KR102147007B1 - Fad3 성능 유전자좌 및 표적화 파단을 유도할 수 있는 상응하는 표적 부위 특이적 결합 단백질 - Google Patents

Fad3 성능 유전자좌 및 표적화 파단을 유도할 수 있는 상응하는 표적 부위 특이적 결합 단백질 Download PDF

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Abstract

세포의 FAD3 유전자에서의 위치를 부위 지정 방식으로 절단하여 FAD3 유전자에서 파단을 생성한 다음, 하나 이상의 관심 형질에 연관된 핵산 분자를 파단 내에 라이게이션함으로써 FAD3 유전자좌 내에서 유전자를 편집하거나 또는 유전자를 스택킹하는 방법이 개시된다.

Description

FAD3 성능 유전자좌 및 표적화 파단을 유도할 수 있는 상응하는 표적 부위 특이적 결합 단백질{FAD3 PERFORMANCE LOCI AND CORRESPONDING TARGET SITE SPECIFIC BINDING PROTEINS CAPABLE OF INDUCING TARGETED BREAKS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 그의 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함되는 2012년 9월 7일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/697,854 및 그의 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함되는 2013년 5월 7일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/820,260의 이익에 대해 우선권을 청구한다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 일반적으로 재조합 식물 기술 (예를 들어, 트랜스제닉 식물을 생성하기 위한 것)에 사용하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 임의의 관심 핵산의 부위-특이적 도입에 사용될 수 있는 그의 게놈 내의 유전자좌를 포함하는 식물 세포 및 식물에 관한 것이다.
다수의 식물은 일반적으로 목적한 형질을 도입하기 위해, 예를 들어 농업상 가치를 개선하기 위해 외인성 핵산 (예를 들어, 트랜스진)으로 유전자 형질전환된다. 유전자 형질전환을 통해 달성할 수 있는 농업상 가치의 개선의 예는 개선된 영양 품질, 증가된 수율, 해충 또는 병해 저항성, 가뭄 및 스트레스 저항성, 개선된 원예학 품질 (예를 들어, 개선된 색소침착 및/또는 성장), 제초제 저항성, 식물로부터의 산업적으로 유용한 화합물 및/또는 물질의 생산, 및/또는 약제의 제조를 포함한다. 식물 세포 내로 클로닝된 유전자의 도입 및 안정한 생식력 있는 트랜스제닉 식물의 회수는 여러 세대를 통해 식물의 유전자 변형을 안정하게 하는데 사용될 수 있고, 이에 따라 작물 식물의 유전자 조작을 가능하게 한다.
유전자 형질전환 및 트랜스제닉 식물 생산 방법에서는, 외인성 DNA를 전형적으로 진핵 식물 세포의 핵 또는 색소체 DNA로 무작위로 도입한 후, 통합된 외인성 DNA를 함유하는 세포를 단리시키고, 안정하게 형질전환된 식물의 후속적인 재생이 이어진다. 트랜스제닉 식물은 전형적으로 아그로박테리움-매개 형질전환 기술에 의해 생성되었다. 이들 기술을 사용한 성공은 관심 핵산 분자를 식물의 게놈 내로 도입하기 위한 다른 방법, 예컨대 원형질체 내의 PEG-매개 DNA 흡수, 미세입자 투사법 (microprojectile bombardment), 및 규소 휘스커 (silicon whisker)-매개 형질전환의 개발을 자극하였다.
그러나, 이들 모든 식물 형질전환 방법에서, 식물 게놈에 혼입된 외인성 핵산은 식물 세포의 게놈에서 무작위로 예측불가능한 카피수로 통합된다 (Terada et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10):1030; Terada et al. (2007) Plant Physiol 144(2):846; D'Halluin et al. (2008) Plant Biotechnology J. 6(1):93). 예를 들어, 트랜스진은 빈번하게 전체 트랜스진 또는 그의 일부의 서열 반복의 형태로 통합된다. 이러한 복합 통합 패턴은 통상적으로 통합된 핵산의 발현 수준에 유해한 영향을 미친다 (예를 들어, 전사후 유전자 침묵 메카니즘을 통한 전사 RNA의 파단에 의해, 또는 통합된 DNA의 메틸화를 유도하는 것에 의해). 또한, 통합 부위의 위치는 통합된 핵산의 발현 수준에 통상적으로 영향을 미친다. 또한, 외인성 DNA의 통합은 통합이 발생한 게놈 영역에 대한 분열 효과를 가질 수 있고, 이에 따라 표적 영역의 정상 기능에 영향을 미치거나 또는 이를 방해하여 바람직하지 않은 부작용을 생산할 수 있다. 상기를 비롯한 인자의 조합은 그것이 동일한 방법에 의해 생성된 것임에도 다양한 트랜스제닉 식물 세포 및 식물 라인들 사이에 트랜스진 또는 외인성 DNA의 발현 수준 (및 전체 농경학상 품질)에서의 광범위한 변화를 초래한다. 통합이 무작위이기 때문에, 실시자가 목적한 특징을 갖는 새로운 식물을 생산하려고 시도하지만 이들 효과는 제어할 수 없다.
상기 고려사항은, 식물 내로의 특정한 외인성 핵산의 도입의 효과가 조사될 때마다, 유의한 결과를 얻기 위해서는 다수의 트랜스제닉 식물 라인이 생성되고 분석되어야 하는 것이 필요하다. 마찬가지로, 목적한 표현형을 갖는 트랜스제닉 식물을 제공하기 위한 특정한 통합 핵산을 함유하는 트랜스제닉 식물의 생성에서는, 핵산을 최적으로 발현하고 트랜스제닉 식물의 전체 표현형 및 성능에 부작용이 최소인 또는 갖지 않는 식물 라인의 선택을 가능하게 하기 위해 독립적으로 생성된 트랜스제닉 식물 라인의 다수의 집단을 생성해야 한다. 이들 실질적인 고려사항은 다중 외인성 핵산 삽입 (즉, 유전자 스택킹)에 의해 생성된 트랜스제닉 식물에서 중요성을 더한다. 이러한 식물에서, 전사후 유전자 침묵과 같은 현상이 증폭될 수 있다.
식물에서 트랜스진 삽입을 제어하기 위한 노력으로 여러 방법이 개발되었다. 예를 들어, 문헌 [Kumar and Fladung (2001) Trends Plant Sci. 6:155-9]을 참조한다. 이들 방법은 원핵생물 및 하등 진핵생물 둘 다에 성공적으로 적용된 상동 재조합-기반 트랜스진 통합에 의존한다 (Paszkowski et al. (1988) EMBO J. 7:4021-6). 그러나, 식물에서, 최근까지 트랜스진 통합을 위한 우세한 메카니즘은 재조합 DNA 가닥들 사이에 거의 상동성을 수반하지 않는 비정규 재조합을 기초로 한다. 따라서, 이 분야의 주요 과제는 비정규 재조합을 통해 보다 훨씬 더 효율적인 통합 사례에 의해 차폐되는 드문 상동성 재조합 사례의 검출 및 선택적 생성이다. 또한, 표적화 상동 재조합 사례의 선택적 생성 및 검출이 달성될지라도, 상기 전략의 최대 이익을 실현하기 위해 사례는 숙주 게놈에서 바람직한 위치를 표적화해야 한다.
예를 들어, 표적화 유전자 형질전환의 추정되는 이익은 무작위 통합으로부터 획득된 형질전환 사례와 비교하여 트랜스진 발현의 사례-대-사례 가변성의 감소이다. 추가로 추정되는 이익은 도입된 핵산을 스크리닝하고, 형질전환 구축물을 분류하고, 생성된 트랜스제닉 식물에서 목적하는 전체 특징에 기여하는 사례를 생산하기 위해 요구되는 사례의 수의 유의한 감소이다. 이들 이익을 실현하기 위해 요구되는 중요한 인자는 트랜스진 성능이 일정하고, 가능하다면, 숙주 식물에 대한 부작용이 제거되거나 또는 최소화되는 게놈 내 특정 위치의 확인이다.
최근에, 게놈 DNA의 표적화된 절단을 위한 방법 및 조성물이 기재되었다. 이러한 표적화 절단 사례를 사용하여, 예를 들어 표적화 돌연변이유발을 유도하고, 세포성 DNA 서열의 표적화 결실을 유도하며, 미리 결정된 염색체 유전자좌에서의 표적화 재조합 및 통합을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 모든 목적을 위해 그의 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Urnov et al. (2010) Nature 435(7042):646-51] 및 미국 특허 공개 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20090263900; 20090117617; 20100047805; 20110207221; 20110301073; 2011089775; 20110239315; 20110145940; 및 국제 공보 WO 2007/014275를 참조한다. 절단은 특이적 뉴클레아제 예컨대, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사-활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)의 사용, 또는 특이적 절단을 유도하도록 조작된 crRNA/tracr RNA ('단일 가이드 RNA')를 갖는 CRISPR/Cas 시스템의 사용을 통해 일어날 수 있다. 미국 특허 공개공보 번호 20080182332는 식물 게놈의 표적화 변형을 위한 비정규 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)의 용도가 기재되어 있으며, 미국 특허 공개공보 번호 20090205083은 식물 EPSPS 유전자좌의 ZFN-매개 표적화 변형이 기재되어 있으며, 미국 특허 공개공보 번호 20100199389는 식물 Zp15 유전자좌의 표적화 변형이 기재되어 있으며, 미국 특허 공개공보 번호 20110167521은 지방산 생합성에 관여하는 식물 유전자의 표적화 변형이 기재되어 있다. 또한, 문헌 [Moehle et al. (2007) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 104(9):3055-3060]은 명시된 유전자좌에서의 표적화된 유전자 부가를 위해 설계된 ZFN의 사용을 기재하고 있다. 미국 특허 공개 20110041195는 동형접합 이배체 유기체를 생성하는 방법을 기재하고 있다.
그러나, FAD3 유전자좌에서의 목적하는 트랜스진의 표적화 삽입을 사용한 식물의 생성을 포함하는 식물에서의 FAD3 유전자의 발현을 변형 및/또는 조절하기 위한 조성물 및 방법에 대한 필요성이 남아있다.
본 개시내용의 간단한 개요
본 개시내용은 FAD3 유전자의 발현 (예를 들어, 식물, 조류 및 진균에서)을 조절하기 위한 조성물 및 방법 및 숙주 세포 내로 관심 핵산 서열 (예를 들어, 외인성 핵산 서열)의 표적화 통합을 위한 부위로서 이들 유전자좌의 이용을 기재한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 그 중 임의의 것 또는 모두가 선택적으로 변형 및/또는 분열될 수 있는 것인 하나 이상의 FAD3 서열을 갖는 하나 이상의 게놈 (예를 들어, 동조체 및/또는 파라로그)을 함유할 수 있다. 구체적 예에서, 본 개시내용은 FAD3A, FAD3A', FAD3C' 및/또는 FAD3C 유전자, 뿐만 아니라 브라시카 나푸스(Brassica napus) (즉 비. 나푸스(B. napus ) 라인, DH12075)에서 상응하는 동조체 또는 파라로그 및 관심 핵산 서열의 표적화 통합을 위한 유전자좌로서의 그의 이용을 기재한다. 본원에 기재된 바와 같이, FAD3 유전자가 숙주에서 지방산 생합성에 관여하지만, 그의 변형 또는 분열 (예를 들어, FAD3 코딩 서열 내에 외인성 핵산의 통합에 의해)은 생성된 숙주 유기체에 대해 예상외로 부작용이 없거나 또는 최소화될 수 있다.
FAD3 유전자좌 내에 특이적 핵산 서열의 절단 및/또는 통합을 생성할 수 있는 폴리펩티드와 연계된 하나 이상의 특정한 FAD3 유전자좌의 사용이 또한 본원에 기재된다. FAD3 유전자좌의 절단 및/또는 통합을 수행할 수 있는 폴리펩티드와 연계된 FAD3 유전자좌의 사용의 예는 아연 핑거 단백질, 메가뉴클레아제, TAL 도메인, TALEN, RNA-유도 CRISPR-Cas9, 레콤비나제, 류신 지퍼, CRISPr/Cas 및 관련 기술분야에 공지되어 있는 다른 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다. 특정한 예는 부위-특이적 DNA 결합 도메인 폴리펩티드 및 절단 도메인 폴리펩티드 (예를 들어, 뉴클레아제)를 포함하는 키메라 ("융합") 단백질, 예컨대 아연-핑거 폴리펩티드 및 FokI 뉴클레아제 폴리펩티드를 포함하는 ZFN 단백질을 포함한다. 예를 들어, 상응하는 동조체 또는 파라로그의 절단 없이 FAD3A, FAD3A', FAD3A", FAD3C, FAD3C', FAD3C" 및 그의 조합에서 결합하여 이중 가닥 파단을 유도하도록 설계된 특정한 ZFN의 시험관내 및 생체내 효능 및 특이성의 입증이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 특정한 FAD3 유전자좌는 상기 폴리펩티드 중 임의의 것과 함께 사용되어 숙주의 농업상 성능에 대해 최소한의 유해한 영향을 가지면서 숙주에서 후속적으로 발현되는 관심 핵산의 부위-특이적 통합에 영향을 미칠 수 있다.
특정 측면에서, FAD3 유전자에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 이러한 폴리펩티드는, 또한 폴리펩티드가 표적화 이중-가닥 파단을 유도하고/거나 파단 부위에서의 관심 핵산의 재조합을 용이하게 할 수 있도록 뉴클레아제 (절단) 도메인 또는 절반-도메인 (예를 들어, ZFN, 레콤비나제, 트랜스포사제 또는 귀소 엔도뉴클레아제, 예컨대 변형된 DNA-결합 도메인, TAL 도메인, TALEN, RNA-유도 CRISPR-Cas9를 갖는 귀소 엔도뉴클레아제), 및/또는 리가제 도메인을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, FAD3 유전자좌를 표적으로 하는 DNA-결합 도메인은 DNA-절단 기능적 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 외인성 핵산을 숙주 유기체 (예를 들어, 식물 또는 동물 종)의 게놈에 하나 이상의 FAD3 유전자좌에서 도입하여 상동 재조합을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 하나 이상의 아연 핑거 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 아연 핑거)를 갖는 아연 핑거 단백질을 포함하고, FAD3 유전자 내의 임의의 서열에 결합하도록 조작 (비-자연 발생)될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 아연 핑거 단백질은 표적 유전자의 코딩 서열 내의 또는 인접한 서열 (예를 들어, 프로모터 또는 다른 발현 요소) 내의 표적 부위에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아연 핑거 단백질은, 예를 들어 표 4에 나타낸 바와 같이, FAD3 유전자 내의 표적 부위에 결합한다. 예시적인 FAD3-결합 아연 핑거의 인식 나선 영역은 표 3에 나타낸다. 아연 핑거 단백질의 하나 이상의 성분 아연 핑거 결합 도메인은 정규 (C2H2) 아연 핑거 또는 비정규 (예컨대, C3H) 아연 핑거일 수 있다 (예를 들어, N-말단 및/또는 C-말단 아연 핑거가 비정규 핑거일 수 있음).
FAD3 유전자를 분열시키거나 또는 편집하는 방법이 또한 본원에 기재된다. 본 발명의 실시양태에 따른 방법에 의해 생성된 유전자 변형된 숙주 유기체 (예를 들어, 트랜스제닉 식물)이 본원에 추가로 기재된다. 특정한 예에서, 본 발명의 한 실시양태에 따른 방법에 의해 생성된 트랜스제닉 유기체는 제한 없이 조류, 진균, 단자엽 식물, 쌍자엽 식물 등일 수 있다.
상기 및 다른 특징은 첨부 도면을 참조로 하여 진행되는, 여러 실시양태의 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
도 1, 패널 a 내지 t는 얼라인엑스(AlignX)®를 사용하여 생성된 FAD3 유전자 서열 (서열 7-12)의 서열 정렬을 나타낸 것이다.
도 2는 이웃 연결 거리에 기반한 잘뷰(Jalview) v 2.3을 사용하여 생성된 FAD3 유전자 서열의 계통발생학적 트리를 나타낸 것이다. 표지된 서열은 다음에 해당한다: FAD3A'/A"는 FAD3A'로서 본원 전반에 걸쳐 기재되고; 반수체형 2는 FAD3C'로서 본원 전반에 걸쳐 기재되고; 반수체형 1은 FAD3C"로서 본원 전반에 걸쳐 기재되고; 반수체형 3은 FAD3A"로서 본원 전반에 걸쳐 기재됨.
도 3은 pDAB107828의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 pDAB107829의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 5는 pDAS000271의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 6은 pDAS000272의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 7은 pDAS000273의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 8은 pDAS000274의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 9는 pDAS000275의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 10은 pDAS000031의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 11은 pDAS000036의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 12는 pDAS000037의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 13은 pDAB107827의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 14는 pDAB107828의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 15는 pDAS000340의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 16은 pDAS000341의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 17은 pDAS000342의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 18은 pDAS000343의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 19는 Fad3C의 개시 및 정지 코돈과 관련하여 프라이머 및 그의 위치의 위치를 나타낸 개략도이다. 패널 a는 야생형 Fad3C 유전자좌에 대한 프라이머 부위의 위치를 나타낸 것이다. 패널 b는 공여자 통합을 확인하기 위한 프라이머 부위의 위치, 및 공여자가 Fad3C 유전자좌 내에 통합될 수 있는 가능한 배향을 나타낸 것이다.
도 20, 패널 A 및 B는 지시된 ZFN 및 공여자 플라스미드를 갖는 변형 후의 서열 정렬을 나타낸 것이다. 도 20a는 ZFN 28051-2A-28052에 의해 인식되는 이중 가닥 파단에서 Fad3C와 pDAS000341의 tGFP 카세트의 접합부로부터 증폭된 서열 정렬을 나타낸 것이다. ":"는 절단 부위에 위치하는 결실을 나타낸 것이다. 서열 300 내지 서열 313이 이 정렬에 제시된다. 도 20b는 ZFN 28051-2A-28052 및 ZFN 28053-2A-28054에 의해 인식되는 이중 가닥 파단에서 Fad3C와 pDAS000343의 tGFP 카세트의 접합부로부터 증폭된 서열 정렬을 나타낸 것이다. ":"는 절단 부위에 위치하는 결실을 나타낸 것이다. 서열 314 내지 서열 327이 이 정렬에 제시된다.
도 21, 패널 A 및 B는 ZFN 28051-2A-28052에 의해 인식되는 이중 가닥 파단에서 FAD3C와 pDAS000340의 hph 카세트의 접합부로부터 증폭된 서열의 서열 정렬을 나타낸 것이다. "샘플"은 분석된 각각의 식물에 대한 고유 식별자이다. ":"는 절단 부위에 위치하는 결실을 나타낸 것이다. 도 21a에 나타낸 서열은 5' 접합부에 대한 것이고, 도 21b에 나타낸 서열은 3' 접합부에 대한 것이다. 서열 368 내지 서열 375가 도 21a의 정렬에 제시된다. 서열 376 내지 서열 377이 도 21b의 정렬에 제시된다.
도 22는 ZFN 28053-2A-28054에 의해 인식되는 이중 가닥 파단에서 FAD3C과 pDAS000342의 hph 카세트의 접합부로부터 증폭된 서열의 서열 정렬을 나타낸 것이다. "샘플"은 분석된 각각의 식물에 대한 고유 식별자이다. ":"는 절단 부위에 위치하는 결실을 나타낸 것이다. 도 22에 나타낸 서열은 3' 접합부에 대한 것이다. 서열 378 내지 서열 379가 이 정렬에 제시된다.
도 23, 패널 a 및 b는 ZFN 28051-2A-28052에 의해 인식되는 이중 가닥 파단에서 FAD3C와 pDAS000340의 hph 카세트의 접합부로부터 증폭된 서열의 서열 정렬을 나타낸 것이다. ":"는 절단 부위에 위치하는 결실을 나타낸다. 도 23a에 나타낸 서열은 5' 접합부에 대한 것이고, 박스 (B)에 나타낸 서열은 3' 접합부에 대한 것이다. 서열 328 내지 서열 334이 도 23a의 정렬에 제시된다. 서열 335 내지 서열 342가 도 23b의 정렬에 제시된다.
도 24, 패널 a 및 b는 ZFN 28053-2A-28054에 의해 인식되는 이중 가닥 파단에서 FAD3C와 pDAS000342의 hph 카세트의 접합부로부터 증폭된 서열의 서열 정렬을 나타낸다. ":"는 절단 부위에 위치하는 결실을 나타낸다. 도 24a에 나타낸 서열은 5' 접합부에 대한 것이고, 도 24b에 나타낸 서열은 3' 접합부에 대한 것이다. 서열 343 내지 서열 346이 도 24a의 정렬에 제시된다. 서열 347 내지 서열 351이 도 24b의 정렬에 제시된다.
서열 목록
핵산 서열은 37 C.F.R. § 1.822에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 나타낸다. 각 핵산 서열의 단지 하나의 가닥을 나타내었지만, 상보적 가닥은 표시된 가닥을 임의로 참조하여 포함된다는 것이 이해된다.
상세한 설명
I. 여러 실시양태의 개관
본 발명의 실시양태는 통합된 핵산에 의해 영향을 받은 것 이외에 숙주의 다른 표현형에 크게 유해한 영향을 미치지 않는 숙주 게놈에서 외인성 핵산 (예를 들어, 트랜스진)의 표적화 통합에 대한 접근법을 확립한다. 일부 실시양태는 단일 숙주 게놈에서의 다중 핵산 "스택킹"에 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 4가지의 상호연결 기술: 특이적 게놈 DNA 위치에서의 이중 가닥 파단의 도입을 허용하는 표적화 기술 (예를 들어, 문헌 [Puchta et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21:5034-40; Siebert and Puchta (2002) Plant Cell 14:1121-31; D'Halluin et al. (2008) Plant Biotechnol. J. 6(1):93-102; Cai et al. (2009) Plant Mol. Biol. 69(6):699-709; Shukla et al. (2009) Nature 459(7245):437-41); Shan et al. (2103) Nature Biotechnol. 31:686-680; Le et al. (2013) Nature Biotechnol 31: 688-691; Nekrasov et al. (2013) Nature Biotechnol. 31:691-693, Ainely et al. (2013) Plant Biotechnol. J. (On Line 19 Aug)] 참조); 최적화된 외인성 (공여자) 핵산의 전달을 허용하는 전달 기술 (Bibikova et al. (2003) Science 300(5620):764); 표적화 공여자 DNA 통합을 위한 HDR 또는 NHEJ 빈도를 증가시키기 위한 숙주 유전자의 변형 (상동 재조합 또는 NHEJ 경로에 위치함)을 포함하는 통합 기술; 표적화 통합 사건을 풍부화 및 특성화하는 분석 툴; 및 형질전환된 숙주 유기체에 대해 크게 유해한 영향을 미치지 않고 세대에 걸쳐 유전학적으로 잘 정해지고 안정한 유전자 발현을 지지하는 목적한 특이적 숙주 게놈 위치 ("성능 유전자좌")의 개발 및 전개를 사용한다. 또한, 미국 특허 공개 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20090263900; 20090117617; 20100047805; 20110207221; 20110301073; 2011089775; 20110239315; 20110145940; 20080182332; 20090205083; 20100199389; 20110167521을 참조한다. 예를 들어, 식물에서, 성능 유전자좌는 트랜스진이 유전자좌에 삽입된 트랜스제닉 식물의 농경학상 또는 품질 특성에 대한 부정적인 영향이 무시할 정도인 또는 존재하지 않는 유전자좌이다.
본원에 기재된 실시양태는 식물 FAD3 유전자가 외인성 핵산 (예를 들어, 유전자(들); 비-코딩 DNA 서열, 예컨대 조작된 랜딩 Pad (ELP) (미국 출원 12/011,735) 및 조작된 트랜스진 삽입 플랫폼 (ETIP) (출원중인 미국 출원 번호 61/697882); 및 식물 형질전환 유닛(들))의 표적화 삽입을 위한 성능 유전자좌라는 예상치 못한 발견의 이점을 이용한다. 식물의 FAD3 유전자좌의 보편적인 특성, 및 카놀라, 옥수수, 해바라기, 밀, 목화 및 대두에서의 FAD3의 변경 또는 녹-아웃이 농경학상 또는 품질 페널티를 수반하지 않는다는 증거는 FAD3 유전자좌가 상업적으로-관련된 식물 종에 걸친 광범위한 부류의 성능 유전자좌임을 확인시킨다.
일부 실시양태는, 예를 들어 표적-부위 특이적 DNA 인식 및 절단 단백질의 전달 및 발현에 기인한 FAD3 유전자좌에서의 부위-특이적 이중-가닥 DNA 절단을 이용한다. 구체적 예에서, 이러한 FAD3-특이적 DNA 인식 및 절단 단백질은, 예를 들어 제한 없이 ZFN; TALEN; RNA-유도 CRISPR-Cas9 시스템, 레콤비나제 (예를 들어, Cre, Hin, RecA, Tre 및 FLP 레콤비나제); 메가뉴클레아제 및 상기 중 임의의 것 또는 그의 등가물로부터 유래하는 조작된 단백질일 수 있다. 절단은 특이적 절단을 유도하기 위해 조작된 crRNA/tracr RNA ('단일 가이드 RNA')를 갖는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 또한 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 이중-가닥 파단은 FAD3 성능 유전자좌 내에, 예를 들어 상동성 지정 복구 (HDR) 또는 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)에 의해 절단 부위로의 공여자 핵산의 통합을 통해 복구될 수 있다.
본 개시내용은, 예를 들어 카놀라 (브라시카 나푸스)의 FAD3A 또는 3C 유전자좌 및 FAD3A 또는 3C 유전자좌에 외인성 핵산을 통합하기 위해 이용될 수 있는 상응하는 FAD3-특이적 ZFN을 기재함으로써 성능 유전자좌로서의 FAD3 유전자좌의 유용성을 예시한다.
본 발명의 실시양태는 관련 기술분야에서 다수의 해결되지 않은 문제를 다룬다. 예를 들어, 본원에 기재된 표적화 통합 접근법의 선택성은 원치 않는 트랜스제닉 사례의 제거에 요구되는, 이 분야에 관련된 자원 및 힘든 규제 요건으로 인한 값비싼 반복되는 실지 시험의 필요성을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 표적화된 DNA 삽입 접근법은 트랜스진 스택킹의 과정에서 특히 유익할 수 있다.
내인성 FAD3 유전자좌에서의 천연 뉴클레오티드 서열이 관심 핵산을 직접적으로 표적으로 하는데 사용될 수 있지만, 일부 실시양태에서 숙주로의 추가의 관심 핵산 분자의 통합이 용이해지도록, 핵산은 먼저 숙주의 적어도 하나의 FAD3 유전자좌를 표적으로 할 수 있다. 다른 예에서, 숙주 유기체의 천연 서열 (예를 들어, 본질적으로 무작위로 발생된 핵산 서열)과 상동이 아니고 DNA 인식 부위 (예를 들어, 아연 핑거 인식 부위)에 플랭킹된 뉴클레오티드 서열이 이용될 수 있다.
II. 용어
특허청구범위를 포함하여 본원에 사용된 바와 같은 단수 및 단수 형태의 용어 (예를 들어, "a," "an," 및 "the")는 그 내용이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "식물" ("plant," "the plant," 또는 "a plant")은 또한 다수의 식물을 지칭한다. 또한, 문맥에 따라, 용어 "식물"의 사용은 또한 그 식물의 유전적으로 유사하거나 또는 동일한 자손을 지칭할 수 있다. 유사하게, 용어 "핵산"은 핵산 분자의 다수의 카피를 지칭할 수 있다. 마찬가지로, 용어 "프로브"은 다수의 유사하거나 또는 동일한 프로브 분자를 지칭할 수 있다.
수치 범위는 범위를 한정하는 수를 포함하고, 한정 범위 내의 각각의 정수 및 비-정수 부분을 명백하게 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 전문 과학 용어는 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 개시내용에 기재된 다양한 실시양태에 관한 검토를 용이하게 하기 위해, 구체적인 용어의 다음 설명을 제공한다.
단리된: "단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 또는 단백질)은 성분의 화학적 또는 기능적 변화를 초래하면서 (예를 들어, 핵산은 핵산을 염색체의 나머지 DNA에 연결시키는 화학 결합을 파단하는 것에 의해 염색체로부터 단리될 수 있음), 그 성분이 자연 발생하는 유기체 세포의 다른 생물학적 성분 (즉, 다른 염색체 및 염색체-외 DNA 및 RNA 및 단백질)로부터 실질적으로 분리되거나, 분리되어 생성되거나, 또는 정제 분리된다. "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 또한, 이 용어는 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 분자, 단백질 및 펩티드를 포함한다.
교배시킨다: 식물에 관하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "교배시킨다" 또는 "교배시킨"은 자손 (예를 들어, 세포, 종자 및 식물)을 생산하기 위한 수분을 통한 배우자의 융합를 지칭한다. 이 용어는 유성 교배 (즉, 또 다른 것에 의한 하나의 식물의 수분) 및 자가 수분 (즉, 예를 들어 동일한 식물로부터의 화분 및 배주를 사용한 자가-수분) 둘 다를 포함한다.
역교배: 역교배 방법을 사용하여 핵산 서열을 식물에 도입할 수 있다. 이 기술은 신규 형질을 식물에 도입하기 위해 수십년 동안 널리 사용되어 왔다 (Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988). 전형적인 역교배 프로토콜에서, 원래의 관심 품종 (반복친)을 이동시킬 관심 핵산 서열을 보유하는 제2 품종 (비-반복친)에 교배시킨다. 상기 교배로부터 생성되는 자손체는 이어서 다시 반복친과 교배되고, 이 과정을, 전환된 식물에서 반복친의 필수적으로 모든 목적하는 형태학적 및 생리학적 특징 뿐만 아니라 비-반복친으로부터의 핵산 서열이 복구되는 전환된 식물이 얻어질 때까지 반복된다.
유전자이입: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유전자이입"은 특정한 유전자좌에서 유전적 배경으로 대립유전자 (또는 외인성 핵산을 포함하는 변형된 대립유전자)의 전달을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유전자좌에서의 특정한 대립유전자의 유전자이입은 동일한 종의 2가지 모 사이의 유성 교배를 통해 대립유전자를 적어도 하나의 자손으로 전달함으로써 발생할 수 있고, 여기서 모 중 적어도 하나는 그의 게놈에서 특정한 대립유전자 형태를 갖는다. 특정한 대립유전자를 포함하는 자손은 바람직한 유전적 배경을 갖는 라인에 대해서 반복해서 역교배될 수 있다. 역교배 자손은 특정한 대립유전자 형태가 유전적 배경에서 고정되어 있는 새로운 품종을 생성하기 위해, 특정한 대립유전자 형태에 대해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정한 대립유전자의 유전자이입은 2가지 공여자 게놈 (예를 들어, 융합된 원형질체에서) 사이의 재조합에 의해 발생할 수 있고, 여기서 공여자 게놈 중 적어도 하나는 그의 게놈에서 특정한 대립유전자 형태를 갖는다. 유전자이입은, 예를 들어 제한 없이 분열 또는 변형된 대립유전자; 트랜스진; PTU; 및 ELP일 수 있는 특정한 대립유전자 형태의 전달을 포함할 수 있다.
생식질: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "생식질"은 개별 식물, 식물의 군 (예를 들어, 식물 라인, 품종 및 패밀리) 및 식물 또는 식물의 군으로부터 유래한 클론의 또는 그로부터의 유전 물질을 지칭한다. 생식질은 유기체 또는 세포의 일부일 수 있거나, 유기체 또는 세포로부터 분리될 수 있다 (예를 들어, 단리됨). 일반적으로, 생식질은 식물의 유전성 품질을 위한 기준인 특정한 분자 구성을 갖는 유전 물질을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 "생식질"은 특정한 식물의 세포; 종자; 특정한 식물의 조직 (예를 들어, 그로부터 새로운 식물이 성장할 수 있는 조직); 특정한 식물의 비-종자 부분 (예를 들어, 잎, 줄기, 수분 및 세포)을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "생식질"은 "유전 물질"과 동의어이고, 식물이 그로부터 전파될 수 있는 종자 (또는 다른 식물 물질)를 지칭하는데 사용될 수 있다. 그로부터 공지된 재배품종이 배양될 수 있고, 그로부터 새로운 재배품종이 생성될 수 있는 "생식질 은행"은 다양한 종자 또는 다른 유전 물질 (여기서 각각의 유전자형이 고유하게 확인됨)의 조직화된 콜렉션을 지칭할 수 있다.
유전자: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유전자" (또는 "유전 요소")는 기능적 중요성을 갖는 유전가능한 게놈 DNA 서열을 지칭할 수 있다. 유전자는 본래 핵산 또는 게놈에 통합된 핵산일 수 있다. 용어 "유전자"는 또한, 예를 들어 제한 없이 유전가능한 게놈 DNA 서열에 의해 코딩된 cDNA 및/또는 mRNA를 지칭하는데 사용될 수 있다.
핵산 분자: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산 분자"는 뉴클레오티드 (즉 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 및/또는 상기 중 어느 하나의 변형된 형태)의 중합체 형태를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 용어는 RNA, cDNA, 게놈 DNA의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다, 및 그의 합성 형태 및 혼합된 중합체를 포함한다. 용어는 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적으로 이중체화된, 삼중체화된, 헤어핀, 환상 및 잠긴 입체형태를 비롯한 임의의 구조적 입체형태를 포함한다. 핵산 분자는 자연 발생 및 변형된 뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드는 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결될 수 있다.
통상의 기술자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 상기 변형은, 예를 들어 제한 없이 표지, 메틸화, 자연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상을 유사체로 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들어, 비하전된 연결, 예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트 및 카르바메이트; 하전된 연결, 예를 들어 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트; 펜던트 모이어티, 예를 들어 펩티드; 삽입제, 예를 들어 아크리딘 및 프소랄렌; 킬레이트화제; 알킬화제; 및 변형된 연결, 예를 들어 알파 아노머 핵산)을 포함한다.
외인성: "외인성" 분자는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 및/또는 게놈 위치 (즉, 유전자좌)와 관련하여 (및 폴리펩티드의 아미노산 서열 및/또는 세포 위치와 관련하여) 특정한 시스템 (예를 들어, 생식질, 변종, 선발 변종 및/또는 식물)에 천연이 아닌 분자이다. 실시양태에서, 외인성 또는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 생물계 (예를 들어, 식물 세포, 식물 유전자, 특정한 식물 종 또는 품종, 및/또는 식물 염색체)에 인공적으로 공급되었고 이러한 특정한 생물계에 대해 천연이 아닌 분자일 수 있다. 따라서, 핵산을 "외인성"으로 지정하는 것은 핵산이 자연 발생 공급원 이외의 공급원으로부터 유래되었음을 가리킬 수 있거나, 또는 핵산이 비-천연의 배향, 유전자 위치, 또는 요소 배열을 갖는 것을 가리킬 수 있다.
반면, 예를 들어 "천연" 또는 "내인성" 핵산은 자연에서 정상적으로 핵산이 발견되는 염색체 또는 다른 유전 물질에 정상적으로 존재하는 것들이 아닌 다른 핵산 요소는 함유하지 않는 핵산 (예컨대 유전자)이다. 내인성 유전자 전사체는 그의 천연 염색체 유전자좌의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 인공적으로 세포에 공급되지 않는다.
작동가능하게 연결된: 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때, 제1 뉴클레오티드 서열은 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 줄 때 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 재조합 방식으로 생산될 때, 작동가능하게 연결된 핵산 서열은 일반적으로 인접하고, 2개의 단백질-코딩 영역을 연결하기 위해 필요한 경우에 동일한 리딩 프레임에 존재한다. 그러나, 요소들이 작동가능하게 연결되기 위해 인접할 필요는 없다.
프로모터: 프로모터는 일반적으로 핵산의 전사를 증진시키는 핵산의 상류 (5' 영역 방향으로) 위치한 DNA의 영역이다. 프로모터는 작동가능하게 연결된 핵산(들)의 적절한 활성화 또는 억제를 허용한다. 프로모터는 전사 인자에 의해 인식되는 특정 서열을 함유한다. 이들 인자는 프로모터 DNA 서열에 결합하여 핵산의 코딩 영역으로부터 RNA를 합성하는 효소인 RNA 폴리머라제의 동원을 유도한다. 형질전환된: 벡터가 핵산 분자를 세포로 전달할 때 벡터는 세포를 "형질전환시킨다" 또는 "형질도입시킨다". 세포는 핵산 분자가 핵산 분자의 세포 게놈 내로의 도입에 의해 또는 에피솜 복제에 의해 세포에 의해 안정하게 복제될 때 핵산 분자에 의해 "형질전환"된 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환"은 핵산 분자를 상기 세포 내로 도입할 수 있는 모든 기술을 포함한다. 예는 바이러스 벡터를 사용한 형질감염; 플라스미드 벡터를 사용한 형질전환; 전기천공 (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3); 리포펙션 (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); 미세주사 (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); 아그로박테리움-매개 전달 (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); 직접 DNA 흡수; 및 미세입자 투사법 (Klein et al. (1987) Nature 327:70)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
도입된: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "도입된"은 세포 내로의 외인성 핵산의 전위에 관해 언급할 때, 관련 기술분야에서 이용가능한 임의의 방법론을 사용하는 핵산의 세포 내로의 혼입을 지칭한다. 이 용어는, 예를 들어 제한 없이 형질감염; 형질전환; 및 형질도입을 포함하는 핵산 도입 방법을 포함한다.
트랜스진: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "트랜스진"은 관심 외인성 핵산 코딩 서열을 지칭한다. 예를 들어, 트랜스진은 산업적으로 또는 제약상 유용한 화합물 또는 바람직한 농업상 형질 (예를 들어, 제초제 저항성 또는 해충 저항성)에 기여하는 발현 산물을 코딩할 수 있다. 추가의 예에서, 트랜스진은 안티센스 핵산의 발현을 통해 표적 핵산 서열의 발현이 억제되는 것인, 안티센스 핵산일 수 있다. 트랜스진은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FAD3 유전자좌에서의 부위-특이적 표적화에 의해 도입되는 관심 핵산 분자는 트랜스진이다. 그러나, 다른 실시양태에서, 관심 핵산 분자는 PTU, ELP, ETIP 또는 내인성 핵산 서열 (예를 들어, 여기서 내인성 핵산 서열의 추가의 외인성 게놈 카피가 바람직함)일 수 있다.
요소는 또한 구조적 RNA, 예컨대 shRNA를 코딩하는 DNA를 포함할 수 있다. 이러한 RNA는 제초제 저항성을 개시하거나 또는 부여하는데 영향을 미치는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 외인성 또는 내인성 유전자를 변형시킬 수 있다.
재조합: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합"은 인간 개입에 의해 변경된 물질 (예를 들어, 핵산, 유전자, 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드)를 지칭한다. 예를 들어, 그의 발현 및/또는 활성을 최적화하기 위해, 예를 들어 재조합 분자의 부분 또는 요소의 배열이 그의 천연 배열이 아닐 수 있고/거나 재조합 분자의 일차 서열이 그의 천연 서열로부터 변화될 수 있다. 물질은 그의 천연 환경 또는 상태 내에서 재조합 물질을 생성하도록 변경될 수 있거나 또는 그로부터 제거될 수 있다. 한 예로서, 핵산의 오픈 리딩 프레임은, 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열이 그 천연 상황으로부터 제거되어, 인공 핵산 분자 (예를 들어, 벡터) 내로 클로닝되는 경우에 재조합된 것이다. 재조합 분자 (예를 들어, 재조합 핵산)을 생산하기 위한 프로토콜 및 시약은 관련 기술분야에서 일반적이고, 그의 용도는 일상적이다. 용어 "재조합"은 또한 본원에서 재조합 물질을 포함하는 세포 또는 유기체 (예를 들어, 재조합 핵산을 포함하는 식물 및/또는 식물 세포)를 지칭할 수 있다. 일부 예에서, 재조합 유기체는 트랜스제닉 유기체이다.
벡터: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 적어도 하나의 핵산 절편(들)을 세포 내로 전달할 수 있는 폴리뉴클레오티드 또는 다른 분자를 지칭한다. 벡터는 벡터 유지를 매개하고/거나 그의 의도된 용도를 가능하게 하는 성분/요소 (예를 들어, 복제를 위해 필요한 서열, 약물 또는 항생제 저항성을 부여하는 유전자, 다중 클로닝 부위, 및/또는 클로닝된 유전자의 발현을 가능하게 하는 작동가능하게 연결된 프로모터/인핸서 요소)를 임의로 포함할 수 있다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 박테리오파지 또는 식물 또는 동물 바이러스로부터 유래할 수 있다. "클로닝 벡터", "셔틀 벡터" 또는 "서브클로닝 벡터"는 클로닝 또는 서브클로닝 단계를 용이하게 하기 위해 작동가능하게 연결된 요소 (예를 들어, 다중 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 다중 클로닝 부위)를 일반적으로 포함한다.
발현 벡터: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현 벡터"는 특정한 숙주 유기체에서 코딩 서열의 발현을 용이하게 할 수 있는 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 지칭한다. 예를 들어, 박테리아 발현 벡터는 박테리아에서 코딩 서열의 발현을 용이하게 할 수 있다. 마찬가지로, 식물 발현 벡터는 식물 세포에서 코딩 서열의 발현을 용이하게 할 수 있다. 원핵생물에서 발현을 용이하게 하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 제한 없이 프로모터; 오퍼레이터; 및 리보솜 결합 부위를 포함할 수 있다. 진핵 발현 벡터 (예를 들어, 식물 발현 벡터)는, 예를 들어 프로모터; 인핸서; 종결 신호; 및 일반적으로 원핵 발현 벡터에서 사용된 것과 상이한 폴리아데닐화 신호 (및 다른 서열)을 포함할 수 있다.
서열 동일성: 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교창에 대해 최대로 상응하도록 정렬하였을 때, 2개의 서열 중의 동일한 잔기를 지칭한다. 서열 동일성의 값은 비교창에 대해 2개의 최적화로 정렬된 서열 (예를 들어, 핵산 서열 및 아미노산 서열)을 비교함으로써 결정할 수 있고, 여기서 비교창 내의 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (첨가 또는 결실을 포함하지 않는 것)에 비해 첨가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 서열 동일성은 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 서열 둘 다에 존재하는 위치의 개수를 결정함으로써 매칭되는 위치의 개수를 구하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교창 내의 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과치에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 구함으로써 백분율로서 계산된다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 관련 기술분야에 익히 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘은, 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50]에 기재되어 있다. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 관한 상세한 고려 사항은 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]에서 찾아볼 수 있다.
여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위한 것으로 미국 국립 생물 정보 센터 (NCBI)의 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool: BLAST™; Altschul et al. (1990))은 서열을 정렬하기 위해 사용할 수 있고, 미국 국립 생물 정보 센터 (메릴랜드주 베데스다)를 비롯한 여러 공급원으로부터, 및 인터넷 상에서 이용가능하다. 상기 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법에 관한 설명은 인터넷 상에서 BLAST™에 대한 "도움말" 섹션에서 이용가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, 디폴트 파라미터를 사용하여 BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능을 사용할 수 있다. 참조 서열에 대해 보다 큰 유사성을 갖는 핵산 서열은 상기 방법에 의해 평가되었을 때 증가된 동일성 백분율을 나타낼 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "실질적으로 동일한"은 80% 초과로 동일한 뉴클레오티드 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열은 참조 서열에 대해 적어도 85%; 적어도 86%; 적어도 87%; 적어도 88%; 적어도 89%; 적어도 90%; 적어도 91%; 적어도 92%; 적어도 93%; 적어도 94%; 적어도 95%; 적어도 96%; 적어도 97%; 적어도 98%; 적어도 99%; 또는 적어도 99.5% 동일할 수 있다.
유전자좌: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "유전자좌"는 측정가능한 특징 (예를 들어, 형질)에 해당하는 게놈 상의 위치를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 특정한 관심 유전자좌는 FAD3 유전자의 게놈 위치이며, 여기서 이 유전자의 분열이 야생형 유전자로부터 전사된 mRNA의 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 유전자좌는 서던 혼성화 또는 PCR 동안 유전자좌 내에 함유된 특유한 뉴클레오티드 서열과 혼성화되는 프로브에 의해 정의될 수 있다.
마커: 본원에 사용된 바와 같은 "마커"는 특정한 대립유전자를 가질 가능성이 있고/거나 특정한 형질 또는 표현형을 나타낼 가능성이 있는 식물을 확인하는데 사용될 수 있는 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 마커는 주어진 게놈 유전자좌에서의 변이로서 기재될 수 있다. 유전자 마커는 짧은 DNA 서열, 예컨대 단일 염기-쌍 변화 (단일 뉴클레오티드 다형성, 또는 "SNP")를 둘러싸는 서열, 또는 긴 서열, 예를 들어 미소부수체/단순 서열 반복체 ("SSR")일 수 있다. "마커 대립유전자"는 특정한 식물에 존재하는 마커의 버전을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 마커는 식물 염색체 DNA의 클로닝된 절편 (예를 들어, FAD3 유전자좌, 또는 변형 및/또는 분열된 FAD3 유전자좌를 포함하는 절편)을 지칭할 수 있고, 또한 또는 대안적으로 식물 염색체 DNA의 클로닝된 절편에 상보적인 DNA 분자를 지칭할 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 마커에 포함시키기 위한 부가적인 인접 뉴클레오티드 서열을 수득하는 과정은 거의 무한정 반복될 수 있으며 (염색체의 길이에 의해서만 제한됨), 이에 따라 염색체에 따른 부가적인 마커가 확인된다. 상기 기재된 임의의 모든 마커의 변이가 본 발명의 일부 실시양태에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 생식질 중의 트랜스진 또는 마커의 존재 (이것은 "표적" 서열을 특징으로 함)는 핵산 프로브; 예를 들어, 올리고뉴클레오티드를 사용함을 통해 검출될 수 있다. 프로브는 DNA 분자, 또는 RNA 분자일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 합성하여 또는 클로닝에 의해 제조될 수 있다. 적합한 클로닝 벡터는 통상의 기술자에게 익히 공지되어 있다. RNA 프로브는 관련 기술분야에 공지된 수단에 의해, 예를 들어 DNA 분자 주형을 사용하여 합성될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프로브는 표지될 수 있거나 또는 표지되지 않을 수 있다. 예를 들어, 제한 없이 닉 번역에 의한 방사성 표지; 무작위 프라이밍; 및 말단 데옥시트랜스퍼라제를 사용한 꼬리달기를 포함하는 광범위한 기술이 핵산 분자를 표지하기 위해 존재하고, 이때 사용된 뉴클레오티드는, 예를 들어 방사성 32P로 표지된다. 사용될 수 있는 다른 표지는, 예를 들어 제한 없이 형광단; 효소; 효소 기질; 효소 보조인자; 및 효소 억제제를 포함한다. 대안적으로, 그 자체로 또는 다른 반응성 작용제와 함께 검출가능한 신호를 제공하는 표지를 사용하는 것이 수용체가 결합하는 리간드에 의해 대체될 수 있고, 이때 수용체는 그 자체로 또는 다른 시약과 함께 검출가능한 신호를 제공하도록 표지된다 (예를 들어, 상기 나타낸 표지에 의해). 예를 들어, 문헌 [Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045-9]을 참조한다.
프로브는 검출하고자 하는 트랜스진 또는 마커의 정확한 카피일 수 있다. 프로브는 또한 검출할 트랜스진 또는 마커를 포함하는 염색체 DNA의 클로닝된 절편과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어지는 핵산 분자일 수 있다. 프로브는 추가의 핵산 서열, 예를 들어 프로모터; 전사 신호; 및/또는 벡터 서열을 추가로 포함할 수 있다.
프로브는 표적 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부 및 게놈으로부터의 추가의 인접 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 이는 본원에서 "인접 프로브"로서 지칭된다. 통상적으로 이해되는 바와 같이, 염색체로부터의 인접 뉴클레오티드 서열이 최초 마커의 5'측에 있느냐 또는 3'측에 있느냐에 따라, 인접 뉴클레오티드 서열은 최초 표적의 "상류" 또는 "하류"로서 지칭된다. 프로브는 또한 최초 표적의 뉴클레오티드 서열에 인접하지 않는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있고; 상기 프로브는 본원에서 "비-인접 프로브"로서 지칭된다. 비-인접 프로브의 서열은 비-인접 프로브가 최초 마커 또는 트랜스진에 연결되도록 염색체의 최초 표적의 서열에 충분히 근접하게 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브는 검출할 표적의 정확한 카피에 "특이적으로 혼성화가능한" 또는 "특이적으로 상보적인" 핵산 분자이다. "특이적으로 혼성화가능한" 및 "특이적으로 상보적인"은 핵산 분자와 표적간에 안정하고 특이적인 결합이 일어나도록 하는 충분한 정도의 상보성을 가리키는 용어이다. 핵산 분자는 특이적으로 혼성화가능할 수 있는 것이 되기 위해 그의 표적 서열에 대하여 100% 상보적일 필요는 없다. 특이적 결합이 바람직한 조건 하에, 예를 들어 엄격한 혼성화 조건 하에 핵산이 비-표적 서열에 비-특이적으로 결합하는 것을 방지하는 충분한 정도의 상보성이 존재하는 경우에 핵산 분자가 특이적으로 혼성화할 수 있다.
특정한 정도의 엄격성에 이르게 하는 혼성화 조건은 선택되는 혼성화 방법의 특성, 및 혼성화 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히, Na+ 및/또는 Mg++ 농도)가 혼성화의 엄격성을 결정할 것이지만, 세척 시간 또한 엄격성에 영향을 미친다. 특정한 정도의 엄격성을 달성하는데 필요한 혼성화 조건에 관한 계산은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 이는, 예를 들면 문헌 [Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; 및 Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985]에 논의되어 있다. 핵산 혼성화에 관한 추가의 상세한 지침서 및 안내를, 예를 들어 문헌 [Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; 및 Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995]에서 찾아볼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "엄격한 조건"은 혼성화 분자와 DNA 표적 사이에 25% 미만의 미스매치가 존재하는 경우에만 혼성화가 발생할 조건을 포함한다. "엄격한 조건"은 특정한 수준의 염격성을 추가로 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "온건한 엄격성" 조건은 25% 초과의 서열 미스매치가 있는 분자가 혼성화하지 않을 조건이고, "중간 엄격성"의 조건은 15% 초과의 미스매치가 있는 분자가 혼성화하지 않을 조건이며, "높은 엄격성"의 조건은 10% 초과의 미스매치가 있는 서열이 혼성화하지 않을 조건이다. "매우 높은 엄격성"의 조건은 6% 초과의 미스매치가 있는 서열이 혼성화하지 않을 조건이다.
특정한 실시양태에서, 엄격한 조건은 65℃에서 6x 염수-시트르산나트륨 (SSC) 완충제, 5x 덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100 μg 전단 연어 고환 DNA 중에서 혼성화한 후, 65℃에서 2x SSC 완충제 및 0.5% SDS에 이어서 1x SSC 완충제 및 0.5% SDS, 및 최종적으로 0.2x SSC 완충제 및 0.5% SDS를 사용하여 순차적으로 15-30분 세척하는 것이다.
연관 (불)평형: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "연관 평형"은 마커 및 제2 핵산 (예를 들어, 트랜스진, PTU 및 제2 마커)이 독립적으로 분리된 상황을 지칭하며; 즉, 마커 및 제2 핵산이 자손 중에 무작위로 정렬되는 것이다. 연관 평형을 나타내는 핵산은 (이것이 동일한 염색체 상에 있든지 아니든지) 연관되지 않은 것으로 간주된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "연관 불평형"은 마커 및 제2 핵산이 비-무작위 방식으로 분리되는 상황을 지칭하며; 즉, 핵산은 50% 미만 (및 정의에 의해 따라서 동일한 연결 기에 대해 50 cM 미만으로 분리됨)의 재조합 빈도를 갖는다. 일부 예에서, 연관 불평형을 나타내는 핵산은 연관된 것으로 간주된다.
연관된, 긴밀하게 연관된, 및 극도로 긴밀하게 연관된: 본원에 사용된 바와 같은 마커와 제2 핵산 (예를 들어, 트랜스진, PTU 및 제2 마커) 사이의 연관은 염색체 상의 핵산이 차세대에서 개체에게 함께 전달되는 측정가능한 확률을 나타내는 현상를 지칭할 수 있다. 따라서, 제2 핵산에 대한 하나의 마커의 연관은 재조합 빈도로서 측정 및/또는 표현할 수 있다. 2개의 핵산이 서로 근접할수록, 이 확률은 "1"에 근접하게 된다. 따라서, 용어 "연관된"은 제2 핵산과 함께 0.5보다 큰 확률 (마커/유전자가 상이한 염색체 상에 위치하는 독립적인 분류로부터 예상되는 것)로 전달되는 하나 이상의 유전자 또는 마커를 지칭할 수 있다. 유전자 (예를 들어, 트랜스진)의 존재가 개체에서의 표현형에 기여할 때, 그 유전자와 연관된 마커는 그 표현형과 연관되어 있는 것으로 볼 수 있다. 따라서, 용어 "연관된"은 마커와 유전자, 또는 마커와 표현형 사이의 관계를 지칭할 수 있다.
상대 유전자 거리 (교차 빈도에 의해 결정되고, 센티모르간 (cM)으로 측정됨)는 일반적으로 2개의 연관된 마커 또는 유전자가 염색체 상에서 서로 분리되는 물리적 거리 (염기 쌍으로 측정됨)에 비례한다. 1 센티모르간은 1% 재조합 빈도 (즉, 교차 사례가 2개의 마커 사이에서 100개의 세포 분열마다 1회 발생)를 나타내는 2개의 유전자 마커 사이의 거리로서 정의된다. 일반적으로, 하나의 마커가 또 다른 마커 또는 유전자에 보다 근접할수록 (이들 사이의 거리가 유전자 거리 또는 물리적 거리의 관점에서 측정되든지 아니든지), 이것은 보다 긴밀하게 연관된다. 염색체 거리가 형질 사이의 재조합 사례의 빈도에 대략 비례하기 때문에, 재조합 빈도와 관련된 대략적인 물리적 거리가 존재한다. 이 상관관계는 일반적으로 공지되어 있거나 또는 주요 작물 식물 (Helentjaris and Burr (eds.) (1989) Development 및 Application of Molecular Markers to Problems in Plant Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Gresshoff (ed.) (1994) Plant Genome Analysis. CRC Press, Boca Raton, FL; Lander et al. (1987) Genomics 1:174-81; Tanksley et al. (1988) "Molecular mapping of plant chromosomes," In Chromosome Structure and Function. Gustafson and Appels (eds.) Plenum Press, NY, pp. 157-73) 및 다른 다수의 유기체에 걸쳐 용이하게 결정가능하다. 예를 들어, 1 cM은 효모에서 약 2.5-3.0 kb, 아라비돕시스(Arabidopsis)에서 약 140 kb, 해바라기의 약 400 kb 및 유칼립투스(Eucalyptus)에서 약 350 kb에 상응한다.
용어 "연관된"은 본원에서 50% 미만의 재조합 빈도 (즉, 50 cM 미만)를 나타내는 하나 이상의 핵산을 지칭할 수 있다. 예를 들어, "연관된" 핵산은 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하, 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 및 약 10% 이하의 빈도로 재조합될 수 있다. 상기 재조합 빈도에 상응하는 동일한 염색체 (상이한 염색체 상의 핵산이 연관 평형에 있을 것으로 예상됨) 상의 이러한 핵산 사이의 물리적 거리는 숙주 게놈에 좌우되고, 상기 문헌에 제시된 바와 같이 용이하게 계산될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "긴밀하게-연관된"은 약 20% 이하 (즉, 약 20 cM 이하)의 재조합 빈도를 나타내는 하나 이상의 핵산를 지칭할 수 있다. 예를 들어, "긴밀하게 연관된" 핵산은 22% 이하, 약 18% 이하, 약 16% 이하, 약 14% 이하, 약 12% 이하, 약 10% 이하, 약 8% 이하, 약 6% 이하, 약 4% 이하, 및 약 2% 이하의 빈도로 재조합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "극도로 긴밀하게 연관된"은 약 10% 이하의 재조합 빈도 (즉, 약 10 cM 이하)를 나타내는 하나 이상의 핵산를 지칭할 수 있다. 예를 들어, "극도로 긴밀하게 연관된" 핵산은 11% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 및 약 1% 이하의 빈도로 재조합될 수 있다.
특정한 핵산이 특정한 표현형에 기여하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 근접할수록 (유전적 또는 물리적 거리의 관점에서 측정되든지 아니든지), 특정한 핵산은 표현형에 더 긴밀하게-연관된 것이다. 상기를 고려하여, 특정한 유전자 또는 표현형에 연관된 핵산이 유전자 또는 표현형에 긴밀하게 연관된 핵산, 및 극도로 긴밀하게 연관된 핵산을 포함한다는 것이 인식될 것이다. 일부 실시양태에서, 유전적 또는 물리적 거리의 관점에서 측정되든지 아니든지, 특정한 핵산이 FAD3 유전자좌 (예를 들어, 변형 또는 분열된 FAD3 유전자좌)에 더 근접할수록, 특정한 핵산은 FAD3 유전자좌에서 통합된 외인성 핵산에 의해 부여된 임의의 형질/표현형 (또는 비변형된 유전자좌의 경우에 야생형 FAD3 표현형)에 더 긴밀하게-연관된 것이다. 따라서, 통합된 외인성 핵산을 포함하는 FAD3 유전자좌에 연관된, 긴밀하게 연관된 및/또는 극도로 긴밀하게 연관된 유전자 마커는 통합된 핵산을 포함하는 유기체 (예를 들어, 식물 및 식물 품종)를 확인하고, 통합된 핵산에 의해 부여된 표현형을 포함하는 유기체를 확인하고, 이러한 통합된 핵산 및/또는 통합된 핵산에 의해 부여된 표현형을 다른 적합한 유기체 내에서 육종하기 위한 MAS 프로그램에서 유용할 수 있다.
마커-지원 육종: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "마커-지원 육종"은 직접적으로 1종 이상의 형질(들) (예를 들어, 다유전자 형질)에 대한 육종 식물에 대한 접근법을 지칭할 수 있다. 현행 실무에서, 식물 육종가는 용이하게 검출가능한 형질, 예컨대 농경학적으로 목적하는 형질과 연관되어 있는 화색, 종피 외관, 또는 동종효소 변이체를 확인하고자 시도한다. 이어서 식물 육종가들은 용이하게 검출가능한 형질의 분리를 추적함으로써 분리 육종 집단에서의 농경학상 형질을 추적한다. 그러나, 식물 육종에 사용하기 위해 이용가능한 용이하게 검출가능한 형질과 관심 형질 사이의 이들 연관 관계는 거의 없다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 마커-지원 육종은, 관심 형질에 기여하는 외인성 핵산이 통합된 FAD3 유전자좌에 연관된 하나 이상의 유전자 마커 (예를 들어, SNP, 동종효소 및/또는 SSR 마커)를 확인하고, 하나 이상의 유전자 마커의 분리를 추적함으로써 분리 육종 집단을 추적하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 유전자 마커의 분리는 하나 이상의 유전자 마커의 존재에 대해 자손 식물로부터 유전자 샘플을 분석함으로써 하나 이상의 유전자 마커에 대한 프로브를 이용하여 결정될 수 있다. 마커-지원 육종은 식물 품종의 개량을 위한 시간- 및 비용-효과적인 과정을 제공한다.
형질 또는 표현형: 용어 "형질" 및 "표현형"은 상호교환가능하게 본원에서 사용된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 특정한 관심 형질은, 예를 들어 작물 식물에서 발현될 수 있는 바와 같이 농경학적으로 중요한 형질, 및 표적화 통합 사례로부터의 트랜스진 발현 생성물의 제조를 포함한다. 용어 "분자 표현형"은 분자 (하나 이상)의 집단의 수준이 검출가능한 것인 표현형을 지칭할 수 있다. 일부 예에서, 분자 표현형은 분자 수준에서만 검출가능한 것일 수 있다. 표현형의 검출가능한 분자는 핵산 (예를 들어, 게놈 DNA 또는 RNA); 단백질; 및/또는 대사물일 수 있다. 예를 들어, 분자 표현형은 하나 이상의 유전자 산물에 대한 발현 프로파일 (예를 들어, 식물 발생의 특정한 단계에서, 또는 환경 조건 또는 스트레스에 대한 반응으로)일 수 있다.
정량적 형질 유전자좌: 유전적 영향 (상가적, 우성 및 상위성) 및 환경적 영향으로 인해 계속 달라지는 형질은 통상적으로 "정량적 형질"로서 지칭된다. 정량적 형질은 2개 인자; 표현형의 연속 분포를 생성하는 유전자 발현에 대한 환경적 영향 및 다유전자성 유전에 의해 생성되는 복합 분리 패턴에 기반한 "정성적" 또는 "이산" 형질로 구별될 수 있다. 정량적 형질의 발현에 연관된 게놈의 하나 이상 영역의 확인은 정량적 형질 유전자좌 ("QTL")와 같은 영역으로 정의한다.
식물: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "식물"은 전체 식물, 식물로부터 유래한 세포 또는 조직 배양물 및/또는 상기 중 임의의 것의 임의의 부분를 지칭할 수 있다. 따라서, 용어 "식물"은, 예를 들어 제한 없이 전체 식물; 식물 성분 및/또는 기관 (예를 들어, 잎, 줄기 및 뿌리); 식물 조직; 종자; 및 식물 세포를 포함한다. 식물 세포는, 예를 들어 제한 없이 식물 내의 세포 및/또는 식물 세포, 식물로부터 단리된 세포 및 식물로부터 단리된 세포의 배양을 통해 획득한 세포일 수 있다.
"트랜스제닉 식물"은 그의 세포 중 적어도 하나에 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물이다. 용어 "트랜스제닉"은 본원에서 임의의 세포, 세포주, 캘러스, 조직, 식물 부분 또는 그의 유전자형이 외인성 핵산의 존재에 의해 변경된 식물을 지칭하는데 사용된다. 따라서, 이 용어는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 초기에 변경되고 초기 트랜스제닉 유기체 또는 세포의 교배 또는 무성 번식에 의해 생성된 것인 트랜스제닉 유기체 및 세포를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "트랜스제닉"은 종래 식물 육종 방법 (예를 들어, 단지 비-트랜스제닉 유기체의 교배) 또는 자연 발생 사례 (예를 들어, 무작위 교배-수정, 비-재조합 바이러스 감염, 비-재조합 박테리아 형질전환, 비-재조합 전위 및 자발적 돌연변이)에 의해 도입된 게놈 (염색체 또는 염색체외) 교대를 포함하지 않는다.
식물 "라인", "품종" 또는 "균주"는 동일한 혈통을 갖는 개별 식물의 군이다. 식물 라인은 일반적으로 어느 정도로 근교배되고, 일반적으로 대부분의 유전자좌 (예를 들어, FAD3 유전자좌)에서 동형접합 및 동종이다. "서브라인"은 동일한 선조로부터 유래한 다른 유사한 근교배 하위세트와 유전적으로 구분되는 공통 선조로부터의 후손의 근교배 하위세트를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, "서브라인"은 나머지 분리 유전자좌가 유전자좌의 대부분 또는 전부에 걸쳐 동형접합일 때까지 F3 내지 F5 세대에서 선택된 개별 트랜스제닉 식물로부터 종자를 근교배시킴으로써 생성될 수 있다.
"결합 단백질"은 또 다른 분자와 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어 DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우, 이는 자신에게 결합할 수 있고/있거나 (동종이량체, 동종삼량체 등을 형성), 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 결합 활성의 유형이 한가지를 초과할 수 있다. 예를 들어, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합 활성, RNA-결합 활성 및 단백질-결합 활성을 갖는다.
"아연 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는, 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이고, 이때 상기 아연 핑거는 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"은 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩티드이다. 반복 도메인은 TALE의 그의 동족 표적 DNA 서열에 대한 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위" ("반복체"로도 언급됨)는 일반적으로 33-35개 아미노산 길이이고, 자연 발생 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복 서열과 적어도 몇몇의 서열 상동성을 나타낸다.
아연 핑거 및 TALE 결합 도메인은, 예를 들어 자연 발생 아연 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작 (하나 이상의 아미노산의 변경)을 통해 소정의 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 따라서, 조작된 DNA 결합 단백질 (아연 핑거 또는 TALE)은 비-자연 발생 단백질이다. DNA-결합 단백질의 조작 방법의 비-제한적 예는 설계 및 선택이다. 설계된 DNA 결합 단백질은 그의 설계/조성이 주로 합리적인 기준에 의해 이루어지는 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계의 합리적인 기준은 존재하는 ZFP 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이터의 데이터베이스 저장 정보에서의 정보 처리를 위한 치환 규칙 및 컴퓨터 알고리즘의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 미국 공개공보 번호 20110301073을 참조한다.
"선택된" 아연 핑거 단백질 또는 TALE는 그의 생산이 주로 실험 처리, 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택에 의해 이루어지는 자연에서 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들어, US 5,789,538; US 5,925,523; US 6,007,988; US 6,013,453; US 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970, WO 01/88197, WO 02/099084 및 미국 공개공보 번호 20110301073을 참조한다.
"절단"은 DNA 분자의 공유결합 백본의 파단을 지칭한다. 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 절단이 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단 및 이중-가닥 절단 둘 다 가능하고, 이중-가닥 절단은 2개의 별도의 단일-가닥 절단 사례의 결과로서 발생할 수 있다. DNA 절단으로 평활 말단 또는 엇갈린 말단이 생산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 융합 폴리펩티드가 표적화된 이중-가닥 DNA 절단에 사용된다.
"절단 절반-도메인"은, 제2의 폴리펩티드 (동일하거나 상이함)와 함께, 절단 활성 (바람직하게는 이중-가닥 절단 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열이다. 용어 "제1 및 제2 절단 절반-도메인", "+ 및 - 절단 절반-도메인" 및 "우측 및 좌측 절단 절반-도메인"은 이량체화하는 절단 절반-도메인의 쌍을 지칭하는데 상호교환가능하게 사용된다.
"조작된 절단 절반-도메인"은 또 다른 절단 절반-도메인 (예를 들어, 또 다른 조작된 절단 절반-도메인)과 절대적 이종이량체를 형성하도록 변형된 절단 절반-도메인이다. 또한, 그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개공보 번호 2005/0064474, 20070218528, 2008/0131962 및 2011/0201055를 참조한다.
이중 가닥 DNA 파단을 생성하는 수단: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "이중 가닥 DNA 파단을 생성하는 수단"은 35 U.S.C. § 112, 제6 단락에서의 의회에 의해 공인된 특별한 청구 조항을 원용하도록 의도된다. 특히, "이중 가닥 DNA 파단을 생성하는 수단"은 이중-가닥 DNA 분자의 양쪽 가닥을 절단할 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 이러한 구조는 다수의 공지된 뉴클레아제 단백질, 예를 들어 FokI 뉴클레아제 도메인 내에 포함되는 폴리펩티드 도메인을 포함하며, 촉매 도메인은 단백질 Mmel, 콜리신-E7 (CEA7_ECOLX), 콜리신-E9, APFL, EndA, 엔도 I (END1 EC0LI), 인간 엔도 G (NUCG_HUMAN), 소 엔도 G (NUCG_BOVIN), R.HinPll, l-Basl, l-Bmol, l-Hmul, l-Tevl, l-Tevll, l-Tevlll, l-Twol, R.Mspl, R.Mval, NucA, NucM, Vvn, Vvn_CLS, 스타필로코쿠스(Staphylococcal) 뉴클레아제 (NUC_STAAU), 스타필로코쿠스 뉴클레아제 (NUC_STAHY), 미크로코쿠스(Micrococcal) 뉴클레아제 (NUC_SHIFL), 엔도뉴클레아제 yncB, 엔도데옥시리보뉴클레아제 I (ENRN-BPT7), 메트나제(Metnase), Nb.BsrDI, BsrDI A, Nt. BspD6l (R. BspD6l 큰 서브유닛), ss.BspD6l (R. BspD6l 작은 서브유닛), R.PIel, Mlyl, Alwl, Mval269l, Bsrl, Bsml, Nb.BtsCI, Nt.BtsCI, Rl.Btsl, R2.Btsl, BbvCI 서브유닛 1, BbvCI 서브유닛 2, BpulOI 알파 서브유닛, BpulOI 베타 서브유닛, Bmrl, Bfil, l-Crel, 헥솔(hExol) (EX01JHUMAN), 효모 엑솔(Exol) (EX01_YEAST), 이.콜라이(E.coli) 엑솔, 인간 TREX2, 마우스 TREX1, 인간 TREX1, 소 TREX1, 래트 TREX1, 인간 DNA2, 효모 DNA2 (DNA2_YEAST)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이중 가닥 DNA 파단을 복구하는 수단: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "이중 가닥 DNA 파단을 복구하는 수단"은 또한 35 U.S.C. § 112, 제6 단락에서의 의회에 의해 공인된 특별한 청구 조항을 원용하도록 의도된다. 특히, "이중 가닥 DNA 파단을 복구하는 수단"은, 예를 들어 단일 이중-가닥 DNA 분자를 절단함으로써 생성되는 말단을 연결하거나, 또는 외인성 이중-가닥 DNA 분자의 말단으로 단일 이중-가닥 DNA 분자를 절단함으로써 생성되는 하나의 말단을 연결함으로써 이중-가닥 DNA 분자의 말단을 연결하는 것을 용이하게 하거나/촉매작용할 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 이러한 구조는 다수의 공지된 리가제 단백질, 예를 들어 Cre 레콤비나제 내에 포함된 폴리펩티드 도메인을 포함한다. 일부 예에서, 동일한 분자 구조는 이중 가닥 DNA 파단을 생성하는 수단 및 이중 가닥 DNA 파단을 복구하는 수단 둘 다로서 역할을 할 수 있으며, 여기서 동일한 구조는 이중-가닥 DNA 분자 (예를 들어, Hin 레콤비나제)의 절단 및 복구 둘 다를 용이하게 한다.
게놈에서의 부위 특이적 이중 가닥 파단의 유도는 상동성-지정 복구 (HDR) 또는 비-상동성 말단-연결 (NHEJ) 복구를 통해 이중 가닥 파단을 해결하는 숙주 식물 세포 DNA 복구 경로를 유도한다. 식물에서, 과학 문헌은, 본래 게놈 내로 또는 미리 조작된 위치에서의 정확한 유전자 또는 공여자 DNA 통합이 표적화 이중 가닥 파단에 플랭킹된 서열에 상동인 다양한 양의 서열을 포함하는 유입 공여자 DNA 구축물(들)을 수반한다는 것을 보고하고 있다. 특이적 표적 유전자좌로의 이러한 공여자의 통합은 아마도 HDR 경로에 의지했을 것이다. 식물에서 유전자 표적화를 위해 HDR 접근법에 전적으로 의지하는 것은 NHEJ와 비교할 때 HDR 복구 경로가 우세한 DNA 복구 경로가 아니라는 보고로 인해 제한을 가질 수 있다. NHEJ 경로를 파단시키는 표적 특이적 DNA (ZFN, TALeN 또는 조작된 메가뉴클레아제 등)를 이용하는 공개된 식물 과학 문헌은 특정한 점 돌연변이 (삽입 또는 결실)를 게놈에 도입하는 방법으로서 보고되었다. 여기서 본 발명자들은 0 내지 <10 bp의 상동성 영역을 갖는 다양한 공여자 DNA 설계의 존재 하의 부위 특이적 이중 가닥 파단 (ZFN, TALeN 등에 의해 유래함) 식물에서 NHEJ 복구 경로를 통해 표적화된 파단에서 특이적으로 삽입될 수 있음을 보고하였다. 선형 내지 원형의 단일 가닥 내지 이중 가닥의 0 상동성 내지 작은 1-10 bp의 범위를 갖는 상이한 다양한 DNA 공여자 설계는 NHEJ 경로를 사용하는 특정한 위치를 표적화할 수 있다. NHEJ 기반 공여자 DNA 식물 게놈 표적화는 "점착성 말단 포획"에 기반할 수 있고, 여기서 Fok1 (또는 다른 유형 II 엔도뉴클레아제 도메인) 및 상응하는 점착성 말단에 의해 생성된 게놈에서의 표적화된 이중 가닥 파단은 NHEJ 공여자 DNA 설계 상에 있다. 점착성 말단 공여자 DNA는 미리 정의된 오버행을 갖는 선형 공여자 DNA로서 직접적으로 세포에 전달될 수 있다. 대안적 접근법은 숙주 표적 ZFN 및 표적 인식 부위와 동일한 적어도 하나의 ZFN 인식 부위를 함유하는 원형 DNA 공여자 분자를 공-전달함으로써 생체내 공여자 DNA 점착성 말단을 생성하는 것이다. 적어도 하나의 ZFN의 발현은 숙주 게놈 DNA (천연 또는 미리 조작된 것) 및 원형 공여자 DNA를 절단하여 숙주 NHEJ 복구 경로를 사용하여 분해되는 점착성 말단을 생산한다.
공여자 분자 상에 하나 이상의 ZFN 절단 부위를 갖는 것이 가능하다 (전체 공여자 분자를 선형화하기 위한 단일 ZFN 절단 부위, 보다 작은 공여자 DNA 단편을 방출하는 동일한 ZFN 부위 중 2개 또는 숙주 게놈 DNA로부터의 공여자로부터의 단편 및 상응하는 단편을 방출하기 위한 2개의 상이한 ZFN 부위 (DNA 대체)).
따라서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 및/또는 이중-가닥일 수 있고, 선형 또는 원형 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 20100047805 및 20110207221을 참조한다. 특정 경우, 본 발명의 실시양태는 또한 선형 외인성 (공여자) 핵산(들), 이들 핵산을 포함하는 조성물 및 이들 선형 공여자 분자를 제조 및 사용하는 방법을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 선형 공여자 분자는 그것이 도입된 세포를 안정하게 지속한다. 다른 실시양태에서, 선형 공여자 분자는, 예를 들어 공여자 분자의 말단 상에 하나 이상의 염기 쌍 사이의 하나 이상의 포스포로티오에이트 포스포디에스테르 결합을 두는 것으로써 엑소뉴클레아제 절단에 저항하기 위해 변형된다. 선형 외인성 핵산은 또한 단일 가닥 특이적 DNA를 포함할 수 있다.
IV. FAD3 성능 유전자좌
FAD3 (지방산 데새투라제 3)으로 지정된 유전자좌는 식물 중 지방산 함량의 복합적 다유전자성 형질의 유전에 관련된 QTL에 포함된다. FAD3은 리놀레산 (18:2)의 리놀렌산 (C18:3)으로의 탈포화를 일으키는 효소를 코딩한다 (Tanhuanpaa et al. (1998) Mol. Breed. 4:543-50; Schierholt et al. (2001) Crop Sci. 41:1444-9).
식물 오일 생합성 경로 내에서 지방산 데새투라제 (FAD)는 지방산 조성물에 유의하게 영향을 미치는 식물 지질 생합성 및 그의 활성에서 주요 역할을 한다. FAD는 식물에서 풍부하고, 발현 분석은 FAD mRNA가 과잉 생산됨을 시사한다. 또한, FAD 유전자는 다양한 조직 및 세포 유형, 뿐만 아니라 색소체 및 세포질 세망을 비롯한 세포하 구획에서 발현된다.
식물의 지방산 조성, 및 다수의 적용으로 그로부터 생산된 오일의 성능은 주요 지방산 구성성분; 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산 (C18:3)의 상대 농도에 의해 결정된다. 이들 지방산의 농도는 효소 FAD2 및 FAD3의 기능에 의해 주로 조절된다. 올레산은 하기 반응식에 따라 식물에서 리놀레산 및 리놀렌산으로 전환된다.
Figure 112015032530092-pct00001
FAD3 유전자는 옥수수, 대두, 목화, 아라비돕시스, 밀, 화본과 사료작물, 벼, 해바라기 및 브라시카(Brassica)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 주요 식물 및 조류 종에서 확인되었고, 이러한 유기체에서 FAD3 발현의 변형은 변경된 지방산 프로파일을 유도한다. 또한, 변형된 FAD3 유전자를 포함하는 식물은 상업화되었고, FAD3 유전자의 분열은 숙주 식물에 농경학적 페널티 없이 숙주 식물에 의해 생산된 오일의 영양적 및 기능적 특성을 개선할 수 있음을 보여주었다. 예를 들어, 넥세라(Nexera)® 상표 (다우 아그로사이언시스, 엘엘씨(Dow AgroSciences, LLC)) 하에 시판된 카놀라 및 해바라기 품종은 야생형 카놀라 및 해바라기 프로파일과 비교할 때 더 고급 올레산, 더 저급 리놀레산 및 더 저급 리놀렌산 (및 더 저급 포화 지방산) 조성물을 특징으로 한다. 유럽, 북미 및 오스트레일리아에서 성장시킨 우세한 카놀라 종은 비. 올레라세아(B. oleracea) (이배체 C 게놈을 가짐)와 비. 라파(B. rapa) (이배체 A 게놈을 가짐)의 혼성화로부터 발생된 것으로 간주되는 이배체 브라시카 종인 브라시카 나푸스이다. 세포유전 이상 조사는 AA 및 CC 게놈이 부분적으로 서로에 상동인 것으로서의 관련성의 정도를 나타냄을 밝혔다. A 및 C 게놈 둘 다는 높은 백분율의 동조체 및/또는 유사 유전자를 함유한다. 따라서, AA 및 CC 게놈은 공통 조상 게놈으로부터 유래한 것으로 여겨진다 (Prakash and Hinata (1980) Opera Botanica 55:1-57). 선조 종 둘 다의 게놈이 기술적으로 이배체로서 분류될지라도, 이들 게놈은 높은 백분율의 서로 중복되는 영역을 함유한다 (Song et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 82:296-304). 상세한 소기관 및 핵 RFLP 분석은, 비. 라파의 AA 게놈이 비. 나푸스에 대해 10개의 염색체를 기여하는 반면, 비. 올레라세아는 모체 공여자로서 그의 CC 게놈으로부터 9개의 염색체를 기여받는 것을 밝혀내었다 (Song et al. (1992) Genome 35:992-1001). 조상 게놈 둘 다에서의 게놈 중복의 수, 뿐만 아니라 A, B 및 C 게놈 사이의 높은 백분율의 유사성을 통해, FAD2 및 FAD3 유전자의 여러 카피가 발생하였다. 실질적으로, 이 사실은 특정한 지방산 프로파일을 생산하기 위해 시험되는 이들 유전자의 변형 및/또는 분열된 카피를 갖는 육종 카놀라를 생성한다.
카놀라에서 FAD3의 모든 공지된 기능적 유전자 카피는 A 게놈의 연결 기 N4 상에 위치한다 (Scheffler et al. (1997) TAG 94(5):583-91; Schierholt et al. (2000) TAG 101(5-6):897-901). 보다 최근에, 카놀라에서의 높은 올레산 형질은 A 게놈 상에 위치한 변형 및 분열된 FAD3 유전자와 연관되었다 (미국 특허 공개공보 번호 US 2006/0248611 A1; 문헌 [Hu et al. (2006) "Identification and Mapping of FAD2 and FAD3 Mutations and Development of Allele-specific Markers for High Oleic and Low Linolenic Acid Contents in Canola (Brassica napus L.)," Plant & Animal Genomes XIV Conference, January 14-18, 2006, San Diego, CA]). FAD3 대립유전자의 불활성화는 리놀레산의 리놀렌산으로의 탈포화를 감소시킴으로써 올레산 함량의 제어에 기여한다. 이 높은 올레산 및 FAD3 형질은 약 77%의 특징적인 올레산 함량을 갖는 비. 나푸스 품종 (DMS100)에서 확인되었다. 미국 공개공보 번호 20060248611을 참조한다. 또한, 유전자 마커는 카놀라로의 Fad3 및 높은 올레산 형질의 유전자이입을 지원하기 위해 개발되었다.
FAD3 유전자좌는 식물의 가치에 유해한 영향을 미치지 않고, 다수의 목적을 위해 그의 가치를 실제로 증가시키면서 FAD3 발현의 변경, 오일 함량/비의 변경 및/또는 목적한 트랜스진의 통합 및 발현을 비롯하여, 식물에서 변형 및/또는 분열될 수 있다. 또한, 식물의 FAD 유전자좌의 보편적인 특성에 따라, FAD3 유전자좌는 다수의 종에서, 예를 들어 제한 없이 카놀라; 대두; 옥수수; 밀; 화본과 사료작물; 브라시카 종; 벼, 토마토, 보리; 귀리; 소르굼; 목화 및 해바라기, 뿐만 아니라 진균 및 조류에서 적어도 일부 목적을 위해 유해함 없이 변형 및/또는 분열될 수 있다. 본 발명의 실시양태는 외인성 핵산의 통합을 위한 FAD3 유전자좌, 및 성능 유전자좌로서의 그의 용도를 포함한다. 예에서, FAD3 유전자좌는 성능 유전자좌로서의 그의 용도의 문맥 내에서 바람직한 것으로 발견된 여러 특성, 예컨대 예를 들어 제한 없이 숙주 유기체의 생활 주기 동안 대략 일정한 발현 수준이 존재하고, 놀랍게도, FAD3 유전자좌에서의 공여자 DNA의 삽입은 숙주 상에 품질 또는 적합성 페널티를 유도하지 않는 것 중 적어도 하나를 나타낸다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 FAD3 유전자좌 (예를 들어, FAD3A 및/또는 FAD3C 유전자좌)는 외인성 핵산 (예를 들어, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산)의 부위-특이적 통합에 대한 표적 부위로서 사용된다. 특정한 실시양태에서, 외인성 핵산의 통합은 변형된 유전자좌를 생성한다. 예를 들어, 외인성 핵산의 통합은 분열된 (즉, 불활성화된) FAD3 유전자를 생성하도록 유전자좌를 변형시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, FAD3 유전자좌는 서열 20-23, 서열 25-38, 서열 40-45, 서열 47 및 서열 49로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열의 보체에 특이적으로 혼성화가능한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, FAD3 유전자좌는 서열 20-23, 서열 25-38, 서열 40-45, 서열 47 및 서열 49로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FAD3 유전자좌는 서열 20-23, 서열 25-38, 서열 40-45, 서열 47 및 서열 49로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, FAD3 유전자좌는 서열 20-23, 서열 25-38, 서열 40-45, 서열 47 및 서열 49로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 FAD3 상동체 (예를 들어, 오르토로그 또는 파라로그)이다. FAD3 상동체는 서열 20-23, 서열 25-38, 서열 40-45, 서열 47 및 서열 49로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과, 예를 들어 제한 없이 적어도 80%; 적어도 85%; 적어도 약 90%; 적어도 약 91%; 적어도 약 92%; 적어도 약 93%; 적어도 약 94%; 적어도 약 95%; 적어도 약 96%; 적어도 약 97%; 적어도 약 98%; 적어도 약 99%; 적어도 약 99.5%; 99.6%, 99.7%, 99.8% 및/또는 적어도 약 99.9% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 FAD3 상동체는 다양한 유기체에 대해 관련 기술분야에서 통상의 기술자에게 용이하게 이용가능한 임의의 완전한 또는 부분 게놈으로부터 용이하게 확인되고 단리될 수 있다.
IV. FAD3 유전자좌에서의 핵산의 표적화 통합
FAD3 유전자좌에서의 외인성 핵산의 부위-특이적 통합은 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, FAD3 유전자좌에서의 외인성 핵산의 통합은 세포 (예를 들어, 조직 또는 유기체의 단리된 세포 또는 세포)를 외인성 핵산을 포함하는 핵산 분자에 접촉시키는 것을 포함한다. 예에서, 이러한 핵산 분자는 핵산 분자와 적어도 하나의 FAD3 유전자좌 사이의 상동 재조합을 용이하게 하는 외인성 핵산에 플랭킹된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 특정한 예에서, 상동 재조합을 용이하게 하는 외인성 핵산에 플랭킹된 뉴클레오티드 서열은 FAD3 유전자좌의 내인성 뉴클레오티드에 상보적일 수 있다. 특정한 예에서, 상동 재조합을 용이하게 하는 외인성 핵산에 플랭킹된 뉴클레오티드 서열은 이전에 통합된 외인성 뉴클레오티드에 상보적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 외인성 핵산은 하나의 FAD3 유전자좌에서, 예컨대 유전자 스택킹으로 통합될 수 있다.
일부 실시양태에서 FAD3 유전자좌에서의 핵산의 통합은 숙주 세포의 내인성 세포 기구, 예컨대 예를 들어 제한 없이 내인성 DNA 및 내인성 레콤비나제 효소에 의해 용이할 수 있다 (예를 들어, 촉매작용함). 일부 실시양태에서, FAD3 유전자좌에서의 핵산의 통합은 숙주 세포에 제공된 하나 이상의 인자 (예를 들어, 폴리펩티드)에 의해 용이해질 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제(들), 레콤비나제(들) 및/또는 리가제 폴리펩티드는 폴리펩티드를 숙주 세포와 접촉시킴으로써, 또는 숙주 세포 내에서 폴리펩티드를 발현시킴으로써 (독립적으로 또는 키메라 폴리펩티드의 일부로서) 제공될 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 적어도 하나의 뉴클레아제, 레콤비나제 및/또는 리가제 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 FAD3 유전자좌에 부위-특이적 통합되는 핵산을 공동으로 또는 순차적으로 숙주 세포 내로 도입할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 뉴클레아제, 레콤비나제 및/또는 리가제 폴리펩티드는 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열로부터 발현된다.
A. DNA-결합 폴리펩티드
일부 실시양태에서, 부위-특이적 통합은, 예를 들어 숙주 유기체의 게놈에서 특정한 뉴클레오티드 서열을 인식하고 이에 결합될 수 있는 인자를 이용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 다수의 단백질은 부위-특이적 방식으로 DNA를 인식하고 이에 결합될 수 있는 폴리펩티드 도메인을 포함한다. DNA 결합 폴리펩티드에 의해 인식된 DNA 서열은 "표적" 서열로서 언급될 수 있다. 도메인이 원래 그로부터 단리되어진 단백질이 아닌 폴리펩티드에서 발현될 때도, 부위-특이적 방식으로 DNA를 인식하고 이에 결합될 수 있는 폴리펩티드 도메인은 일반적으로 정확하게 접히고, 독립적으로 기능하여 부위-특이적 방식으로 DNA에 결합된다. 유사하게, 심지어 큰 DNA 구조 (예를 들어, 염색체)로 존재하는 경우에도, 특히 표적 서열이 위치한 부위가 가용성 세포성 단백질 (예를 들어, 유전자)에 접근가능한 것으로 공지된 것일 때, DNA-결합 폴리펩티드에 의한 인식 및 결합에 대한 표적 서열은 일반적으로 이러한 폴리펩티드에 의해 인식되고 이에 결합될 수 있다.
자연에 존재하는 단백질로부터 확인된 DNA-결합 폴리펩티드가 전형적으로 별개의 뉴클레오티드 서열 또는 모티프 (예를 들어, 컨센서스 인식 서열)에 결합하는 반면, 이러한 다수의 DNA-결합 폴리펩티드를 변형하여 다양한 뉴클레오티드 서열 또는 모티프를 인식하도록 하는 방법이 존재하고, 이는 관련 기술분야에 공지되어 있다. DNA-결합 폴리펩티드는, 예를 들어 제한 없이 아연 핑거 DNA-결합 도메인; 류신 지퍼; UPA DNA-결합 도메인; GAL4; TAL; LexA; Tet 리프레서; LacR; 및 스테로이드 호르몬 수용체를 포함한다.
일부 예에서, DNA-결합 폴리펩티드는 아연 핑거이다. 개별적인 아연 핑거 모티프는 광범위한 DNA 부위 중 임의의 부위를 특이적으로 표적화하고 이에 결합하도록 설계될 수 있다. 정규 Cys2His2 (뿐만 아니라 비-정규 Cys3His) 아연 핑거 폴리펩티드도 표적 DNA 이중 나선의 주요 홈에 α-나선을 삽입하는 것에 의해 DNA에 결합한다. 아연 핑거에 의한 DNA의 인식은 모듈식이어서; 각 핑거가 일차적으로 표적의 3개 연속 염기 쌍에 접촉하고, 폴리펩티드의 소수의 핵심 잔기들이 인식을 매개한다. 표적화 엔도뉴클레아제에 다수의 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 포함시키는 것에 의해, 표적화 엔도뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 추가로 증가될 수 있다 (및 이에 따라 그에 의해 부여되는 임의의 유전자 조절 효과의 특이성 또한 증가될 수 있음). 예를 들어, 문헌 [Urnov et al. (2005) Nature 435:646-51]을 참조한다. 따라서, 숙주 세포 내로 도입된 표적화 엔도뉴클레아제가 숙주 세포의 게놈 내의 특유한 DNA 서열과 상호작용하도록, 하나 이상의 아연 핑거 DNA-결합 폴리펩티드가 조작되고 이용될 수 있다.
바람직하게는, 아연 핑거 단백질은 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된다는 점에서 비-자연 발생된 것이다. 예를 들어, 그 전문이 모두 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416]; 미국 특허 번호 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 공개공보 번호 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061을 참조한다.
조작된 아연 핑거 결합 도메인에는 자연 발생 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성이 있을 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중 (또는 사중) 뉴클레오티드 서열 및 개별 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 사용을 포함하며, 여기서 각각의 삼중 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정한 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연관된다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 공동 소유의 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261을 참조한다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는 예시적인 선택 방법이 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다. 또한, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증진은, 예를 들어 공동 소유의 WO 02/077227에 기재되어 있다.
또한, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거의 아연 핑거 단백질은, 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 대해서는 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 아연 핑거 사이의 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
표적 부위의 선택; ZFP 및 융합 단백질 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구축을 위한 방법은 통상의 기술자에 공지되어 있고, 미국 특허 번호 6,140,0815; 789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496에 상세하게 설명되어 있다.
또한, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중 핑거의 아연 핑거 단백질은, 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 대해서는 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 아연 핑거 사이의 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 예에서, DNA-결합 폴리펩티드는 GAL4로부터의 DNA-결합 도메인이다. GAL4는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서 모듈화된 전사활성인자이지만, 이것은 또한 다수의 다른 유기체에서 전사활성인자로서 작동한다. 예를 들어, 문헌 [Sadowski et al. (1988) Nature 335:563-4]을 참조한다. 이와 같은 조절 시스템에서, 에스. 세레비시아에(S. cerevisiae)에서의 갈락토스 대사 경로의 효소를 코딩하는 유전자의 발현은 이용가능한 탄소원에 의해 엄격하게 조절된다 (Johnston (1987) Microbiol. Rev. 51:458-76). 이들 대사 효소의 전사 조절은 양성 조절 단백질 GAL4, 및 GAL4가 특이적으로 결합하는 17 bp 대칭형 DNA 서열 (UAS) 사이의 상호작용에 의해 매개된다.
천연 GAL4는 99 kDa의 분자량을 갖는 881개의 아미노산 잔기를 포함한다. GAL4는 기능적으로 자율성인 도메인을 포함하며, 이의 조합된 활성이 생체 내에서의 GAL4의 활성을 담당한다 (Ma and Ptashne (1987) Cell 48:847-53); Brent and Ptashne (1985) Cell 43(3 Pt 2):729-36). GAL4의 N-말단 65개 아미노산은 GAL4 DNA-결합 도메인을 포함한다 (Keegan et al. (1986) Science 231:699-704; Johnston (1987) Nature 328:353-5). 서열-특이적 결합은 DNA 결합 도메인에 존재하는 6개의 Cys 잔기에 의해 배위되는 2가 양이온의 존재를 필요로 한다. 배위된 양이온-함유 도메인은 DNA 나선의 주요 홈과의 직접적인 접촉을 통하여 17 bp UAS 각 말단의 보존되어 있는 CCG 삼중체와 상호작용하여 그것을 인식한다 (Marmorstein et al. (1992) Nature 356:408-14). 단백질의 DNA-결합 기능은 활성화 도메인이 전사를 유도할 수 있도록 프로모터의 근처에 C-말단 전사 활성화 도메인을 위치시킨다.
특정 실시양태에서, 이용할 수 있는 추가의 DNA-결합 폴리펩티드는, 예를 들어 제한 없이 AVRBS3-유도성 유전자로부터의 결합 서열; AVRBS3-유도성 유전자로부터의 컨센서스 결합 서열 또는 그로부터 조작된 합성 결합 서열 (예를 들어, UPA DNA-결합 도메인); TAL; LexA (예를 들어, 상기 문헌 [Brent & Ptashne (1985)] 참조); LacR (예를 들어, 문헌 [Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-56; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(12):5072-6)] 참조); 스테로이드 호르몬 수용체 (Ellliston et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:11517-121); 테트라시클린 (Tc)의 존재 하에는 tet 오퍼레이터 서열에 결합하나 부재시에는 그렇지 않은 Tet 리프레서 (미국 특허 6,271,341) 및 돌연변이된 Tet 리프레서; NF-κB의 DNA-결합 도메인; 및 GAL4, 호르몬 수용체 및 VP16의 융합을 이용하는, 문헌 [Wang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(17):8180-4]에 기재된 조절 시스템의 성분을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용되는 하나 이상의 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 자연 발생 또는 조작된 (비-자연 발생) TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개공보 번호 20110301073을 참조한다. 속 크산토모나스(Xanthomonas)의 식물 병원성 박테리아는 중요한 작물 식물에서 많은 병해를 야기하는 것으로 알려져 있다. 크산토모나스의 병원성은 25개 초과의 상이한 이펙터 단백질을 식물 세포 내로 주입하는 보존된 유형 III 분비 (T3S) 시스템에 좌우된다. 상기 주입된 단백질 중에는 식물 전사 활성제를 모방하고 식물 트랜스크립톰을 조작하는 전사 활성제-유사 (TAL) 이펙터가 존재한다 (문헌 [Kay et al. (2007) Science 318:648-651] 참조). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 함유한다. 대부분의 잘 특성화된 TAL-이펙터 중의 하나는 크산토모나스 캄페스트그리스 피브이. 베시카토리아(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다 (문헌 [Bonas et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136] 및 WO2010079430 참조). TAL-이펙터는 탠덤 반복체의 중앙 집중된 도메인을 함유하고, 각각의 반복체는 이들 단백질의 DNA 결합 특이성에 핵심적인 대략 34개의 아미노산을 함유한다. 또한, 이들은 핵 국재화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다 (검토에 대해서는, 문헌 [Schornack S, et al. (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272] 참조). 또한, 식물병원성 박테리아 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에서, 알. 솔라나세아룸(R. solanacearum) 생태형 1 균주 GMI1000 및 생태형 4 균주 RS1000에서 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리에 상동성인 brg11 및 hpx17로 지정된 2개의 유전자가 발견되었다 (문헌 [Heuer et al. (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384] 참조). 이들 유전자는 서로 뉴클레오티드 서열이 98.9% 동일하지만, hpx17의 반복 도메인 내의 1,575 bp의 결실에서 상이하다. 그러나, 유전자 산물 둘 다는 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,420,782 및 8,440,431 및 미국 특허 공개공보 번호 20110301073을 참조한다.
다른 실시양태에서, 뉴클레아제는 CRISPR/Cas 시스템을 포함한다. 시스템의 RNA 성분을 코딩하는 CRISPR (군집성의 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복체) 유전자좌, 및 단백질을 코딩하는 cas (CRISPR-연관) 유전자좌 (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60)는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 유전자 서열을 구성한다. 미생물 숙주 내의 CRISPR 유전자좌는 CRISPR-연관 (Cas) 유전자의 조합 뿐만 아니라 CRISPR-매개 핵산 절단의 특이성을 프로그래밍할 수 있는 비-코딩 RNA 요소를 함유한다.
유형 II CRISPR은 가장 잘 특성화된 시스템 중의 하나이고, 4개의 순차적 단계에서 표적화된 DNA 이중-가닥 파단을 수행한다. 먼저, 2개의 비-코딩 RNA인 프리-crRNA 어레이 및 tracrRNA가 CRISPR 유전자좌로부터 전사된다. 이어서, tracrRNA는 프리-crRNA의 반복 영역에 혼성화하고, 프리-crRNA의 개별적인 스페이서 서열을 함유하는 성숙 crRNA로의 프로세싱을 매개한다. 세번째로, 성숙 crRNA:tracrRNA 복합체는 crRNA 상의 스페이서와, 표적 인식을 위한 추가의 요건인 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 옆에 존재하는 표적 DNA 상의 프로토스페이서 사이의 왓슨-크릭(Wastson-Crick) 염기-쌍형성을 통해 Cas9를 표적 DNA로 유도한다. 마지막으로, Cas9는 프로토스페이서 내의 이중 가닥 파단을 생성하기 위해 표적 DNA의 절단을 매개한다. CRISPR/Cas 시스템의 활성은 3 단계: (i) 이후의 공격을 방지하기 위해 '순응'으로 불리는 방법으로 CRISPR 어레이 내로의 외래 DNA 서열의 삽입, (ii) 관련 단백질의 발현, 뿐만 아니라 어레이의 발현 및 프로세싱 후, (iii) 외래 핵산을 사용한 RNA-매개 간섭을 포함한다. 따라서, 박테리아 세포에서, 소위 'Cas' 단백질 중 몇몇은 CRISPR/Cas 시스템의 천연 기능과 연관되고, 외래 DNA 등의 삽입과 같은 기능에서 역할을 한다.
특정 실시양태에서, Cas 단백질은 자연 발생 Cas 단백질의 "기능적 유도체"일 수 있다. 천연 서열 폴리펩티드의 "기능적 유도체"는 천연 서열 폴리펩티드와 공통적인 정성적 생물학적 특성을 갖는 화합물이다. "기능적 유도체"는 상응하는 천연 서열 폴리펩티드와 공통적인 생물학적 특성을 갖는다면, 천연 서열의 단편 및 천연 서열 폴리펩티드의 유도체 및 그의 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 고려되는 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수분해하는 기능적 유도체의 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체 둘 다, 공유 변형, 및 그의 융합체를 포함한다. Cas 폴리펩티드의 적합한 유도체 또는 그의 단편은 Cas 단백질의 돌연변이체, 융합체, 공유 변형 또는 그의 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. Cas 단백질 또는 그의 단편, 뿐만 아니라 Cas 단백질의 유도체 또는 그의 단편을 포함하는 Cas 단백질은 세포로부터 얻거나 또는 화학적으로 합성되거나 또는 이들 2가지 절차의 조합에 의해 얻을 수 있다. 세포는 Cas 단백질을 천연적으로 생산하는 세포, 또는 Cas 단백질을 천연적으로 생산하고 내인성 Cas 단백질을 보다 높은 발현 수준으로 생산하거나 또는 내인성 Cas와 동일하거나 상이한 Cas를 코딩하는 외인성으로 도입된 핵산으로부터 Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작된 세포일 수 있다. 일부 경우에, 세포는 Cas 단백질을 천연적으로 생산하지 않고, Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작된다.
특정한 실시양태에서, DNA-결합 폴리펩티드는 숙주 유기체의 게놈 핵산 내에 포함되는 표적 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하고 이에 결합한다. 별개의 경우의 표적 뉴클레오티드 서열 중 임의의 수가 일부 예에서 숙주 게놈에서 발견될 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열은 유기체의 게놈 내에서 드물게 있을 수 있다 (예를 들어, 표적 서열의 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2 또는 약 1 카피(들) 미만이 게놈 중에 존재할 수 있다). 예를 들어, 표적 뉴클레오티드 서열은 유기체의 게놈 내에 특유한 부위에 위치할 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 제한 없이 서로에 대한 게놈 전반에 무작위로 분산될 수 있고; 게놈의 다양한 연결 기에 위치할 수 있고; 동일한 연결 기에 위치할 수 있고; 다양한 염색체 상에 위치할 수 있고; 동일한 염색체 상에 위치할 수 있고; 유기체에서 유사한 조건 하에 (예를 들어, 동일한 또는 기능적으로 실질적으로 동일한 조절 인자의 제어 하에) 발현된 부위에서 게놈에 위치할 수 있고; 게놈에서 서로에 근접하게 위치할 수 있다 (예를 들어, 표적 서열은 게놈 유전자좌에 콘카테머로서 통합된 핵산 내에 포함될 수 있음).
B. 표적화 엔도뉴클레아제
특정한 실시양태에서, 특히 표적 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 DNA-결합 폴리펩티드는 키메라 폴리펩티드 내에 포함되어 키메라 폴리펩티드 상의 표적 서열에 특이적 결합을 부여할 수 있다. 예에서, 이러한 키메라 폴리펩티드는 이들 폴리펩티드가 상기에 기재된 바와 같이, 예를 들어 제한 없이 뉴클레아제, 레콤비나제 및/또는 리가제 폴리펩티드를 포함할 수 있다. DNA-결합 폴리펩티드 및 뉴클레아제, 레콤비나제 및/또는 리가제 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 다른 기능적 폴리펩티드 모티프 및/또는 도메인, 예컨대 예를 들어 제한 없이 키메라 단백질에서 기능적 폴리펩티드 사이에 위치한 스페이서 서열; 리더 펩티드; 융합 단백질을 소기관 (예를 들어, 핵)에 표적화하는 펩티드; 세포 효소에 의해 절단되는 폴리펩티드; 펩티드 태그 (예를 들어, Myc, His 등); 및 키메라 폴리펩티드의 기능을 간섭하지 않는 다른 아미노산 서열을 또한 포함할 수 있다.
키메라 폴리펩티드에서의 기능적 폴리펩티드 (예를 들어, DNA-결합 폴리펩티드 및 뉴클레아제 폴리펩티드)는 작동적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 폴리펩티드의 기능적 폴리펩티드는 인-프레임 내에서 서로 라이게이션된 기능적 폴리펩티드를 적어도 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드로부터 그의 발현에 의해 작동적으로 연결되어 키메라 단백질을 코딩하는 키메라 유전자를 생성할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 키메라 폴리펩티드의 기능적 폴리펩티드는 다른 수단, 예컨대 독립적으로 발현된 폴리펩티드의 교차-연결에 의해 작동적으로 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 DNA-결합 폴리펩티드는 단리된 천연 단백질 (또는 그의 돌연변이체) 내에 포함될 수 있고, 여기서 단리된 천연 단백질 또는 그의 돌연변이체는 또한 뉴클레아제 폴리펩티드 (및 레콤비나제 및/또는 리가제 폴리펩티드를 또한 포함할 수 있음)를 포함한다. 이러한 단리된 단백질의 예는 TALEN, 레콤비나제 (예를 들어, Cre, Hin, Tre 및 FLP 레콤비나제), RNA-유도 CRISPR-Cas9 및 메가뉴클레아제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적화 엔도뉴클레아제"는 DNA-결합 폴리펩티드 및 뉴클레아제 폴리펩티드를 포함하는 단리된 천연 또는 조작된 단백질 및 그의 돌연변이체, 뿐만 아니라 DNA-결합 폴리펩티드 및 뉴클레아제를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. FAD3 유전자좌 내에 포함된 (예를 들어, 표적 서열이 유전자좌에서 천연 서열 내에 포함되기 때문에, 또는 표적 서열이 유전자좌 내로, 예를 들어 재조합에 의해 도입되었기 때문에) 표적 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 DNA-결합 폴리펩티드를 포함하는 임의의 표적화 엔도뉴클레아제는 특정 실시양태에서 이용될 수 있다.
본 발명의 특정한 실시양태에서 유용할 수 있는 키메라 폴리펩티드의 일부 예는 제한 없이 하기 폴리펩티드의 조합을 포함한다: 아연 핑거 DNA-결합 폴리펩티드; FokI 뉴클레아제 폴리펩티드; TALE 도메인; 류신 지퍼; 전사 인자 DNA-결합 모티프; 및 예를 들어 제한 없이 TALEN, 레콤비나제 (예를 들어, Cre, Hin, RecA, Tre 및 FLP 레콤비나제), RNA-유도 CRISPR-Cas9, 메가뉴클레아제로부터 단리된 DNA 인식 및/또는 절단 도메인; 및 관련 기술분야에 공지된 다른 것. 특정한 예는 부위-특이적 DNA 결합 폴리펩티드 및 뉴클레아제 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질을 포함한다. 키메라 폴리펩티드는 키메라 폴리펩티드 내에 포함된 DNA-결합 폴리펩티드의 인식 서열을 변경하여 특정한 관심 뉴클레오티드 서열을 키메라 폴리펩티드에 표적화하기 위해 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 조작될 수 있다.
특정 실시양태에서, 키메라 폴리펩티드는 DNA-결합 도메인 (예를 들어, 아연 핑거, TAL-이펙터 도메인 등) 및 뉴클레아제 (절단) 도메인을 포함한다. 절단 도메인은 DNA-결합 도메인에 이종일 수 있으며, 예를 들어 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제로부터의 절단 도메인 또는 TALEN DNA-결합 도메인 및 절단 도메인, 또는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 및 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인임. 이종 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소성 엔도뉴클레아제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조한다. DNA를 절단하는 추가의 효소가 공지되어 있다 (예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 미크로코쿠스(micrococcal) 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한, 문헌 [Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)]을 참조한다). 이들 효소 (또는 그의 기능성 단편) 중 하나 이상이 절단 도메인 및 절단 절반-도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 절반-도메인은 절단 활성을 위해 이량체화를 필요로 하는, 상기 제시된 바와 같이 임의의 뉴클레아제 또는 그의 일부로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반-도메인을 포함하는 경우에 2개의 융합 단백질이 절단에 필요하다. 대안적으로, 2개의 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 절반-도메인이 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있거나, 또는 각각의 절단 절반-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질이 각각의 표적 부위에 결합하는 것이 절단 절반-도메인이 기능성 절단 도메인을 형성 (예를 들어, 이량체화에 의해 형성)하는 것이 가능하도록 절단 절반-도메인을 서로에 대해 공간적으로 배향시키도록, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위들이 서로 관련되어 배치되는 것이 바람직하다. 따라서, 특정 실시양태에서, 표적 부위의 가까운 경계는 뉴클레오티드 5-8개 또는 뉴클레오티드 15-18개에 의해 분리된다. 그러나, 임의의 정수 개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 2개의 표적 부위 사이에 개입할 수 있다 (예를 들어, 2 내지 50개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 쌍). 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 존재한다.
예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 다수의 종에 존재하고, 예를 들어 하나 이상의 외인성 서열 (공여자/트랜스진)이 결합 (표적) 부위에 또는 그 근처에서 통합되도록, DNA에 (인식 부위에서) 서열-특이적으로 결합하여, 결합의 부위에 또는 그 근처에서 DNA를 절단하는 것이 가능하다. 특정 제한 효소 (예를 들어, 유형 IIS)는 인식 부위에서 제거된 부위에서 DNA를 절단하고, 분리가능한 결합 도메인 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들어, 유형 IIS 효소 Fok I은 한쪽 가닥 상의 그의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오티드, 및 다른쪽 가닥 상의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오티드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매작용한다. 예를 들어, 미국 특허 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 뿐만 아니라 문헌 [Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982]을 참조한다. 따라서, 한 실시양태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 유형 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인), 및 조작되거나 또는 조작되지 않을 수 있는 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 Fok I이다. 상기 특정한 효소는 이량체로서 활성이다 (Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575). 따라서, 본 개시내용의 목적을 위해, 개시된 융합 단백질에서 사용된 Fok I 효소의 일부는 절단 절반-도메인으로 간주된다. 따라서, 아연 핑거-FokI 융합체를 사용한 표적화된 이중 가닥 절단 및/또는 세포 서열의 표적화된 교체를 위해, 각각 FokI 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 촉매적 활성 절단 도메인을 재구성하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, DNA 결합 도메인 및 2개의 Fok I 절단 절반-도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드 분자가 또한 사용될 수 있다.
절단 도메인 또는 절단 절반-도메인은 절단 활성을 보유하거나 또는 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 다량체화 (예를 들어, 이량체화)하는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
예시적인 유형 IIS 제한 효소는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개공보 번호 20070134796에 기재되어 있다. 추가의 제한 효소가 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 또한 함유하고, 이것은 본 개시내용에서 고려된다. 예를 들어, 문헌 [Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 절단 도메인은, 예를 들어 그 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개공보 번호 20050064474; 20060188987 및 20080131962에 기재된 바와 같이 동종이량체화를 최소화하거나 또는 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 절반-도메인 (이량체화 도메인 돌연변이체로도 언급됨)을 포함한다. FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 및 538의 아미노산 잔기는 모두 FokI 절단 절반-도메인의 이량체화에 영향을 주기 위한 표적이다.
절대적 이종이량체를 형성하는 FokI의 예시적인 조작된 절단 절반-도메인은 제1 절단 절반-도메인이 FokI의 위치 490 및 538의 아미노산 잔기에서의 돌연변이를 포함하고 제2 절단 절반-도메인이 아미노산 잔기 486 및 499에서의 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 490에서의 돌연변이는 Glu (E)를 Lys (K)로 대체하고; 538에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 대체하고; 486에서의 돌연변이는 Gln (Q)를 Glu (E)로 대체하고; 위치 499에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 대체한다. 구체적으로, 본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 "E490K:I538K"로 지정된 조작된 절단 절반-도메인을 생산하기 위해 하나의 절단 절반-도메인에서 위치 490 (E->K) 및 538 (I->K)을 돌연변이시키고, "Q486E:I499L"로 지정된 조작된 절단 절반-도메인을 생산하기 위해 또 다른 절단 절반-도메인에서 위치 486 (Q->E) 및 499 (I->L)를 돌연변이시킴으로써 제조하였다. 본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 비정상적 절단이 최소화되거나 또는 제거된 절대적 이종이량체 돌연변이체이다. 예를 들어, 모든 목적을 위해 그 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개공보 번호 2008/0131962를 참조한다.
특정 실시양태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 486, 499 및 496 (야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에 돌연변이, 예를 들어 위치 486의 야생형 Gln (Q) 잔기를 Glu (E) 잔기로, 위치 499의 야생형 Iso (I) 잔기를 Leu (L) 잔기로, 위치 496의 야생형 Asn (N) 잔기를 Asp (D) 또는 Glu (E) 잔기로 대체한 돌연변이 (각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인으로도 언급됨)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 490, 538 및 537 (야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에 돌연변이, 예를 들어 위치 490의 야생형 Glu (E) 잔기를 Lys (K) 잔기로, 위치 538의 야생형 Iso (I) 잔기를 Lys (K) 잔기로, 위치 537의 야생형 His (H) 잔기를 Lys (K) 잔기 또는 Arg (R) 잔기로 대체한 돌연변이 (각각 "KKK" 및 "KKR" 도메인으로도 언급됨)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 유전자 조작된 절단 절반-도메인은 위치 490 및 537 (야생형 FokI에 대해 번호 매김)의 돌연변이, 예를 들어 위치 490의 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 위치 537의 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기 (각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인으로도 언급됨)로 대체한 돌연변이를 포함한다 (미국 특허 공개공보 번호 20110201055 참조). 본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 임의의 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어 미국 특허 공개공보 번호 20050064474; 20080131962; 및 20110201055에 기재된 바와 같은 야생형 절단 절반-도메인 (FokI)의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 제조할 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제는 소위 "분할-효소" 기술을 사용하여 핵산 표적 부위에서 생체 내에서 조립될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 20090068164 참조). 이러한 분할 효소의 성분은 별개의 발현 구축물에서 발현될 수 있거나, 또는 개별 성분이, 예를 들어 자가-절단성 2A 펩티드 또는 IRES 서열에 의해 분리되는 하나의 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 성분은 개별적인 아연 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.
C. 아연 핑거 뉴클레아제
구체적 실시양태에서, 키메라 폴리펩티드는, 표적 부위-특이적 이중-가닥 DNA 파단을 전달하여 외인성 핵산, 또는 공여자 DNA가 통합될 수 있도록 설계될 수 있는 주문-설계된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)이다 (본원에 참조로 포함되는 공동 소유의 미국 특허 공개 20100257638 참조). ZFN은 제한 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI)로부터의 비-특이적 절단 도메인 및 아연 핑거 DNA-결합 도메인 폴리펩티드를 함유하는 키메라 폴리펩티드이다. 예를 들어, 문헌 [Huang et al. (1996) J. Protein Chem. 15:481-9; Kim et al. (1997a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3616-20; Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-60; Kim et al. (1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:883-7; Kim et al. (1997b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12875-9; Kim et al. (1997c) Gene 203:43-9; Kim et al. (1998) Biol. Chem. 379:489-95; Nahon and Raveh (1998) Nucleic Acids Res. 26:1233-9; Smith et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27:674-81]을 참조한다. 일부 실시양태에서, ZFN는 비-정규 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 포함한다 (본원에 참조로 포함되는 공동 소유의 미국 특허 공개 20080182332 참조). FokI 제한 엔도뉴클레아제는 DNA를 절단하고 이중-가닥 파단을 도입하기 위해 뉴클레아제 도메인을 통해 2량체화되어야 한다. 결과적으로, 이러한 엔도뉴클레아제로부터의 뉴클레아제 도메인을 함유하는 ZFN는 또한 표적 DNA를 절단하기 위해 뉴클레아제 도메인의 이량체화가 요구된다 (Mani et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 334:1191-7; Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-9). ZFN의 이량체화는 반대로 배향된 2개의 인접한 DNA-결합 부위에 의해 용이해질 수 있다. 상기 동일 문헌을 참조한다.
ZFN 시스템의 유연성 및 특이성은 공지된 레콤비나제-매개 유전자 편집 전략에 의해 이전에는 달성될 수 없었던 제어 수준을 제공한다. 한 예로서, ZFN는, 예를 들어 특이적 핵산 서열을 인식하기 위해 용이하게 조작될 수 있다 (Wu et al. (2007) Cell. Mol. Life Sci. 64:2933-44 (그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 20090205083, 20110189775, 20110167521 및 20100199389 참조)). 아연 핑거 인식 잔기에 대한 코돈의 무작위화는 임의로 선택된 DNA 서열에 대해 높은 친화도를 갖는 새로운 핑거의 선택을 허용한다. 또한, 아연 핑거는 천연 DNA-결합 분자이고, 조작된 아연 핑거는 살아있는 세포 내에서 그의 설계된 표적에 대해 작용하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 아연 핑거를 기초로 한 뉴클레아제는 특이적인 그러나 임의의 인식 부위에 대한 표적화가 가능하다.
특정한 예에서, 숙주의 적어도 하나의 FAD3 성능 유전자좌로의 외인성 핵산의 부위-특이적 통합 방법은 ZFN을 숙주의 세포 내로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 ZFN은 표적 뉴클레오티드 서열을 인식하고 이에 결합하며, 여기서 표적 뉴클레오티드 서열은 숙주의 적어도 하나의 FAD3 유전자좌 내에 포함된다. 특정 예에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 FAD3 유전자좌 이외의 임의의 위치에서는 숙주의 게놈 내에 포함되지 않는다. 예를 들어, ZFN의 DNA-결합 폴리펩티드는 적어도 하나의 FAD3 유전자좌 내에 확인된 표적 뉴클레오티드 서열을 인식하고 이에 결합하도록 조작될 수 있다 (예를 들어, FAD3 유전자좌를 서열분석함으로써). ZFN을 숙주의 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 숙주의 적어도 하나의 FAD3 성능 유전자좌로의 외인성 핵산의 부위-특이적 통합 방법은 또한 외인성 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 FAD3 유전자좌를 포함하는 숙주의 핵산 내로의 외인성 핵산의 재조합은 표적 서열에 대한 부위-특이적 인식 및 ZFN의 결합 (및 FAD3 유전자좌를 포함하는 핵산의 후속적인 절단)에 의해 용이해진다.
VI. FAD3 유전자좌에서의 통합을 위한 외인성 핵산
본 발명의 실시양태는 적어도 하나의 FAD3 유전자좌에서 부위-특이적 통합을 위한 외인성 핵산, 예를 들어 제한 없이 PTU, ELP, ETIP 또는 ORF; 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 및 상기 중 어느 하나 또는 둘 다 중 적어도 하나를 포함하는 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에 사용하기 위한 특정한 핵산은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 구조적 뉴클레오티드 서열 및/또는 DNA-결합 폴리펩티드 인식 및 결합 부위를 포함한다.
A. 부위-특이적 통합을 위한 외인성 핵산 분자
상기에 기재된 바와 같이, 외인성 서열 (또한 "공여자 서열" 또는 "공여자" 또는 "트랜스진"으로도 불림)의 삽입은, 예를 들어 폴리펩티드의 발현, 돌연변이체 유전자의 수정 또는 야생형 유전자의 증가된 발현을 위해 제공된다. 공여자 서열은 전형적으로 이것이 위치한 게놈 서열과 동일하지 않음이 용이하게 명백할 것이다. 공여자 서열은 상동성인 2개의 영역에 의해 플랭킹된 비-상동 서열을 함유하여 관심 위치에서 효율적 HDR을 가능하게 할 수 있다. 추가로, 공여자 서열은 세포 염색질에서의 관심 영역에 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자 포함할 수 있다. 공여자 분자는 세포 염색질에 대한 여러 개의 비연속적인 상동성 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 보통 관심 영역에 존재하지 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열이 공여자 핵산 분자에 존재할 수 있고, 관심 영역 내의 서열에 대한 상동성 영역에 의해 상기 서열이 플랭킹될 수 있다.
공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 선형 또는 원형 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 20100047805, 20110281361, 20110207221 및 미국 출원 번호 13/889,162를 참조한다. 선형 형태로 도입되면, 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 공여자 서열의 말단이 보호될 수 있다 (예를 들어, 엑소뉴클레아제 분해로부터). 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 부가되고/되거나, 자가-상보적 올리고뉴클레오티드가 한쪽 또는 양쪽 말단에 라이게이션된다. 예를 들어, 문헌 [Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오티드를 보호하기 위한 추가의 방법은 말단 아미노 기(들)의 부가, 및 변형된 뉴클레오티드간 연결기, 예컨대 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기의 사용을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 복제 기점, 프로모터 및 항생제 저항성을 코딩하는 유전자와 같은 추가의 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 또한, 공여자 폴리뉴클레오티드는 네이키드 핵산으로서, 리포솜 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 또는 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결핍 렌티바이러스 (IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
공여자는 통합 부위에서의 내인성 프로모터, 즉 공여자가 통합된 내인성 유전자 (예를 들어, FAD3)의 발현을 유도하는 프로모터에 의해 그의 발현을 유도하도록 일반적으로 통합된다. 그러나, 공여자가 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 구성적 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있음이 명백할 것이다.
또한, 발현을 위해 요구되지 않지만, 외인성 서열은 또한, 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩티드를 코딩하는 서열 및/또는 폴리아데닐화화 신호를 포함할 수 있다.
실시양태에서 적어도 하나의 FAD3 유전자좌 내로 부위-특이적 방식으로 통합되어 FAD3 유전자좌를 변형시킬 수 있는 외인성 핵산은, 예를 들어 제한 없이 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산; 농경학적 유전자를 포함하는 핵산; RNAi 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 또는 FAD3 유전자를 분열시키는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 FAD3 유전자좌에서 통합되어 FAD3 유전자좌를 변형시키고, 여기서 핵산은 농경학적 유전자 또는 뉴클레오티드 서열이 숙주에서 FAD3 유전자좌로부터의 발현되도록, 농경학적 유전자 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 예에서, 관심 폴리펩티드 (예를 들어, 외래 단백질)은 산업량으로 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로부터 발현된다. 이러한 예에서, 관심 폴리펩티드는 숙주 세포, 조직 또는 바이오매스로부터 추출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주는 식물이고, 관심 폴리펩티드의 상업적 생산을 위해 제공된 식물 물질은 식물, 식물 일부, 식물 조직 또는 식물 세포일 수 있다. 일부 예에서, 식물 일부는 식물 종자일 수 있다. 식물 바이오매스로부터의 단백질 추출은, 예를 들어 문헌 [Heney and Orr (1981) Anal. Biochem. 114:92-6]에 논의된 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
마찬가지로, 농경학적 유전자는 형질전환된 식물 세포, 식물 및/또는 그의 자손에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 식물은 적어도 하나의 FAD3 유전자좌로부터의 다양한 농경학적 관심 표현형을 발현하는 특정한 실시양태의 방법을 통해 유전자 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 농경학적 유전자 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은, 예를 들어 제한 없이 해충 또는 병해에 대한 저항성을 부여하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Jones et al. (1994) Science 266:789] (클라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum)에 대한 저항성에 대한 토마토 Cf-9 유전자의 클로닝); 문헌 [Martin et al. (1993) Science 262:1432]; 문헌 [Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089] (슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae)에 대한 저항성을 위한 RSP2 유전자); PCT 국제 특허 공개 번호 WO 96/30517 (대두 낭 선충병에 대한 저항성); PCT 국제 특허 공개 번호 WO 93/19181; 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 단백질, 그의 유도체, 또는 그에 대해 모델링된 합성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Geiser et al. (1986) Gene 48:109] (Bt δ-내독소 유전자의 클로닝 및 뉴클레오티드 서열; 또한, δ-내독소 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; 버지니아주 마나사스)으로부터 예를 들어, ATCC 등록 번호 40098; 67136; 31995 및 31998 하에 구입할 수 있음) 참조); 렉틴을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Van Damme et al. (1994) Plant Molec. Biol. 24:25] (몇몇 클리비아 미니아타(Clivia miniata) 만노스-결합 렉틴 유전자의 뉴클레오티드 서열) 참조); 비타민-결합 단백질, 예를 들어 아비딘을 코딩하는 유전자 (PCT 국제 특허 공개 번호 US93/06487 (곤충 해충에 대한 유충구충제로서 아비딘 및 아비딘 상동체의 사용) 참조); 효소 억제제, 예를 들어 프로테아제, 프로테이나제 억제제 또는 아밀라제 억제제를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Abe et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:16793] (벼 시스테인 프로테이나제 억제제의 뉴클레오티드 서열); 문헌 [Huub et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:985] (담배 프로테이나제 억제제 I을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열); 문헌 [Sumitani et al. (1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243] (스트렙토미세스 니트로스포레우스(Streptomyces nitrosporeus) 알파-아밀라제 억제제의 뉴클레오티드 서열) 및 미국 특허 5,494,813 참조); 곤충-특이적 호르몬 또는 페로몬, 예를 들어 엑디스테로이드 또는 유충 호르몬, 그의 변이체, 그에 대한 모방체, 또는 그의 길항제 또는 효능제를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Hammock et al. (1990) Nature 344:458] (클로닝된 유충 호르몬 에스테라제 (유충 호르몬의 불활성화제)의 바큘로바이러스 발현) 참조); 발현시 이환된 해충을 생리학상 분열시키는, 곤충-특이적 펩티드 또는 신경펩티드를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Regan (1994) J. Biol. Chem. 269:9] (발현 클로닝은 곤충 이뇨 호르몬 수용체를 코딩하는 DNA를 생성함); 문헌 [Pratt et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243] (디플로프테라 푼타타(Diploptera puntata) 내의 알로스타틴); 및 미국 특허 5,266,317 (곤충-특이적, 마비성 신경독소를 코딩하는 유전자) 참조); 자연에서 뱀, 말벌 또는 다른 유기체에 의해 생산되는 곤충-특이적 독을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Pang et al. (1992) Gene 116:165] (전갈 곤충독성 펩티드를 코딩하는 유전자의 식물 내 이종성 발현) 참조); 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 스테로이드, 히드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체 또는 살곤충 활성을 갖는 다른 분자의 과축적을 담당하는 효소를 코딩하는 유전자; 생물학적 활성 분자의 번역후 변형을 비롯한 변형에 관여하는 효소, 예를 들어 당분해 효소, 단백질분해 효소, 지질분해 효소, 뉴클레아제, 시클라제, 트랜스아미나제, 에스테라제, 히드롤라제, 포스파타제, 키나제, 포스포릴라제, 폴리머라제, 엘라스타제, 키티나제 또는 글루카나제 (천연이든 합성이든)를 코딩하는 유전자 (예를 들어, PCT 국제 특허 공개 번호 WO 93/02197 (칼라제 유전자의 뉴클레오티드 서열); 또한, 키티나제-코딩 서열을 함유하는 DNA 분자는, 예를 들어 ATCC로부터 등록 번호 39637 및 67152 하에 얻을 수 있음); 문헌 [Kramer et al. (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691] (담배 박각시나방 키티나제를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열); 및 문헌 [Kawalleck et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:673] (파슬리 ubi4-2 폴리유비퀴틴 유전자의 뉴클레오티드 서열) 참조); 신호 전달을 자극하는 분자를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Botella et al. (1994) Plant Molec. Biol. 24:757] (녹두 칼모둘린 cDNA 클론에 대한 뉴클레오티드 서열); 및 문헌 [Griess et al. (1994) Plant Physiol. 104:1467] (옥수수 칼모둘린 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열) 참조); 소수성 모멘트 펩티드를 코딩하는 유전자 (예를 들어, PCT 국제 특허 공개 번호 WO 95/16776 (진균 식물 병원체를 억제하는 태키플레신 (Tachyplesin)의 펩티드 유도체); 및 PCT 국제 특허 공개 번호 WO 95/18855 (병해 저항성을 부여하는 합성 항미생물 펩티드) 참조); 막 퍼미아제(permease), 채널 형성제, 또는 채널 차단제를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Jaynes et al. (1993) Plant Sci 89:43] (트랜스제닉 담배 식물을 슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)에 대해 저항성으로 만드는 세크로핀-β 라이틱 펩티드 유사체의 이종성 발현) 참조); 바이러스-침습 단백질 또는 그로부터 유래하는 복합 독소를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Beachy et al. (1990) Ann. rev. Phytopathol. 28:451] 참조); 곤충-특이적 항체 또는 그로부터 유래하는 면역독소를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Taylor et al., Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interations (Edinburgh, Scotland) (1994)] (단일쇄 항체 단편의 생산을 통해 트랜스제닉 담배 내에서 효소에 의한 불활성화) 참조); 바이러스-특이적 항체를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Tavladoraki et al. (1993) Nature 366:469] (재조합 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물은 바이러스 공격으로부터 보호됨) 참조); 병원체 또는 기생충에 의해 자연에서 생산되는 발달 억제성 단백질을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Lamb et al. (1992) Bio/Technology 10:1436] (진균 엔도 α-1,4-D-폴리갈락토우로나제는 식물 세포벽 호모-α-1,4-D-갈락토우로나제를 가용화함으로써 진균 콜리니화 및 식물 영양분 방출을 촉진함); 문헌 [Toubart et al. (1992) Plant J. 2:367] (콩 엔도폴리갈락토우로나제-억제 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝 및 특성화) 참조); 식물에 의해 자연에서 생산되는 발달-억제성 단백질을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Logemann et al. (1992) Bio/Technology 10:305] (보리 리보솜-불활성화 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물은 진균 질환에 대한 증가된 저항성을 가짐) 참조)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 농경학적 유전자 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 또한 및/또는 대안적으로, 예를 들어 제한 없이 성장점 또는 분열조직을 억제하는 제초제와 같은 제초제, 예를 들어 이미다졸리논 또는 술포닐우레아에 대한 저항성을 부여하는 유전자 (본 카테고리에서 예시적인 유전자는, 예를 들어 문헌 [Lee et al. (1988) EMBO J. 7:1241, 및 Miki et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449]에 각각 설명된 바와 같은 돌연변이체 ALS 및 AHAS 효소를 코딩함); 예를 들어, 돌연변이체 5-엔올피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSP) 유전자에 의해 부여된 바와 같은 글리포세이트 저항성 (재조합 핵산 및/또는 다양한 형태의 천연 EPSP 유전자 (비제한적으로 CP4, DMMG 및 DGT-28 포함)의 생체내 돌연변이 유발의 도입을 통해; 각각 aroA 유전자 및 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제 (GAT) 유전자); 스트렙토미세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토미세스 비리디크로모게네스(Streptomyces viridichromogenes)를 포함하는 스트렙토미세스 종으로부터 다른 포스포노 화합물, 예컨대 글루포시네이트 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 유전자); 및 피리디녹시 또는 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손 (ACCase 억제제-코딩 유전자)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 4,940,835 및 6,248,876 (식물에 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 EPSP의 형태의 뉴클레오티드 서열)을 참조한다. 돌연변이체 aroA 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 ATCC 등록 번호 39256 하에 얻을 수 있다. 또한, 미국 특허 4,769,061 (돌연변이체 aroA 유전자의 뉴클레오티드 서열)을 참조한다. 유럽 특허 출원 번호 0 333 033 및 미국 특허 번호 4,975,374에서는 L-포스피노트리신과 같은 제초제에 대한 저항성을 부여할 수 있는 글루타민 신테타제 유전자의 뉴클레오티드 서열을 개시하고 있다. 예시적인 PAT 유전자의 뉴클레오티드 서열은 유럽 특허 출원 번호 0 242 246, 및 문헌 [DeGreef et al. (1989) Bio/Technology 7:61] (PAT 활성을 코딩하는 키메라 바(bar) 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생산)에 제공되어 있다. 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손, 예컨대 세톡시딤 및 할록시포프에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 예는 문헌 [Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435]에 기재된 바와 같은 Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3 유전자를 포함한다. 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 GAT 유전자는, 예를 들어 WO 2005012515에 기재되어 있다. 2,4-D, 페녹시프로프리온산 및 피리딜옥시 옥신 제초제에 대한 저항성을 부여하는 유전자는, 예를 들어 WO 2005107437 및 WO 2007053482에 기재되어 있다.
관심 폴리펩티드를 코딩하는 농경학적 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 또한, 예를 들어 제한 없이 광합성을 억제하는 제초제, 예컨대 트리아진 (psbA 및 gs+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자)에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Przibila et al. (1991) Plant Cell 3:169] (돌연변이체 psbA 유전자를 코딩하는 플라스미드를 사용한 클라미도모나스(Chlamydomonas)의 형질전환)을 참조한다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 4,810,648에 개시되어 있고, 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 등록 번호 53435; 67441; 및 67442 하에 이용가능하다. 또한, 문헌 [Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173] (글루타티온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현)을 참조한다.
일부 실시양태에서, 농경학적 유전자 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 또한 및/또는 대안적으로 가치-부가 형질, 예를 들어 제한 없이, 예를 들어 식물의 스테아르산 함량을 증가시키기 위한 스테아릴-ACP 데새투라제의 안티센스 유전자를 갖는 식물의 형질전환에 의해 변형된 지방산 대사를 부여하거나 또는 이에 기여하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Knultzon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624] 참조); 감소된 파이테이트(phytate) 함량 (예를 들어, 피타제-코딩 유전자의 도입은 파이테이트의 분해를 증진하여, 더 많은 유리 포스페이트를 형질전환된 식물에 첨가함) (예를 들어, 문헌 [Van Hartingsveldt et al. (1993) Gene 127:87] (아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 피타제 유전자의 뉴클레오티드 서열); 낮은 수준의 피트산을 특징으로 하는 옥수수 돌연변이체에 기인할 수 있는 단일 대립유전자에 연관된 DNA의 클로닝에 이어서 이를 재도입시킴으로써 달성될 수 있는, 옥수수에서 파이테이트 함량을 감소시키기 위해 도입될 수 있는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Raboy et al. (1990) Maydica 35:383] 참조); 및 예를 들어 식물을 전분의 분지화 패턴을 변경시키는 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환시킴으로써 달성되는 변형된 탄수화물 조성 (예를 들어, 문헌 [Shiroza et al. (1988) J. Bacteol. 170:810] (스트렙토코쿠스 돌연변이체 프룩토실트랜스페라제 유전자의 뉴클레오티드 서열); 문헌 [Steinmetz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 20:220] (레반수크라제 유전자); 문헌 [Pen et al. (1992) Bio/Technology 10:292] (α-아밀라제); 문헌 [Elliot et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:515] (토마토 인버타제 유전자의 뉴클레오티드 서열); 문헌 [Sogaard et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:22480] (보리 α-아밀라제 유전자); 및 문헌 [Fisher et　al. (1993) Plant Physiol. 102:1045] (옥수수 내배유 전분 분지화 효소 II) 참조)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 FAD3 유전자좌를 변형시키기 위해 FAD3 유전자좌에 통합되고, 여기서 핵산은, 예를 들어 PTU 또는 ELP의 부위에서의 제2 외인성 핵산의 후속적인 부위-특이적 통합이 용이해지도록 PTU 또는 ELP를 포함한다. 또한, 미국 출원 번호 13/889,162를 참조한다.
표적화 통합을 통해 식물 게놈 내로의 관심 핵산 분자의 표적화 엔도뉴클레아제-매개 통합은 표적화 엔도뉴클레아제 또는 표적화 엔도뉴클레아제-코딩 핵산 분자의 전달 후, 숙주에서의 기능적 표적화 엔도뉴클레아제 단백질의 발현을 필요로 한다. 외인성 핵산은, 기능적 표적화 엔도뉴클레아제 단백질이 적어도 하나의 FAD3 유전자좌에서의 표적 부위(들)에서 이중-가닥 파단을 유도한 다음, 예를 들어 유전자좌 내로의 외인성 핵산의 상동성-유도 통합을 통해 복구되도록, 표적화 엔도뉴클레아제가 숙주 세포 내로 전달되거나 또는 발현되는 것와 동시에 숙주 세포에 내에 존재하는 것이 바람직하다. 통상의 기술자는 기능적 표적화 엔도뉴클레아제 단백질의 발현이 표적화 엔도뉴클레아제-코딩 구축물의 유전자도입, 및 표적화 엔도뉴클레아제-코딩 구축물의 일시 발현을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 방법에 의해 달성될 수 있음을 알 수 있다. 이들 둘 다의 경우에서, 기능적 표적화 엔도뉴클레아제 단백질의 발현 및 숙주 세포 내로 외인성 핵산의 전달은 FAD3 유전자좌에서 표적화 통합을 유도하기 위해 동시에 달성될 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제로서 ZFN을 이용하는 실시양태에서 획득된 특정한 이점은 키메라 아연 핑거 뉴클레아제의 절단 도메인의 이량체화에 대한 요건이 서열의 높은 수준을 제공하고, 따라서 절단, 특이성의 높은 수준을 제공한다는 것이다. 3개 핑거의 각각의 세트는 9개의 연속적인 염기 쌍에 결합하기 때문에, 2개의 키메라 뉴클레아제는 각각의 아연 핑거 도메인이 완전한 특이성을 갖는다면 18개 bp 표적을 효과적으로 처리한다. 상기 길이의 임의의 주어진 서열은 단일 게놈 (대략 109 bp 가정) 내에서 특유할 것으로 예측된다 (상기 문헌 [Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21(1):289-97; Wu et al. (2007)]). 또한, 추가의 핑거는 증진된 특이성을 제공할 수 있으며 (Beerli et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14628-33; Kim and Pabo (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-7; Liu et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5525-30), 따라서 각각의 DNA-결합 도메인 내의 아연 핑거의 수는 추가의 특이성을 제공하기 위해 증가될 수 있다. 예를 들어, 특이성은 24개 bp 서열을 인식하는 한 쌍의 4-, 5-, 6- 또는 그 초과의 핑거 ZFN을 사용함으로써 추가로 증가될 수 있다 (Urnov et al. (2005) Nature 435:646-51). 따라서, ZFN은 숙주 식물 게놈 내로 도입된 인식 서열이 게놈 내에서 특유하도록 사용될 수 있다.
B. 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자
일부 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 표적화 엔도뉴클레아제 내에 포함된 폴리펩티드를 코딩하는 본래 뉴클레오티드 서열의 조작 (예를 들어, 라이게이션)에 의해 조작될 수 있다. 예를 들어, DNA-결합 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 검사하여, DNA-결합 폴리펩티드에 상응하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 확인하고 그 뉴클레오티드 서열을, DNA-결합 폴리펩티드를 포함하는 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 요소로서 사용할 수 있다. 대안적으로, 표적화 엔도뉴클레아제의 아미노산 서열을 사용하여, 예를 들어 유전자 코드의 축중성에 따라 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추론할 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 예시적인 핵산 분자에서, 뉴클레아제 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈 및 DNA-결합 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 첫번째 코돈은 임의 수의 뉴클레오티드 트리플릿에 의해, 예를 들어 인트론 또는 "정지"를 위한 코딩 없이 분리될 수 있다. 마찬가지로, DNA-결합 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈 및 뉴클레아제 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 첫번째 코돈이 임의 수의 뉴클레오티드 트리플릿에 의해 분리될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 뉴클레아제 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 DNA-결합 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 마지막 (즉, 핵산 서열의 가장끝 3')의 마지막 코돈은 거기에 바로 연속되거나, 또는 합성 뉴클레오티드 링커 (예를 들어, 융합을 달성하는데 사용되었을 수 있는 뉴클레오티드 링커)에 의해 코딩되는 것과 같이 짧은 펩티드 서열로만 그로부터 분리된 서열을 코딩하는 추가의 폴리뉴클레오티드의 첫번째 코돈과 위상-일치 (phase-register)로 융합될 수 있다. 이러한 추가의 폴리뉴클레오티드 서열의 예는, 예를 들어 제한 없이 태그, 표적화 펩티드 및 효소적 절단 부위를 포함한다. 마찬가지로, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 가장끝 5' (핵산 서열에서)의 첫번째 코돈은 거기에 바로 연속되거나, 또는 짧은 펩티드 서열로만 그로부터 분리된 서열을 코딩하는 추가의 폴리뉴클레오티드의 마지막 코돈과 위상-일치로 융합될 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제 (예를 들어, DNA 결합-폴리펩티드 및 뉴클레아제 폴리펩티드)에서 기능적 폴리펩티드를 코딩하는 서열 분리 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 코딩된 아미노산 서열이 표적화 엔도뉴클레아제의 번역을 유의하게 변경할 가능성이 없도록 하는 임의의 서열로 이루어질 수 있다. 공지된 뉴클레아제 폴리펩티드 및 공지된 DNA-결합 폴리펩티드의 자율 특성으로 인해, 개재 서열은 예에서 이들 구조의 각각 기능을 간섭하지 않을 것이다.
C. 벡터 및 발현 구축물
일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드 및/또는 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자(들)는 세포, 조직 또는 유기체 내로 그 내부에서의 발현을 위해 도입될 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 FAD3 유전자좌 내에 포함된 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하는 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는 표적화 엔도뉴클레아제의 발현을 위해 세포 내로 도입될 수 있고, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이, 예를 들어 발현된 표적화 엔도뉴클레아제에 의한 유전자좌에서의 이중 가닥 파단의 도입 후 상동 재조합에 의해, 적어도 하나의 FAD3 유전자좌 내로 통합되도록 세포 내로 도입될 수 있고, 관심 폴리펩티드는 통합된 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현된다.
일부 실시양태에서, 상기 중 하나와 같은 핵산 분자는, 예를 들어 벡터 시스템, 예컨대 예를 들어 제한 없이 선형 플라스미드 또는 폐쇄된 원형 플라스미드일 수 있다. 특정한 예에서, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 특정한 실시양태에 따른 핵산 서열은, 예를 들어 핵산 서열이 1종 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 벡터에 삽입될 수 있다. 다수의 벡터들이 이와 같은 목적으로 이용가능한데, 구체적인 벡터의 선택은, 예를 들어 벡터에 삽입될 핵산의 크기, 벡터를 사용하여 형질전환될 특정한 숙주 세포, 및/또는 발현되기를 원하는 코딩된 폴리펩티드의 양에 따라 달라질 수 있다. 벡터는 전형적으로 다양한 성분을 함유하며, 그의 동일성은 벡터의 기능 (예를 들어, DNA 증폭 및 DNA 발현), 및 적합한 벡터를 갖는 특정한 숙주 세포(들)에 따라 달라진다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 코딩 서열(들)에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 숙주 세포, 예컨대 박테리아 세포, 조류 세포, 진균 세포 또는 식물 세포에서 기능하는 프로모터 서열일 수 있고, 여기서 핵산 분자는 증폭되거나 또는 발현되는 것이다. 일부 실시양태는 관심 폴리펩티드 또는 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드(들)에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 조절 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 형질전환 벡터를 포함할 수 있고, 여기서 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)은 관심 폴리펩티드 또는 표적화 엔도뉴클레아제를 생성하기 위해 식물 세포, 조직 또는 유기체에서, 조절 서열(들)의 제어 하에 발현될 수 있다.
일부 실시양태에 따른 핵산 분자에서 사용하기에 적합한 프로모터는 유도성인 것, 조직-특이성인 것, 바이러스인 것, 합성인 것 또는 구성적인 것을 포함하며, 모두 관련 기술분야에 익히 공지되어 있다. 본 발명의 실시양태에서 유용할 수 있는 프로모터의 비제한적인 예는 미국 특허 번호 6,437,217 (옥수수 RS81 프로모터); 5,641,876 (벼 액틴 프로모터); 6,426,446 (옥수수 RS324 프로모터); 6,429,362 (옥수수 PR-1 프로모터); 6,232,526 (옥수수 A3 프로모터); 6,177,611 (구성적 옥수수 프로모터); 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142 및 5,530,196 (35S 프로모터); 6,433,252 (옥수수 L3 올레오신 프로모터); 6,429,357 (벼 액틴 2 프로모터 및 벼 액틴 2 인트론); 6,294,714 (빛-유도성 프로모터); 6,140,078 (염-유도성 프로모터); 6,252,138 (병원체-유도성 프로모터); 6,175,060 (인 결핍-유도성 프로모터); 6,388,170 (양방향성 프로모터); 6,635,806 (감마-코익신 프로모터); 5,447,858 (대두 열 쇼크 프로모터); 및 미국 특허 출원 일련 번호 09/757,089 (옥수수 엽록체 알돌라제 프로모터)에 의해 제공되어 있다.
추가의 예시적 프로모터는 노팔린 신타제 (NOS) 프로모터 (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9); 옥토핀 신타제 (OCS) 프로모터 (아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens))의 종양-유도 플라스미드 상에서 운반되는 것); 카울리모바이러스 프로모터, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 프로모터 (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2); 현삼 (figwort) 모자이크 바이러스 35S-프로모터 (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); 수크로스 신타제 프로모터 (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); R 유전자 복합 프로모터 (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83); 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터; CaMV35S (미국 특허 번호 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142 및 5,530,196); FMV35S (미국 특허 번호 6,051,753 및 5,378,619); PC1SV 프로모터 (미국 특허 번호 5,850,019); SCP1 프로모터 (미국 특허 번호 6,677,503); 및 AGRtu.nos 프로모터 (진뱅크(GenBank) 등록 번호 V00087; 문헌 [Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7])를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 핵산 분자는 조직-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 조직-특이적 프로모터는 유기체의 다른 조직과 비교하여, 프로모터가 특이적인 조직에서 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 더 높은 수준으로 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 조직-특이적 프로모터의 예는 제한 없이 융단조직-특이적 프로모터; 수술-특이적 프로모터; 화분-특이적 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,141,424 및 국제 PCT 공개 번호 WO 99/042587 참조); 배주-특이적 프로모터; (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 2001/047525 A1 참조); 과실-특이 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,943,674 및 5,753,475 참조); 및 종자-특이적 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,420,034 및 5,608,152 참조)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발달 단계-특이적 프로모터 (예를 들어, 후기 발달 단계에 활성을 보이는 프로모터)가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 서열로는 번역 리더 서열로서의 기능을 하는, 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 위치하는 5' UTR을 포함한다. 번역 리더 서열은 완전하게 프로세싱된 mRNA에 존재하고, 이는 1차 전사체의 프로세싱, 및/또는 RNA의 안정성에 영향을 줄 수 있다. 번역 리더 서열의 예는 옥수수 및 페튜니아 열 쇼크 단백질 리더 (미국 특허 번호 5,362,865), 식물 바이러스 코트 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36]을 참조한다. 5' UTR의 비-제한적인 예는 GmHsp (미국 특허 번호 5,659,122); PhDnaK (미국 특허 번호 5,362,865); AtAnt1; TEV (Carrington and Freed (1990) J Virol. 64:1590-7); 및 AGRtunos (진뱅크 등록 번호 V00087; 및 상기 문헌 [Bevan et al. (1983)])에 의해 제공된다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 서열은 또한 3' 비번역 서열, 3' 전사 종결 영역, 또는 폴리아데닐화 영역을 포함한다. 이들은 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치하는 유전 요소이며, 이는 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사 또는 mRNA 프로세싱에 영향을 줄 수 있는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 식물에서 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드를 mRNA 전구체의 3' 말단에 부가하는 기능을 한다. 폴리아데닐화 서열은 다양한 식물 유전자로부터, 또는 T-DNA 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 3' 전사 종료 영역의 비제한적인 예는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; 문헌 [Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7])이다. 다양한 3' 비번역 영역의 사용의 예가 문헌 [Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-80]에 제공되어 있다. 폴리아데닐화 신호의 비제한적 예는 피숨 사티붐(Pisum sativum) RbcS2 유전자 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) 및 AGRtu.nos (진뱅크 등록 번호 E01312)로부터의 것을 포함한다.
구체적인 실시양태들에서 유용할 수 있는 조절 서열에 관한 추가의 정보는, 예를 들어 문헌 [Goeddel (1990) "Gene Expression Technology," Methods Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, CA]에 기재되어 있다.
재조합 핵산 분자 또는 벡터는 형질전환된 세포, 예컨대 식물 세포에 선택가능한 표현형을 부여하는 선택 마커를 포함할 수 있다. 선택 마커는 또한 선택 마터를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 세포 또는 유기체를 선택하는데 사용될 수 있다. 마커는 살생물제 저항성, 항생제 저항성 (예를 들어, 카나마이신, 게네티신 (G418), 블레오마이신 및 히그로마이신), 또는 제초제 저항성 (예를 들어, 글리포세이트)을 코딩할 수 있다. 선택 마커의 예는 카나마이신 저항성을 부여하며, 예를 들어 카나마이신 및 G418을 사용하여 선택될 수 있는 neo 유전자; 비알라포스 저항성을 부여하는 bar 유전자; 글리포세이트 저항성을 부여하는 돌연변이 EPSP 신타제 유전자; 브로목시닐에 대한 저항성을 부여하는 니트릴라제 유전자; 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 저항성을 부여하는 돌연변이 아세토락테이트 신타제 유전자 (ALS); 및 메토트렉세이트-내성 DHFR 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 제한 없이 암피실린; 블레오마이신; 클로람페니콜; 겐타마이신; 히그로마이신; 카나마이신; 린코마이신; 메토트렉세이트; 포스피노트리신; 퓨로마이신; 스펙티노마이신; 리팜피신; 스트렙토마이신 및 테트라시클린을 포함하여, 화학적 작용제에 대한 저항성을 부여하는 다수의 선택 마커들이 이용가능하다. 상기 선택 마커의 예는, 예를 들어 미국 특허 5,550,318; 5,633,435; 5,780,708 및 6,118,047에 예시되어 있다.
핵산 분자 또는 벡터는 또한 또는 대안적으로 스크리닝가능 마커를 포함할 수 있다. 스크린가능한 마커는 발현을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예시적인 스크리닝가능 마커는, 그에 대한 각종 발색 기질이 공지되어 있는 효소를 코딩하는 β-글루쿠로니다제 또는 uidA 유전자 (GUS) (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); 식물 조직에서 안토시아닌 색소 (적색) 생산을 조절하는 생성물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds., Plenum, NY (pp. 263-82); β-락타마제 유전자 (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); 그에 대한 각종 발색 기질이 공지되어 있는 효소를 코딩하는 유전자 (예를 들어, PADAC, 발색성 세팔로스포린); 루시퍼라제 유전자 (Ow et al. (1986) Science 234:856-9); 발색성 카테콜을 전환시킬 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); 아밀라제 유전자 (Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); 티로신을 도파 및 도파퀴논으로 산화시킴에 따라 멜라닌을 축합시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자 (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); 및 α-갈락토시다제를 포함한다.
예를 들어, 특정한 관심 폴리펩티드 또는 특정한 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열은 통상의 기술자에 의해 즉시 인식가능할 것이다. 유전자 코드의 축중성은 특정한 아미노산 서열에 대한 한정된 개수의 코딩 서열을 제공한다. 본 발명의 실시양태에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 특정한 서열의 선택은 실시자의 판단에 속한다. 상이한 적용에 있어서는 상이한 코딩 서열이 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 특정한 숙주의 핵산 내에 포함되는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 증진시키기 위해, 핵산의 뉴클레오티드를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 유전자 코드는 64개의 가능한 코돈으로 중복되지만, 대부분의 유기체는 우선적으로 이들 코돈의 하위세트를 사용한다. 종에서 가장 빈번하게 이용되는 코돈은 최적 코돈이라 불리며, 가장 빈번하게 사용되지 않는 것들은 희귀 또는 저-사용 코돈으로 분류된다 (Zhang et al. (1991) Gene 105:61-72). 코돈은 때때로 "코돈 최적화"로서 지칭되는 과정에서 특정한 숙주의 바람직한 코돈 사용을 반영하기 위해 대체될 수 있다. 특정한 원핵 또는 진핵 숙주가 선호하는 코돈을 함유하는 최적화된 코딩 서열은, 예를 들어 번역률을 증가시키거나, 목적하는 특성 (예를 들어, 비-최적화된 서열로부터 제조된 전사체와 비교하여 보다 장기간의 반감기)을 갖는 재조합 RNA 전사체를 생산함으로써 제조할 수 있다.
핵산은 통상의 기술자로 공지된 임의의 방법, 예컨대 예를 들어 제한 없이 원형질체의 형질전환에 의한 것 (예를 들어, 미국 특허 5,508,184); 건조/억제-매개 DNA 흡수에 의한 것 (예를 들어, 문헌 [Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8]); 전기천공에 의한 것 (예를 들어, 미국 특허 5,384,253); 탄화규소 섬유를 사용한 교반에 의한 것 (예를 들어, 미국 특허 5,302,523 및 5,464,765); 아그로박테리움-매개 형질전환에 의한 것 (예를 들어, 미국 특허 5,563,055, 5,591,616, 5,693,512, 5,824,877, 5,981,840, 및 6,384,301); 및 DNA-코팅 입자의 가속에 의한 것 (예를 들어, 미국 특허 5,015,580, 5,550,318, 5,538,880, 6,160,208, 6,399,861, 및 6,403,865)에 의해 본 발명의 실시양태에서 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이들과 같은 기술의 적용을 통해, 실질적으로 임의의 종의 세포는 안정하게 형질전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질전환 DNA는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 다세포 종의 경우에, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 유기체 내로 재생될 수 있다. 임의의 이들 기술은, 예를 들어 트랜스제닉 식물의 게놈에 본 발명의 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
발현 벡터를 식물에 도입하는데 가장 광범위하게 이용되는 방법은 아그로박테리움의 자연 형질전환 시스템을 기반으로 한다. 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 에이. 리조게네스(A. rhizogenes)는 식물 세포를 유전자 형질전환시키는 식물 병원성 토양 박테리아이다. 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 각각 식물의 유전 형질전환을 담당하는 유전자를 운반한다. Ti (종양-유도)-플라스미드는 형질전환된 식물로 전달되는 T-DNA로 공지된 큰 절편을 함유한다. Ti 플라스미드의 또 다른 절편인 vir 영역은 T-DNA 전달을 담당한다. T-DNA 영역에는 각각 말단 반복 뉴클레오티드 서열로 이루어진 좌측 및 우측 경계가 접한다. 몇몇의 변형된 이원성 벡터에서, 종양-유도 유전자가 결실되었고, vir 영역의 기능은 T-DNA 경계 서열이 접하는 외래 DNA를 전달하기 위해 이용된다. T-영역은 또한, 예를 들어 트랜스제닉 식물 및 세포의 효율적인 회수를 위한 선택 마커, 및 전달을 위한 삽입 서열, 예컨대 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 다중 클로닝 부위를 함유할 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 식물 형질전환 벡터는 에이. 투메파시엔스의 Ti 플라스미드 (예를 들어, 미국 특허 4,536,475, 4,693,977, 4,886,937, 및 5,501,967; 및 유럽 특허 EP 0 122 791 참조) 또는 에이. 리조게네스의 Ri 플라스미드로부터 유래된다. 추가의 식물 형질전환 벡터는, 예를 들어 제한 없이 문헌 [Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13]; 상기 문헌 [Bevan et al. (1983)]; 문헌 [Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42]; 및 유럽 특허 EP 0 120 516에 기재된 것, 및 상기 중 임의의 것으로부터 유래되는 것을 포함한다. 자연상에서 식물과 상호작용하는 다른 박테리아, 예컨대 시노리조비움(Sinorhizobium), 리조비움(Rhizobium) 및 메소리조비움(Mesorhizobium)이 수많은 다양한 식물로의 유전자 전달을 매개하도록 변형될 수 있다. 이들 식물-연관 공생 박테리아는 무력화된 Ti 플라스미드 및 적합한 이원성 벡터 둘 다의 획득에 의해 유전자 전달에 대해 적격으로 만들 수 있다.
외인성 DNA를 수용자 세포에 제공한 후, 일반적으로는 추가의 배양 및 식물 재생을 위해 형질전환된 세포를 확인한다. 형질전환된 세포를 확인할 수 있는 능력을 개선시키기 위해서는 형질전환체를 생성하는데 사용되는 벡터와 함께, 이전에 제시된 바와 같은 선택 또는 스크리닝가능 마커 유전자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 선택 마커가 사용되는 경우, 형질전환된 세포는 세포를 선택제 또는 선택제들에 노출시킴으로써 잠재적으로 형질전환된 세포 집단 내에서 확인된다. 스크리닝가능 마커가 사용되는 경우, 세포는 목적하는 마커 유전자 형질에 대해 스크리닝될 수 있다.
선택제에의 노출에서 살아남은 세포, 또는 스크리닝 검정에서 양성인 것으로 평가된 세포를 식물의 재생을 지지하는 배지 중에서 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지 (예를 들어, MS 및 N6 배지)는 추가 물질, 예컨대 성장 조절제를 포함함으로써 변형될 수 있다. 조직은 식물 재생의 노력을 개시하는데 충분한 조직이 이용가능할 때까지, 또는 수동식 선택 라운드를 반복한 후, 조직의 형태가 재생에 적합한 형태가 될 때까지 (예를 들어, 적어도 2주) 성장 조절제를 포함하는 기초 배지 상에서 유지시킨 다음, 신초 형성에 도움이 되는 배지로 옮겨 놓는다. 충분한 신초 형성이 일어날 때까지 주기적으로 배양물을 옮겨 놓는다. 일단 신초가 형성되고 나면, 이를 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 옮겨 놓는다. 일단 뿌리가 형성되고 나면, 추가 성장 및 성숙화를 위해 식물을 토양으로 옮겨 놓을 수 있다.
재생 식물에서의 관심 핵산 분자 (예를 들어, 적어도 하나의 본 발명 융합 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)의 존재를 확인하기 위하여, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 분자 생물학적 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, PCR 및 핵산 서열분석; 생화학적 검정, 예컨대 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및/또는 웨스턴 블롯)에 의해, 또는 효소 작용에 의해 단백질 생성물의 존재를 검출하는 것; 식물 부분 검정, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정; 및 재생된 전체 식물의 표현형의 분석을 포함한다.
통합 사례는, 예를 들어 관심 뉴클레오티드 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한, 예를 들어 PCR 증폭에 의해 분석될 수 있다. PCR 유전자형 결정은 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유할 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 폴리머라제-연쇄 반응 (PCR) 증폭에 이어서, PCR 증폭 생성물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 수행하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형 결정 방법에 대해서는 잘 기재되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53] 참조), 세포 배양물을 포함한 임의의 식물 종 또는 조직 유형으로부터 유래하는 게놈 DNA에 적용될 수 있다.
아그로박테리움-의존성 형질전환 방법을 사용하여 형성된 트랜스제닉 식물은 전형적으로 단일 내지 다중 카피의 재조합 DNA를 함유한다. 단일 재조합 DNA 서열은 "트랜스제닉 사례" 또는 "통합 사례"로 지칭된다. 이러한 트랜스제닉 식물은 삽입된 DNA 서열에 대해 이형접합성이다. 일부 실시양태에서, 트랜스진과 관련하여 동형접합성인 트랜스제닉 식물은 단일 외인성 유전자 서열을 함유하는 독립 분리개체 트랜스제닉 식물을 그 자신, 예를 들어 F0 식물과 유성적으로 교배시켜 (자가 수정시켜) F1 종자를 생성함으로써 획득할 수 있다. 생성된 F1 종자 중 1/4은 트랜스진과 관련하여 동형접합성일 것이다. F1 종자를 발아시킴으로써, 전형적으로 SNP 검정, 또는 이형접합체와 동형접합체가 구별될 수 있게 하는 열 증폭 검정 (즉, 접합성 검정)을 사용하여 이형접합성에 대해 시험될 수 있는 식물을 생성한다.
일부 실시양태에서 핵산 분자를 사용한 식물 또는 식물 세포의 직접적인 형질전환 이외에도, 적어도 하나의 트랜스제닉 사례를 갖는 제1 식물을 이러한 사례가 결핍되어 있는 제2 식물과 교배시키는 것에 의해 트랜스제닉 식물이 특정한 실시양태에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산이 부위-특이적 방식으로 통합된 것인 적어도 하나의 변형된 FAD3 유전자좌를 포함하는 핵산은 트랜스제닉 식물을 생성하기 위한 형질전환에 순응하는 제1 식물 라인 내로 도입될 수 있으며, 여기서 트랜스제닉 식물은 적어도 하나의 변형된 FAD3 유전자좌를 제2 식물 라인 내로 유전자이입시키기 위해 (따라서, 외인성 핵산이 제2 식물 라인 내로 들어감) 제2 식물 라인과 교배될 수 있다.
재생 식물에서 관심 핵산 분자의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 분자 생물학적 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅 및 PCR; 생화학적 검정, 예컨대 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및/또는 웨스턴 블롯)에 의해 또는 효소적 기능에 의한 단백질 생성물의 존재를 검출하는 것; 식물 부분 검정, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정; 및 재생된 전체 식물의 표현형의 분석을 포함한다.
표적화된 통합 사례는, 예를 들어 관심 핵산 분자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한, 예를 들어 PCR 증폭에 의해 스크리닝될 수 있다. PCR 유전자형 결정은 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유할 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 캘러스 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 폴리머라제-연쇄 반응 (PCR) 증폭에 이어서 PCR 증폭 생성물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형 결정 방법은 잘 기재되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53]), 세포 배양물을 비롯한 임의의 식물 종 또는 조직 종류로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다. 표적 서열 및 도입된 서열 둘 다에 결합하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조합은 PCR 증폭 반응에서 순차적으로 사용되거나 또는 멀티플렉스화될 수 있다. 표적 부위, 도입된 핵산 서열, 및/또는 둘의 조합에 어닐링하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용될 수 있다. 따라서, PCR 유전자형 결정 전략은 식물 게놈 내의 특이적 서열의 증폭, 식물 게놈 내의 다중 특이적 서열의 증폭, 식물 게놈 내의 비-특이적 서열의 증폭, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다 (이에 제한되지는 않음). 통상의 기술자는 게놈에 대해 정보를 얻기 위한 프라이머 및 증폭 반응의 추가의 조합을 고안할 수 있다. 예를 들어, 도입된 핵산 서열의 경계 외부의 표적에 특이적인 핵산 서열(들)에 어닐링하도록 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트가 설계될 수 있다.
정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머는, 예를 들어 관심 핵산 분자 내의 코딩 영역, 또는 관심 핵산 분자의 다른 부분에 상응하는 서열에서, 도입된 관심 핵산 분자에 특이적으로 어닐링하도록 설계될 수 있다. 이들 프라이머는 상기 기재된 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 목적하는 서열에 따라 합성될 수 있고, 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스, 인크.(Integrated DNA Technologies, Inc.) 아이오와주 코랄빌)로부터). 증폭 후에, 증폭 생성물의 클로닝 및 서열 결정, 또는 직접적인 서열 분석이 수행될 수 있다. 통상의 기술자는 PCR 유전자형 결정 동안 생성된 증폭 생성물의 분석을 위한 대안적인 방법을 구상할 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 표적에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머가 PCR 증폭에 사용된다.
VI. FAD3 성능 유전자좌에 통합된 핵산을 포함하는 트랜스제닉 식물 및 식물 물질
일부 실시양태에서, 식물이 적어도 하나의 변형된 FAD3 유전자좌 (예를 들어, 분열되고/거나 외인성 서열의 표적화 통합된 FAD3 유전자좌)를 포함하는 식물 세포를 포함하는, 트랜스제닉 식물이 제공된다. 특정한 실시양태에서, 이러한 식물은 식물 조직 또는 식물 세포의 형질전환, 및 전체 식물의 재생에 의해 생성될 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 식물은 부위-특이적 방식으로 적어도 하나의 FAD3 유전자좌에서의 외인성 핵산의 도입을 통해 또는 변형된 FAD3 유전자좌의 생식질로의 유전자이입을 통해 획득될 수 있다. 이러한 식물 세포를 포함하는 식물 물질이 또한 제공된다. 이러한 식물 물질은 식물 세포를 포함하는 식물로부터 획득될 수 있다.
적어도 하나의 변형된 FAD3 유전자좌를 포함하는 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 물질은 일부 실시양태에서 하기 특징: 식물 세포에서의 표적화 엔도뉴클레아제의 발현; 식물 세포에서의 (또는 그 내부의 색소체에서의) 관심 폴리펩티드의 발현; 식물 세포의 핵에서의 표적화 엔도뉴클레아제의 발현; 식물 세포에서의 표적화 엔도뉴클레아제의 국재화; 식물 세포의 게놈에서 FAD3 유전자좌에서의 통합; 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 농경학상 유전자의 식물 세포의 게놈에서 FAD3 유전자좌에서의 통합; 및/또는 식물 세포의 게놈에서 FAD3 유전자좌에서 통합된 코딩 서열에 상응하는 RNA 전사체의 존재 중 하나 이상을 나타낼 수 있다. 이러한 식물은 추가로, 예를 들어 제한 없이 내인성 또는 트랜스제닉 뉴클레오티드 서열의 발현, 식물 세포의 게놈에서 FAD3 유전자좌에서 통합된 관심 폴리펩티드 또는 농경학상 유전자에 의해 조절되는 발현; 곤충, 다른 해충, 및 병해 유발제에 대한 저항성; 제초제에 대한 내성; 안정성, 수율 또는 보관-수명 증진; 환경상의 내성; 약제 생산; 산업 제품 생산; 및 영양상 증진으로 인한 것을 비롯한 하나 이상의 바람직한 형질을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 트랜스제닉 식물은 본원에 기재된 방법에 따라 적어도 하나의 FAD3 유전자좌에 후속적으로 통합되는 핵산으로 형질전환될 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 따라서, 식물은 쌍자엽 또는 단자엽일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용가능한 쌍자엽 식물의 비제한적인 예는 아라비돕시스, 알팔파, 콩, 브로콜리, 양배추, 카놀라, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 배추, 목화, 오이, 가지, 상추, 멜론, 완두콩, 후추, 땅콩, 감자, 호박, 무, 평지씨, 시금치, 대두, 스쿼시, 사탕무, 해바라기, 담배, 토마토 및 수박을 포함한다. 본 방법에 사용가능한 단자엽 식물은 비제한적인 예는 옥수수, 보리, 양파, 벼, 소르굼, 밀, 호밀, 기장, 사탕수수, 귀리, 트리티케일, 스위치그래스 및 잔디를 포함한다. 본 발명에 따른 트랜스제닉 식물이 사용될 수 있거나, 또는 이는 임의의 방식으로 재배될 수 있다.
일부 실시양태는 또한 본 발명의 트랜스제닉 식물로부터 생산되는 일상용품을 제공한다. 일상용품은, 예를 들어 제한 없이 적어도 하나의 FAD3 유전자좌에 통합되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식품 제품, 음식, 오일 또는 식물의 분쇄 곡물 또는 통곡물 또는 종자를 포함한다. 하나 이상의 상품 또는 일상용품에서의 하나 이상의 이러한 뉴클레오티드 서열의 검출은 상품 또는 일상용품이 적어도 일부가 본 발명의 실시양태에 따라 생산된 트랜스제닉 식물로부터 생산되었다는 사실상의 증거이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 변형된 FAD3 유전자좌를 포함하는 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 종자는 그의 게놈에서의 적어도 하나의 다른 트랜스제닉 사례, 예컨대 제한 없이 RNAi 분자가 전사되는 트랜스제닉 사례; 살곤충 단백질 (예를 들어, 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 살곤충 단백질)을 코딩하는 유전자; 제초제 내성 유전자 (예를 들어, 글리포세이트에 대한 내성을 제공하는 유전자); 및 트랜스제닉 식물에서 목적하는 표현형 (예를 들어, 증가된 수율, 변경된 지방산 대사물질, 또는 세포질 남성 불임의 회복)에 기여하는 유전자를 포함할 수 있다.
적어도 하나의 변형된 FAD3 유전자좌를 포함하는 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물은 하나 이상의 목적하는 형질을 가질 수 있다. 이러한 형질은, 예를 들어 곤충, 다른 해충, 및 병해 유발제에 대한 저항성; 제초제에 대한 내성; 안정성, 수율 또는 보관-수명 증진; 환경상의 내성; 제약 생산; 산업 제품 생산; 및 영양상 증진을 포함할 수 있다. 바람직한 형질은 바람직한 형질을 나타내는 식물에서 발현되는 FAD3 유전자좌에서의 표적화된 재조합에 의해 통합된 하나 이상의 핵산 분자에 의해 부여될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 목적하는 형질은 적어도 하나의 변형된 FAD3 유전자좌의 부위에서의 식물의 게놈 내로 도입된 트랜스진(들)의 식물 내 존재에 의한 것일 수 있다. 추가 실시양태에서, 목적하는 형질은 형질이 적어도 하나의 변형된 FAD3 유전자좌에서 표적화된 재조합에 의해 통합된 하나 이상의 핵산 분자에 의해 부여될 수 있는 통상적인 육종을 통해 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 트랜스제닉 식물은 임의의 방식으로 사용되거나 또는 배양될 수 있고, 여기서 적어도 하나의 변형된 FAD3 유전자좌의 존재는 바람직한 것이다. 따라서, 식물은, 특히 본 발명에 따른 적어도 하나의 FAD3 유전자좌에서 부위-특이적 방식으로 후속적으로 통합되는 핵산 분자로 형질전환되고, 관련 기술분야에서 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 경작 및 배양됨으로써 하나 이상의 목적하는 형질을 갖도록 조작될 수 있다.
VII. FAD3 성능 유전자좌에 통합된 핵산을 포함하는 트랜스제닉 식물의 마커-지원 육종
브라시카(Brasicca) 종에서 Fad2 및 Fad3에 연관된 (예를 들어, 긴밀하게-연관된) 분자 마커가 제공된다. 예를 들어, HO 형질에 관련된 서열 (FAD3)을 함유하는 DNA 절편이 확인된다. 이들 절편은 게놈 연결 기의 돌연변이체 대립유전자에 연관된 (예를 들어, 긴밀하게-연관된) 마커 주위에 및 이들 사이에 위치한다. 따라서, 불활성화 돌연변이를 갖는 돌연변이체 FAD3 유전자를 포함하는 핵산 분자가 또한 제공된다. 부분적으로, 확인된 절편 및 그의 마커는 비. 나푸스 게놈에서의 연결 기에서 그의 위치에 의해 본 발명의 대상에 포함된다.
본원에 인용된 공개공보, 특허 및 특허 출원을 비롯한 모든 참고문헌은 이들이 본 개시내용의 명백한 상세한 설명과 불일치하지 않는 정도로 본원에 참조로 포함되고, 각 참고문헌이 참고문헌으로써 개별적으로 및 구체적으로 나타나고 그 전문이 본원에 기재된 것과 동일한 정도로 포함된다. 본원에서 논의된 참고 문헌은 단지 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공하는 것이다. 본 발명자들이 선행 발명으로 인해 이러한 개시내용에 대해 선행하는 권리가 없음을 용인하는 것으로 해석되는 것은 아니다. 하기 실시예는 특정 특별한 특징 및/또는 실시양태를 예시하기 위해 제공된다. 실시예는 예시되어 있는 구체적인 특징 또는 실시양태로 본 개시내용을 제한하는 것으로 간주되지는 않는다.
실시예
실시예 1: 박테리아 인공 염색체 라이브러리로부터 FAD3 표적 서열의 확인
BAC 라이브러리 구축
박테리아 인공 염색체 (BAC) 라이브러리는 상업적 공급원 (앰플리콘 익스프레스(Amplicon Express), 워싱턴주 풀만)으로부터 입수하였다. BAC 라이브러리는 브라시카 나푸스(Brassica napus) L. var. DH10275로부터 단리된 고분자량 게놈 DNA (gDNA) 단편을 함유하는 110,592개의 BAC 클론을 포함하였다. gDNA를 BamHI 또는 HindIII 제한 효소로 소화시켰다. 약 135 Kbp의 단리된 gDNA 단편을 pCC1BAC 벡터 (에피센트레(Epicentre), 위스콘신주 매디슨)에 라이게이션시키고, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) str. DH10B (인비트로젠(Invitrogen))로 형질전환시켰다. BAC 라이브러리는 2개의 상이한 제한 효소를 사용하여 구축된 짝수 개의 BAC 클론으로 구성되었다. 이와 같이, Hind III 구축된 BAC 라이브러리는 144개의 개별 384-웰 플레이트로 함유되었다. 마찬가지로, BamHI 구축된 BAC 라이브러리는 144개의 개별 384-웰 플레이트로 함유되었다. 총 110,592개의 BAC 클론을 단리하고, 288개의 개별 384-웰 플레이트에 배열하였다. 288개의 개별 384-웰 플레이트는 각각 고속 PCR 기반 스크리닝을 위한 단일 DNA 추출용으로 공급원에 의해 제공되었다. 생성된 BAC 라이브러리는 대략 15 Gbp의 gDNA를 포괄하며, 이는 브라시카 나푸스 L. var. DH10275 게놈의 12-배 게놈 커버리지에 해당한다 (브라시카 나푸스 L. 게놈의 추정치는 문헌 [Johnston et al. (2005) Annals of Botany 95:229-235]에 기재된 바와 같이 약 1.132 Gbp임).
BAC 라이브러리로부터 단리된 FAD3 코딩 서열의 서열 분석
구축된 BAC 라이브러리를 사용하여 FAD3 유전자 코딩 서열을 단리하였다. 서열분석 실험을 수행하여 브라시카 나푸스 L. var. DH10275로부터의 6개의 FAD3 유전자 동조체 및 파라로그의 특정 유전자 서열을 확인하였다.
FAD3 유전자 서열이 처음에 모델 종 아라비돕시스 탈리아나에서 확인되었다. 유전자 서열은 진뱅크에 유전자좌 태그: At2g29980으로 열거된다. 모델 식물 종 아라비돕시스 탈리아나 및 이배체 브라시카 라파 (사배체 브라시카 나푸스의 조상 중 하나) 사이의 비교 게놈 상관관계는 이전에 기재되어 있다. (Schranz et al. (2006) Trends in Plant Science 11(11):535-542). FAD 유전자에 대한 특정의 관련성으로 미루어 보아 비교 분석시에 유전자의 3-4개 카피가 이배체 브라시카 게놈 내에서 발생할 수 있을 것으로 예상되었다. 추가의 유전자 맵핑 연구는 문헌 [Scheffler et al. (1997) Theoretical and Applied Genetics 94; 583-591]에 따라 완료되었다. 이러한 유전자 맵핑 연구의 결과는 FAD3 유전자의 6개의 카피가 브라시카 나푸스에 존재한다는 것을 보여주었다.
브라시카 나푸스로부터의 FAD3 유전자에 집중된 이전의 서열분석 시도에서 양쪽 A 및 C 게놈 특이적 카피를 확인하고, 유전자 맵핑하였다 (Hu et al., (2006) Theoretical and Applied Genetics, 113(3): 497-507). 종자 특이적 cDNA 라이브러리로부터의 EST 서열의 수집물이 이전에 구축되었으며, 캐나다 농업농산식품부(Agriculture and Agri-food Canada, 서스캐처원주 새스커툰 107 사이언스 플레이스)의 앤드루 샤프(Andrew Sharpe)에 의해 식물 세포주 DH12075로부터 서열분석되었다. 더욱이, 2배가 된 반수체 카놀라 식물 DH12075 전장 유전자 서열로부터의 EST의 수집물이 이용가능하지 않았기 때문에, 정확하게 호출된 뉴클레오티드의 서열 품질 및 신뢰도의 지침 또한 이용가능하지 않았다. 결과적으로, 상이한 FAD 유전자 서열 판독물 사이의 서열 변이는 명백하게 FAD3 유전자 패밀리의 다양한 동조체 및 파라로그의 상이한 유전자 카피에 기인할 수 없었으며, 게놈 서열도 이용가능하지 않았다. 그러나, EST 뿐만 아니라 2개의 FAD3A 및 FAD3C 전장 유전자 서열 (문헌 [Hu et al., (2006)]에 기재됨)을 사용하여 조합된 서열 분석을 수행하였을 때, 유전자 둘 다와 매치되는 EST를 추가의 4개의 반수체형과 함께 확인하였다. 그 결과, 총 6개의 특유한 FAD3 반수체형이 확인되었다. 다양한 FAD3 반수체형에 대한 모든 이용가능한 데이터의 어셈블리 후에, 엑손 1에서 높은 수준의 엑손 서열 분기가 확인되었다. 엑손 1에서 FAD3 서열의 분기는 유전자/대립유전자 특이적 PCR 프라이머의 설계에 이용될 수 있는 기회로 확인되었다. 또한, 반수체형 사이에서 최소로 분화된 엑손 (예를 들어, 엑손 5, 6, 7 및 8이 1-3 bp를 가지며, 이는 FAD3A 및 FAD3C 사이에서 달라짐) 또는 서열 변이가 없는 엑손 (예를 들어, 엑손 2 및 3)이 확인되었다.
비. 나푸스 L. var. DH12075로부터 구축된 BAC 라이브러리의 서열결정 분석에서 6개의 BAC 서열 (서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 및 서열 6)을 단리하였으며, 이로부터 FAD3A (서열 7), FAD3A' (서열 8), FAD3A" (서열 9), FAD3C (서열 10), FAD3C" (서열 11), 및 FAD3C' (서열 12) 유전자에 대한 코딩 서열을 결정하였다. FAD3A, FAD3A', FAD3A", FAD3C, FAD3C", 및 FAD3C' 유전자 서열을 확인하고, 유전자 맵핑하였다.
6개의 FAD3 유전자의 서열 분석을 서열 정렬 프로그램 및 이웃-접합수 (동일성 백분율 사용)를 이용하여 수행하였다. 서열 정렬을 벡터 NTI 어드밴스 11.0 컴퓨터 프로그램 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 캘리포니아주 칼스배드)으로부터의 얼라인X® 프로그램을 통해 만들고, 도 1에 제시하였다. 얼라인X®는 변형된 클러스탈 W 알고리즘을 이용하여 유사성 비교 및 주석달기를 위한 단백질 또는 핵산 서열의 다중 서열 정렬을 생성한다. 이웃-접합수를 잘뷰 v2.3® 소프트웨어로 생성하고, 도 2에 제시하였다. (Waterhouse et al. (2009) Bioinformatics 25 (9) 1189-1191). FAD3 유전자를 함유하는 것으로 확인된 콘티그를 아라비돕시스 탈리아나 유전자의 데이터베이스에 대한 BLASTn 쿼리(query)로 사용하였다. FAD3 유전자를 함유하는 6개의 콘티그 각각의 영역을 아라비돕시스 탈리아나 FAD3 유전자 (진뱅크 등록 번호 At2g29980)에 대한 비교를 통해 확인하였다. 이어서, FAD3 콘티그를 모든 FAD3 유전자가 5' → 3' 배향을 갖도록 배향하였다. FAD3 콘티그를 가능한 경우에 2개의 상류 (5') 및 1개의 하류 (3') 아라비돕시스 탈리아나 유전자를 함유하도록 트리밍하였다. 일단 배향되면 FAD3 유전자의 완전한 코딩 영역을 각 콘티그로부터 추출하고, 이를 이용하여 상이한 FAD3 유전자 패밀리 구성원 사이의 상관관계를 보여주는 이웃 접합수를 생성한다. 6개의 FAD3 패밀리 구성원을 FAD3 유전자의 3개의 쌍에 정렬시켰다 (도 2).
PCR 기반 스크리닝
상기 언급된 BAC 라이브러리를 스크리닝하기 위해 PCR 프라이머의 코호트를 설계하였다. 프라이머를 유전자 패밀리의 모든 구성원을 증폭시키는 범용 프라이머, 또는 표적화된 대립유전자 증폭을 위한 유전자 특이적 프라이머로 설계하였다. PCR 프라이머는 20 bp 길이 (+/- 1bp)가 되고 50% (+/- 8%)의 G/C 함량을 함유하도록 설계하였다. 표 1은 설계 및 합성된 프라이머를 열거한다. BAC 라이브러리의 클론을 모으고, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해 스크리닝하였다.
표 1: FAD3 서열의 PCR 증폭에 사용된 프라이머 서열
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폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 2가지 상이한 세트의 조건을 이용하였다. 첫번째 시리즈의 PCR 반응은 다음을 함유하였다: 1X PCR 완충제 (dNTP 함유); 1.5 mM MgCl2; 200 μM의 0.25 U 이몰라제(Immolase)® DNA 폴리머라제 (바이오라인(Bioline), 영국 런던); 250 nM의 각 프라이머; 및 약 5-10 ng 주형 DNA. 두번째 시리즈의 PCR 반응은 게놈 DNA의 증폭을 위해 개발하였으며, 다음을 함유하였다: 5-10 ng의 게놈 DNA, 1X PCR 완충제, 2 mM dNTP, 0.4 μM 정방향 및 역방향 프라이머, 및 0.25 U 이몰라제® DNA 폴리머라제 (바이오라인, 영국 런던). 시약을 13 μL의 최종 부피로 모으고, MJ PTC200® 써모사이클러 (바이오라드(BioRad), 캘리포니아주 허큘레스) 또는 ABI 9700 진 앰프 시스템(Gene Amp System)® (라이프 테크놀로지스, 캘리포니아주 칼스배드)을 이용하여 증폭시켰다. 특정 플레이트의 PCR 기반 스크리닝을 상기 기재된 PCR 조건에서 문헌 [Bryan et al. (Scottish Crops Research Institute annual report: 2001-2002)]에 기재된 스크리닝 시스템에 기초한 4차원 스크리닝 접근법을 이용하여 수행하였다. 모은 BAC 라이브러리의 PCR 기반 스크리닝 후에; 증폭된 PCR 생성물을 직접적 생어(Sanger) 서열분석 방법을 이용하여 서열분석하였다. 증폭된 생성물을 빅다이(BigDye)® v3.1 프로토콜 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))에 따라 에탄올, 아세트산나트륨 및 EDTA로 정제하고, ABI3730xl® 자동화 모세관 전기영동 플랫폼 상에서 전기영동을 수행하였다.
PCR 기반 스크리닝 및 입체형태적 생어 서열분석에 따라, 다양한 상이한 FAD3 유전자 패밀리 구성원을 함유하는 플레이트의 집단을 확인하였다. 총 6개의 특유한 FAD3 동조체 및 파라로그 유전자 서열이 확인되었다 (표 2). FAD3 유전자를 함유하는 플레이트 내에서의 특이적 웰 및 클론을 확인하기 위한 플레이트 스크리닝을 수행하기 위해 각각의 FAD3 유전자 서열당 총 2개의 플레이트를 선택하였다 (표 2). 양쪽 플레이트에서 특이적 웰을 확인하고, 각각의 FAD3 유전자 패밀리 구성원에서 개별 클론을 선택하였다 (표 2).
표 2: 양성 반응을 제공하는 BAC 클론 플레이트의 확인 (사용된 상세한 PCR 프라이머 조합 및 플레이트 내에서의 클론 확인을 위해 선택된 2개의 플레이트 Id).
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각각의 확인된 FAD 유전자 패밀리 구성원에서 단일 BAC 클론을 서열분석을 통해 추가로 분석하였다. BAC 클론의 DNA를 단리하고, 라지 컨스트럭트 키트(Large Construct kit)® (퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아)를 제조업체의 지침에 따라 사용하는 서열분석을 위해 제조하였다. 추출된 BAC DNA는 GS-FLX 티타늄 기술® (로슈(Roche), 인디애나주 인디애나폴리스)을 제조업체의 지침에 따라 이용하는 서열분석을 위해 제조하였다. 최적의 데이터 산출을 위해 쌍별로 모은 BAC의 서열분석 반응을 물리적으로 분할된 GS-FLX TI 피코-타이터(Pico-titer) 플레이트®를 이용하여 수행하였다. BAC는 FAD2 유전자가 FAD3 유전자와 쌍을 형성하여 만든 쌍별로 조합하였다. 모든 생성된 서열 데이터를 뉴블러(Newbler) v2.0.01.14® (454 라이프 사이언시스, 코네티컷주 브랜포드)에 의해 어셈블리하였다. 어셈블리된 콘티그를 대응하는 FAD 유전자의 존재에 대해 시퀀셔(Sequencher) v3.7® (진코드스(GeneCodes), 미시간주 앤 아버)를 이용하여 수동적으로 평가하였다.
모든 6개의 FAD3 유전자의 전체 게놈 서열을 확인하고 완전히 특성화한 후에, 아연 핑거 뉴클레아제를 각각의 특정 유전자 패밀리 구성원에 대한 서열에 결합하도록 설계하였다.
실시예 2: FAD2 유전자에 특이적인 아연 핑거 결합 도메인의 설계
FAD3 유전자 유전자좌의 다양한 기능적 서열을 코딩하는 DNA 서열에 대해 지시된 아연 핑거 단백질을 이전에 기재된 바와 같이 설계하였다. 예를 들어, 문헌 [Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651]을 참조한다. 예시적인 표적 서열 및 인식 나선은 표 3 (인식 나선 영역 설계) 및 표 4 (표적 부위)에 제시된다. 표 4에서, ZFP 인식 나선에 의해 접촉되는 표적 부위에서의 뉴클레오티드는 대문자로 나타내고; 접촉되지 않은 뉴클레오티드는 소문자로 나타낸다. 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 표적 부위는 FAD3의 7개의 표적 부위에 결합하도록 설계하였다. FAD3 아연 핑거 설계를, CCHC 구조의 핑거를 적어도 하나 갖는 단백질을 코딩하는 아연 핑거 발현 벡터에 도입하였다. 미국 특허 공보 번호 2008/0182332를 참조한다. 특히, 각 단백질에서 마지막 핑거는 인식 나선에 대해 CCHC 백본을 갖는다. 비-정규 아연 핑거-코딩 서열을 4개의 아미노산 ZC 링커 및 제아 메이스(Zea mays)로부터 유래된 opaque-2 핵 국재화 신호를 통해 유형 IIS 제한 효소 FokI의 뉴클레아제 도메인 (문헌 [Wah et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569]의 서열의 아미노산 384-579)에 융합시켜 FAD3 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 형성하였다. 융합 단백질의 발현은 상대적으로 강한 구성적 프로모터, 예컨대 카사바 베인 모자이크(Cassava Vein Mosaic) 바이러스 (CsVMV) 프로모터로부터 유래되고 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) ORF23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3'UTR v1)에 의해 플랭킹된 프로모터에 의해 구동된다. 토세아 아시그나(Thosea asigna) (Szymczak et al., 2004)로부터의 바이러스 자기-가수분해 2A 코딩 뉴클레오티드 서열을 구축물에 클로닝된 2개의 ZFN 사이에 부가하였다. 예시적인 벡터는 하기 기재되어 있다.
최적의 아연 핑거는 이전에 활성 뉴클레아제를 확인하는 것으로 밝혀진 출아 효모 기반 시스템을 이용하여 절단 활성에 대해 검증하였다. 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 20090111119; 문헌 [Doyon et al. (2008) Nat Biotechnol. 26:702-708; Geurts et al. (2009) Science 325:433]을 참조한다. 다양한 기능적 도메인에 대한 아연 핑거를 생체내 사용을 위해 선택하였다. 추정 FAD 게놈 폴리뉴클레오티드 표적 부위에 결합하도록 설계, 생산 및 시험된 다수의 ZFN 중에서, 높은 수준의 생체내 활성을 갖는 15개의 ZFN을 확인하고, 추가의 실험을 위해 선택하였다. 이러한 ZFN은 식물체내에서 특유한 FAD3 게놈 폴리뉴클레오티드 표적에 효율적으로 결합하여 이를 절단할 수 있는 것으로 특성화되었다.
표 3: FAD3 아연 핑거 설계
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표 4: FAD3 아연 핑거의 표적 부위
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실시예 3: FAD3 유전자의 아연 핑거 뉴클레아제 절단의 평가
구축물 어셈블리
실시예 2에 기재된 바와 같이, 효모 검정을 이용하여 확인된, 예시적인 아연 핑거 뉴클레아제의 ZFN 발현 구축물을 함유하는 플라스미드 벡터를 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 기술을 이용하여 설계하고 완성하였다. 각각의 아연 핑거-코딩 서열을 아연 핑거 뉴클레아제의 상류에 위치한, opaque-2 핵 국재화 신호를 코딩하는 서열에 융합시켰다 (Maddaloni et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17(18):7532).
이어서, opaque-2 핵 국재화 신호::아연 핑거 뉴클레아제 융합 서열과 상보적 opaque-2 핵 국재화 신호::아연 핑거 뉴클레아제 융합 서열의 쌍을 형성하였다. 이에 따라, 각 구축물은 토세아 아시그나 바이러스로부터의 2A 서열에 의해 분리된 2개의 opaque-2 핵 국재화 신호::아연 핑거 뉴클레아제 융합 서열을 포함하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다 (Mattion et al. (1996) J. Virol. 70:8124-8127). 융합 단백질의 발현은 상대적으로 강한 구성적 프로모터, 예컨대 카사바 베인 모자이크 바이러스 (CsVMV) 프로모터로부터 유래되고 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3'UTR)에 의해 플랭킹된 프로모터에 의해 구동된다.
벡터를 인-퓨전(In-FUSION)™ 어드밴티지 테크놀로지(Advantage Technology) (클론테크(Clontech), 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 이용하여 어셈블리하였다. 제한 엔도뉴클레아제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs) (NEB; 매사추세츠주 입스위치)로부터 입수하고, T4 DNA 리가제 (인비트로젠)를 DNA 라이게이션에 사용하였다. 플라스미드 제조는 뉴클레오스핀(NUCLEOSPIN)® 플라스미드 키트 (마슈레-나겔 인크.(Macherey-Nagel Inc.), 펜실베니아주 베들레헴) 또는 플라스미드 미디 키트 (퀴아젠)를 공급업체의 지침에 따라 사용하여 수행하였다. DNA 단편을 아가로스 트리스-아세테이트 겔 전기영동 후에 퀴아퀵(QIAquick) 겔 추출 키트™ (퀴아젠)를 사용하여 단리하였다. 모두 어셈블리된 플라스미드의 콜로니를 처음에 미니프렙 DNA의 제한 소화에 의해 스크리닝하였다. 선택된 클론의 플라스미드 DNA를 상업적인 서열분석 공급원 (유로핀스 MWG 오페론(Eurofins MWG Operon), 알라배마주 헌츠빌)에서 서열분석하였다. 서열 데이터를 어셈블리하고, 시퀀셔™ 소프트웨어 (진 코드스 코포레이션(Gene Codes Corp.), 미시간주 앤 아버)를 이용하여 분석하였다. 비. 나푸스 원형질체로 전달하기 전에, 플라스미드 DNA를 이. 콜라이의 배양물로부터 퓨어 일드(Pure Yield) 플라스미드 맥시프렙 시스템® (프로메가 코포레이션(Promega Corporation), 위스콘신주 매디슨) 또는 플라스미드 맥시 키트® (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 공급업체의 지침에 따라 사용하여 제조하였다.
생성된 11개의 플라스미드 구축물; pDAB107824 (ZFNs 28025-2A-28026), pDAB107815 (ZFNs 27961-2A-27962), pDAB107816 (ZFNs 27969-2A-27970), pDAB107817 (ZFNs 27973-2A-27974), pDAB107825 (ZFNs 28035-2A-28036), pDAB107826 (ZFNs 28039-2A-28040), pDAB107818 (ZFNs 27987-2A-27988), pDAB107827 (ZFNs 28051-2A-28052), pDAB107821 (ZFNs 28004-2A-28005), pDAB107819 (ZFNs 27989-2A-27990), pDAB107828 (ZFNs 28053-2A-28054) (도 3), pDAB107829 (ZFNs 28055-2A-28056) (도 4), pDAB107820 (ZFNs 27991-2A-27992), pDAB107822 (ZFNs 28021-2A-28022) 및 pDAB107823 (ZFNs 28023-2A-28024)을 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.
형질감염을 위한 DNA의 제조
상기 기재된 벡터의 플라스미드 DNA를 침전, 100% (v/v) 에탄올 중의 세척에 의해 멸균시키고, 층류 후드에서 건조시켰다. DNA 펠릿을 하기 기재되는 바와 같은 원형질체 세포로의 형질감염을 위해 0.7 μg/μl의 최종 농도로 30 μL의 멸균 이중-증류수에 현탁시켰다. 플라스미드 DNA의 제조는 일시적 형질감염에서는 슈퍼코일드(supercoiled) 플라스미드 DNA 및 안정한 형질감염의 경우에는 선형화된 플라스미드 DNA가 생성되도록 수행하였다. 운반 DNA (예를 들어, 어류-정자 DNA)를 형질전환 플라스미드에 부가하는 것은 원형질체 세포의 일시적 형질감염에서는 요구되지 않는다. 일시적 연구에서, 106개 원형질체당 약 30 μg의 플라스미드 DNA가 1회 형질전환에 사용되었다.
형질감염
브라시카 나푸스 L. var. DH10275의 형질감염은 문헌 [Spangenberg et al., (1986) Plant Physiology 66: 1-8]에 기재된 바와 같이 완료되었으며, 배지 제제는 문헌 [Spangenberg G. and Protrykus I. (1995) Polyethylene Glycol-Mediated Direct Gene Transfer in Tobacco Protoplasts. In: Gene Transfer to Plants. (Protrykus I. and Spangenberg G. Eds.) Springer-Verlag, Berlin]에 기재되어 있다. 브라시카 나푸스 종자를 70% 에탄올 중에서 표면 멸균시켰다. 종자를 12 mL의 70% 에탄올 용액에 침지시키고, 10분 동안 칵테일을 부드럽게 흔들어 혼합하였다. 용액을 경사분리하여 70% 에탄올 용액을 제거하고, 1% w/v 칼슘 하이포클로라이트 및 0.1% v/v 트윈-20의 종자 멸균 용액으로 교환하였다. 종자를 종자 멸균 용액에 침지시키고, 25분 동안 칵테일을 부드럽게 흔들어 혼합하였다. 종자 멸균 용액을 경사분리하고, 멸균된 종자를 50 mL의 멸균수로 3회 세정하였다. 최종적으로, 페트리 디쉬 안에 넣은 멸균 80 mm 와트만(Whatman) 여과지 디스크® (피셔-사이언티픽(Fisher-Scientific), 미주리주 세인트 루이스)에 종자를 옮기고, 종자를 멸균수로 약간 포화시켰다. 페트리 디쉬를 파라필름(Parafilm)® (피셔-사이언티픽, 미주리주 세인트 루이스)으로 밀봉하고, 플레이트를 25℃에서 완전히 어두운 상태로 1 내지 2일 동안 인큐베이션하였다. 묘목 발생 신호가 종자로부터 관찰된 후에, 묘목을 고형화된 GEM 배지를 함유하는 페트리 디쉬로 옮겨 추가의 종자 발아를 장려하였다. 묘목을 GEM 배지 상에서 4 내지 5일 동안 25℃에서 인큐베이션하였다.
소정 부피의 액체 PS 배지 (약 10 mL)를 멸균 페트리 디쉬로 경사분리하였다. 멸균 겸자 및 해부용 칼을 사용하여, 성장 및 발육의 4-잎 단계에서 4 내지 5일령의 묘목의 공기 부분을 제거하여 처리하였다. 소형 세포질-풍부 원형질체의 최고 집단을 생산하기 위해 20-40 mm 길이의 배축 절편을 결정하였다. 배축 절편을 무균 절제하고, 액체 PS 배지로 옮겼다. 절제된 배축 절편을 함께 분류하고, 가로로 5-10 mm의 절편으로 절단하였다. 이어서, 배축 절편을 새로운 PS 배지로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 원형질분리된 배축을 효소 용액을 함유하는 페트리 디쉬로 옮겼다. 모든 배축 절편을 주의깊게 용액에 침지시켰다. 페트리 디쉬를 파라필름®으로 밀봉하고, 부드럽게 흔들면서 20 - 22℃에서 16 내지 18시간 동안 밤새 인큐베이션하였다.
원형질체 세포를 배축 절편으로부터 방출시켰다. 밤샘 배축 소화물을 부드럽게 교반하여 원형질체를 효소 용액으로 방출시켰다. 페트리 디쉬를 약간 기울여서 효소 용액 및 식물 잔해물의 소화 용액의 전달을 보조하였다. 10 mL 피펫을 사용하여 소화 현탁액을 멸균된 원형질체 여과 (100 마이크로미터 메쉬의 필터) 장치로 옮겨 식물 잔해물로부터 원형질체를 추가로 분리하였다. 여과 장치를 가볍게 두드려 체에 남아있는 잉여 액체를 방출시켰다. 원형질체 현탁액, 약 8 내지 9 mL를 부드럽게 혼합하고, 14 mL 멸균 플라스틱 원형-바닥 원심분리 튜브에 분배하였다. 각각의 현탁액을 1.5 mL의 W5 용액 위에 올렸다. W5 용액을 기울여서 원형질체 현탁액 상에 주의깊게 분배하고, 최소의 교반으로 한 방울씩 분배하였다. W5 용액을 원형질체 현탁액에 첨가하여 원형질체 풍부 인터페이스를 생성하였다. 이러한 인터페이스를 피펫을 사용하여 수집하였다. 이어서, 수집된 원형질체를 새로운 14 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 부드럽게 혼합하였다. 밀리리터당 원형질체의 수를 결정하기 위해 혈구계를 이용하여 수율 또는 수득된 원형질체를 측정하였다. 이 방법을 반복하였으며, 여기서 잎 조직을 소화시켜 엽육 원형질체를 생산하였다.
이어서, W5 용액을 10 mL의 부피로 첨가하고, 원형질체를 70 g에서 펠릿화한 후에, W5 용액을 제거하였다. 나머지 원형질체 현탁액을 부드럽게 진탕시켜 재현탁시켰다. 원형질체 현탁액을 함유하는 각각의 튜브를 5 mL의 W5 용액으로 채우고, 실온에서 1 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다. 원형질체 현탁액을 70 g에서 펠릿화하고, 모든 W5 용액을 제거하였다. 이어서, 300 μL의 형질전환 완충제를 단리된 원형질체를 함유하는 각각의 펠릿화된 원형질체 현탁액에 첨가하였다. 각각의 튜브에, 10 μg의 플라스미드 DNA를 원형질체 현탁액에 첨가하였다. 플라스미드 DNA는 상기 기재된 아연 핑거 뉴클레아제 구축물을 포함하였다. 이어서, 300 μL의 예열된 PEG 4000 용액을 원형질체 현탁액에 첨가하고, 튜브를 가볍게 두드렸다. 원형질체 현탁액 및 형질전환 혼합물을 어떠한 교반도 없이 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 추가의 10 mL의 W5 용액을 각각의 튜브에 1 mL, 1 mL, 1 mL, 2 mL, 2 mL, 및 3 mL의 순차적 분취액으로 첨가하였으며, W5 용액의 각 첨가 사이에 튜브를 부드럽게 전도시켰다. 원형질체를 원심분리기에서 70 g로 회전시켜 펠릿화하였다. 모든 W5 용액을 제거하여 순수한 원형질체 현탁액을 남겼다.
이어서, 0.5 mL의 K3 배지를 펠릿화된 원형질체 세포에 첨가하고, 세포를 재현탁시켰다. 재현탁된 원형질체 세포를 페트리 디쉬의 중앙에 놓고, 5 mL의 K3 및 0.6 mL 씨 플라크(Sea Plaque)™ 아가로스 (캠브렉스(Cambrex), 뉴저지주 이스트 러더포드)를 1:1 농도로 첨가하였다. 페트리 디쉬를 단일의 부드러운 소용돌이 운동으로 진탕시키고, 20-30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 페트리 디쉬를 파라필름®으로 밀봉하고, 원형질체를 완전히 어두운 상태에서 24시간 동안 배양하였다. 어두운 상태에서 인큐베이션한 후에, 페트리 디쉬를 희미한 광 (5 μMol m-2 s-1의 오스람(Osram) L36 W/21 루미룩스(Lumilux) 백색 튜브) 상태에서 6일 동안 배양하였다. 배양 단계 후에, 멸균 스패튤라를 사용하여 원형질체를 함유하는 아가로스를 사등분하였다. 분리된 사분원을 20 mL의 A 배지를 함유하는 250 mL 플라스틱 배양 용기에 넣고, 80 rpm 및 1.25 cm 스로에서의 회전 진탕기 상에서 14일 동안 24℃에서 연속적인 희미한 광 상태로 인큐베이션한 후에, 각각의 ZFN 구축물의 활성의 수준을 결정하기 위한 분석을 수행하였다.
카놀라 원형질체로부터의 게놈 DNA 단리
형질감염된 원형질체를 개별 1.5 또는 2.0 mL 미세원심분리기 튜브에 공급하였다. 세포를 완충제 용액 중에 튜브 바닥에서 펠릿화하였다. 액체 질소 중에서 세포를 급속 냉동시킨 후에 에이 랩콘코 프리존 4.5(a Labconco Freezone 4.5)® (랩콘코(Labconco), 미주리주 캔자스 시티)에서 약 48시간 동안 -40℃ 및 약 133 x 10-3 mBar 압력에서 세포를 동결 건조시킴으로써 DNA 추출을 수행하였다. 조직 파괴가 요구되지 않으며 원형질체 세포를 용해 완충제에 직접 첨가하는 것을 예외로 하고, 제조업체의 지침에 따라 DNeasy® (퀴아젠, 캘리포니아주 칼스배드) 식물 키트를 사용하여 동결건조된 세포에서 DNA를 추출하였다.
카놀라 원형질체에서의 게놈 DNA 서열 절단에 대한 FAD3A 및 FAD3C ZFN의 시험
FAD3A 및 FAD3C 유전자 유전자좌 내의 ZFN 표적 부위의 설계를 클러스터링하여, ZFN의 다중 쌍이 표적 부위에서 중첩되도록 설계하였다. ZFN 표적 부위의 클러스터링은 모든 중첩 ZFN 표적 부위를 포함하도록 100 bp 윈도우 내의 모든 FAD3A 및 FAD3C 유전자 패밀리 구성원으로부터의 플랭킹 게놈 서열을 증폭시키는 PCR 프라이머를 설계할 수 있다. 이에 따라, 일루미나 짧은 판독 서열 기술을 이용하여 형질감염된 원형질체의 표적 ZFN 부위의 완전성을 평가할 수 있다. 또한, 설계된 PCR 프라이머는 서열 판독물이 FAD3A 및 FAD3C 유전자 패밀리의 특정 유전자 구성원에 기인하는 특정 뉴클레오티드 염기를 포함할 필요가 있다. 따라서, 모든 PCR 프라이머는 비-상동 말단 접합부 (NHEJ) 활성이 프라이밍 부위를 제거하고, 증폭을 억제하여 NHEJ 활성의 평가를 왜곡시킬 수 있는 작은 결실을 유발하는 것으로 알려져 있으므로 임의의 ZFN 표적 절단 부위로부터 5-10개 뉴클레오티드만큼 떨어져 결합하는 것이 요구될 것이다.
프라이머는 FAD3A 및 FAD3C 유전자 패밀리 (표 5)에 대한 모든 ZFN 표적 유전자좌에 결합하도록 설계하였고, 경험적으로 PCR 증폭 생성물의 생어 기반 서열분석을 통해 모든 유전자 패밀리 구성원의 증폭물을 시험하였다. 몇몇 경우에는, 모든 유전자 패밀리 구성원 (표 6)을 구별하는 프라이머가 개발될 수 없었으나, 모든 경우에서 FAD3A 및 FAD3C의 표적 유전자 서열은 구별될 수 있었다. PCR 프라이머 설계에 따라, 주문 DNA 바코드 서열을, 상이한 ZFN 표적 유전자좌를 구별하고 형질감염 및 ZFN에 특이적인 서열 판독물을 확인하는데 사용되는 PCR 프라이머에 혼입시켰다 (표 5 및 6).
표 5: FAD3 유전자 패밀리 상의 설계된 PCR 프라이머의 증폭 성능. "X"는 유전자 카피 검출 특이성을 나타내고, 회색 음영 및 "+"는 해당하는 특정 유전자좌에서 2개의 프라이머에 의해 설계된 서열 판독물이 구별될 수 없음을 나타내고, "N/A"는 유전자좌가 이들 특정 유전자 카피로부터 증폭될 수 없음을 나타낸다.
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표 6: 활성의 FAD3 ZFN 평가를 위해 설계된 프라이머 서열. 프라이머는 서열분석-합성 분석에 대한 일루미나 라이브러리의 구축을 위해 필요한 일루미나 어댑터 서열 둘 다와 함께, 통상의 바코드를 포함한다. 구입한 프라이머는 나타낸 3개의 칼럼 모두의 합계였다.
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ZFN으로 형질감염된 카놀라 원형질체의 DNA 추출 후에, 표적 ZFN 유전자좌의 PCR 증폭을 수행하여 합성 기술에 의한 일루미나 기반 서열분석에 올바른 포맷으로 필수 유전자좌 특이적 DNA 분자를 생성하였다. 각 검정을 25 ng 개시 DNA (브라시카 나푸스 게놈의 약 12,500개 세포 등가물) 상에서 작업하는데 최적화시켰다. 적절한 수준에서 NHEJ 효율 및 특이성을 평가하는데 요구되는 커버리지를 제공하기 위해 샘플당 다중 반응을 수행하였다 (개별 원형질체로부터 수득한 브라시카 나푸스 게놈의 200,000개 카피에 대해 약 16회 PCR 반응이 상응함). 동일한 검정으로 시험할 모든 샘플에 대해 PCR 증폭 마스터-믹스를 만들고, 하나의 반응 (삼중으로 수행함)을 표적 조직 상에서 수행되는 사이클의 최적의 수 (PCR 증폭이 시약에 제한받지 않고 여전히 지수적 증폭 단계에 있도록 보장함)를 결정하는데 사용되는 정량적 PCR 방법을 이용하여 검정하였다. 필수 음성 대조 반응을 이용한 실험을 96 웰 포맷으로 MX3000P 써모사이클러® (스트라타진(Stratagene), 캘리포니아주 라졸라)를 이용하여 수행하였다.
정량적 PCR 플랫폼으로부터 모은 결과로부터, 형광의 상대적 증가를 사이클-대-사이클로부터 플롯팅하고, 통상의 전사체 또는 분자의 오버 사이클링 및 증폭을 감소시키기 위한 시도로, 반응이 시약에 제한받게 되는 것을 허용하지 않으면서, 충분한 증폭을 전달할 사이클 수를 검정마다 결정하였다. 미사용 마스터 믹스는 정량적 PCR 분석을 마치고 사이클 수가 결정될 때까지 얼음 상에 두고, 이후에 원하는 개수의 반응 튜브 (ZFN 검정당 약 16개)에 분취하고, PCR 반응을 수행하였다.
증폭 후에, 단일 ZFN 유전자좌에 대한 샘플을 함께 모으고, ZFN당 모은 생성물 200 μL를 민일루트(MinElute) PCR 정제 키트® (퀴아젠)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 세정하였다. 일루미나 짧은 판독 기술을 이용한 샘플의 서열분석을 가능하게 하기 위해 추가의 쌍형성된 말단 프라이머는 생성된 단편 상에 증폭에 의해 부착시킬 필요가 있었다. 이는 증폭의 제1 라운드에서 첨가되는 서열에 부분적으로 상보적이며, 또한 요구되는 쌍형성된 말단 서열을 함유하는 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 달성되었다. 주형에 대한 통상의 단편을 과다 증폭시키지 않고 쌍형성된 말단 서열을 첨가하는, 수행하기에 최적인 PCR 사이클 수를 다시 이전에 기재된 바와 같이 정량적 PCR 사이클 분석을 통한 서열 통과를 이용하여 결정하였다.
PCR 증폭 후에, 생성된 생성물을 민일루트 칼럼® (퀴아젠)을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 세정하고, 2.5% 아가로스 겔 상에서 분할시켰다. 사이버® 세이프(Syber® Safe) (라이프 테크놀로지스, 캘리포니아주 칼스배드)를 이용하여 정확한 크기의 밴드로 시각화된 DNA 단편을 겔 추출하여 임의의 잔류 PCR 생성된 프라이머-이량체 또는 다른 허위 단편을 제거하고, DNA를 겔 슬라이스로부터 민일루트 겔 추출 키트® (퀴아젠)를 제조업체의 지침에 따라 이용하여 추출하였다. 겔 추출 완료 후에, 앰퓨어(AMPure) 자기 비드® (베크만-쿨터(Beckman-Coulter), 캘리포니아주 브리)를 1:1.7의 DNA 대 비드 비로 사용하여 추가의 DNA 세정을 수행하였다. 이어서, DNA를 일루미나 서열분석 (KAPA)을 위해 정량적 PCR 기반 라이브러리 정량화 키트를 사용하여 농도에 대해 평가하였으며, 이 때 1/40,000 및 1/80,000 희석을 이용하고 반응은 삼중으로 수행하였다. 정량적 PCR 결과에 기초하여 DNA를 2 nM의 표준 농도로 희석하고, DNA 서열분석을 위해 모든 라이브러리를 합하였다. 씨보트 클러스터(cBot cluster) 생성 키트® (일루미나, 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하는 서열분석을 위한 샘플을 제조하고, 100 bp 쌍형성된-말단 서열분석 판독물로 제조업체 지침에 따라 일루미나 GA2x® 상에서 서열분석하였다.
표적 아연 핑거 부위에서의 비-상동 말단 접합부의 검출을 위한 데이터 분석 방법
서열분석 반응의 완료 및 염기 호출을 위해 일루미나 생물정보 파이프라인을 이용하여 수행된 일차 데이터 호출 후에, 각각의 경우에 표적 ZFN 부위에서 결실된 염기를 확인하기 위해 완전한 분석을 수행하였다. 입력 서열의 목록에 따라 컴퓨터 계산에 의해 DNA 서열로부터 바코드를 추출 및 분류하기 위해 주문 PERL 스크립트를 설계하였다. 바코드는 오귀인 서열 판독물을 감소시키기 위해 허용되는 30 초과의 Phred 스코어로 참조 서열과 매치되어야 한다. 서열 판독물이 사용된 상이한 바코드 군에 비닝된 후에, 품질 필터를 모든 서열을 가로질러 통과시켰다. 품질 필터는 제2의 주문 개발된 PERL 스크립트였다. "N"으로 호출된 염기가 3개 초과하여 존재하거나 또는 중간 Phred 스코어가 20 미만이거나 또는 20 미만의 Phred 스코어를 갖는 3개 연속적 염기가 존재하거나 또는 서열 판독물의 길이가 40 bp 미만인 경우에 서열 판독물을 제외시켰다. 쌍형성된 서열 판독물이 둘 다 넥스트진(NextGENe)® (소프트제네틱스(SoftGenetics), 펜실베니아주 스테이트 컬리지) 패키지를 이용하여 사용가능한 경우에 나머지 서열을 합하였다. 이어서, 나머지 합쳐진 서열 판독물을 나머지 서열 식별자의 말단 상에 기록되는 확인된 여분의 서열의 수의 카운트와 제3의 주문 PERL 스크립트를 이용하여 특유한 서열 판독물의 집합으로 축소시켰다. 이어서, 특유한 서열 판독물을 갭이 있는 FASTA 정렬된 파일을 생성하는 넥스트진® 소프트웨어를 이용하여 FAD3 참조 서열에 정렬시켰다.
갭이 있는 FASTA 파일을 이용하여 갭이 있는 염기 위치 번호의 입력 참조물로의 전환를 제4의 주문 PERL 스크립트로 수행하였다. 이는 상이한 유전자 패밀리 구성원을 식별하는 염기 (상이한 유전자 패밀리 구성원 사이의 동조 또는 파라로그 서열 변이)가 어셈블리된 데이터에서 확인될 수 있도록 한다. 염기 넘버링의 전환이 수행되면, 각각의 특유한 서열 판독물에 대한 반수체형 보고의 생성 및 특정 유전자 패밀리 구성원에 대한 판독물의 할당이 가능하였다. 판독물이 유전자에 의해 분류되면, ZFN 표적 부위를 둘러싼 10 bp 윈도우가 확인 및 평가되었다. 유전자당 결실이 있는 서열의 수를 결실된 염기의 수와 함께 기록하였다.
이어서, 데이터를 10,000개 서열 판독물당 표적 ZFN 부위에서 결실된 1 내지 10개 염기를 갖는 서열의 수와 함께 다중선 그래프로서 그래프로 나타내었다. 이러한 분석을 모든 ZFN 형질감염과 대조 형질감염에 대해 수행하였다. 몇몇 경우에, 천연 DNA 서열에서의 반복부는 표적 ZFN 부위에서의 서열분석 오류를 증가시키며, 이러한 오류는 통상적으로 둘 다 ZFN 또는 대조군으로 형질감염된 모든 샘플에서 보고된 단일 염기 결실의 출현율의 증가로 나타날 수 있다.
이러한 결과로부터 FAD3A 및 FAD3C 표적 부위에서 최고 수준의 ZFN 활성을 NHEJ의 보다 큰 활성에 의해 결정된 바와 같이 관찰하였다. 유의한 게놈 DNA 절단 활성 및 최소 비-표적 활성의 특성이 주어지는 조작된 트랜스진 통합 플랫폼 (Engineered Transgene Integration Platform; ETIP)의 식물체내 표적화를 위해 플라스미드 pDAB107828 상에서 코딩된 ZFN (즉, ZFN28053 및 28054) 및 pDAB107829 상에서 코딩된 ZFN (즉, ZFN28055 및 28056)을 선택하였다.
실시예 4: 조작된 트랜스진 통합 플랫폼 ( ETIP ) 카놀라 식물 세포주를 위한 DNA 구축물
하기 기재된 플라스미드 벡터 구축물을 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 공지된 방법 및 기술을 이용하여 구축하였다. 본 단락 내에 기재된 특정 시약 및 기술의 적용은 용이하게 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 플라스미드 벡터 구축물을 구축하고자 하는 목적을 달성하기 위해 다른 시약 및 기술과 용이하게 교환될 수 있다. 제한 엔도뉴클레아제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (NEB; 매사추세츠주 입스위치)로부터 입수하였다. 라이게이션을 T4 DNA 리가제 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)로 완수하였다. 하나의 진입 벡터를 단일 목적지 벡터에 어셈블리하기 위해 게이트웨이(GATEWAY)® LR 클로나제(CLONASE)® 효소 믹스 (인비트로젠)를 사용하여 게이트웨이 반응을 수행하였다. 하나의 진입 벡터를 단일 목적지 벡터에 어셈블리하기 위해 인-퓨전™ 어드밴티지 테크놀로지 (클론테크, 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 이용하여 인-퓨전™ 반응을 수행하였다. 뉴클레오스핀® 플라스미드 키트 (마슈레-나겔 인크., 펜실베니아주 베들레헴) 또는 플라스미드 미디 키트® (퀴아젠)를 공급업체의 지침에 따라 사용하여 플라스미드 제조를 수행하였다. 아가로스 트리스-아세테이트 겔 전기영동 후에 퀴아퀵 겔 추출 키트™ (퀴아젠)를 사용하여 DNA 단편을 단리하였다. 모든 어셈블리된 플라스미드의 콜로니를 처음에 미니프렙 DNA의 제한 소화에 의해 스크리닝하였다. 선택된 클론의 플라스미드 DNA를 상업적 서열분석 공급원 (유로핀스 MWG 오페론, 알라배마주 헌츠빌)에서 서열분석하였다. 시퀀셔™ 소프트웨어 (진 코드스 코포레이션, 미시간주 앤 아버)를 이용하여 서열 데이터를 어셈블리하고 분석하였다.
대조 벡터
대조 벡터를 사용하여 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 세포 기반 분류 방법을 개발하였다. 2개의 유전자 발현 카세트를 포함하는 대조 벡터, pDAS000031 (도 10: 서열 85로서의 T-가닥 삽입물)을 구축하는데 표준 클로닝 방법을 이용하였다. 제1 유전자 발현 카세트는 콜리플라워 모자이크 바이러스 19s 프로모터 (CaMV 19S 프로모터; Shillito, et al., (1985) Bio/Technology 3; 1099-1103) :: 히그로마이신 내성 유전자 (hph(HygR);미국 특허 번호 4,727,028) :: 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임 1 3' 비번역 영역 (AtORF1 종결인자; Huang et al., (1990) J. Bacteriol. 1990 172:1814-1822)을 함유하였다. 제2 유전자 발현 카세트는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (AtUbi10 프로모터; Callis, et al., (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493) :: dsRED (dsRED(D); 미국 특허 번호 6,852,849) 및 아라비돕시스로부터의 인트론 (인트론 #1; 진뱅크: AB025639.1) :: 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임 23 3' 비번역 영역 (AtORF23 종결인자; 미국 특허 번호 5,428,147)을 트랜스 배향 (예를 들어, 헤드 대 헤드 배향)을 갖는 인-프레임 융합체로서 함유하였다. 플라스미드 벡터를 인-퓨전™ 어드밴티지 테크놀로지 (클론테크, 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 이용하여 어셈블리하였다.
실시예 5: ETIP 카놀라 식물 세포주의 생성
브라시카 나푸스의 형질전환
FAD3A 및 FAD3C 부위 특이적 구축물 (pDAS000271-pDAS000275)에 대한 ETIP 구축물 및 수반되는 ZFN (pDAB107828 및 107829) 및 대조군 DS-Red 대조 구축물 (pDAS000031)은 이전에 실시예 4에 기재되어 있다. 이들 이원 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101: PM90으로 형질전환시켰다. 브라시카 나푸스 원형질체 세포의 형질전환은 일부 변형된 실시예 3에 기재된 형질감염 프로토콜을 이용하여 완수하였다.
프로토콜에 대한 변형은 씨 플라크™ 아가로스를 대신한 알긴산나트륨의 사용을 포함하였다. ZFN 구축물 및 ETIP 구축물이 둘 다 브라시카 나푸스 원형질체 세포로 공동-전달되는 형질감염 실험은 5:1 몰비의 플라스미드 DNA를 포함하는 DNA 농도에서 완수하였다. 다른 ETIP 및 대조 플라스미드 구축물을 30 μg의 플라스미드 DNA 농도에서 형질감염시켰다.
프로토콜에 대한 부가의 변형은 1.5 mg/mL의 히그로마이신을 함유하는 배지 중에서 형질전환된 원형질체 세포로부터 온전한 식물을 증폭시키는 것을 포함하였다. 온전한 식물의 증폭은 A 배지를 2주마다 교체하고 원형질체-유래된 콜로니의 성장을 모니터링하는 것을 필요로 한다. 원형질체-유래된 콜로니가 대략 2-3 mm의 직경으로 성장한 후에, 이러한 콜로니를 고형화된 MS 모르포 배지를 함유하는 12-웰 코스타(Costar)® 플레이트 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 미주리주 세인트 루이스)의 개별 웰로 옮겼다. 캘러스가 8-10 mm 직경의 크기로 증식할 때까지 플레이트를 1 내지 2주 동안 24℃에서 지속적인 희미한 광 상태에서 인큐베이션하였다. 원형질체 세포가 1-2 cm 직경의 크기에 도달한 후에, 이러한 원형질체 세포를 MS 모르포 배지를 함유하는 개별 250 mL 배양 용기로 옮겼다. 용기를 16시간 광 (20 μMol m-2 s-1의 오스람 L36 W/21 루미룩스 백색 튜브) 및 8시간 어둠 조건 하에 24℃에서 인큐베이션하였다. 1 내지 2주 내에, 여러 개의 신초를 볼 수 있었다. 신초가 3-4 cm 의 길이에 도달한 후에, 이를 MS 배지를 함유하는 250 mL 배양 용기로 옮겼다. 250 mL 배양 용기를 16시간 광 (20 μMol m-2 s-1의 오스람 L36 W/21 루미룩스 백색 튜브) 및 8시간 어둠 조건 하에 24℃에서 인큐베이션하였다. 신초는 묘목으로 클 때까지 배양 용기에서 유지하고, 묘목이 되었을 때 온실로 옮겨 성장시킴으로써 성숙시켰다.
실시예 6: 카놀라에서 ETIP를 함유하는 T-DNA의 통합의 분자 확인
게놈 DNA를 모든 추정 트랜스제닉 식물의 잎 조직으로부터 DNeasy 96 식물 DNA 추출 키트™ 또는 DNeasy 식물 미니 키트™ (퀴아젠)를 사용하여 추출하였다. 각 식물로부터의 게놈 DNA는 에이. 투메파시엔스의 영속성에 대해 시험하기 위해 virC를 증폭시키도록 설계된 프라이머; pTiC58 정방향 (서열 88 CGAGAACTTGGCAATTCC) 및 pTiC58 역방향 (서열 89 TGGCGATTCTGAGATTCC), 게놈 DNA의 품질을 확인하기 위해 비. 나푸스로부터 액틴을 증폭시키도록 설계된 프라이머; 액틴 정방향 (서열 90 GACTCATCGTACTCTCCCTTCG) 및 액틴 역방향 (서열 91 GACTCATCGTACTCTCCCTTCG)을 사용하여 PCR에 의해 분석하였다. 프라이머는 ETIP에 의해 코딩되는 hph 유전자를 증폭시키도록 설계하였다; HPH 정방향 (서열 92 TGTTGGTGGAAGAGGATACG) 및 HPH 역방향 (서열 93 ATCAGCAGCAGCGATAGC). 액틴 및 hph에 대한 프라이머로 증폭될 때 virC 프라이머로부터의 생성물은 제공하지 않았으나 그로부터 정확한 크기의 앰플리콘을 생성하는 식물을 트랜스제닉으로 확인하였다.
제2 스크린을 완수하였으며, 여기서 각각의 트랜스제닉 식물로부터의 gDNA를 T-DNA 영역 외의 이원 벡터를 증폭시키도록 설계된 5개 세트의 프라이머 [(1F 서열 94 ATGTCCACTGGGTTCGTGCC; 1R 서열 95 GAAGGGAACTTATCCGGTCC) (2F 서열 96 TGCGCTGCCATTCTCCAAAT; 2R 서열 97 ACCGAGCTCGAATTCAATTC) (3F 서열 98 CCTGCATTCGGTTAAACACC; 3R 서열 99 CCATCTGGCTTCTGCCTTGC) (4F 서열 100 ATTCCGATCCCCAGGGCAGT; 4R 서열 101 GCCAACGTTGCAGCCTTGCT) (5F 서열 102 GCCCTGGGATGTTGTTAAGT; 5R 서열 103 GTAACTTAGGACTTGTGCGA)]를 사용하여 PCR에 의해 분석하였다. 정확하고 예상되는 크기의 PCR 생성물이 프라이머 세트 3 및 4로 증폭된 식물을 백본 통합을 갖는 것으로 간주하였다.
백본 통합을 갖지 않는 식물로부터의 DNA를 20 g의 잎 조직으로부터 변형된 CTAB 방법 (Maguire et al., (1994) Plant Molecular Biology Reporter, 12( 2): 106-109)을 이용하여 정제하였다. 단리된 gDNA를 여러 제한 효소로 소화시키고, 10 μg의 gDNA를 아가로스 겔 상에서 전기영동에 의해 분리하고, 표준 서던 블롯팅 프로토콜을 이용하여 막으로 옮겼다. DIG 이지 Hyb 시스템(DIG Easy Hyb System)™ (로슈, 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)을 제조업체의 지침에 따라 이용하여 막을 프로빙하였다. ELP에 대한 각각의 발현 카세트 및 내인성 대조 유전자, 액틴에 대한 프로브를 ETIP 구축물로부터 하기 프라이머: (IPT-F 서열 104 TCTCTACCTTGATGATCGG; IPT-R 서열 105 AACATCTGCTTAACTCTGGC; dsRED-F 서열 106 ATGGCTTCATCTGAGAACG; dsRED-R 서열 107 TTCCGTATTGGAATTGAGG; PAT-F 서열 108 TTGCTTAAGTCTATGGAGGCG; PAT-R 서열 109 TGGGTAACTGGCCTAACTGG; ELP-F 서열 110 ATGATATGTAGACATAGTGGG; ELP-R 서열 111 AGGGTGTAAGGTACTAGCC; Hph-F 서열 112 TGTTGGTGGAAGAGGATACG; Hph-R 서열 113 ATCAGCAGCAGCGATAGC; 액틴-F 서열 114 GTGGAGAAGAACTACGAGCTACCC; 액틴-R 서열 115 GACTCATCGTACTCTCCCTTCG)를 사용하여 증폭시켰다.
ETIP 서열을 오직 ETIP의 단일 카피를 함유하는 모든 식물로부터 증폭시키고 서열분석하였다. 각각의 T-DNA 삽입물의 서열을 ABI3730xI™ (어플라이드 바이오시스템즈, 라이프 테크놀로지스)를 이용하는 PCR 생성물의 직접적 서열분석에 의해 분석하였다. T-DNA 삽입물을 게놈 DNA로부터, 퓨전 핫 스타트 II 폴리머라제(Phusion Hot Start II Polymerase)™ (핀자임스(Finnzymes), 써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 증폭시켰다. T-DNA의 증폭 반응은 대략 2 Kbp 길이의 중첩 서열을 증폭시키기 위한 다중 프라이머 쌍으로 완수하였다. 각각의 PCR 생성물을 완전한 커버리지를 보장하기 위해 다중 프라이머로 서열분석하였다. PCR 반응물을 새우 알칼리성 포스파타제 및 엑소뉴클레아제 I (어플라이드 바이오시스템즈, 라이프 테크놀로지스)로 처리하여 PCR 반응물의 서열분석 이전에 잉여 프라이머를 불활성화시켰다. 각각의 단일 카피 ETIP 세포주의 T-DNA 삽입물에 플랭킹된 서열은, 정제된 게놈 DNA를 8개의 제한 엔도뉴클레아제로 별도로 소화시킨 후에 이러한 제한 엔도뉴클레아제에 의해 생성된 오버행에 특이적인 이중-가닥 어댑터를 라이게이션하여 확인하였다. 이러한 라이게이션 단계 후에, PCR을 ETIP의 3' 또는 5' 말단에 대한 비오티닐화 프라이머 및 각각의 어댑터에 대한 프라이머로 수행하였다. PCR 생성물을 포획하고, 앰퓨어 고상 가역적 고정화 (SPRI) 비즈(Ampure Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) beads)™ (아젠커트 바이오사이언스 코포레이션(Agencourt Bioscience Corporation), 베크만 쿨터 컴퍼니) 상에서 세정하였다. 네스티드(nested) PCR을 수행하고, 모든 생성물은 ABI 생어 서열분석 및 빅 다이 터미네이터 v3.1 사이클™ 서열분석 프로토콜 (어플라이드 바이오시스템즈, 라이프 테크놀로지스)을 이용하여 서열분석하였다. 서열 데이터는 시퀀셔™ 소프트웨어 (진 코드스 코포레이션, 미시간주 앤 아버)를 이용하여 어셈블리하고 분석하였다.
아연 핑거 뉴클레아제 및 pDAS000271-PDAS000275 ETIP 구축물로 형질전환된 ETIP 트랜스제닉 카놀라의 결과
ETIP 및 ZFN 구축물의 형질전환을 통해 생성된 트랜스제닉 브라시카 나푸스 사례는 FAD3A 유전자좌 내의 pDAS000273 또는 pDAS275로부터, 및 pDAS000271, pDAS000272 또는 pDAS000274로부터 FAD3C 유전자좌로의 ETIP 폴리뉴클레오티드 서열의 단일 카피, 전장 T-가닥 삽입물의 통합을 발생시킨다. 3 내지 4개의 사례가 완전하게 특성화되었으며, 통합된 ETIP를 함유하는 것으로 확인되었다. 인-아웃 PCR 증폭 방법을 이용하여 확인을 완료하고, 서던 블롯을 통해 추가로 검증하였다. 선택된 T0 사례를 발육의 T1 단계로 성장시켰다. 통합된 T-가닥의 접합성을 결정하기 위해 T1 식물을 다시 스크리닝하였다. 스크리닝된 사례를 동형접합, 반접합, 또는 널로 분류하였다.
이전에 기재된 방법을 통해 원형질체를 생성하는데 동형접합 사례를 이용하였다. 이후에, 원형질체를 ETIP 서열 내에 혼입된 아연 핑거 결합 부위를 표적화하도록 설계된 ZFN 및 ETIP의 특정 영역과 상동성을 공유하는 공여자 플라스미드로 공동-형질전환시켰다. ZFN은 ETIP 유전자좌를 절단하고, 공여자 플라스미드는 상동성 지시된 복구를 통해 브라시카 나푸스 세포의 게놈 내에 통합된다. 공여자 플라스미드의 통합의 결과로서, 부분 DS-red 트랜스진을 전장 DS-red 트랜스진으로 복구하였다. 새로운 완전 작동 DS-red 트랜스진의 발현을 이용하여 원형질체 세포를 FACS 방법으로 분류하였다. 추정 트랜스제닉 식물을 실시예 7에 기재된 FACS 방법을 이용하여 분류하고, 단리된 원형질체를 성숙한 식물로 재생시켰다. 공여자 플라스미드의 통합은 분자 확인 방법을 이용하여 ETIP-표적화된 식물 내에서 확인되었다. 이에 따라, ETIP 유전자좌는 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 유전자 표적화된 통합을 위한 부위-특이적 유전자좌로서 역할을 한다.
실시예 7: 원형질체 세포의 FACS 기반 분류
DS-Red 대조 구축물, pDAS000031로 형질감염된 브라시카 나푸스 원형질체를, BD 바이오사이언시스(BD Biosciences) 인플럭스-셀 분류기(Influx-Cell sorter)™ (캘리포니아주 산호세)를 이용하는 FACS-매개된 세포 분류를 통해 분류하였다. 원형질체 세포를 실시예 3에 기재된 바와 같이 단리하고 형질감염시켰다. 세포를 pDAS000031로 형질감염시킨 후에, 세포를 표 7에 기재된 조건에서 FACS 분류기를 이용하여 분류하였다.
표 7: pDAS000031로 형질감염된 원형질체 세포의 분류에 사용된 조건
Figure 112015032530092-pct00013
DS-red 트랜스진을 발현하는 원형질체를 분류하고 단리하였다. FACS 단리된 원형질체를 분류기를 이용하여 카운팅하였다. 약 1x105 내지 1.8x105개의 세포를 FACS 단리 후 제1일에 24-웰 마이크로 타이터 플레이트의 웰에 넣었다. 세포를 5 내지 20일 동안 비드 배양물로 옮겼다. 약 1x104개의 세포를 FACS 단리 후 제2일에 2 또는 4-웰 마이크로 타이터 플레이트의 웰에 넣는 유사한 조건에서 시험하였다. 시험된 다양한 조건은 총 단리된 원형질체 세포 중 95 - 98%의 생존률로 세포를 회수하였다. FACS 분류된 원형질체 세포를 3 - 20일 동안 비드 배양물로 옮겼다. FACS 분류된 원형질체 세포를 상기 기재된 프로토콜을 이용하여 1.5 mg/mL의 히그로마이신을 함유하는 배지 상에서 식물로 재생시켰다. 추정 트랜스제닉 식물은 분자 입체형태 프로토콜을 통해 pDAS000031로부터의 무손상 T-가닥 삽입물을 함유하는 것으로 확인되었다.
FACS 분류 방법은 임의의 형광 트랜스진 서열의 스크리닝에 직접 적용가능하며, 소정 비율의 게놈 유전자좌 내의 ETIP 영역의 특정 부위 내에서의 상동성 매개된 복구를 통해 형광 트랜스진으로 표적화되는 브라시카 나푸스 원형질체 세포를 단리하는데 이용된다.
실시예 8: NHEJ를 통한 브라시카 나푸스 오메가-3 지방산 데새투라제 ( FAD3 ) 내로의 표적화 통합 및 그의 분열
FAD3C 및 FAD3A에 특이적인 아연 핑거 결합 도메인의 선택
동조 Fad3 유전자의 전사되는 영역을 확인하고, 특성화하고, 본원에 기재된 공여자 서열의 NHEJ-매개 표적화를 위해 이들 부위에 결합하고 절단하도록 설계된 아연 핑거 뉴클레아제를 확인하고 특성화하였다. Fad3 서열의 동조체로부터의 DNA 서열에 대해 지정된 아연 핑거 단백질 (ZFP)을 상기에 기재된 바와 같이 설계하고 시험하였다. 정확한 활성을 나타내는 ZFN으로부터, Fad3 표적을 높은 효율로 절단하는 2개의 아연 핑거 단백질을 선택하였고: ZFP 28051-2A-28052는 서열 255 5'-gcccaaggaacCCTTTTCTGGGCCATcttcgTACTCGGCCACGactggtaatttaat -3'을 인식하고, Fad3C 게놈 유전자좌에 특이적으로 결합하고 이를 절단하는 것으로 나타났다. 마찬가지로, 아연 핑거 단백질 28053-2A-28054는 서열 256 5'-agcgagagaaAGCTTAtTGCAACTTCaactacTTGCTGGTCGATCGTGTTggccactc -3'를 인식하고, Fad3A 및 Fad3C 게놈 유전자좌에 특이적으로 결합하고 이를 절단하는 것으로 나타났다. 예시적인 표적 부위는 표 8에 나타내었고; ZFP 인식 나선에 의해 접촉시킨 표적 부위에서의 뉴클레오티드는 대문자로 나타내고; 비-접촉 뉴클레오티드는 소문자로 나타내었다. Fad3C와 상이한 Fad3의 카피에서의 뉴클레오티드는 밑줄로 나타내었다. ZFP 인식 나선에 의해 접촉시킨 표적 부위에서의 뉴클레오티드는 표 8에 나타내었다.
표 8: Fad3C (28051-2A-28052) 또는 Fad3A 및 Fad3C (28053-2A-28054)에 특이적인 아연 핑거 단백질 결합 부위
Figure 112015032530092-pct00014
FAD3C 및 FAD3A에 특이적인 아연 핑거 뉴클레아제를 코딩하는 발현 벡터의 설계 및 구축
Fad3 아연 핑거 설계를 CCHC 구조의 적어도 하나의 핑거를 갖는 단백질을 코딩하는 아연 핑거 발현 벡터 내로 도입하였다 (미국 특허 공개공보 번호 2008/0182332). 특히, 각각의 단백질 내의 마지막 핑거는 인식 나선에 대한 CCHC 백본을 가졌다. 비-정규 아연 핑거-코딩 서열을 4개의 아미노산 ZC 링커를 통해 유형 IIS 제한 효소 FokI의 뉴클레아제 도메인 (문헌 [Wah et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569]의 서열의 아미노산 384-579) 및 sop2 핵 국재화 신호에 융합하였다. 토세아 아시그나 바이러스 (Szymczak et al., 2004)로부터의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 자가가수분해성 2A를 2개의 ZFN 융합 단백질 사이에 부가하였다. ZFN의 발현은 카사바 베인 모자이크 바이러스로부터 강력한 구성적 프로모터 및 5' 비번역 영역 (UTR) (Verdaguer et al., Plant Molecular Biology 1996, 31(6); 1129-1139)에 의해 유도되고, 아그로박테리움 투메파시엔스 pTi15955의 오픈 리딩 프레임 23 (ORF23)으로부터의 3' UTR (전사 종결인자 및 폴리아데닐화 부위 포함) (Barker et al., Plant Molecular Biology 1983, 2(6); 335-50)에 의해 플랭킹되었다.
벡터를 인-퓨전™ 어드밴티지 테크놀로지 (클론테크, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)을 이용하여 어셈블리하였다. 제한 엔도뉴클레아제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (NEB; 미국 매사추세츠주 입스위치)로부터 얻었고, T4 DNA 리가제 (인비트로젠)를 DNA 라이게이션을 위해 사용하였다. 플라스미드 제조는 공급업체의 지시에 따라 뉴클레오스핀(NUCLEOSPIN)® 플라스미드 키트 (마슈레-나겔 인크.(Macherey-Nagel Inc., 펜실베니아주 베들레헴)) 또는 플라스미드 미디 (Midi) 키트 (퀴아젠)를 사용하여 수행하였다. 아가로스 트리스-아세테이트 겔 전기영동 후, 퀴아퀵™ 겔 익스트렉션 키트(QIAquick™ Gel Extraction Kit) (퀴아젠)을 사용하여 DNA 단편을 단리시켰다. 어셈블리된 플라스미드의 콜로니를 초기에 미니프렙 DNA의 제한 소화에 의해 스크리닝하였다. 선택된 클론의 플라스미드 DNA는 상업적인 서열분석 회사 (유로핀스 엠더블유지 오페론, 앨라배마주 헌츠빌)에 의해 서열분석되었다. 서열 데이터를 모으고, 시퀀셔™ 소프트웨어 (진 코즈, 미시건주 앤 아버)를 사용하여 분석하였다. 생성되는 플라스미드 구축물인 pDAB107827 (ZFN 28051-2A-28052, 도 13, 서열 273) 및 pDAB107828 (ZFN 28053-2A-28054, 도 14, 서열 274)을 제한 효소 소화를 통해 및 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.
NHEJ-지정 DNA 복구를 위한 "공여자" 벡터의 설계 및 구축
DNA를 Fad3 내로 통합하는 2개의 전략을 착수하였다; 발현 카세트가 단일 ZFN-유도 이중가닥 파단 내로 통합되는 유전자 스플라이싱 및 유전자의 일부가 2개의 ZFN-유도 이중 가닥 파단에 의해 제거되고 발현 카세트가 갭을 복구하기 위해 삽입되는 유전자-편집.
각각의 통합 방법, 즉 유전자 스플라이싱 또는 유전자-편집을 위해, 2개의 벡터를 구축하였다. 제1 벡터는 turboGFP (tGFP) 유전자 발현 카세트를 코딩하고, 제2 벡터는 항생제 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 유전자 발현 카세트를 코딩하였다. tGFP 발현 카세트는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 폴리유비퀴틴 10 (UBQ10) 유전자로부터의 프로모터, 5' 비번역 영역 및 인트론 (Norris et al, Plant Molecular Biology 1993, 21(5), 895-906), 이어서 tGFP 코딩 서열 (Evrogen, Moscow, Russia)을 포함하였다. tGFP 코딩 서열은 쌍자엽 식물에서의 발현을 위해 코돈-최적화되었고, 에이. 투메파시엔스 pTi15955의 오픈 리딩 프레임 23 (ORF23)의 전사 종결인자 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' 비번역 영역 (UTR) (Barker et al, Plant Molecular Biology 1983, 2(6), 335-50)에 의해 플랭킹되었다. 히그로마이신 내성 유전자 발현 카세트는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)로부터의 5' UTR을 포함하는 19S 프로모터 (Cook and Penon Plant Molecular Biology 1990 14(3), 391-405), 이어서 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hph) 유전자 (Kaster et al Nucleic Acids Research 1983 11 (19), 6895-6911)를 포함하였다. hph 유전자는 쌍자엽 식물에서의 발현을 위해 코돈-최적화되었고, 에이. 투메파시엔스 pTi15955의 오픈 리딩 프레임 1 (ORF1)의 전사 종결인자 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' UTR (Barker et al, Plant Molecular Biology 1983, 2(6), 335-50)에 의해 플랭킹되었다. 두 카세트는 상업적인 유전자 합성 회사 (진아트(GeneArt), 라이프 테크놀로지스, 독일 레겐스베르크)에 의해 합성되었다.
유전자 스플라이싱 실험을 위한 벡터는 벡터 pDAB10782에서 코딩되는 ZFN에 의해 표적화되는 ZFN 인식 서열의 2개의 텐덤 카피를 클로닝함으로써 구축하였다. 유전자 편집 실험을 위한 벡터는 벡터 pDAB107827 및 pDAB107828에서 코딩되는 ZFN에 의해 표적화되는 각각의 ZFN 인식 서열의 하나의 카피를 클로닝함으로써 구축하였다. 둘 다의 경우에서, 2개의 ZFN 인식 서열은 BamHI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열에 의해 분리되었다. tGFP 및 HPH 카세트는 각각 벡터의 BamHI와 NotI 부위로 클로닝되어 4개의 "공여자" 벡터: pDAS000340 (히그로마이신-내성 유전자-접합 공여자: 서열 275, 도 15), pDAS000341 (tGFP 리포터 유전자 스플라이싱 공여자: 서열 276, 도 16), pDAS00342 (히그로마이신-내성 유전자-편집 공여자: 서열 277, 도 17) 및 pDAS000343 (tGFP 리포터 유전자 편집 공여자: 서열 278, 도 18)을 생성하였다.
어셈블리된 플라스미드의 콜로니를 이. 콜라이의 밤새 배양액으로부터 정제된 DNA의 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 초기에 스크리닝하였다. 제한 엔도뉴클레아제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (NEB, 미국 매사추세츠주 입스위치) 및 프로메가 (프로메가 코포레이션, 위스콘신주)로부터 얻었다. 플라스미드 제조는 공급업체의 지시에 따라 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit)™ (퀴아젠, 독일 힐덴) 또는 퓨어 일드 플라스미드 맥시프렙 시스템™ (프로메가 코포레이션, 미국 위스콘신주)을 사용하여 수행하였다. 생성되는 단편의 아가로스 겔 전기영동에 의해 제한 단편이 확인된 후, 선택된 클론의 플라스미드 DNA를 ABI 생어 서열분석 및 빅 다이 터미네이터 V3.1™ 사이클 서열분석 프로토콜 (어플라이드 바이오시스템즈, 라이프 테크놀로지스)을 사용하여 서열분석하였다. 서열 데이터를 모으고, 시퀀셔™ 소프트웨어 (진 코즈, 미국 미시건주 앤 아버)를 사용하여 분석하였다.
원형질체 단리를 위한 식물 물질의 유지
엽육세포 유래 원형질체를 브라시카 나푸스 (DH10275)의 3주령 멸균 신초 (shoot) 배양액으로부터 단리하였다. 대응하는 종자를 본원에 기재된 방법에 따라 발아시켰다. 종자를 70% 에탄올을 사용하여 1분 동안 표면-멸균하고, 부드럽게 진탕한 후, 멸균 이중-증류수로 3-4회 세정하였다. 종자를 20% 표백제 및 10μl의 트윈 20을 사용하여 후속적으로 멸균시켰다. 종자를 약 100 RPM에서 15분 동안 테이블용 진탕기에서 표백제로 추가로 처리한 후, 멸균 이중-증류수로 3-4회 세정하고, 과량의 습기를 제거하기 위해 종자를 멸균 여과지에 조심스럽게 옮기고, 종자 발아 배지 (1/2 강도 MS/B5 비타민 + 1% 수크로스 + 0.8% 한천; pH 5.8)에서 배양하였다.
대략 50-60 mL의 배지를 각각의 페트리™ 디쉬 (15 X 100 mm) 내에 붓고, 지지대를 사용하여 플레이트를 약간 경사지게 두었다. 약 50개의 종자를 각 플레이트 상에 두었다. 플레이트를 22℃에서 16h/d의 광 (20μmol m-2 s-1) 하에 6일 동안 수직으로 인큐베이팅하였다. 0.5cm 크기의 배축 절편을 6일령 묘목으로부터 절제하고, 신초 유도 배지 (MS/B5 비타민 + 3% 수크로스 + 500 mg/L MES + BAP (13μm) + 제아틴 (5μm) + 질산은 (5 mg/L) + 0.8% 한천 (pH 5.8)에서 배양하였다. 배지를 100 x 20 mm 멸균 페트리™ 디쉬 내에 붓고; 약 20개의 체외이식편을 플레이트마다 배지 중에 두었다. 3-4주 후에 나타난 신초 분열조직을 신초 연장 배지 (250 mL 배양 용기에 부은 MS/B5 비타민 + 2% 수크로스 + 500 mg/L MES + BAP (2μm) + GA-3 (0.1μm) + 0.8% 한천 (pH 5.8))에 옮기고, 배양액을 상기 배지에서 4주 동안 유지하고, 그 사이에 1 라운드의 계대배양을 수행하였다. 이어서, 2-3cm 높이의 신초를 뿌리 발생을 위해 발근 개시 배지 (700 mL 배양 용기에 부은 1/2 강도의 MS/B5 비타민 + 1% 수크로스 + 500 mg/L MES + IBA (2.5μm) + 0.6% 한천 (pH 5.8))에 옮겼다. 발근 신초를 사용 전에 2-3 라운드 동안 경삽 (stem cutting)으로서 3-4주 간격으로 신선한 발근 개시 배지에서 계대배양하였다. 배양액을 22℃에서 16h/d의 광 (30μmol m-2 s-1) 하에 유지하였다.
엽육세포 원형질체의 단리 및 정제
시험관내에서 성장한 DH12075 브라시카 나푸스 식물을 엽육세포 원형질체를 단리하기 위한 체외이식편 공급원으로서 사용하였다. 원형질체를 단리하기 위해, 3 - 4주령의 묘목으로부터 3 내지 4번째의 완전히 전개된 잎을 원형질체 단리를 위해 날카로운 메스로 작은 스트립 (0.5 내지 1mm)로 절단하였다. 효소에 의한 소화는 25 mL의 소화 완충제 (K4 배지 (Spangenberg et al., 1998)에 용해된 1.2% (w/v) 셀룰라제 "오노주카(ONOZUKA)™" R10 및 0.2% (w/v) 마세로자임® R10으로 250-500 mg의 잎 물질을 처리함으로써 수행하였다. 잎 물질 및 소화 완충제를 함유하는 페트리™ 디쉬를 파라필름™으로 밀봉하고, 암소에서 12 내지 15시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션 후에, 소화액을 BD® 세포 스트레이너(strainer) (메쉬 크기 70μm)를 통해 여과하였다. 14 mL 환저 튜브 내에 수집한 원형질체 현탁액 (5-6 mL)을 1 mL의 W5 세척 완충제 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl 및 5 mM 글루코스; pH 5.8 [Menzel et al. (1981)])로 덮었다.
원형질체 현탁액을 추가로 400 RPM에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에, 간기 (interphase)에 부유하는 원형질체를 빼내고, 10 mL의 W5 완충제를 사용하여 400 RPM에서 10분 동안 원심분리에 의해 세척하였다. 최종 세척 후에, 단리된 원형질체를 W5 완충제 1mL당 1 X 106개의 원형질체의 밀도로 재현탁하고, 형질감염 전에 1시간 동안 인큐베이팅하였다.
원형질체 수득량 및 생존율의 평가
원형질체 수득량을 문헌 [Sambrook and Russell, (2006)]의 방법에 따라 혈구계를 사용하여 평가하였다. 세포 생존율은 프로토콜을 일부 변형하여 문헌 [Huang et al. (1996)]에 설명된 바와 같이 0.5 M의 만니톨에 용해된 400 mg/L의 에반스 블루 염색을 사용하여 시험하였다.
PEG 4000 매개 DNA 전달
비. 나푸스 원형질체로의 전달 전에, 각각의 공여자 및 ZFN 구축물의 플라스미드 DNA를 공급업체의 지시에 따라 퓨어 일드 플라스미드 맥시프렙 시스템® (프로메가 코포레이션, 미국 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 이. 콜라이의 배양액으로부터 제조하였다. 공여자 및 ZFN 플라스미드 DNA의 분취액을 1:1 (30 μg의 각각의 플라스미드), 5:1 (공여자 플라스미드 대 ZFN 플라스미드 (총 30 μg의 플라스미드 DNA에 대해)) 및 10:1 (공여자 플라스미드 대 ZFN 플라스미드 (총 30 μg의 플라스미드 DNA에 대해))의 3개의 몰비로 제조하였다. 추가로, 공여자-단독 및 ZFN-단독 분취액 (30 μg)을 대조군으로서 제조하였다. PEG4000 매개 형질전환을 통해 비. 나푸스 원형질체로 전달된 DNA의 양을 표 9에 요약한다.
표 9: 원형질체에 전달된 ZFN 및 공여자 DNA의 양
Figure 112015032530092-pct00015
플라스미드 DNA의 각각의 분취액을 100 μl의 형질전환 완충제 (15 mM MgCl2, 0.1% (w/v) 모르폴리노에탄술폰산 (MES) 및 0.5M 만니톨; pH 5.8)에 현탁된 1백만 개의 원형질체 (생존율 ≥95)에 적용한 후, 150μl의 PEG 용액 (0.4M 만니톨 및 0.1M Ca(N03)2 (pH 6-7) 내의 40% (w/v) PEG 4000; 문헌 [Spangenberg and Potrykus (1995))에 적용하였다. 실온에서 10-15분의 인큐베이션 후에, 5 mL의 W5 완충제를 적가하고, 원형질체를 부드럽게 혼합하였다. 추가의 5 mL의 W5 완충제를 원형질체 현탁액에 느린 유동액으로 첨가하였다. 원형질체를 부드럽게 혼합하고, 400 RPM에서 10분 동안 원심분리하고, W5 상청액을 조심스럽게 제거하여 원형질체를 펠릿 형태로 얻었다. 이어서, 형질감염된 원형질체를 비드형 배양액에 포매될 때까지 실온에서 1 mL의 W5 완충제에서 인큐베이팅하였다. 형질감염된 원형질체를 아래에서 설명되는 알긴산나트륨 방법에 따라 포매하였다.
생존가능 마이크로캘러스를 회복시키기 위한 엽육세포 유래 원형질체의 배양
배지 내에서 포매 전에 형질감염된 원형질체를 400 RPM에서 10분 동안 원심분리하고, W5 완충제를 조심스럽게 제거하였다. 이어서, 원형질체를 1.0 mL의 0.5 M 만니톨 내에 재현탁하고, 얼음 상에서 인큐베이팅하였다. 원형질체 용액에, 동일한 부피의 1.0% 알긴산나트륨을 첨가하고, 부드럽게 혼합하였다. 원형질체 현탁액을 포매될 때까지 얼음 내에서 인큐베이팅하였다. 비드 형성 용액 (0.4 M 만니톨 + 50 mM CaCl2 (pH 5.8))을 혈청 피펫을 사용하여 멸균 6웰 플레이트 (3-4 mL/웰)에 옮겼다. 정확히 1.0 mL의 원형질체 현탁액을 1 mL 피펫을 사용하여 비드 형성 용액에 적가하고, 각각의 형질감염된 샘플 (약 5 x 105개 원형질체)을 웰마다 포매하였다. 원형질체 현탁액을 알긴산나트륨 비드 형성을 위해 1-2시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 기간 후에, 비드 형성 용액을 조심스럽게 제거하고, 1.5 mg/L의 히그로마이신으로 보충된 K3+H:A 배지 (Spangenberg et al. 1998)의 1:2 혼합물 4-5 mL로 교체하였다. 원형질체를 진탕기 (50 RPM) 내에서 3-4주 동안 암소에서 22℃에서 배양하였다. 3-4주 후에, 저항성 마이크로캘러스 (0.5-1.0 mm)를 탈중합 완충제 (0.3 M 만니톨 + 20 mM 시트르산나트륨 (pH 5.8))로 처리함으로써 방출시켰다. 액체 배지를 제거한 후에, 3-4 mL의 탈중합 완충제를 비드형 배양액을 함유하는 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 멸균 겸자를 사용하여, 비드를 부드럽게 혼합하여 마이크로캘러스의 효율적인 방출을 향상시켰다. 이어서, 멸균 1.0 mL 피펫을 사용하여 탈중합 완충제에 방출된 겔화제를 부드럽게 혼합한 후, 제거하였다. 마이크로캘러스를 5 mL의 액체 A 배지로 2회 세척하고, 마이크로캘러스를 충분한 양의 액체 A에 재현탁하였다 (50 mL의 액체 A는 1 mL의 침강된 세포 부피 (SCV: 이것은 모든 방출된 마이크로캘러스를 멸균 50 또는 15 mL 팔콘(falcon) 튜브로 옮기고 5분 동안 침강시킨 후 측정하였다)에 대해 사용되었다). 마이크로캘러스 균일하게 혼합한 후, 액체 A 배지에 현탁한 0.5 mL의 마이크로캘러스를 B1 배지 (100 x 20 mm 멸균 페트리™ 디쉬에 부은 MS/MS 비타민 + 3.5 % 수크로스 + 500 mg/L MES + BAP (5 μm) + NAA (5 μm) + 2,4-D (5 μm) + 1.5 mg/L 히그로마이신 + 0.7 % 아가로스 타입 I (pH 6.0))로 옮기고, 1-2 mL의 추가의 액체 A 배지를 사용하여 마이크로캘러스를 B1 배지에 균일하게 분포시키고, 과량의 액체 A 배지를 각각의 플레이트로부터 조심스럽게 제거하였다. 플레이트를 배아 성숙을 향상시키는 세공 테이프로 밀봉하였다. 배양액을 22℃에서 16h/d의 광 (30 μmol m-2 s-1) 하에 유지하였다.
엽육세포 유래 원형질체로부터 신초의 증식 및 재생
히그로마이신 저항성 콜로니를 2-3주의 인큐베이션 후에 B1 배지 (SA 및 SP 방법으로 유도된 마이크로캘러스)로부터 선택하고, B2 배지 (100 x 20 mm 멸균 페트리™ 디쉬에 부은 MS/MS 비타민 + 3.0 % 수크로스 + 500 mg/L MES + 500 mg/L PVP + 5 mg/L 질산은 + 5 mg/L 2i P + NAA (0.5 μm) + GA-3 (0.3 μm) + 1.5 mg/L 히그로마이신 + 0.7 % 아가로스 타입 I (pH 5.8))로 옮겼다. 약 25-30개의 캘러스를 플레이트마다 넣고, 플레이트를 파라필름™으로 밀봉하고, 22℃에서 16h/d의 광 (30 μmol m-2 s- 1)에서 인큐베이팅하였다. 히그로마이신 저항성 콜로니를 후속적으로 B2 배지에서 2주 간격으로 5-6 라운드의 계대배양 후에 회복시켰다. 플레이트 당 캘러스의 수를 제3 라운드의 계대배양 후에 12-15로 감소시켰다. 10-12주 후에 출현한 신초 원기 (primordia)를 잔여 캘러스와 함께 조심스럽게 회복시키고, 신초 신장 배지 (250 mL 배양 용기에 부은 MS/B5 비타민 + 2% 수크로스 + 500 mg/L MES + BAP (2 μm) + GA-3 (0.1 μm) + 300 mg/L 티멘틴 + 1.5 mg/L 히그로마이신 + 0.8% 아가 (pH 5.8))로 옮겼다. 2-3 라운드의 히그로마이신 선택 후에 생존한 신초를 발근 배지 (700 mL 배양 용기에 부은 1/2 강도 MS/B5 비타민 + 1% 수크로스 + 500 mg/L MES + IBA (2.5 μm) + 1.5 mg/L 히그로마이신 + 0.6% 아가 (pH 5.8))로 옮겼다.
엽육세포 원형질체로부터 게놈 DNA의 단리
형질감염된 원형질체를 3 cm 페트리™ 디쉬로부터 2 mL 원심분리 튜브로 옮겼다. 세포를 70 g에서 원심분리에 의해 펠렛화하고, 상청액을 제거하였다. 형질감염된 원형질체의 회수를 최대화하기 위해, 페트리™ 디쉬를 1 mL의 세척 완충제로 3회 세정하였다. 각각의 세정은 세척 완충제를 페트리™ 디쉬에서 1분 동안 회전시킨 후, 액체를 동일한 2 mL 원심분리 튜브에 전달함으로써 수행하였다. 각각의 세정 종료시에, 세포를 70 g에서 원심분리하여 펠렛화하고, 상청액을 제거하였다. 펠렛화된 원형질체를 액체 질소로 급속 냉동한 후, -40℃ 및 133 x 10-3 mBar 압력에서 랍콘코 프리존 4.5® (랍콘코, 미국 미주리주 캔자스 시티))에서 24 h 동안 동결 건조하였다. 동결건조된 세포는 제조자의 지시에 따라 DNEASY® 식물 DNA 추출 미니 키트 (퀴아젠)를 사용하여 DNA 추출에 적용하되, 조직 붕괴는 필요하지 않았고, 원형질체 세포는 용해 완충제에 직접 첨가하였다.
캘러스 조직으로부터 게놈 DNA의 단리
개별적인 캘러스를 액체 질소 내에서 급속 냉동한 후, 24 h 동안 -40℃ 및 133 x 10-3 mBar 압력에서 랍콘코 프리존 4.5® (랍콘코, 미국 미주리주 캔자스 시티) 내에서 동결 건조하였다. 동결건조된 캘러스는 제조자의 지시에 따라 DNEASY® 식물 DNA 추출 미니 키트 (퀴아젠, 독일 힐덴)를 사용하여 DNA 추출에 적용하였다.
잎 조직으로부터 게놈 DNA의 단리
재생된 식물로부터의 30 mg의 어린 잎 조직을 액체 질소 내에서 급속 냉동한 후, 24 h 동안 -40℃ 및 133 x 10-3 mBar 압력에서 랍콘코 프리존 4.5® (랍콘코, 미국 미주리주 캔자스 시티) 내에서 동결 건조하였다. 동결건조된 캘러스는 제조자의 지시에 따라 DNEASY® 식물 DNA 추출 맥시 키트™ (퀴아젠, 독일 힐덴)를 사용하여 DNA 추출에 적용하였다.
FAD3C의 NHEJ-매개 스플라이싱 및 편집에 대한 게놈 DNA의 PCR 검정
공여자 DNA의 비. 나푸스의 Fad3C 유전자에 대한 통합의 검출은 적어도 하나의 프라이머가 Fad3C 유전자좌 (표 10)에 특이적이고 제2 프라이머가 gfp 카세트의 프로모터 또는 종결인자 (표 10 및 도 19a)에 특이적인 일련의 PCR에 의해 수행하였다. 특이성은 마지막 염기쌍이 Fad3C 게놈 서열을 Fad3 유전자의 다른 카피와 구별케하는 SNP에 정렬되고 별표 [*]로 표시된, 상기 염기쌍 앞의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 설계함으로써 얻었다. 교정 (proofreading) 활성을 갖는 폴리머라제와 조합하여 사용되는 상기 설계는 각각의 Fad3C 또는 Fad3A 대립유전자의 특이적인 증폭을 유도하고, 나타낸 다른 Fad3 카피를 배제하였다. 각각의 프라이머 세트는 야생형 비. 나푸스로부터 얻은 PCR 증폭 생성물의 생어-기반 서열결정을 통해 정확한 유전자 카피의 증폭에 대해 실험에 의해 시험하였다.
표 10: ZFN-유도 이중-가닥 파단 내로 DNA의 통합을 검출하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 서열
Figure 112015032530092-pct00016
*는 나타낸 다른 Fad3 카피를 배제하면서 Fad3C 또는 Fad3A의 특이적인 증폭 (교정 폴리머라제 사용)을 유도하는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 나타낸다. 각각의 프라이머 세트는 야생형 비.나푸스로부터 얻은 PCR 증폭 생성물의 생어-기반 서열결정에 의해 정확한 유전자 카피의 증폭에 대해 실험에 의해 시험하였다.
원형질체에서 비-상동성 말단부 연결에 의한 FAD3C에 대한 유전자 부가의 검출
게놈 DNA를 기능성 tGFP 리포터 카세트 (pDAS000341 또는 pDAS000343)를 코딩하는 공여자 DNA, ZFN DNA (pDAB107827 또는 pDAB107828) 또는 공여자 및 ZFN DNA의 혼합물이 24시간 더 일찍 전달된 원형질체 풀 (1백만 개의 원형질체/풀)로부터 추출하였다. 형질전환을 위해 전달된 DNA의 양은 상기 설명되어 있다. PCR 산물을 플라스미드 벡터 내로 클로닝하였다. 게놈 편집은 각각의 세포에서 독립적으로 발생하여 플라스미드 벡터 내로의 클로닝에 의해 다양한 상이한 삽입 이벤트를 생성하고, 각각의 게놈 편집은 불명료함이 없이 서열결정될 수 있다. 몇몇 클론은 ABI3730XL® 자동 모세관 전기영동 플랫폼에서 서열결정되었다. 유전자 서열의 분석은 시퀀셔 소프트웨어 V5.0™ (진코즈, 미국 미시건주 앤 아버)을 사용하여 수행하였다.
편집 또는 스플라이싱에 의한 Fad3C 유전자좌에 대한 부가의 증거는 표 10에 설명된 프라이머를 사용하여 원형질체로부터 추출된 게놈 DNA로부터의 5' 및 3' Fad3C-카세트 접합부의 증폭에 의해 제공되었다. 프라이머 "FAD3CNHEJ-L4-F2" 및 "AtUbiNHEJ-R1"을 사용한 PCR 증폭은 tGFP 카세트 및 Fad3C의 5' 접합부를 증폭시키기 위해 수행하였다. "FAD3CNHEJ-L4-R2" 및 "AtORF23tNHEJ-F1"을 사용한 PCR 증폭은 tGFP 카세트 및 Fad3C의 3' 접합부를 증폭시키기 위해 수행하였다. 프라이머 "FAD3CNHEJ-L4-F2" 및 "FAD3CNHEJ-L4-R2"를 사용한 PCR 증폭은 ZFN 28051-2A-28052에 의해 유도된 이중 가닥 파단에 걸쳐 증폭하기 위해 수행하였다. 증폭은 ZFN 플라스미드 또는 공여자 플라스미드가 단독으로 전달된 원형질체로부터 관찰되지 않았다. 모든 접합부 서열은 NHEJ-매개 복구 경로를 통해 Fad3C 유전자좌에서 tGFP 카세트의 삽입을 나타내었다. 게놈 및 카세트 중의 어느 하나 또는 둘 모두로부터의 상이한 길이의 결실이 관찰되었고, 벡터 백본 (공여자 또는 ZFN으로부터의)으로부터 유래된 서열의 부가가 게놈과 카세트 사이에 삽입되었다 (도 20a 및 도 20b).
원형질체로부터 재생된 캘러스 조직에서 비-상동성 말단부 연결에 의한 FAD3C에 대한 유전자 부가의 검출
또한, Fad3C 유전자좌의 스플라이싱 및 편집에 대한 증거는 hph 카세트를 코딩하는 공여자 DNA (pDAS000340 또는 pDAS000342), ZFN DNA 단독 (pDAB107827 또는 pDAB107828) 또는 공여자 및 ZFN DNA가 전달된, 선택 (상기 설명된 바와 같은 1.5 mg/L 히그로마이신)시에 원형질체로부터 재생된 캘러스 조직으로부터 얻었다 (전달된 DNA의 양을 표 9에 제공함). 원형질체 형질감염 4주 후에 캘러스가 생존하지 않은 편집 1:1:1을 제외한 각각의 비율에 대해 DNA를 약 80개의 캘러스로부터 추출하였다.
비. 나푸스 게놈 내로의 hph 카세트의 통합 (fwat Fad3C 또는 무작위로) hph 유전자에 특이적인 프라이머 (서열 294; F - 5' CTTACATGCTTAGGATCGGACTTG 3', 서열 295; R - 5' AGTTCCAGCACCAGATCTAACG 3') 및 프로브 (서열 296; 5' CCCTGAGCCCAAGCAGCATCATCG 3')를 사용하는 타크만™ qPCR에 의해 확인하였다. 이들 프라이머-프로브 쌍을 A 게놈 상에 단일 카피로서 존재하는 비. 나푸스 높은 이동도 그룹 단백질 I/I (HMG I/Y) (Weng et al., 2004, Plant Molecular Biology Reporter)에 특이적인 프라이머 (서열 297; F - 5' CGGAGAGGGCGTGGAAGG 3', 서열 298; R - 5' TTCGATTTGCTACAGCGTCAAC 3') 및 프로브 (서열 299; 5' AGGCACCATCGCAGGCTTCGCT 3')와의 이중체 반응에 사용하였다. 증폭은 CFX96 또는 CF384 실시간 PCR 검출 시스템™ (바이오라드, 미국 캘리포니아주 허큘레스)을 사용하여 C1000 열 순환기 상에서 수행하였다. 결과를 CFX 매니저(MANAGER)™ (바이오라드) 소프트웨어 패키지를 이용하여 분석하였다. 상대적인 정량은 게놈 내로 삽입된 hph 카세트의 카피수의 추정을 제공하는 2-ΔΔCt 방법 (Livak and Schmittgen, 2001)에 따라 계산하였다.
Fad3C의 NHEJ-매개 스플라이싱 및 편집에 대한 증거는 Fad3C에 특이적인 제1 프라이머 및 hph 카세트의 프로모터 또는 종결인자에 특이적인 제2 프라이머를 사용하여 PCR 검정을 수행함으로써 얻었다 (표 9 및 도 19b). 캘러스 조직으로부터 얻은 DNA의 제한된 양 때문에, 센스 배향으로의 통합만이 검정되었다. PCR 산물은 퀴아퀵 미니일루트(QiaQuick MiniElute) PCR 정제 키트™ (퀴아젠)를 사용하여 겔-정제되었고, 직접 생어 서열결정 방법을 사용하여 서열결정하였다. 서열결정 생성물은 빅다이® v3.1 프로토콜 (어플라이드 바이오시스템즈)에 따라 에탄올, 아세트산나트륨 및 EDTA로 정제하고, 상기한 바와 같이 서열결정하고 분석하였다.
각각의 실험에서 공여자 카세트를 함유하는 캘러스의 수를 표 11에 제공한다. 편집 및/또는 스플라이싱에 의한 Fad3C 유전자좌에 대한 공여자 유전자의 증거는 ZFN 절단 부위 및 5' 및 3' Fad3C-hph 카세트 접합부 둘 모두에 걸친 PCR 증폭 (표 10에 제시된 프라이머를 사용하는)에 의해 제공되었다. 단지 hph 플라스미드 (pDAS000340 및 pDAS000342) 또는 단지 ZFN 플라스미드 (pDAB107827 및 pDAB107828)를 사용하여 형질전환된 대조 원형질체로부터 회복된 캘러스 조직으로부터 단리된 게놈 DNA의 PCR 증폭은 PCR 증폭 생성물을 생산하지 않았다.
5' 및 3' Fad3C-hph 카세트 접합부의 증폭으로부터 생산된 PCR 앰플리콘을 아가로스 겔로부터 정제하고, Fad3C 게놈 유전자좌 내에서 통합의 특이성을 확인하기 위해 서열결정하였다. PCR 산물의 서열결정 분석의 결과는 개별적으로 형질전환된 원형질체로부터 생성된 각각의 단리된 캘러스가 단지 단일 PCR 증폭 생성물을 생성하고 혼합 유전자형의 세포를 함유하지 않음을 나타내었다.
Fad3C 게놈 유전자좌 실험 내의 공여자 서열의 NHEJ-매개 통합에서, 표적 유전자좌에 대한 부가의 빈도 (표적 유전자좌로부터 증폭된 공여자 DNA 벡터의 임의의 부분에 의해 규정됨)는 각각 1:1, 5:1, 및 10:1 (공여자 DNA:ZFN DNA)의 DNA 농도에 대해 42%, 46% 및 32%이었다. 표 12를 참조한다. 정확한 스플라이싱의 빈도는 두 카세트 접합부가 증폭가능한지 검정하고 PCR 산물의 서열결정으로부터 결정되었다. 이들 결과를 통해, 카세트가 정확한 배향으로 표적 유전자좌에서 삽입되었음을 확인하였다. 통합 빈도는 각각 1:1, 5:1 및 10:1의 공여자 플라스미드 DNA:ZFN 플라스미드 DNA 농도에 대해 4%, 3% 및 3%로서 계산하였다. 유전자 편집 실험에서, 표적 유전자좌로부터 증폭된 공여자 DNA 벡터의 임의의 부분에 의해 규정되는, 표적 유전자좌에 대한 부가의 빈도는 각각 5:1:1 및 10:1:1의 공여자 플라스미드 DNA:ZFN 플라스미드 DNA 농도에 대해 66% 및 65%이었다. 표 13을 참조한다. 정확한 편집의 빈도는 두 카세트 접합부가 증폭가능하고 PCR 산물의 서열을 생산함으로써 결정되었다. 이들 결과를 통해, 카세트가 각각 5:1:1 및 10:1:1의 공여자 플라스미드 DNA:ZFN 플라스미드 DNA 농도에 대해 3% 및 6%의 빈도로 정확한 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되었음을 확인되었다. 원형질체 검정에서 관찰되는 바와 같이, ZFN에 의한 게놈 유전자좌의 절단의 결과로서 염기쌍이 결실되거나 또는 추가의 염기가 게놈과 카세트 사이에 삽입되었다 (도 21-22).
특정 경우에, PCR 산물은 표적 유전자좌 내의 뉴클레오티드 서열의 첨가를 유도하거나, 이를 어느 PCR 산물도 유도하지 않거나, 또는 야생형 샘플에서 관찰된 것보다 더 큰 PCR 산물이 유도하였다. 절단 부위에 플랭킹된 프라이머를 사용한 PCR 증폭으로부터 생성된 이들 결과는 유전자좌가 염색체의 두 쌍 모두에서 붕괴됨을 나타내었다 (도 21-22). 몇몇의 예에서, 하나 초과의 밴드가 스플라이스 접합부에서 증폭되었고 (도 21-22), 이것은 상이한 삽입이 각각의 게놈 카피에서 독립적으로 발생함을 나타내었다.
표 11: 선택 4주 후에 hph의 존재에 대해 양성인 캘러스의 수
Figure 112015032530092-pct00017
표 12: ZFN28051-2A-28052에 의해 유도된 DSB에서 Fad3C 유전자좌에서의 스플라이싱에 의해 hph가 삽입된 캘러스의 수
Figure 112015032530092-pct00018
* 절단 부위에 결실된 염기 쌍 또는 삽입된 추가의 염기 쌍의 수
표 13: ZFN28051-2A-28052 및 ZFN28053-2A-28054에 의해 유도된 절단 부위에서 FadC 유전자좌에서의 편집에 의해 hph가 삽입된 캘러스의 수
Figure 112015032530092-pct00019
* 절단 부위에 결실된 염기 쌍 또는 삽입된 추가의 염기 쌍의 수
식물에서 비-상동성 말단부 연결에 의한 FAD3C에 대한 유전자 부가의 검출
DNA를 원형질체로부터 재생된 식물로부터 추출하고, 포팅(potting) 배지 (상기 설명된 바와 같이)에 옮겼다. 회수된 대부분의 식물은 공여자 DNA에서 코딩되는 hph 카세트의 1-2개의 카피만을 함유하는 것으로 추정되었다. 식물을 캘러스 조직에 대해 설명한 바와 동일한 세트의 검정을 사용하고 카세트가 안티센스 배향으로 삽입되었는지 또는 Fad3A 유전자좌에서 공여자 통합이 이루어졌는지 결정하기 위한 검정을 사용하여 분석하였다.
표 14: 원형질체로부터 재생된 식물의 추정된 카피수. 각각의 비율에 대해, 백만개의 원형질체의 형질감염을 3회 수행하였다.
Figure 112015032530092-pct00020
hph 카세트가 어느 한쪽으로 Fad3C 내로 삽입된 선형 공여자 설계 구축물에 대한 정확한 스플라이싱의 빈도는 각각 1:1, 5:1 및 10:1의 농도의 공여자 DNA:ZFN DNA에 대해 51%, 32% 및 56%이었다 (표 15). 이들 결과 중에서, 35%, 32% 및 50% (1:1, 5:1 및 10:1)가 정방향 배향으로 삽입되었다 (표 15).
hph 카세트가 양쪽으로 Fad3C 내로 삽입되어 영역을 유전자좌 4로부터 유전자좌 6으로 교체한 정확한 편집의 빈도는 각각 5:1:1 및 10:1:1의 농도의 공여자 DNA:ZFN DNA:ZFN DNA에 대해 2% 및 0%이었다 (표 16). 또한, 두 ZFN이 5:1:1로 전달될 때, 2%가 유전자좌 4 내로 스플라이싱되고 10%가 유전자좌 6 내로 스플라이싱되고, 두 ZFN이 10:1:1로 전달될 때, 10%가 유전자좌 4 내로 스플라이싱되고 15%가 유전자좌 6 내로 스플라이싱되었다. PCR 앰플리콘을 수득하였고, 서열분석하여 삽입 접합부 서열을 결정하였다. 특이적으로 표지된 식물에 대해 생성된 서열은 표 17에 기재하였다.
표 15: ZFN28051-2A-28052에 의해 유도된 DSB에서 FadC 유전자좌에서의 스플라이싱에 의해 hph가 삽입된 식물의 수
Figure 112015032530092-pct00021
표 16: ZFN28051-2A-28052 및 ZFN28053-2A-28054에 의해 유도된 절단 부위에서 FadC 유전자좌에서의 편집에 의해 hph가 삽입된 식물의 수
Figure 112015032530092-pct00022
표 17: ZFN28051-2A-28052 및 ZFN28053-2A-28054에 의해 유도된 절단 부위에서 Fad3C 유전자좌에 삽입된 표적인 단일 카피 hph의 식물의 설명
Figure 112015032530092-pct00023
hph 카세트가 원형 공여자에 대해 어느 한쪽 방향으로 Fad3C 내로 삽입된 정확한 스플라이싱의 빈도는 1:1, 5:1 및 10:1에 대해 각각 51%, 32% 및 56%였다 (표 18, 도 23). 이들 중에서, 35%, 32% 및 50% (1:1, 5:1 및 10:1)가 정방향 배향으로 삽입되었다 (표 18).
Hph 카세트가 어느 한쪽 방향으로 Fad3C 내로 삽입되어 유전자좌 4에서 유전자좌 6으로 영역을 대체하는 정확한 편집의 빈도는 5:1: 및 10:1:1에 대해 각각 2% 및 0%였다 (표 19; 도 24). 또한, ZFN 둘 다 5:1:1로 전달될 때, 2%가 유전자좌 4 내로 스플라이싱되고 10%가 유전자좌 6 내로 스플라이싱되고, ZFN 둘 다 10:1:1로 전달될 때, 10%가 유전자좌 4 내로 스플라이싱되고 15%가 유전자좌 6 내로 스플라이싱되었다.
표 18: ZFN28051-2A-28052에 의해 유도된 DSB에서 FadC 유전자좌에서의 스플라이싱에 의해 hph가 삽입된 식물의 수
Figure 112015032530092-pct00024
* 절단 부위에 염기 쌍이 결실되거나 추가의 염기쌍이 삽입되지 않음.
표 19: ZFN28051-2A-28052 및 ZFN28053-2A-28054에 의해 유도된 절단 부위에서 FadC 유전자좌에서의 편집에 의해 hph가 삽입된 식물의 수
Figure 112015032530092-pct00025
* 절단 부위에 염기 쌍이 결실되거나 추가의 염기쌍이 삽입되지 않음.
HDR을 통한 브라시카 나푸스 오메가-3 지방산 데새투라제의 표적화 통합
tGFP 및 HPH 카세트를 함유하는 공여자 벡터를 FAD3 상류 및 하류 공여자 서열의 1kb를 포함시키기 위해 변형시켰다. FAD3 상류 및 하류 공여자 서열은 본래 FAD3 서열과 100% 동일하였고, 이를 FAD3 아연 핑거 결합 부위로부터 획득하였다; GCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCTTCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAAT (서열 255) 또는 AGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCAACTACTTGCTGGTCGATCGTGTTGGCCACTC (서열 256). 생성된 4개의 "공여자" 벡터는 pDAS000340 (히그로마이신-저항성 유전자-스플라이싱 공여자), pDAS000341 (tGFP 리포터 유전자 스플라이싱 공여자), pDAS00342 (히그로마이신-저항성 유전자-편집 공여자) 및 pDAS000343 (tGFP 리포터 유전자 편집 공여자)과 유사하며, 여기서 유일한 변형은 FAD3 게놈 상류 및 하류 서열의 1Kb의 포함이었다. 이전에 NHEJ 매개된 통합에 대해 기재된 아연 핑거 뉴클레아제 플라스미드 (pDAB107827 및 pDAB107828)는 HDR 매개된 통합에 사용하였다.
브라시카 나푸스의 형질전환
엽육 유래 원형질체를 단리시키고, 상기 기재된 바와 같이 브라시카 나푸스 (DH10275) 식물로부터 제조하였다. 원형질체를 정제된 플라즈미드 DNA에 의해 형질전환시켰다. 공여자 및 ZFN 플라스미드 DNA의 분취액을 3가지의 몰비: 1:1 (30 μg의 각각의 플라스미드), 5:1 (전체 30 μg의 플라스미드 DNA에 대해 공여자 플라스미드 대 ZFN 플라스미드) 및 10:1 (전체 30 μg의 플라스미드 DNA에 대해 공여자 플라스미드 대 ZFN 플라스미드)로 제조하였다. 추가로, 공여자-단독 및 ZFN-단독 분취액 (30 μg)을 대조군으로서 제조하였다. PEG4000 매개 형질전환을 통해 비. 나푸스 원형질체로 전달된 DNA의 양을 표 20에 요약하였다. 형질전환된 원형질체 세포는 이전에 기재된 것으로서 배양하였으며, 여기서 선택 배지는 글루포시네이트 선택 배지였고, 추정 형질전환체를 트랜스진 삽입에 대한 qPCR 분석을 통해 분석하였다.
표 20: 원형질체에 전달된 ZFN 및 공여자 DNA의 양
Figure 112015032530092-pct00026
원형질체에서 HDR에 의한 FAD3에 대한 유전자 부가의 검출
기능적 리포터 카세트 또는 선택 마커 카세트를 코딩하는 공여자 DNA, ZFN DNA 또는 공여자 및 ZFN DNA의 혼합물이 24시간 더 일찍 전달된 원형질체 풀 (백만개의 원형질체/풀)로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 형질전환을 위해 전달된 DNA의 양은 상기에 기재되어 있다. PCR 생성물을 플라스미드 벡터 내로 클로닝하였다. 게놈 편집은 각각의 세포에서 독립적으로 발생하여 플라스미드 벡터 내로의 클로닝에 의해 상이한 다양한 삽입 사례를 생성하고, 각각의 게놈 편집은 불명료함 없이 서열분석될 수 있다. 몇몇 클론을 ABI3730XL® 자동 모세관 전기영동 플랫폼에서 서열분석하였다. 유전자 서열의 분석을 시퀀셔™ 소프트웨어 V5.0™ (진코즈, 미시건주 앤 아버)을 사용하여 수행하였다.
편집 또는 스플라이싱에 의한 FAD3 유전자좌에 대한 유전자 부가의 증거를 원형질체로부터 추출된 게놈 DNA로부터의 양쪽 5' 및 3' FAD3-카세트 접합부의 증폭에 의해 제공하였다. 증폭은 ZFN 플라스미드 또는 공여자 플라스미드가 단독으로 전달된 원형질체로부터는 관찰되지 않았다. 모든 접합부 서열은 HDR-매개 복구 경로를 통해 FAD3 유전자좌에서 카세트의 삽입을 나타내었다. 게놈 및 카세트 중 어느 하나 또는 둘 다로부터의 상이한 길이의 결실, 뿐만 아니라 게놈과 카세트 사이에 삽입되는 벡터 백본 (공여자 또는 ZFN으로부터의)으로부터 유래된 서열의 부가가 관찰되었다.
원형질체로부터 재생된 캘러스 조직에서 HDR에 의한 FAD3에 대한 유전자 부가의 검출
FAD3 유전자좌의 스플라이싱 및 편집의 추가의 증거를 카세트를 코딩하는 공여자 DNA, ZFN DNA 단독, 또는 공여자 및 ZFN DNA가 전달된 선택한 원형질체로부터 재생된 캘러스 조직으로부터 획득하였다. DNA를 각각 비에 대해 대략 80개의 캘러스로부터 추출하였다.
비. 나푸스 게놈으로의 카세트의 통합을 공여자 삽입 및 게놈 플랭킹 서열에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하는 택맨™ qPCR에 의해 확인하였다. 상대적인 정량화는 게놈 내로 삽입된 카세트의 카피수의 추정을 제공하는 2- ΔΔCt 방법 (Livak and Schmittgen, 2001)에 따라 계산하였다. FAD3의 NHEJ-매개 스플라이싱 및 편집에 대한 증거를 FAD3에 특이적인 제1 프라이머 및 카세트의 프로모터 또는 종결인자에 특이적인 제2 프라이머를 사용하여 PCR 검정을 수행함으로써 얻었다. PCR 생성물은 퀴아퀵 미니일루트 PCR 정제 키트™ (퀴아젠)를 사용하여 겔-정제되었고, 직접 생어 서열분석 방법을 사용하여 서열분석하였다. 서열분석 생성물을 빅다이(BIGDYE)® v3.1 프로토콜 (어플라이드 바이오시스템즈)에 따라 에탄올, 아세트산나트륨 및 EDTA로 정제하고, 상기한 바와 같이 서열분석하고 분석하였다.
각각의 실험에서 공여자 카세트를 함유하는 캘러스의 수를 결정하였다. 편집 및/또는 스플라이싱에 의한 FAD3 유전자좌에 대한 공여자 유전자 부가의 증거를 ZFN 절단 부위 및 양쪽 5' 및 3' FAD3-카세트 접합부에 걸친 PCR 증폭에 의해 제공하였다. 플라스미드 단독 또는 ZFN 플라스미드 단독으로 형질전환된 대조 원형질체로부터 회수된 캘러스 조직으로부터 단리된 게놈 DNA의 PCR 증폭은 PCR 증폭 생성물을 생산하지 않았다.
5' 및 3' FAD3-카세트 접합부의 증폭으로부터 생산된 PCR 앰플리콘을 아가로스 겔로부터 정제하고, FAD3C 게놈 유전자좌 내에서 통합의 특이성을 확인하기 위해 서열분석하였다. PCR 생산물의 서열분석 분석의 결과는 개별적으로 형질전환된 원형질체로부터 생성된 각각의 단리된 캘러스가 단지 단일 PCR 증폭 생성물을 생성하고 혼합 유전자형의 세포를 함유하지 않음을 나타내었다.
식물에서 HDR에 의한 FAD3에 대한 유전자 부가의 검출
DNA를 원형질체로부터 재생된 식물로부터 추출하고, 포팅 배지에 옮겼다. 회수된 대부분의 식물은 공여자 DNA에서 코딩되는 카세트의 1-2개의 카피만을 함유하는 것으로 추정되었다. 식물을 캘러스 조직에 대해 기재한 바와 동일한 세트의 검정 뿐만 아니라 카세트가 FAD3 유전자좌에 삽입되었는지 결정하는 검정으로 분석하였다.
카세트가 FAD3 유전자좌 내에 삽입된 정확한 스플라이싱의 빈도를 상기에 기재된 PCR 검정을 사용하여 결정하였다. 획득한 앰플리콘 밴드를 플랭킹 서열을 결정하기 위해 서열분석하였다. 추가로, 식물을 FAD3 이외의 부위에서의 카세트의 통합의 빈도를 결정하기 위해 표적-이탈 삽입에 대해 스크리닝하였다.
실시예 9: 농경학상 중요한 유전자로의 브라시카 나푸스 오메가-3 지방산 데새투라제 ( FAD3 )의 표적화 통합
제초제 글리포세이트에 저항성을 부여하는 DGT-28 트랜스진 (본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 번호 WO/2013/116700)을 함유하는 구축물을 브라시카 나푸스의 FAD3 게놈 유전자좌 내로의 통합을 위해 설계하고 구축하였다. 구축물 및 연관된 아연 핑거 뉴클레아제 구축물 (예를 들어, pDAB107827 및 pDAB107828)을 이전에 상기에 기재된 바와 같은 브라시카 나푸스 세포로 형질전환시켰다. 형질전환체는 이전에 기재된 것으로서 분자 확인 검정을 통해 동정하고 확인하였다. 통합된 dgt-28 트랜스진을 포함하는 FAD3 염색체 구성요소를 단리시켰다. FAD3 유전자좌 내로의 dgt-28 트랜스진의 통합은 NHEJ 매개된 통합 및 HDR 매개된 통합을 통해 예시된다. FAD3 유전자좌 내로의 통합은 FAD3 내인성 서열 또는 FAD3 유전자좌 내에 안정하게 통합된 이전에 기재된 ETIP (pDAS000271 - pDAS000275) 내로 지정될 수 있다. NHEJ 매개된 메카니즘을 통한 FAD3 유전자좌 내로의 통합은 선형 공여자 또는 원형 공여자 DNA 설계를 사용하여 수행할 수 있다. 형질전환된 DGT-28 브라시카 나푸스 사례를 획득하였고, DGT-28의 강한 발현 및 후속적인 제초제 글리포세이트에 대한 저항성에 대해 시험하였다.
특정의 예시적인 실시양태가 본원에 기재되어 있으며, 통상의 기술자는 예시적 실시양태에 대한 다수의 추가, 제거 및 변형이 하기 청구범위의 범주에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 인식하고 이해할 것이다. 또한, 한 실시양태로부터의 특징은 또 다른 실시양태의 특징과 조합될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> DOW AGROSCIENCES LLC <120> FAD3 PERFORMANCE LOCI AND CORRESPONDING TARGET SITE SPECIFIC BINDING PROTEINS CAPABLE OF INDUCING TARGETED BREAKS <130> 8326-4009.40 <140> PCT/US2013/058267 <141> 2013-09-05 <150> 61/820,260 <151> 2013-05-07 <150> 61/697,854 <151> 2012-09-07 <160> 383 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20890 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 aattgttgta ttttttaaat ataattctca aaaattctat tttaagaaag ttttcatttt 60 tacttaaaaa tattgtagat ttgaagttgt ggtttagtaa tttggataac aataattttt 120 gttgatagat gaaaaacaga agaagatcac gattcgttca cacattccca actcacatta 180 cactaacacc tttgagtaaa gtgagccatt ttattatatt catgcctacc aggctaccaa 240 tatctgtaaa gctctcctca aataaatagc aagcataaga ttttgattat atcccagtag 300 aaaaactaga ctttatcttc taaataatca ttaagcatgc taatgactta gttacaaaga 360 gggtagatca aaagaaatgg atttgatgaa gctctgggaa gcttagtaag agcattggtg 420 attctctggt agttcttgtt aacatttttg tcttctcggt 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aatgtttttc acaacttagt tatactcaaa agacttcttc ctgcaaattt tatttgaaga 104220 acttgcgcag tttctaaata tggttgtgtg gcaatattta taacagatgt ctgctgttgt 104280 gacgattgga tttgttaagg atgcaaaaca tcacgttgat gtacaaggct tcaatgtcta 104340 ccacaagaat cgccttatta aggtttctct cgctcttttc ggcttatatt acctttgttt 104400 ctgtcagttt tttaactgtc ccactttgtt tttgtcagcc attttggagg atatggaatg 104460 cagcaggaag tcaaggtcgt gggattatag gtaatcgtta ttttgcagga aggtctataa 104520 tacatgattg gctcttttaa tgtgaagtct aatgcgttag tttgctaaaa ggtgttttgg 104580 aagctgattt cgttgagccg gctcatgata agcaaggttt tgagcgtaca acagttttgt 104640 ctagactcga gacacgtctt cttgtaatgc agaagaatta ttggtttgtt gctctcttct 104700 cttgcttttt agaaaattgc cgatgcttca ctgaactctt tgcgcttctg atttattcag 104760 gaggttgaac tgtcacagaa ttggatatgt ttcagcacat ggcaaaaagt ccgctaaaga 104820 ctctgaagac agaggtacta acatcttctt cttttttttt taaacaatcg gggttttaaa 104880 acgtgtgcta ataaacaaat ctcttggaca tttgtgtaga atcatcacca gagtatgcag 104940 tcccaaccag gaaaagagct gctgctgctg catcgttgag ctttaaaact ccaactggtg 105000 caaggacagt tgtgaatcga ggaggaaaag gaaaaggatc tgttagagat tctaatgggg 105060 tcggttcatc agagaaaagt ggtaaacatg gaaacacctc ttccaaattt aatggacgag 105120 caaaggctcg aggagctcct ccagctttag aagatatcaa cagtgatgag gactctgatt 105180 acgatcctcc gggtgaagaa aatgtcactg agcttcctga gaaggtcctc caatgctctt 105240 tcttttattt ttctccggta aatagaatta tgaacgtaac cttttgtgta cttgttctcg 105300 cagagcttcg aaccaccaac caagccacgt tctactgatt cacgtaccct cagtcaacta 105360 gagcaagaga atgaaacgtt aaaagagagg ttttgttacc ttacgttacc atgttatgat 105420 tcatgtttct cacttgtttg aacaacactg taagctttgt gttttcctta attctcaggc 105480 taaataaaaa ggaagctgtt tacttgctgt tgcaagaaga gctgcgacgt gagaaagagc 105540 ttcgcaaaaa acttgaagct gaggtataaa ttctactctt taacattttt actgtgtctg 105600 cttgcaaacc tataagcaac aatcagttag tcaccaatgg atgattcctc tttggtattg 105660 ttaggttcaa agaacaaaag acgagttaga agacgtgaag aaagagcaag agagtttaat 105720 cgacatattc tcagaggata gagacagacg cgacaaggag gaagaagatc tcagaaataa 105780 gctagaggtt ccttctttct tcttatcacc tttctctact aaatcttctc tcagattcag 105840 gaaatgtaaa ctttttcttg tggttgcagg aggcgtcaaa gaggatccaa gcgttgttag 105900 atgaaaaatc ccgagggaga cgctagaggt ctggagctag ctcggaagga tagtcactgc 105960 atggaggagg ataccattga ctcgtttagt tttttttt 105998 <210> 3 <211> 59642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 gtagataaca aaataaaact agtggttaat agacaaaata atatatatat atatatatat 60 atatatatat atctatggtt tgttattttc tgtaaatttt tagtttttct aaaacaaatg 120 atataaaaat aataaagatt tattttaaat tttggttttt tattttagtg tagttttagt 180 ctaaatatat tttataactt tggtaaaaat gtataatttt ttgtaattta aatattatat 240 aataaaatta aaagctgatt taaaaaaaaa ttccagtgta ataaatgtat aatacttata 300 actaaagaaa ttatttaact tttctttaag atttatggta tacatattga ctaaaaatta 360 taaattaact tacataaaaa ttaaaattac ttaattcata gagaagatta ttatttgtaa 420 gtttttttgt ttgttttcta gaagggcaga tataattata tatatgaaaa attaatttct 480 tgaaagaaaa tgaagtcagt cgtttggaaa ccacaaaagc acataaaaag tggattttgg 540 tttctatgta taaaatagtg taggagttga aaaactgggt tcccaaaaat acagggaatc 600 tgttttagtt aaatcttgat tgggtaaaaa gtagctttta gtgtctccgc tggtatcggt 660 ctttctcgtt ttttgggtgt aaaatgttaa gaaaaatgtt tggaaaaact gcggtgagcg 720 tgtcattctc attttgttat agaacaaaac ttaggttcac tctctagact ggatttttaa 780 attcaccaca tctcctatca ctaatcaaat tgttacctag ataaataata aaaatattat 840 ttttaaaaga acaaatctaa aataatagaa aaataataat gacgtcaatt ttaatgacgt 900 taacgccgtt atctaaaccc taaaccctaa atcttaaact tcaaacctta aatttaaatc 960 ttaaaatgta aatctaaacc ctaaacctta aactctaaaa ccaaacccta taccctaaac 1020 cttggatcct aaactcaaat cgtaaatcct aaacctaaac cctataccat aaaggtttga 1080 gttaatgttg atgtttttct tttagggttt aaggtttggg tttaaggcct aggatttggg 1140 tttatggtct aggatttaag tttagagttt acgatttgga tttagggtct aggatttagg 1200 tttagggtat atgatttggg tttcaagtct agagtttggg tttagaattt aggttgaggg 1260 tatatgattt cggtttcaag tctagagttt gggtttagaa tttagggtat agtatttggg 1320 tttaggggtt aggatttaga tttaaggttt agaatttagg gtttaaaatt taggatgagt 1380 tttgttagtg gtgttaacgt tattaaaatt ggcaatcatt attttttatt attattttaa 1440 tttttataaa aaaatattaa taatattttt attaatttag gtggtacttt gattagtgat 1500 aagagttgtg gtgaattagg atgaaccaaa attttgttct ttgttatata ctagtggcaa 1560 acccccgcgg agctttgatt taagttgttc tatttatcct gaagtgtata atagtatgac 1620 aaatgtgtat cgtattcatg gtagcatatg ccactctcga gctctgaatg agaatgaaaa 1680 ttttctcgaa aacattgatg aattgatata tgtgagagct tgttagcttg acaatttagc 1740 aatataagaa tgttattatc agccttcatt tcatttttat agtgaaagaa agaatatgaa 1800 cggtaattag caataaagaa cggttgcgta gtttccaaat aagttttttt ttgtgattct 1860 tgaaaaatac agcgaaacat atctacaatg ctagattaac tttagctcat ggttcaattt 1920 tctggcaaca gttacagcac gagcagaaat ccttaacaaa caaaaataag caaaaccgcc 1980 accaccggtt ctaaccacta aaatgagtat ctcatttttt aaattagacc gtttgataga 2040 attgcataac tgtctaacta agcatttgaa accacatggg tgttctcggt ttcttgatct 2100 ctttctgagc attttgaaat tcaatcttaa aacattgtga ctgagagata ttacttggac 2160 aggagcaaaa gggatatttc cagagctggt tcatatggaa attggcgtat cttactcgag 2220 cccaggggcg gatctactaa gggagtagtg ggatctgacc ccattaaaat gaacaaatag 2280 tttgttttgt ataagaaata ctaaagaatc ttcagctcaa ttgttgttag ttctagttct 2340 gacctctata aattagggtt cagttcccta attgacactt tttcagtata tttttgcaga 2400 tttcttttct tatttagtga catctacagt ccacgtaaca tattattaag aagaatcaaa 2460 gcccatgtaa catttttaaa gcttattaca tttttatata gtgaaaacac tacttattct 2520 ttaaaaatac ggccactata atacactata accccggtaa aaacatttct agatccgcca 2580 ctcctcgagc cattagctag acaaacgagt tatatgtcgc tatcaactgg tttactactt 2640 tcgtctttgg ccgtgacatt ttccgtatct gattgtgttt gattccaagt gttttcttct 2700 tagtttactt tacacggcgt ggtttataca gaagcacaat aacataactc ctgagggtat 2760 ttaaagtttc tatttttatt gaattataaa atattagggg tgtgtgaggt ggtgtatttg 2820 ttgtatttta tgtattttat gtttgttatt attttttgtt atgaaaatgt ttgaaagtac 2880 agttttatat attttttgct atagttaatt gatgttatag gatgatatta tcttatacca 2940 atattttgaa tcccggtccg gatccgcggt tgaaccgata aatccagtaa tccgaatata 3000 attcggtttg agttttatga agaaaccatt atttaaaaac ccaataaaac tcggaactcg 3060 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tacgtttaat acagaatcat aatgcaaaag aatgatattt taagaaaagg caatgtcatg 5640 tacagttagc gaaaggataa gagagggaac aaagtgaact gagaagatta agatataata 5700 atggacaagt gacattgtcg tggctatgtc tttaaaactc atatatggtc tctctttgtt 5760 tggctttatg tccgattccg atttcttatc tacgttcaca tgcataacta ataatagtct 5820 tcataaatat cttctccttt cctcattata atttttttta aatacaaaat cgaatttatt 5880 gggagaatat ttcgtttaga tccgatatct tttctaatta tttatggaac aaacgttatt 5940 ttatattaac tcaaatccac tatatgaatt atgtatgtaa gaacaaatat gaaaggtgag 6000 gatgaatata attaaagact tgatgctaag tttggttaaa caaaactaag tgatggtggt 6060 ttagggggcg actggttttc tcgttaccac ccgcaaacgc agcttttgcg attggtcgcg 6120 gttgtcggcg atttgtaaca attactcaaa tcgctctaaa ccgcttcaaa ccgttccgaa 6180 tctcataaat tcaaaagctg gctccagcta gcatttgcgg ttgcgaacgg ttgcgggagg 6240 gtgaattttt ttttcttttt ttaaaacaat atatatacaa aagtaaaaat gtttaataaa 6300 aaatttaaaa tttaaaattg acattatgaa aatattaaaa tatatctatt atattttaat 6360 taaaataata aaattttata ataaaaacaa tttcaataaa ttttcgaaaa ttaaaattat 6420 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cattggaact cacgtgatcc atcatctttt cccacaaatc 4200 cctcactatc acttggtcga tgccgtgagt gatctagctt tctctctctc tagtttcatt 4260 tgattaaatg gtgattaatt actaatttaa ttaatgaatt gtggacagac gagagcagct 4320 aaacatgtgt taggaagata ctacagagag ccgaagacgt caggagcaat accgattcac 4380 ttggtggaga gtttggtcgc aagtattaaa aaagatcatt acgtcagtga cactggtgat 4440 attgtcttct acgagacaga tccagatctc tacgtttatg cttctgacaa atctaaaatc 4500 aattaacttt tcttcctagc tctattagga ataaacactc cttctctttt acttatttgt 4560 ttctgcttta agtttaaaat gtactcgtga aacctttttt ttattaatgt atttacgtta 4620 caaaaagtgg aagttttgtt atctttttct ctggttgcaa tcaaaagg 4668 <210> 12 <211> 5714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 12 catcgaaccc tttcttcacc acattccagt tcccacactt tctttttttt gaattataga 60 gagagaatct tcctccaaat ctctctctct ctctcccagg atggttgttg ctatggacca 120 acgcaccaat gtgaacgaag atgccggtgc ccggaaggaa gaagggtttg atccgagcgc 180 acaaccgccg tttaagatcg gggacataag ggctgcgatt 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ctattcattg 1080 ctcgttcttt ttttttttgg ctagagccaa ttttataatt aaataatgca tgtgaaagta 1140 tgactatata tgtgaggtag cttttcttat tcttgacgaa aagcatcgaa tctttagcaa 1200 cgaaggaaaa aggaatcaaa acttttatta aatgcaatgg gcctatatct ggtcattagt 1260 attttgaata taatttattt ataatttttt ttgaacaaca gctaatttat ttataattaa 1320 atattcattt tataaataat attaaaccaa ttattaaagg ttagatattt gaagaattat 1380 tcatgacttt gtttattggg aaattactcc ttttatcttt tattcttttc tatttctcta 1440 tttttaatat tgagaaactg acttcaaacc tccaataaaa atggtttcct gtagtaacat 1500 cataattttt tgtttggtaa atgtaacatc atcttcaaat atctttgaaa atagacttac 1560 atgcattatt ttgctgcgac attattgtaa cttattcctg gcaataaaaa taatttatta 1620 ctggaaacta tttttggtca atttattact agtaacttaa aacttaaaag agtgagattg 1680 tttgatcaaa aaaaaagaga aaaaaaatag agtgagattg ttagaatctg ccatgaaagc 1740 aacactatat aggtgatgat tggttcgact gtggccgtag aattttagct gtagataaat 1800 tggttgtagt tgtaaagttg ttactgttga ttatttttgc agagactttt gctgtagtta 1860 aatttgttgt agctgtaagc tataggctgc agatatttta aaataaaata tgtaaaatat 1920 gtgatgcatg tatatataaa ataattatta tttttatcac ttaaaataat ttatattaat 1980 attttttaaa attatcaaag tttactgtta tttaaaatgt gatatgtaaa taatctatat 2040 tatttaaaat atttcaataa tttaaaagca cccaaaatta gagtaaaata tttatagatg 2100 tttttttatt atgattatct tatttattta atattataga tattttttgt tcttacagtt 2160 tctacagctt ataaatgaaa gatgtaagtt gtttaactaa aatacataag aaaaatgttt 2220 ggtttttttt ttgctgtagc tttattttta aagttaaagc atgattggta aaaattaata 2280 gaaatttgat gtagacttta attttgaaaa gtaaacgtaa agcatgattg gtaaagttta 2340 atgatttaga aaaaaataaa gctaaagtag gtagataaaa cccaaccaat cacctccatg 2400 gacaatttaa tttttatgta aacacatatt taataatttg aggctgcagg agaataagcc 2460 atcggacaca ccaccagaac catggccatg ttgaaaacga cgagtcttgg gttccggtaa 2520 catttccctc tttaataatt tctatttttc tttgtcaaaa taatttgttt ttcgaaattt 2580 gaggccagaa cgaccacttg tcagatttga tttctagctg tagtaaaaac agtttgctag 2640 tgtcacagtt aaccggtaat tgattctttt tagcgattta tagaagtaac atttttgtaa 2700 aataaaatat acataatagt atgtgacaac ggaccacgcc tatttgtatc ggtgaatctt 2760 ctaattactt cctccgattt attttagtta cagttttaga tttatacaca tagattacaa 2820 aaaataaaat attttgtcca tttttaaaat aaaaacatca ctaattatac acctaacaat 2880 attttaacca ataaaaaata aactagaaaa tattattcat aatttttaca ttgaaattat 2940 aaaacgatac ttattttaaa acaaaatttt aatttacaac gacaattaaa ttgaaacgga 3000 agaagtttat tattacttaa ttaaagagtt tttttaaaaa aaatgaaaga catgtttatg 3060 cgaaactcat gtgaaagtct ttcaaataaa atattttggt ataaattttt caaattttca 3120 aaaataataa ttataaatta atataatata atttgtgata aaatctcgtc aaaaactcac 3180 taatgcaaat gcttttatat ttgagtttct tactcctcta aatgcattta cttttatact 3240 attattattt tctttctcta atttggtgtt ttcgtaatag tttgcctgtg ttttgaaaac 3300 taacaaaaaa taataaaaac aaaagtttat aaacacatag catgcaatga atatatatat 3360 caatacatat ctaagtacta tttttgcaag tacttaatct tgattactaa aattcatttt 3420 aattgttcct ttcagttacc agaaaagtta tacaagattt taccccacag tactcggatg 3480 ctcagataca ctgtccctct gcccatgctc gcttacccga tctatctggt attttttaat 3540 tcctaaaact taccacaatt cattttagat tgtgttttaa aacaatataa 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gataatattc 4440 tgaagtctca tgcatatata tatataaatt ttacaaaaga actaaattgt aacatttggt 4500 taatatttta cagtaattaa aatattttat aaattctaaa taactttatg tatttaattt 4560 attgaatgga aactgaaatt tattttaaat aatcttaaaa atgaaaacat atttgctttg 4620 gtattttgct tatggttcca ttaagttcta caaacataaa aacataacat ttaaaaactg 4680 tgattatttt gtaactattt gatcaaacaa tgattatttt ttaattttaa ttttagtttt 4740 ttaataactc ttaaaaataa gcagtgaaca aaagtgagat tgtatttgaa attaatatta 4800 tacaagtaaa atataatttt ttaagtttat aaaaaaattc ctttttatta tatgtatatg 4860 tttttttgga aaattttaaa aaggaaacta aataaaaaaa taaataatag tattttaaat 4920 gtaatatttt taattcatta agtgtattag tgtaatcaac tatcgtgaga gttaacgtga 4980 gagcgataca tagaaaaccg acttctcaaa taatatttta tagagattac gatgtttcac 5040 aaaaaaaaat tattagtatt tgattaatct taattcttga tgttttgtga ttaataatag 5100 gaatggagtt acttacgtgg aggattaaca actattgata gagattacgg aattttcaac 5160 aacattcatc acgacattgg aactcacgtg atccatcatc ttttcccaca aatccctcac 5220 tatcacttgg tcgatgctgt gagtcatctc actctctcgc tactttcatc 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Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 56 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgctagcc gtgtattttg atagctggtt 60 c 61 <210> 57 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctctagccc gtgtattttg atagctggtt 60 c 61 <210> 58 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 58 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttagctgg agcttctcag acattcctct 60 <210> 59 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttcagtgt ttatttgccc caagcgagag 60 <210> 60 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcagtcgt ttatttgccc caagcgagag 60 <210> 61 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagtcagt ttatttgccc caagcgagag 60 <210> 62 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 62 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtcaggt ttatttgccc caagcgagag 60 <210> 63 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 63 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtacgac ttcaactact tgctggtcsa 60 t 61 <210> 64 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 64 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttacgtac ttcaactact tgctggtcsa 60 t 61 <210> 65 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 65 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatctacg tacgttcaca ttgstrcgyt 60 gg 62 <210> 66 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatctcgt accgttcaca ttgstrcgyt 60 gg 62 <210> 67 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatctctg acccgatctt aaacggyggt 60 tgt 63 <210> 68 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatcttga cttagctcat ggatctcaaa 60 ggact 65 <210> 69 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatctgac tgtagctcat ggatctcaaa 60 ggact 65 <210> 70 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 70 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatctact gatagctcat ggatctcaaa 60 ggact 65 <210> 71 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 71 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatctgct agttaaatta ccagtcgtgg 60 cc 62 <210> 72 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 72 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatctcta gcttaaatta ccagtcgtgg 60 cc 62 <210> 73 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 73 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatcttag ctcttttttc ttcgatkcta 60 aagatt 66 <210> 74 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 74 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatcttca gtctgtgact ggaccaacga 60 gg 62 <210> 75 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 75 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatctcag tcctgtgact ggaccaacga 60 gg 62 <210> 76 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 76 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatctagt cactgtgact ggaccaacga 60 gg 62 <210> 77 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 77 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatctgtc agctgtgact ggaccaacga 60 gg 62 <210> 78 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 78 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatctgta cgacttacaa tgtaaggaac 60 rccrta 66 <210> 79 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 79 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatcttac gtacttacaa tgtaaggaac 60 rccrta 66 <210> 80 <211> 13462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 80 taaataaaaa ctgatggaag tctgtttctt aagtcaaata catcacagtg atgtggcaac 60 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81 <211> 13462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 81 ggtttctttt ttaatttaat ttattttttt aatcggagaa aaaaattaag aaaccaaaaa 60 acagttttaa tcatggcctc atgttggggt tgagttttat attctgataa gaatcccatc 120 ttaaaaaccc cgttaaacat gctcttacca tctgcttcga aaatgatatg ttattgacaa 180 ttccaatttc atttttatga aaataaaata atagtttatt ttataactga gggtggttgc 240 aggagaataa gccatcggac acaccaccag aaccatggcc atgttgaaaa cgacgagtct 300 tgggttccgg taatctttcc ctctctcata ttttttttct tttttttgaa attctttcat 360 tttaattttc ttaggattct atgtatttat tttaatcaat cctttttcca gtttgaggct 420 aggacgacca cttgtcagat ttgtcgttta gctgtagtaa acaactgatt taaattgttt 480 atagtactgt agttaacttt aacaacggac cacttatatt cgagccattg gcataaaatg 540 attcttctcg aaattcgttt acttttctta gtatttttca attttggagt ttacgtagaa 600 ctaataaaaa gaaaaactta taaacacacc acatgcaatg aataaattcg aatatataac 660 catactgtta aatattaatt tacattttaa tcttaatttt gcattccagt tgccagaaaa 720 attatacaag aatttgtccc 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attacgtcag tgacactggt gatattgtct tctacgagac agatccagat ctctacgttt 13200 atgcttctga caaatccaaa atcaactaac ctttcttcct agctctattt aggaataaaa 13260 cagtcctttg gtttttactt atttctggtt gtttttaagt taaatgtact cgtgaaactt 13320 tttttaatta aatgtattta cattacaaat caagtttttg ttcgttttct ttatgttttt 13380 agttacaata aataaaggtc ttaaaaactt tttgttggtg gggacaaaag aaaaagttcg 13440 actgagagag tcgacaaaat gc 13462 <210> 83 <211> 13462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 83 ttttttaatt taatttattt ttttaatcgg agaaaaaaat taagaaacca aaaaacagtt 60 ttaatcatgg cctcatgttg gggttgagtt ttatattctg ataagaatcc catcttaaaa 120 accccgttaa acatgctctt accatctgct tcgaaaatga tatgttattg acaattccaa 180 tttcattttt atgaaaataa aataatagtt tattttataa ctgagggtgg ttgcaggaga 240 ataagccatc ggacacacca ccagaaccat ggccatgttg aaaacgacga gtcttgggtt 300 ccggtaatct ttccctctct catatttttt ttcttttttt tgaaattctt tcattttaat 360 tttcttagga ttctatgtat ttattttaat caatcctttt tccagtttga ggctaggacg 420 accacttgtc agatttgtcg tttagctgta gtaaacaact gatttaaatt gtttatagta 480 ctgtagttaa ctttaacaac ggaccactta tattcgagcc attggcataa aatgattctt 540 ctcgaaattc gtttactttt cttagtattt ttcaattttg gagtttacgt agaactaata 600 aaaagaaaaa cttataaaca caccacatgc aatgaataaa ttcgaatata taaccatact 660 gttaaatatt aatttacatt ttaatcttaa ttttgcattc cagttgccag aaaaattata 720 caagaatttg tcccacagta cacggatgct cagatacact gtccctctcc ccatgctcgc 780 ttaccctctc tatctggtaa atcctaattc ctaatttttc ttcctgatta taattacaat 840 tttgaatttt tagattttga gtattaacta aatataaatt aaatttgttt ggggatgact 900 acagtggtac agaagtcctg gtaaagaagg gtcacattat aacccataca gtagtttatt 960 tgccccaagc gagagaaagc ttattgcaac ttcaactact ggtaccgcct tttgcagttt 1020 atctctatgc ccgggacaag tggagtccat gctcaacacc gtgcaggatg aggatgacca 1080 ccgcggtagc gacttcgtgg gcgaggaaag cctttcgtcc aaggtggtcc ctcctcgcaa 1140 tcttgttgga tggtgaatat tataaaagcc tgcccttctc gcgggtgttt aaacgtcgac 1200 ctgcaggtca acggatcagg atattcttgt ttaagatgtt gaactctatg 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ttaaagggtg attaattact aaattagtga tcttaattaa tgacatgcga 13020 cagacgaaag cagctaaaca tgtgttggga agatactaca gagaaccaaa gacgtcagga 13080 gcaataccga tccacttagt ggaaagtttg gtggcaagta ttaagaaaga tcattacgtc 13140 agtgacactg gtgatattgt cttctacgag acagatccag atctctacgt ttatgcttct 13200 gacaaatcca aaatcaatta atctttcttc ctagctctat ttaggaataa aacactcctt 13260 tggttttact tatttctggt tgtttttaag ttaaaaatgt actcgtgaaa ctttttttta 13320 ttaaatgtat ttacattaca aatcgtaaaa gtttttgttc gttttctcta tgtttttagt 13380 tacaaactta caatcaaaaa ggtcttaaaa actttttgat ggtgggacgg acaaaagaaa 13440 aagttcgact gagagtcgac aa 13462 <210> 84 <211> 13462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 84 tatatatatt tgttttaatg gcttatttta ttgttaaatg gatacatcag cttgaaatat 60 ctacgaacat gcatcatttt cctagataca tttgtttgtt gctcaaaaaa tgaataacgt 120 agttaaacga gtgagattct tagcatctgc ctcgaaaacg atatgttatt gacaattcca 180 atttcatttt tatgaaaata aaataatagt ttattttata attgggggtg gttgcaggag 240 aataagccat cggacacacc accagaacca tggccatgtt gaaaacgacg agtcttgggt 300 tccggtaatc cccctctcat tatttttttt tctttttttg aaactctttc attttaattt 360 tcttagaatt ctatgtattt attttaatca atcctttttc cagtgtgagg cttggacgac 420 cacttgtcag atttgtcgtt tagctgtagt aaacaactga tttaaattgt ttatggtact 480 gtagttaact ttaacaacgg gccacttata ttcgagccat tggcataaaa tgattcttct 540 cgaaattcgt ttacttttct tagtattttt cagttttgta gtttacgtag aactaataaa 600 aagaaaaaaa cttataaaca caccacatgc aatgaataaa ttcgaatata taaccatact 660 gttaaatatt aattaacatt ttaatcttaa ttttgcattc cagttgccag aaaaattata 720 caagaatttg tcccacagta cacggatgct cagatacact gtccctctcc ccatgctcgc 780 ttaccctctc tatctggtaa atcctaattc ctcatttttc ttcctgatta taattacaat 840 tttgaatttt tagattttga gtattaacta aatataaatt aaatttgttt ggggatgact 900 acagtggtac agaagtcctg gtaaagaagg gtcacattat aacccataca gtagtttatt 960 tgccccaagc gagagaaagc ttattgcaac ttcaactact ggtaccgcct tttgcagttt 1020 atctctatgc ccgggacaag tggagtccat gctcaacacc gtgcaggatg aggatgacca 1080 ccgcggtagc gacttcgtgg gcgaggaaag cctttcgtcc aaggtggtcc ctcctcgcaa 1140 tcttgttgga tggtgaatat tataaaagcc tgcccttctc gcgggtgttt aaacgtcgac 1200 ctgcaggtca acggatcagg atattcttgt ttaagatgtt gaactctatg gaggtttgta 1260 tgaactgatg atctaggacc ggataagttc ccttcttcat agcgaactta ttcaaagaat 1320 gttttgtgta tcattcttgt tacattgtta ttaatgaaaa aatattattg gtcattggac 1380 tgaacacgag tgttaaatat ggaccaggcc ccaaataaga tccattgata tatgaattaa 1440 ataacaagaa taaatcgagt caccaaacca cttgcctttt ttaacgagac ttgttcacca 1500 acttgataca aaagtcatta tcctatgcaa atcaataatc atacaaaaat atccaataac 1560 actaaaaaat taaaagaaat ggataatttc acaatatgtt atacgataaa gaagttactt 1620 ttccaagaaa ttcactgatt ttataagccc acttgcatta gataaatggc aaaaaaaaac 1680 aaaaaggaaa agaaataaag cacgaagaat tctagaaaat acgaaatacg cttcaatgca 1740 gtgggaccca cggttcaatt attgccaatt ttcagctcca ccgtatattt aaaaaataaa 1800 acgataatgc taaaaaaata taaatcgtaa cgatcgttaa atctcaacgg ctggatctta 1860 tgacgaccgt tagaaattgt ggttgtcgac gagtcagtaa taaacggcgt caaagtggtt 1920 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ctttgagttt ctttagagct tgtgagggat tagtaagtaa caatgcttga gttttttgct 2820 gctgggcttc gaaaagtttg tcacttgttg gtttgatcca caaggtcttc ttctccatag 2880 ctactagaca tgttttagct taagattcaa gtttatatat gccttgtgga ttaatcattg 2940 cctgattctt ccgtgtcatc tctgagttta tttagagctt ggaagtggtg tagtaataac 3000 taacaatact cttgataagt tgtagcaatg ctcttgatta gtggatgtaa tatgatgttg 3060 ataagatata tgaggcacag aaccaaaagt ggtgcttcca ctagacccgt ttttagccta 3120 aggttcaagt ttataccttg tagatgtttc tgtattgtct gattcttccc tgtgatattt 3180 gaatttctta gagctttgga agtgatatag gaacaatgct cttgtgtgtt tgtctctatg 3240 aagattatcg ctgtcgtgtt tcatccgagt gtgcgggatt ttttgctgct gggtttagcc 3300 tttcttcaaa aagttattac ttgttagttt tattgttttg gtcttgataa gagatgttag 3360 gacagacatg gtgcttcttg tctatagcca ctagacctat tttagcataa ggttaacgaa 3420 attctctcta cataccttgt ggatttgttt acattgcctg atctttcctg tgatcgctgt 3480 catgtttctt tggaatgatt gatgtttata aatggaaaaa tctttgtgca gaagactccc 3540 gcccatctct ctatgcccgg gacaagtgcc accccacagt ggggcaggat gaggatgacc 3600 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gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attgaattcg agctcggtac cggggacaac 120 tttgtataga aaagttgggt ggtttaaact atgtattaca ccataatatc gcactcagtc 180 tttcatctac ggcaatgtac cagctgatat aatcagttat tgaaatattt ctgaatttaa 240 acttgcatca ataaatttat gtttttgctt ggactataat acctgacttg ttattttatc 300 aataaatatt taaactatat ttctttcaag atatcattct ttacaagtat acgtgtttaa 360 attgaatacc ataaattttt atttttcaaa tacatgtaaa attatgaaat gggagtggtg 420 gcgaccgcaa gcacacttca attcctataa cggaccaaat cgcaaaaatt ataataacat 480 attatttcat cctggattaa aagaaagtca ccggggatta ttttgtgacg ccgattacat 540 acggcgacaa taaagacatt ggaaatcgta gtacatattg gaatacactg attatattag 600 tgatgaatac atactttaat atccttacgt aggatcaaca tatcttgtta caatcggaca 660 cttttgcttc atcccgctaa cacctctgca ccttagacca agcgcttcca caaggaactg 720 agagccatag cccacctcac cttgggttcc tttggccgcc tgtctttctg aaagagagcc 780 ttgcccaccg caactatttc aacacagata ggatcaaccc gggatggcgc taagaagcta 840 ttgccgccga tcttcacttc ttggctctag gtctagtaga aggccttctg tttccagaat 900 cagcgagaac 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gccaagcaag ctcatcatag gctgatcgag gaggtgtata atcatgaggc 8700 caacggcggg cttattcttg agggaggatc cacctcgttg ctcaactgca tggcgcgaaa 8760 cagctattgg agtgcagatt ttcgttggca tattattcgc cacaagttac ccgaccaaga 8820 gaccttcatg aaagcggcca aggccagagt taagcagatg ttgcaccccg ctgcaggcca 8880 ttctattatt caagagttgg tttatctttg gaatgaacct cggctgaggc ccattctgaa 8940 agagatcgat ggatatcgat atgccatgtt gtttgctagc cagaaccaga tcacggcaga 9000 tatgctattg cagcttgacg caaatatgga aggtaagttg attaatggga tcgctcagga 9060 gtatttcatc catgcgcgcc aacaggaaca gaaattcccc caagttaacg cagccgcttt 9120 cgacggattc gaaggtcatc cgttcggaat gtattagaaa tcaccagtct ctctctacaa 9180 atctatctct ctctattttt ctccagaata atgtgtgagt agttcccaga taagggaatt 9240 agggttctta tagggtttcg ctcatgtgtt gagcatataa gaaaccctta gtatgtattt 9300 gtatttgtaa aatacttcta tcaataaaat ttctaattcc taaaaccaaa atccagtgtt 9360 taaacaagac tcccgcccat ctctctatgc ccgggacaag tggagtccat gctcaacacc 9420 gtgcactagg gacaggattg cattaaggat gaccagttcg taaaggtcct gcggtgtcta 9480 ttgcttttca 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Synthetic primer <400> 109 tgggtaactg gcctaactgg 20 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 110 atgatatgta gacatagtgg g 21 <210> 111 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 111 agggtgtaag gtactagcc 19 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 112 tgttggtgga agaggatacg 20 <210> 113 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 113 atcagcagca gcgatagc 18 <210> 114 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 114 gtggagaaga actacgagct accc 24 <210> 115 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 115 gactcatcgt actctccctt cg 22 <210> 116 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atttgccgcc agcaagaccc gcaaaaacca taccaagata cacacgggcg 960 agaagccctt ccagtgtcga atctgcatgc gtaagtttgc ccgctccgac gccctgaccc 1020 agcatgccca gagatgcgga ctgcggggat cccaacttgt gaaatcagaa ttggaagaga 1080 aaaagtctga gcttagacac aaattgaagt acgttccaca tgaatatatc gaacttatcg 1140 agattgctag gaactcaaca caggacagaa ttttggagat gaaggttatg gagttcttta 1200 tgaaagtgta cggatatagg ggaaagcacc ttggtggttc taggaaacct gatggtgcaa 1260 tctacactgt gggatcacct attgactatg gtgttatcgt ggatacaaag gcatactctg 1320 gtggatacaa tttgccaatc ggacaagctg acgaaatgca gagatatgtt gaagagaacc 1380 aaactagaaa caaacatatt aatccaaatg aatggtggaa ggtgtatcct tcatctgtta 1440 cagagttcaa attccttttt gtgtctggac actttaaggg taactacaaa gcacagctta 1500 ctaggttgaa ccatattaca aattgcaatg gtgctgtgtt gtcagttgaa gagcttttga 1560 tcggaggtga aatgattaag gcaggaacac ttactttgga ggaagttaga agaaaattca 1620 acaacggtga aatcaatttt agatctggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat 1680 gcggtgacgt ggaggagaat cccggcccta ggatggctcc aaggaagagg aaggagtcta 1740 acagggagtc agctaggagg tcaaggtaca ggaaggtggg tatccacggg gtacccgccg 1800 ctatggctga gaggcccttc cagtgtcgaa tctgcatgcg taacttcagt cgtagtgaca 1860 ccctgagcac gcacatccgc acccacacag gcgagaagcc ttttgcctgt gacatttgtg 1920 ggaggaaatt tgccgacagg agcagccgca taaagcatac caagatacac acgggatctc 1980 agaagccctt ccagtgtcga atctgcatgc gtaacttcag tcgctccgac gacctgtcca 2040 agcacatccg cacccacaca ggcgagaagc cttttgcctg tgacatttgt gggaggaagt 2100 ttgccgacaa ctccaaccgc atcaagcatg cccagagatg cggactgcgg ggatcccaac 2160 ttgtgaaatc agaattggaa gagaaaaagt ctgagcttag acacaaattg aagtacgttc 2220 cacatgaata tatcgaactt atcgagattg ctaggaactc aacacaggac agaattttgg 2280 agatgaaggt tatggagttc tttatgaaag tgtacggata taggggaaag caccttggtg 2340 gttctaggaa acctgatggt gcaatctaca ctgtgggatc acctattgac tatggtgtta 2400 tcgtggatac aaaggcatac tctggtggat acaatttgcc aatcggacaa gctgacgaaa 2460 tgcagagata tgttgaagag aaccaaacta gaaacaaaca tattaatcca aatgaatggt 2520 ggaaggtgta tccttcatct gttacagagt tcaaattcct ttttgtgtct ggacacttta 2580 agggtaacta caaagcacag cttactaggt tgaaccatat tacaaattgc aatggtgctg 2640 tgttgtcagt tgaagagctt ttgatcggag gtgaaatgat taaggcagga acacttactt 2700 tggaggaagt tagaagaaaa ttcaacaacg gtgaaatcaa tttttgataa ctcgagctcg 2760 gtcaccagca taatttttat taatgtacta aattactgtt ttgttaaatg caattttgct 2820 ttctcgggat tttaatatca aaatctattt agaaatacac aatattttgt tgcaggcttg 2880 ctggagaatc gatctgctat cataaaaatt acaaaaaaat tttatttgcc tcaattattt 2940 taggattggt attaaggacg cttaaattat ttgtcgggtc actacgcatc attgtgattg 3000 agaagatcag cgatacgaaa tattcgtagt actatcgata atttatttga aaattcataa 3060 gaaaagcaaa cgttacatga attgatgaaa caatacaaag acagataaag ccacgcacat 3120 ttaggatatt ggccgagatt actgaatatt gagtaagatc acggaatttc tgacaggagc 3180 atgtcttcaa ttcagcccaa atggcagttg aaatactcaa accgccccat atgcaggagc 3240 ggatcattca ttgtttgttt ggttgccttt gccaacatgg gagtccaagg tt 3292 <210> 274 <211> 3475 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 274 ccagaaggta attatccaag 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cacgggcgag aagcccttcc 900 agtgtcgaat ctgcatgcgt aacttcagta cctccggctc cctgtcccgc cacatccgca 960 cccacaccgg cgagaagcct tttgcctgtg acatttgtgg gaggaaattt gcccagtccg 1020 gcaacctggc ccgccatgcc cagagatgcg gactgcgggg atcccaactt gtgaaatcag 1080 aattggaaga gaaaaagtct gagcttagac acaaattgaa gtacgttcca catgaatata 1140 tcgaacttat cgagattgct aggaactcaa cacaggacag aattttggag atgaaggtta 1200 tggagttctt tatgaaagtg tacggatata ggggaaagca ccttggtggt tctaggaaac 1260 ctgatggtgc aatctacact gtgggatcac ctattgacta tggtgttatc gtggatacaa 1320 aggcatactc tggtggatac aatttgccaa tcggacaagc tgacgaaatg cagagatatg 1380 ttgaagagaa ccaaactaga aacaaacata ttaatccaaa tgaatggtgg aaggtgtatc 1440 cttcatctgt tacagagttc aaattccttt ttgtgtctgg acactttaag ggtaactaca 1500 aagcacagct tactaggttg aaccatatta caaattgcaa tggtgctgtg ttgtcagttg 1560 aagagctttt gatcggaggt gaaatgatta aggcaggaac acttactttg gaggaagtta 1620 gaagaaaatt caacaacggt gaaatcaatt ttagatctgg cggcggagag ggcagaggaa 1680 gtcttctaac atgcggtgac gtggaggaga atcccggccc 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660 cttggagaga tttcatctgc gctatcgctg atcctcatgt ttaccattgg cagaccgtta 720 tggatgatac cgtttctgct tctgttgctc aagctcttga tgagcttatg ctttgggctg 780 aggattgtcc tgaggttaga catcttgttc acgctgattt cggatctaac aacgttctca 840 ccgataacgg aagaatcacc gctgttatcg attggtctga ggctatgttc ggagattctc 900 aatacgaggt ggccaacata ttcttttgga ggccttggct tgcttgtatg gaacaacaga 960 ctagatactt cgagagaagg catcctgagc ttgctggatc tcctagactt agagcttaca 1020 tgcttaggat cggacttgat cagctttacc agtctctcgt tgatggaaac ttcgatgatg 1080 ctgcttgggc tcagggaaga tgtgatgcta tcgttagatc tggtgctgga actgttggaa 1140 gaactcaaat cgctagaaga tctgctgctg tttggactga tggatgtgtt gaagttctcg 1200 ctgattctgg aaacagaagg ccttctacta gacctagagc caagaagtga agatcggcgg 1260 caatagcttc ttagcgccat cccgggttga tcctatctgt gttgaaatag ttgcggtggg 1320 caaggctctc tttcagaaag acaggcggcc aaaggaaccc aaggtgaggt gggctatggc 1380 tctcagttcc ttgtggaagc gcttggtcta aggtgcagag gtgttagcgg gatgaagcaa 1440 aagtgtccga ttgtaacaag atatgttgat cctacgtaag gatattaaag tatgtattca 1500 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 277 gcccaaggaa cccttttctg ggccatcttc gtactcggcc acgactggta atttaatgga 60 tccaaccgac aaccactttg cggacttcct ttcaagagaa ttcaataagg ttaattccta 120 attgaaatcc gaagataaga ttcccacaca cttgtggctg atatcaaaag gctactgcct 180 atttaaacac atctctggag actgagaaaa tcagacctcc aagcatgaag aagcctgagc 240 ttactgctac ttctgttgag aagttcctca tcgagaagtt cgattctgtg tctgatctta 300 tgcagctctc tgagggtgag gaatcaagag ctttctcttt cgatgttggt ggaagaggat 360 acgttctcag agttaactct tgcgctgacg gattctacaa ggatagatac gtgtacagac 420 acttcgcttc agctgctctc cctatccctg aagttcttga tatcggagag ttctctgagt 480 ctcttaccta ctgtatctca agaagggctc agggtgttac tcttcaagat cttcctgaga 540 ctgagcttcc tgctgttctt caacctgttg ctgaggctat ggatgctatc gctgctgctg 600 atctttctca aacttctgga ttcggacctt tcggtcctca gggaatcgga cagtacacta 660 cttggagaga tttcatctgc gctatcgctg atcctcatgt ttaccattgg cagaccgtta 720 tggatgatac cgtttctgct tctgttgctc aagctcttga tgagcttatg ctttgggctg 780 aggattgtcc tgaggttaga catcttgttc 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Synthetic primer <400> 280 gaaaatctca tatcgaacgt gcgt 24 <210> 281 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 281 cgcttaccct ctctatctgg taa 23 <210> 282 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 282 ccttgcctct gtaccaaggc ag 22 <210> 283 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 283 gtgtgtggga atcttatctt cgg 23 <210> 284 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 284 caagtcaggt attatagtcc aagca 25 <210> 285 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 285 caagaatatc ctgatccgtt gac 23 <210> 286 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 286 tggcagttga 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 293 cttgcctctg taccaaggca acttc 25 <210> 294 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 294 cttacatgct taggatcgga cttg 24 <210> 295 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 295 agttccagca ccagatctaa cg 22 <210> 296 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 296 ccctgagccc aagcagcatc atcg 24 <210> 297 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 297 cggagagggc gtggaagg 18 <210> 298 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 298 ttcgatttgc tacagcgtca ac 22 <210> 299 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 299 aggcaccatc gcaggcttcg ct 22 <210> 300 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 300 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatctt cgtactcggc 60 cacgactggt aatttaatgg atccactagt aa 92 <210> 301 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 301 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatctt cgtactcggc 60 cacgactggt aatttaatgg atccactagt aa 92 <210> 302 <211> 119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 302 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatcca gtcgtggccg 60 agtacgaaga tggcccagat actcggccac gactggtaat ttaatggatc cactagtaa 119 <210> 303 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 303 ttctggcctc 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307 tccaaggttg cggccgcgcc caaggaaccc ttttctgggc cattactcgg ccacgactgg 60 taatttaatt ttcaatttat tt 82 <210> 308 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 308 tccaaggttg cggccgcgcc caaggaaccc ttttctgggc catttactcg gccacgactg 60 gtaatttaat tttcaattta ttt 83 <210> 309 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 309 cgtactcggc cacgactggt aatttaattt tcaatttatt t 41 <210> 310 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 310 tccaaggttg cggccgcgcc caaggaaccc ttttctgggc catcttcgta ctcggccacg 60 actggtaatt taattttcaa tttattt 87 <210> 311 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 311 tccaaggttg cggccgcgcc caaggaaccc ttttctgggc catcttctgg taatttaatt 60 ttcaatttat tttt 74 <210> 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 320 aggtaattta atggatccac tagtaa 26 <210> 321 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 321 tccaaggttg cggccgcagc gagagaaagc ttattgcaac ttcaactact tgctggtcga 60 tcgtgttggc cactcttgtt tatctatca 89 <210> 322 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 322 tccaaggttg cggccgcagc gagagaaagc ttattgcaac ttcaacttgc tggtcgatcg 60 tgttggccac tcttgtttat ctatca 86 <210> 323 <211> 149 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 323 tccaaggttg cggccgcgcg ccgacccagc tttcttgtac aaagttggca ttataagaaa 60 gcattgctta tcaatttgtt gcaacgaaca ggtcactatc agtcaaaact tgctggtcga 120 tcgtgttggc cactcttgtt tatctatca 149 <210> 324 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 324 tccaaggttt gcggccgcag cgagagaaag cttattgcaa cttcacttgc tggtcgatcg 60 tgttggccac tcttgtttat ctatca 86 <210> 325 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 325 tccaaggttg cggccgcagc gagagaaagc ttattgcaac ttcagataaa agttgctcgc 60 ctgtgtgggt gtggatgcta cttgctggtc gatcgtgttg gccactcttg tttatctatc 120 a 121 <210> 326 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 326 tccaaggttg cggccgcagc gagagaaagc ttattgcaac ttcaactaca ctacttgctg 60 gtcgatcgtg ttggccactc ttgtttatct atca 94 <210> 327 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 327 tccaaggttg cggccgcagc gagagaaagc ttattgcaac ttcaactact tgctggtcga 60 tcgtgttggc cactcttgtt tatctatca 89 <210> 328 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 328 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatctt cgtactcggc 60 cacgactggt aatttaatgg atccaaccga caaccactt 99 <210> 329 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (38)..(40) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 329 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga accctttnnn tactcggcca cgactggtaa 60 tttaatggat ccaaccgaca accactt 87 <210> 330 <211> 245 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (43)..(195) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 330 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct ggnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnntcgta ctcggccacg actggtaatt taatggatcc aaccgacaac 240 cactt 245 <210> 331 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 331 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gg 42 <210> 332 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (50)..(419) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 332 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatctn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc 420 ggccacgact ggtaatttaa tggatccaac cgacaaccac tt 462 <210> 333 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (48)..(83) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 333 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntcgtact cggccacgac tggtaattta atggatccaa 120 ccgacaacca ctt 133 <210> 334 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (50)..(127) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 334 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatctn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnn 127 <210> 335 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 335 gtaatacata gcggccgcgc ccaaggaacc cttttctggg ccatcttcgt actcggccac 60 gactggtaat ttaattttca atttattttt tcttcaactt ctta 104 <210> 336 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (45)..(48) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 336 gtaatacata gcggccgcgc ccaaggaacc cttttctggg ccatnnnngc cacgactggt 60 aatttaattt tcaatttatt ttttcttcaa cttctta 97 <210> 337 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (47)..(158) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 337 gtaatacata gcggccgcgc ccaaggaacc cttttctggg ccatctnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnga ctggtaattt aattttcaat 180 ttattttttc ttcaacttct ta 202 <210> 338 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (47)..(158) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 338 gtaatacata gcggccgcgc ccaaggaacc cttttctggg ccatctnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnga ctggtaattt aattttcaat 180 ttattttttc ttcaacttct ta 202 <210> 339 <211> 334 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (45)..(278) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 339 gtaatacata gcggccgcgc ccaaggaacc cttttctggg ccatnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngt actcggccac gactggtaat 300 ttaattttca atttattttt tcttcaactt ctta 334 <210> 340 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 340 gtactcggcc acgactggta atttaatttt tctttcaact tctta 45 <210> 341 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (25)..(33) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 341 gtaatacata gcggccgcgc ccaannnnnn nnntactcgg ccacgactgg taatttaatt 60 ttcaatttat tttttcttca acttctta 88 <210> 342 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (45)..(51) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 342 tgtaatacat agcggccgcg cccaaggaac cctttactcg gccannnnnn ntaatttaat 60 tttcaattta ttttttcttc aacttctta 89 <210> 343 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 343 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatctt cgtactcggc 60 cacgactggt aatttaatgg atccaaccga caaccactt 99 <210> 344 <211> 305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (50)..(255) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 344 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatctn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnntcgta ctcggccacg actggtaatt taatggatcc aaccgacaac 300 cactt 305 <210> 345 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (50)..(422) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 345 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatctn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 420 nncggccacg actggtaatt taatggatcc aaccgacaac cactt 465 <210> 346 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (45)..(49) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 346 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggcnnnnnt cggccacgac 60 tggtaattta atggatccaa ccgacaacca ctt 93 <210> 347 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 347 gtaatacata gcggccgcag cgagagaaag cttattgcaa cttcaactac ttgctggtcg 60 atcgtgttgg ccactcttgt ttatctatca ttcctcgttg gtc 103 <210> 348 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (48)..(276) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 348 gtaatacata gcggccgcag cgagagaaag cttattgcaa cttcaacnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnncttg ctggtcgatc gtgttggcca 300 ctcttgttta tctatcattc ctcgttggtc 330 <210> 349 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (48)..(73) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 349 gtaatacata gcggccgcag cgagagaaag cttattgcaa cttcaacnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnntacttgc tggtcgatcg tgttggccac tcttgtttat ctatcattcc 120 tcgttggtc 129 <210> 350 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (48)..(80) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 350 gtaatacata gcggccgcag cgagagaaag cttattgcaa cttcaacnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn acttgctggt cgatcgtgtt ggccactctt gtttatctat 120 cattcctcgt tggtc 135 <210> 351 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (48)..(64) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 351 gtaatacata gcggccgcag cgagagaaag cttattgcaa cttcaacnnn nnnnnnnnnn 60 nnnncttgct ggtcgatcgt gttggccact cttgtttatc tatcattcct cgttggtc 118 <210> 352 <211> 592 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 352 cgcccaagga acccttttct gggccatggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 60 ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag 120 ggttgagtgg ccgctacagg gcgctcccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa 180 gggcgtttcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc 240 aaggcgatta 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ccaaggaacc cttttctggg 120 ccatgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgattttta accaataggc cgaaatcggc 180 aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtggccg ctacagggcg 240 ctcccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgtttcggtg cgggcctctt 300 cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc 360 cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgagcgcgac gtaatacgac 420 tcactatagg gcgaattggc ggaaggccgt caaggccgca tcaacgagct cgtgcacgcc 480 caaggaaccc ttttctgggc catcccgcgc aattggcgag tttggcgcgg tgtcggtggt 540 ttccggctcg attcgcggcg aaaccatact cggccacgac tggtaattta atggatccaa 600 ccgacaacca ctttgcggac ttcctttcaa gagaattcaa taaggttaat tcctaattga 660 aatccgaaga taagattccc acacact 687 <210> 355 <211> 618 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 355 tgtcgcgaga gacattttct ccgtcgtggc tctggccgtc gccgccgtgt attttgatag 60 ctggttcttc tggcctcttt attgggccgc ccaaggaacc cttttctggg ccaaaaggcc 120 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 180 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 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catgagctac gtcgcgagag acattttctc cgtcgtggct ctggccgtcg ccgccgtgta 60 ttttgatagc tggttcttct ggcctcttta ttgggccgcc caaggaaccc ttttctgggc 120 tacttacgcc agagaaataa ctggctggct gctacaccat gttgccgggc aacgagggag 180 accgtcagta ctcggccacg actggtaatt taatggatcc aaccgacaac cactttgcgg 240 acttcctttc aagagaattc aataaggtta attcctaatt gaaatccgaa gataagattc 300 ccacacactt gtggctgata tcaaaaggct actgcctatt taaacacatc tctggagact 360 gagaaaatca 370 <210> 358 <211> 625 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 358 tgagctacgt cgcgagagac attttctccg tcgtggctct ggccgtcgcc gccgtgtatt 60 ttgatagctg gttcttctgg cctctttatt gggccgccca aggaaccctt ttctgggcca 120 aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 180 tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 240 ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 300 cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 360 ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 420 ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 480 gccactggca gcagccactg gtagtactcg gccacgactg gtaatttaat ggatccaacc 540 gacaaccact ttgcggactt cctttcaaga gaattcaata aggttaattc ctaattgaaa 600 tccgaagata agattcccac acact 625 <210> 359 <211> 597 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 359 cgtcgccgcc gtgtattttg atagctggtt cttctggcct ctttattggg ccgcccaagg 60 aacccttttc tgggccatcg cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 120 atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 180 tagaccgaga tagggttgag tggccgctac agggcgctcc cattcgccat tcaggctgcg 240 caactgttgg gaagggcgtt tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag 300 ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt 360 gtaaaacgac ggccagtgag cgcgacgtaa tacgactcac tatagggcga attggcggaa 420 ggccgtcaag gccacgtgtc ttgtccagag ctcgtgcacg cccaaggaac ccttttctgg 480 gccatcttcg tactcggcca cgactggtaa tttaatggat ccaaccgaca accactttgc 540 ggacttcctt tcaagagaat tcaataaggt taattcctaa ttgaaatccg aagataa 597 <210> 360 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catgagcgga 180 tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 240 aaagtgccac ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt 300 aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag 360 aatagaccca gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg 420 cgcaactgtt gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 480 atgggtcaag tcaggtatta tagtccaagc aaaaacataa atttattgat gcaagtttaa 540 attcagaaat atttcaataa ctgattatat cagctggtac attgccgtag atgaaagact 600 gagtgcgata ttatggtgta atacatagcg gccgcgccca aggaaccctt ttctgggcca 660 tcttcgtact cggccacgac tggtaattta attttcaatt tattttttct tcaacttctt 720 aatttt 726 <210> 362 <211> 296 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 362 tctcaagtca ggtattatag tccaagcaaa aacataaatt tattgatgca agtttaaatt 60 cagaaatatt tcaataactg attatatcag ctggtacatt gccgtagatg aaagactgag 120 tgcgatatta tggtgtaata catagcggcc gcgcccaagg aacccttttc tgggccatct 180 gccacgactg gtaatttaat tttcaattta ttttttcttc aacttcttaa ttttgatatg 240 tttatatgtt tttttcgttt tttgcatcgt ctttgatttc ttgaacgcac gttcga 296 <210> 363 <211> 558 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 363 ctctccaagt caggattata gtccaagcaa aaacataaat ttattgatgc aagtttaaat 60 tcagaaatat ttcaataact gattatatca gctggtacat tgccgtagat gaaagactga 120 gtgcgatatt atggtgtaat acatagcggc cgcagcgaga gaaagcttat tgcaacttca 180 attgaagtgt gcttgcggtc gccaccactc ccatttcata attttacatg tatttgaaaa 240 ataaaaattt atggtattca atttaaacac gtatacttgt aaagaatgat atcttgaaag 300 aaatatagtt taaatattct tgctggtcga tcatgttggc cactattgtt tatctatcaa 360 tcctcgttgg tccagtcaca gttacacaag tctatggtgt tccttacctt gcacgcgcca 420 catatttcat tattatatca ttgctaatat aactcgttct tgacataacg ttttggaaaa 480 ctttcagatc tttgtaatgt ggttggacgc tgtcacgtac ttgcatcatc atggtcacga 540 tgataagttg ccttggta 558 <210> 364 <211> 615 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 364 ggtattatag tccaagcaaa aacataaatt tattgatgca agtttaaatt cagaaatatt 60 tcaataactg attatatcag ctggtacatt gccgtagatg aaagactgag tgcgatatta 120 tggtgtaata catagcggcc gcagcgagag aaagcttatt gcaacttcaa ctacttgctg 180 gtcgatcgtg ttggccactc ggtacctgga gcacaagact ggcctcatgg gccttccgct 240 cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaacgc tcaccggctc 300 cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 360 ctttatccgc ctccatccag tctatcatgt tggccactct tgtttatcta tcattcctcg 420 ttggtccagt cacagttcta aaagtctatg gtgttcctta cattgtaagt ttcatatatt 480 tcattattat atcattgcta atataatttg tttttgacat aaagttttgg aaaaatttca 540 gatctttgta atgtggttgg acgctgtcac gtacttgcat catcatggtc acgatgataa 600 gttgccttgg tacag 615 <210> 365 <211> 364 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 365 tggcttggag gtctgatttt ctcagtctcc agagatgtgt ttaaataggc agtagccttt 60 tgatatcagc cacaagtgtg tgggaatctt atcttcggat ttcaattagg aattaacctt 120 attgaattct cttgaaagga agtccgcaaa gtggttgtcg gttggatcca ttaaattacc 180 agtcgtggcc gagtagtctg ttgttccata caagcaagcc aaggccgtac tcggccacga 240 ctggtaattt aattttcaat ttattttttc ttcaacttct taattttgat acgtttatat 300 gtttttttcg ttttttgcat cgtctttgat ttcttgaacg cacgttcgat tgtagatttt 360 cgca 364 <210> 366 <211> 500 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 366 tatctggtaa atcctaattc ctcatttttc ttcctgatta taattacaat tttgaatttt 60 tagattttga gtattaacta aatataaatt aaatttgttt ggggatgact acagtggtac 120 agaagtcctg gtaaagaagg gtcacattat aacccataca gtagtttatt tgccccaagc 180 gagagaaagc ttattgcaac tgaccatgtt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact 240 ggaaagcggg cagtgagcgg aaggcccatg aggccagtct tgtgctccag gtaccgagtg 300 gccaacacga tcgaccagca agtagttgaa gttgcaataa gctttctctc gctgcggccg 360 ctatgtatta caccataata tcgcactcag tctttcatct acggcaatgt accagctgat 420 ataatcagtt attgaaatat ttctgaatta aacttgcatc aataaattta tgtttttgct 480 tggactataa tccctgactt 500 <210> 367 <211> 375 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 367 gcagtagcct tttgatatca gccacaagtg tgtgggaatc ttatcttcgg atttcaatta 60 ggaattaacc ttattgaatt ctcttgaaag gaagtccgca aagtggttgt cggttggatc 120 cattaaatta ccactacttg ctggtcgatc atgttggcca ctcttgttta tctatcattc 180 ctcgttggtc cagtcacagt tctaaaagtc tatggtgttc cttacattgt aagtttcata 240 tatttcatta ttatatcatt gctaatataa tttgtttttg acataaagtt ttggaaaaat 300 ttcagatctt tgtaatgtgg ttggacgctg tcacgtactt gcatcatcat ggtcacgatg 360 ataagttgcc ttgga 375 <210> 368 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 368 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatctt cgtactcggc 60 cacgactggt aatttaatgg atccaaccga caaccactt 99 <210> 369 <211> 536 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (48)..(489) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 369 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 420 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 480 nnnnnnnnnt actcggccac gactggtaat ttaatggatc caaccgacaa ccactt 536 <210> 370 <211> 504 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (49)..(454) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 370 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatcnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 420 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnntcgtac tcggccacga ctggtaattt 480 aatggatcca accgacaacc actt 504 <210> 371 <211> 504 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (49)..(454) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 371 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatcnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 420 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnntcgtac tcggccacga ctggtaattt 480 aatggatcca accgacaacc actt 504 <210> 372 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 372 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccattac tcggccacga 60 ctggtaattt aatggatcca accgacaacc actt 94 <210> 373 <211> 530 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (49)..(483) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 373 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatcnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 420 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 480 nnntactcgg ccacgactgg 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<223> a, c, t, g, unknown or other <400> 379 gtaatacata gcggccgcag cgagagaaag cttattgcaa cttcaannnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnncttgctg gtcgatcatg ttggccactc ttgtttatct atcattcctc gttggtc 237 <210> 380 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (48)..(109) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 380 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccatnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt actcggccac 120 gactggtaat ttaatggatc caaccgacaa ccactt 156 <210> 381 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (47)..(424) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 381 ttctggcctc tttattgggc cgcccaagga acccttttct gggccannnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 420 nnnntactcg gccacgactg gtaatttaat ggatccaacc gacaaccact t 471 <210> 382 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 382 gtaatacata gcggccgcgc ccaaggaacc cttttctggg ccatcttcgt actcggccac 60 gactggtaat ttaattttca atttattttt tcttcaactt ctta 104 <210> 383 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 383 gtaatacata gcggccgcag cgagagaaag cttattgcaa cttcaactac ttgctggtcg 60 atcgtgttgg ccactcggta cctggagcac aagactggcc tca 103

Claims (21)

  1. DNA-결합 도메인이 세포 중의 지방산 데새투라제 3(FAD3) 유전자 내 표적 부위에 결합함으로써 FAD3 유전자에서 파단을 생성할 수 있도록, 세포 내로 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인 및 DNA-결합 도메인을 포함하는 뉴클레아제 또는 이 뉴클레아제를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함하는, 식물 세포의 게놈을 변형하는 방법으로서, 상기 표적 부위는 서열 20-23, 서열 25-38, 서열 40-45, 서열 47 및 서열 49 중 어느 하나를 포함하고;
    여기서 관심 핵산 서열은 뉴클레아제에 의해 절단 후 FAD3 유전자에 통합되며, 여기서 식물 세포는 전체 식물이 아닌 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, FAD3 유전자가 하기 FAD3 유전자 중 하나 이상인 것인 방법: FAD3A, FAD3A', FAD3A", FAD3C, FAD3C" 및 FAD3C'.
  3. 제2항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드가 식물 세포의 유전자로부터 결실되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, DNA-결합 도메인이 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인, 류신 지퍼 DNA-결합 도메인, 전사 활성화제-유사 이펙터(TALE) DNA-결합 도메인, CRISPR-Cas 뉴클레아제 시스템의 단일 가이드 RNA, 레콤비나제, 아연 핑거 단백질 DNA-결합 도메인 및 상기 DNA-결합 도메인의 키메라 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인이 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제로부터의 절단 절반-도메인, FokI 엔도뉴클레아제로부터의 절단 절반-도메인, StsI 엔도뉴클레아제로부터의 절단 절반-도메인 및 귀소성 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 아연 핑거 뉴클레아제가 3 내지 6개의 아연 핑거 도메인을 포함하고, 각각의 아연 핑거 도메인은 인식 나선 영역을 포함하며, 여기서 아연 핑거 단백질은 하기 표의 단일 열로 정리하여 나타낸 인식 나선 영역을 포함하는 것인 방법.
    Figure 112020009968479-pct00097

    Figure 112020009968479-pct00098
  8. 제1항에 있어서, 하기 유전자 중 하나 이상이 절단되는 것인 방법: FAD3A, FAD3A', FAD3A", FAD3C, FAD3C" 및 FAD3C'.
  9. 제1항에 있어서, 식물 세포가 단자엽 식물 세포 또는 쌍자엽 식물 세포인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 식물 세포가 브라시카(Brassica) 종; 브라시카 나푸스(Brassica napus); 브라시카 라파(Brassica rapa); 브라시카 주엔세아(Brassica juencea); 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea); 브라시카 니그라(Brassica nigra); 제아(Zea) 종; 제아 메이스(Zea mays); 글리신(Glycine) 종; 글리신 맥스(Glycine max); 트리티쿰(Triticum) 종; 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum); 오리자(Oryza) 종; 오리자 사티바(Oryza sativa); 트리티케일(Triticale) 종; 트리티케일 트리티쿰(Triticale triticum); 헬리안테아에(Heliantheae) 종; 헬리안테아에 헬리안투스(Heliantheae helianthus); 고시피움(Gossypium) 종; 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum); 및 호르데움 불가르(Hordeum vulgar)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 관심 핵산 서열이 DNA-결합 도메인의 표적 부위, 하나 이상의 살곤충 저항성 유전자, 하나 이상의 제초제 내성 유전자, 하나 이상의 질소 이용 효율 유전자, 하나 이상의 물 이용 효율 유전자, 하나 이상의 영양 품질 유전자, 하나 이상의 DNA 결합 유전자, 하나 이상의 선택 마커 유전자 및 그의 조합을 포함하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 방법에 따라 변형된 단리된 식물 세포.
  13. 서열 20-23, 서열 25-38, 서열 40-45, 서열 47 및 서열 49로 이루어진 군으로부터 선택된 FAD3 유전자 내 핵산 표적 부위에 결합하는 아연 핑거 단백질 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인을 포함하는, FAD3 유전자를 절단하는 부위-특이적 아연 핑거 뉴클레아제로서, 아연 핑거 뉴클레아제가 3 내지 6개의 아연 핑거 도메인을 포함하고, 각각의 아연 핑거 도메인은 인식 나선 영역을 포함하며, 여기서 아연 핑거 단백질은 하기 표의 단일 열로 정리하여 나타낸 인식 나선 영역을 포함하는 것인 아연 핑거 뉴클레아제.
    Figure 112020009968479-pct00099

    Figure 112020009968479-pct00100
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