatctttga ggagaaattc caagattttt tatgaacatt ttatataaat 5640
aacttctgct taagtttaca taatcagcaa tttcttgaac ggttatgcta tgcatataat 5700
tagaattaat gaaattaagg gcatcttgaa tatatgtgtg taattcctta tctttgtatt 5760
caaagggttt tgggaattct tctataagtg cgtacaataa tgagtaaagt tcctttagta 5820
atagtatgtc atcagatctt gaaggattat aagtttttga tatttcgcac atatttaata 5880
ttatttgtgg aatttttgag ttttcttcac aattagcaac acaagagtta gtaatagaag 5940
ttctatttaa atattcatta gcatttgaac cactaaagcc tatccagtag tattcccaag 6000
gatcatcaat agaagccaca tactcaactt gcataccttt tagtagtata aagatatcac 6060
cttgttttaa gttaaatacc ttaccattaa atttaaaagt cccatatccc ttagttacgt 6120
aatgaataac ggcatttttc aatacttcat agttatatcc taatcctggt ataccttgtt 6180
ctataccaca ttcatctaca ttcatttcaa agttttcttt aacatacttt ttccacaata 6240
tttgcatttc tacctcctaa cctataaaat taattaattt tatagtagtc ttatattaaa 6300
catttacatg agagctttgc aaagcagttt atcaacataa aagcttttta ttttaaaata 6360
aattcttcta aatataagaa tattttaaag aaatatcttt atatattagt tattaaaatt 6420
tataagatta taagaaacat tataacatat tttagaactt tttaactatt ttaaaagatt 6480
aatttacata ttaacattta attatgggta aaaactattt tgaaaaatga tttatatgga 6540
agtatgtttc ttaaatatat aatcatgttt catgaataca taattatttt aaatgtattg 6600
ggagggtaaa atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg 6660
atgggcggtg atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa 6720
tacagaccgc cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga 6780
gacagcggaa gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa 6840
tcgtatttgt tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt 6900
ctttcatcga cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc 6960
tatttttgga aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca 7020
tctgcgaaaa aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc 7080
cttagcgcat atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga 7140
taatagtgat gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga 7200
agaaaaccct attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag 7260
taaatcaaga cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt 7320
atttgggaat ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga 7380
tttggcagaa gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa 7440
tttattggcg caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc 7500
agatgctatt ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct 7560
atcagcttca atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc 7620
tttagttcga caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa 7680
cggatatgca ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa 7740
accaatttta gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga 7800
tttgctgcgc aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg 7860
tgagctgcat gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg 7920
tgagaagatt gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg 7980
tggcaatagt cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa 8040
ttttgaagaa gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa 8100
ctttgataaa aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta 8160
ttttacggtt tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc 8220
agcatttctt tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg 8280
aaaagtaacc gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag 8340
tgttgaaatt tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt 8400
gctaaaaatt attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga 8460
ggatattgtt ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa 8520
aacatatgct cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac 8580
tggttgggga cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa 8640
aacaatatta gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat 8700
ccatgatgat agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg 8760
cgatagttta catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat 8820
tttacagact gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga 8880
aaatatcgtt attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc 8940
gcgagagcgt atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa 9000
agagcatcct gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca 9060
aaatggaaga gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga 9120
tgtcgatcac attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt 9180
aacgcgttct gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa 9240
aaagatgaaa aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt 9300
tgataattta acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat 9360
caaacgccaa ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag 9420
tcgcatgaat actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac 9480
cttaaaatct aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga 9540
gattaacaat taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt 9600
gattaagaaa tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga 9660
tgttcgtaaa atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt 9720
cttttactct aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat 9780
tcgcaaacgc cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg 9840
gcgagatttt gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa 9900
aacagaagta cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga 9960
caagcttatt gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc 10020
aacggtagct tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt 10080
aaaatccgtt aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa 10140
tccgattgac tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa 10200
actacctaaa tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc 10260
cggagaatta caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata 10320
tttagctagt cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt 10380
gtttgtggag cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc 10440
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tagagacaaa ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa 10560
tcttggagct cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac 10620
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gtctacgagg ttttagagct atgctgtttt gaatggtccc aaaactgaga ccagtctcgg 10920
aagctcaaag gtctcgtttt agagctatgc tgttttgaat ggtcccaaaa cttcagcaca 10980
ctgagacttg ttgagttcca tgttttagag ctatgctgtt ttgaatggac tccattcaac 11040
attgccgatg ataacttgag aaagagggtt aataccatca agacgatagt taccggataa 11100
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 11160
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 11220
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 11280
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 11340
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 11400
cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 11460
gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 11520
ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat 11580
acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 11640
tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta 11700
ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg 11760
ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac 11800
<210> 2
<211> 1425
<212> DNA
<213> Clostridium perfringens
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(1425)
<223> lactose inducible promoter, bgaR
<400> 2
cattaatatg aaaagtataa gagctaattt agatattaat actaaattaa gtgaaattaa 60
tatagtaatt atattaaaag tctaattgag attttagaaa ataaatttca tataatttta 120
attcttataa aagatttaaa aagtataaca gaggttttaa tttacgcctc tgttatactt 180
tttatttttg aaattttttt gttttaaagc tgtattttaa atttatatac ttgttttatt 240
tacttgatta tttctgtaat ttagtggaga cattgaaaaa tgttttgaaa aagtttttga 300
aaataatagt gaatcactat agcctacact acttgcaact tcacctatgg gaagtttagt 360
gccttttagt aaaagagtgg ctttgtacat tctaagattt attaaatatc tttgaggaga 420
aattccaaga ttttttatga acattttata taaataactt ctgcttaagt ttacataatc 480
agcaatttct tgaacggtta tgctatgcat ataattagaa ttaatgaaat taagggcatc 540
ttgaatatat gtgtgtaatt ccttatcttt gtattcaaag ggttttggga attcttctat 600
aagtgcgtac aataatgagt aaagttcctt tagtaatagt atgtcatcag atcttgaagg 660
attataagtt tttgatattt cgcacatatt taatattatt tgtggaattt ttgagttttc 720
ttcacaatta gcaacacaag agttagtaat agaagttcta tttaaatatt cattagcatt 780
tgaaccacta aagcctatcc agtagtattc ccaaggatca tcaatagaag ccacatactc 840
aacttgcata ccttttagta gtataaagat atcaccttgt tttaagttaa ataccttacc 900
attaaattta aaagtcccat atcccttagt tacgtaatga ataacggcat ttttcaatac 960
ttcatagtta tatcctaatc ctggtatacc ttgttctata ccacattcat ctacattcat 1020
ttcaaagttt tctttaacat actttttcca caatatttgc atttctacct cctaacctat 1080
aaaattaatt aattttatag tagtcttata ttaaacattt acatgagagc tttgcaaagc 1140
agtttatcaa cataaaagct ttttatttta aaataaattc ttctaaatat aagaatattt 1200
taaagaaata tctttatata ttagttatta aaatttataa gattataaga aacattataa 1260
catattttag aactttttaa ctattttaaa agattaattt acatattaac atttaattat 1320
gggtaaaaac tattttgaaa aatgatttat atggaagtat gtttcttaaa tatataatca 1380
tgtttcatga atacataatt attttaaatg tattgggagg gtaaa 1425
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CPF_0486 target crRNA
<400> 3
aaactccagt tggagctcat gaaagtggat taatgtttt 39
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LysCPD7 C-terminal locus target crRNA
<400> 4
aaaacgttaa agtttcataa ggacagtttt 30
<210> 5
<211> 2954
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HR::LysCPD7*::HR
<400> 5
agatgtttta ggtattaata ataactctaa tcaagataaa agagaaagat tgctggtaga 60
tgaagtgaat atcaataatg gttatatatt aaataactta gatgtcgctt ataaaatgag 120
aaaagatgct tgtaaaaaaa ttaatgaaat gtttggatta aacttaaaag taattaaagt 180
tagggattta ttagacccac cacaagaaaa aaatgaattt gaaaataagg aaggagaaca 240
agataatggc taaatttacg ttggaactta gaactttagc agatgacccc aactttaaca 300
tttttggatt tccatacaac tttgttgatg aagatttaaa aggggtattt gaacaaagat 360
ttatagaaca tttttatttt catgaaatag gttttgaaac tgttagaaga tttcaacaaa 420
gattaatggc aactctcaac agaatagctc cttattatag tcaattatat cagactgaat 480
tggctagtaa aaaaatagat tttttgttga ataaagattt aaaagaaact tttattcgtg 540
agttagtaac agaaaataat aaaaaccaac ttaatgagaa tgttagtaat attattggtt 600
ctgataactc taagaatgag attgttaata cagaaaatag cacctcttca tcagataata 660
aagaaagttc tattgatgga gcattagccc atgtaagtga gggatattta actaatcaaa 720
atatagaaag tattaaagca aattcaaatt ctaataatat atctacaaat tcatcaacta 780
ataatagtaa ttcaaattca aatgggaaat taaaagaaga tgaaaaaggt aaggaattag 840
aaaaaactga gttagtatca cagggtaaca taggtgtaac aagttccgca gaattattag 900
aaaaatggag aagtgtttta ataaacatat ttgaaatgta cttggaagaa tgtgaaccat 960
tatttatgat ggtaatgtaa taaaaatttt agcccacggg gaacgttcct cgccctgcga 1020
ggatacgccc cgaggggctt tcaaaactgg ggcaaacttg ccaaaattgc caaaattgta 1080
aaatcgtaaa tcataataaa tttagggggg attttaaaaa tgtatataga aaatatttta 1140
aaaactagaa aattaagaat aggtttaaga gcgggtcatt ctccaaactg tttgggagca 1200
ataggtttaa gaaatgaaca tactaccatg atggtatatt ataagtatgt taaagaatgt 1260
tttgagaaat atggtcatac tgtaatagat tgtaattcaa ccgctaatac tgaaaaagca 1320
gaagtttatg agggtataaa taaggctaat aatgcaggtg ttgatatttt tatttctctt 1380
catatgaact cttataatgg taaagccttt ggggttgagt gtttagttgc taatggttca 1440
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agaggtgtaa agataggtaa tcaatgggaa atgaaagact taaatgcacc taatataata 1560
tttgaaactt gtttttgtga tagtcaaaaa gacattgata tatggtcacc ttgtccttat 1620
gaaactttaa caagggcttt atgtcatgcg gtcgaccctt caataccttt aacagatgaa 1680
ccggactatt accgtgtggt tgttcaaaga tttaaaacaa aggaagatgc tgaaaaagct 1740
gaaagtaaaa taaaaaatga tttaggatta tattgtttca ccgagaaaat atagaagttt 1800
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ttgtcaatat aattttgtaa tttatctcta aaaatttcta aacttaaatt ataatactca 1920
atgaaagaat ctaaatcaat attattataa aaatcattta aaataaaaga atgtgcataa 1980
caaaaatcat tacaattatg atgaaattga aatattacat tttcatgttc ggggtcatta 2040
taagatatta ttcgacaacc tttataatgt tgaacatatt gattattttt acaaatatta 2100
tcaaaaacct tcattaactt taatctatca tttttattca attttaaaat ccccctttaa 2160
aatgtgatga ataatattca aagttatgct ttttaataag ttttctaaac tttacattac 2220
tttcaatatg tggtatttgt tcccttaaat ttaaacaaat ttgttgacat gataattttg 2280
ttttttctat tctgtcgttt aaatcttcta tatcatcagt atcgtaatag tcttgtaatc 2340
ctaattgaaa taaagtattt tttaatgatg aataaacatc taatctaact tctaataatt 2400
caagttcttt ttcaaggtca gtaatctttt ttcttttcat tttataaacc tccttaaagg 2460
ggaattattc ccctattttt tcaacctcat gttttaaata atatcttagt gtcattacag 2520
tatcagcaaa aactataccg cattcttcta atccgaaaat atatccgtct ttaagttcac 2580
atactattct accatcttct ctatacaatc tatgaataac ttccctatct ttttctttta 2640
aatttatatt agtttcatta atacattctt gagttttatt tttttctgtt ttttcaattt 2700
cagaaactct ttttaataaa ctattaattt catcttgcat aattaacaat tcttttttta 2760
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ttatttcctt taattcttta atttctttat tttcttcttt ttcttcttca tttttaaata 2880
aatctatgtt attaacttta atgtatgctt taacagattg taaaaatcta ccccatttta 2940
ctgatttatt tatt 2954
Claims (3)
- 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens)에서 복제가 가능하게 하는 복제원점, 락토오스 유도성 프로모터인 bgaR, 항생제 내성 유전자로 Chloramphenicol acetyltransferase을 암호화하는 catP 유전자, 가이드 RNA인 crRNA 및 tracrRNA 및 Cas9 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터로서, 서열번호 1에 기재된 핵산 서열로 구성된 플라스미드 벡터.
- 제1항의 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 균주의 유전자 제거 또는 치환 방법.
- 제1항의 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 감염 박테리오파지의 유전자 제거 또는 치환 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210153285A KR20230067316A (ko) | 2021-11-09 | 2021-11-09 | CRISPR-Cas9 시스템을 활용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주 및 박테리오파지 유전자 조작 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210153285A KR20230067316A (ko) | 2021-11-09 | 2021-11-09 | CRISPR-Cas9 시스템을 활용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주 및 박테리오파지 유전자 조작 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230067316A true KR20230067316A (ko) | 2023-05-16 |
Family
ID=86546001
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210153285A KR20230067316A (ko) | 2021-11-09 | 2021-11-09 | CRISPR-Cas9 시스템을 활용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주 및 박테리오파지 유전자 조작 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230067316A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190138274A (ko) | 2018-06-04 | 2019-12-12 | 아이에프피 에너지스 누벨레 | 클로스트리디움 박테리아의 변형을 위한 최적화된 유전 툴 |
-
2021
- 2021-11-09 KR KR1020210153285A patent/KR20230067316A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190138274A (ko) | 2018-06-04 | 2019-12-12 | 아이에프피 에너지스 누벨레 | 클로스트리디움 박테리아의 변형을 위한 최적화된 유전 툴 |
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|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal |