CN111378721B

CN111378721B - 凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记及其筛选

Info

Publication number: CN111378721B
Application number: CN202010300905.6A
Authority: CN
Inventors: 赵永贞; 杨春玲; 刘青云; 李强勇; 陈晓汉; 彭敏; 曾地刚; 陈秀荔; 朱威霖
Original assignee: Guangxi Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Guangxi Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2020-04-16
Filing date: 2020-04-16
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2040-04-16
Also published as: CN111378721A

Abstract

本发明公开了凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记及其筛选，通过将凡纳滨对虾进行亚硝酸盐氮胁迫实验，留取存活和死亡的凡纳滨对虾的肝胰腺作为样本，再用样本作为模板进行PCR扩增，并将扩增片段测序，得到肝胰腺DNA基因的部分序列以及测序峰图，将序列结果进行BLACT比对，筛选出碱基突变位点即SNP位点，再利用Seqman软件对测序的峰图进行基因分型分析，用SPSS19.0软件的卡方检验对凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮与基因型间的相关性进行分析，得到与凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮显著相关的SNP标记，该标记用于凡纳滨对虾的选择育种，可以准确、高效地选择出具有耐亚硝酸盐氮性状的凡纳滨对虾进行规模养殖。

Description

凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记及其筛选

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记及其筛选。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾，属于甲壳纲、十足目、对虾科、对虾属、滨对虾亚属，原产于美洲太平洋沿岸海域，秘鲁南部至墨西哥桑诺拉沿海海域分布较多，以厄瓜多尔最集中。凡纳滨对虾具有个体大、生长快、适应能力强、饲料蛋白需求低、抗病能力强、离水存活时间长和适合长途运输销售等优点；其肉质肥嫩味美，营养丰富，出肉率高达65％，是世界三大优良对虾养殖品种之一。自1988年开始，我国开展了凡纳滨对虾的引进、适应性养殖以及大面积推广工作，进入2000年以后，我国凡纳滨对虾养殖规模逐年扩大，至2013年，仅广东省凡纳滨对虾养殖面积就达到了6.8万公顷，产量达到32.84万吨。

随着养殖水平的不断提高，养殖密度的不断加大，投入的饲料量大,养殖代谢产物积累，水交换量少，环境负荷大，导致水质因子波动频繁，养殖环境稳定性变差，从而影响养殖凡纳滨对虾的健康成长，而且凡纳滨对虾等高档水产品所投喂的饲料蛋白质含量较高，所产生的粪便蛋白质含量较高，水体的负载大都达到或超过饱和程度，在常规微生物的作用下，有机碳源被大量分解，而有机氮源残剩过多，特别在氧气不足的条件，过多的氮源很容易转化为亚硝酸盐和氨氮，给凡纳滨对虾生长造成了有毒环境。

发明内容

针对上述不足，本发明公开凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记及其筛选，可以快速筛选出凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的SNP标记，用于选育具有耐亚硝酸盐氮性状的凡纳滨对虾品种。

本发明是采用如下技术方案实现的：

凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记，所述分子标记包括SNP分子标记A、SNP分子标记B和SNP分子标记C中任一个；

所述SNP分子标记A是如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，其中自5’端起第169位碱基中的Y为C或T，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列如下：

TGGAATACATGCTATTTCTYTTTTCGTTCATAGACAAAGGT，150bp～190bp；

所述SNP分子标记B是如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，其中自5’端起第192位碱基中的Y为C或T，SEQ ID NO.2所示核苷酸序列如下：

ACTGGCGGACTTTTTTGTGATCYGAGTTATAGTTCAGATTGGCATTTTCAT，大小为170bp～220bp；

所述SNP分子标记C是如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，其中自5’端起第275位碱基中的Y为C或T，SEQ ID NO.3所示核苷酸序列如下：

GCATTATGGATATCTTCTTGCTTTAYGATTGAAAAAAGTCCGGCCTAACCC，大小为250bp～300bp。

进一步的，凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记的检测引物，其包括用于SNP分子标记A检测的引物对A和用于SNP分子标记B检测的引物对B；所述引物对A为引物SCLF25-2和引物SCLR25-2；所述引物对B为引物SCLF25-5和引物SCLR25-5；所述引物SCLF25-2为SEQ ID NO.4所示序列，引物SCLR25-2为SEQ ID NO.5所示序列，所述引物SCLF25-5为SEQ ID NO.6所示序列，引物SCLR25-5为SEQ ID NO.7所示序列，

SEQ ID NO.4所示序列为CCTTCAGGACAGCGTCAATG；

SEQ ID NO.5所示序列为GAGCATGTCTGACAGGAACCTTC；

SEQ ID NO.6所示序列为TTCTTGAGGCGGCAGGTCT；

SEQ ID NO.7所示序列为TCGCCTTTTTTGGAATACTCT。

上述凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记的筛选方法，其包括如下步骤：

(1)用体积为1000L的塑料圆桶，装入养殖水体为500L，添加药品级的亚硝酸钠并且调节亚硝酸盐氮的浓度为757.18mg/L，然后放入至少30尾凡纳滨对虾进行亚硝酸盐氮胁迫实验，实验过程中不投喂饲料且亚硝酸盐氮的浓度控制在600～757.18mg/L；

(2)亚硝酸盐氮胁迫实验的时间为96小时，实验过程中每隔24小时换新水一次，并重新调节亚硝酸盐氮的浓度为757.18mg/L，当凡纳滨对虾侧翻后用木棍触碰无迅速游走或无明显反应，并且仍然呈侧翻姿势则视为死亡；亚硝酸盐氮胁迫实验结束后，留取存活和死亡的凡纳滨对虾的肝胰腺作为样本，用液氮保存；

(3)用步骤(2)中得到的样本提取DNA，具体是称取样本100mg，加入600μL DNA提取缓冲液浸泡，并用剪刀剪碎样本后加入12μL 20mg/mL蛋白酶K混匀，充分混匀后放人56℃水浴锅中温浴3h；取出冷却至室温，加人200μL/mL7.5mmol/L醋酸铵溶液，颠倒混匀2min，14000r/min离心5min，取上清至另一离心管，加入等体积预冷异丙醇，在-80℃下放置15min，随后14000r/min离心5min，取沉淀用70％乙醇洗涤2～3次，接着自然干燥后，加人100μL灭菌ddH₂O，再加人1μL 10mg/mL胰RNA酶37℃水浴30min，在-20℃下保存备用；将所得到的DNA作为模板，利用如权利要求2所述的引物对A或引物对B进行PCR扩增，获得扩增片段；将扩增片段进行测序，得到肝胰腺DNA基因的部分序列以及测序峰图，将序列结果进行BLACT比对，筛选出碱基突变位点即SNP位点；

(4)利用Seqman软件对测序的峰图进行基因分型分析，若在SNP位点处出现双峰则说明是杂合型，单峰则是纯合子；用SPSS19.0软件的卡方检验对凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮与基因型间的相关性进行分析，得到与凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮显著相关的SNP标记。

进一步的，步骤(3)中所述PCR扩增的扩增反应体系总体积为10ul，并且由以下体积的组分组成：模板1ul、上引物0.2ul、下引物0.2ul、扩增Mix 5ul、余量为超纯水；扩增程序为：94℃预热3min，然后依次94℃30s，60℃30s，72℃40s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。

进一步的，步骤(3)中所述DNA提取缓冲液为10mmol/L Tris-HCl pH＝8.0，100mmol/L EDTA pH＝8.0，2％SDS。

上述凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记的应用，是在凡纳滨对虾的选择育种过程中，对凡纳滨对虾育种候选群体进行SNP位点分型，再结合耐亚硝酸盐氮性状相关位点的分型信息，选择具有耐亚硝酸盐氮性状的凡纳滨对虾进行规模养殖或者作为选育的亲本。

本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：

1.本发明采用合理的亚硝酸盐氮胁迫实验，留取存活和死亡的凡纳滨对虾的肝胰腺作为样本，然后提取样本的DNA作为模板，利用自主设计的特异性引物进行PCR扩增，对扩增片段进行测序、比对和分析，得到与凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮显著相关的SNP标记，进而，通过检测不同育种候选群体的上述SNP标记，能够有效的确定凡纳滨对虾对于亚硝酸盐氮环境的耐受性，辅助选育出优良的凡纳滨对虾品种。

2.采用本发明方法可根据实际育种需求对凡纳滨育种材料进行早期选择，有效提高育种的效率和准确性，提高凡纳滨对虾繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出耐亚硝酸盐氮性强的凡纳滨对虾品种；

3.本发明方法实用性强，可以快速筛选出凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的SNP标记，用于选育具有耐亚硝酸盐氮性状的凡纳滨对虾品种，对基因组DNA提取和测序方法没有特定要求，适用性广。

附图说明

图1是实施例1中所得倒的肝胰腺DNA基因的部分序列中第169位点以及其测序峰图。

图2是实施例2中所得倒的肝胰腺DNA基因的部分序列中第192位点以及其测序峰图。

图3是实施例2中所得倒的肝胰腺DNA基因的部分序列中第275位点以及其测序峰图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：

凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记的筛选方法，其包括如下步骤：

(1)用体积为1000L的塑料圆桶三个，分别装入养殖水体为500L，添加药品级的亚硝酸钠并且调节亚硝酸盐氮的浓度为757.18mg/L，分别放入3个耐亚硝氮选育家系的凡纳滨对虾，每个家系对虾分别为170尾、177尾、150尾，然后进行亚硝酸盐氮胁迫实验，实验过程中不投喂饲料且亚硝酸盐氮的浓度控制在600～757.18mg/L；

(2)亚硝酸盐氮胁迫实验的时间为96小时，实验过程中每隔24小时换新水一次，并重新调节亚硝酸盐氮的浓度为757.18mg/L，当凡纳滨对虾侧翻后用木棍触碰无迅速游走或无明显反应，并且仍然呈侧翻姿势则视为死亡；实验进行到96h时，对比耐亚硝氮家系和敏感性家系对虾死亡死亡时间，并且选取耐亚硝氮组对虾30尾和敏感型对虾30尾的肝胰腺作为样本，用液氮保存；

(3)用步骤(2)中得到的样本提取DNA，具体是称取样本100mg，加入600μL DNA提取缓冲液浸泡，并用剪刀剪碎样本后加入12μL 20mg/mL蛋白酶K混匀，充分混匀后放人56℃水浴锅中温浴3h；取出冷却至室温，加人200μL/mL 7.5mmol/L醋酸铵溶液，颠倒混匀2min，14000r/min离心5min，取上清至另一离心管，加入等体积预冷异丙醇，在-80℃下放置15min，随后14000r/min离心5min，取沉淀用70％乙醇洗涤2～3次，接着自然干燥后，加人100μL灭菌ddH₂O，再加人1μL 10mg/mL胰RNA酶37℃水浴30min，在-20℃下保存备用；然后将所得到的DNA作为模板，利用引物对A进行PCR扩增，获得扩增片段；将扩增片段进行测序，得到肝胰腺DNA基因的部分序列以及测序峰图，将序列结果进行BLACT比对，筛选出碱基突变位点即SNP位点；所述PCR扩增的扩增反应体系总体积为10ul，并且由以下体积的组分组成：模板1ul、上引物0.2ul、下引物0.2ul、扩增Mix 5ul、余量为超纯水；扩增程序为：94℃预热3min，然后依次94℃30s，60℃30s，72℃40s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；所述引物对A是依据对虾的Penaeus vannamei solute carrier family 26member6-like(GeneBank号NW_020870530.1)基因序列，通过Primer Premier 5软件设计得到的，其具体是引物SCLF25-2和引物SCLR25-2，所述引物SCLF25-2为SEQ ID NO.4所示序列，引物SCLR25-2为SEQ ID NO.5所示序列，SEQ ID NO.4所示序列为CCTTCAGGACAGCGTCAATG；SEQ ID NO.5所示序列为GAGCATGTCTGACAGGAACCTTC；

(4)利用SeqMan软件对测序的峰图进行基因分型分析，若在SNP位点处出现双峰则说明是杂合型，单峰则是纯合子；用SPSS19.0软件的卡方检验对凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮与基因型间的相关性进行分析，得到与凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮显著相关的SNP分子标记A，所述SNP分子标记A是如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，其中自5’端起第169位碱基中的Y为C或T，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列如下：TGGAATACATGCTATTTCTYTTTTCGTTCATAGACAAAGGT，150bp～190bp。

实施例2：

(3)用步骤(2)中得到的样本提取DNA，具体是称取样本100mg，加入600μL DNA提取缓冲液浸泡，并用剪刀剪碎样本后加入12μL 20mg/mL蛋白酶K混匀，充分混匀后放人56℃水浴锅中温浴3h；取出冷却至室温，加人200μL/mL 7.5mmol/L醋酸铵溶液，颠倒混匀2min，14000r/min离心5min，取上清至另一离心管，加入等体积预冷异丙醇，在-80℃下放置15min，随后14000r/min离心5min，取沉淀用70％乙醇洗涤2～3次，接着自然干燥后，加人100μL灭菌ddH₂O，再加人1μL 10mg/mL胰RNA酶37℃水浴30min，在-20℃下保存备用；然后将所得到的DNA作为模板，利用引物对A进行PCR扩增，获得扩增片段；将扩增片段进行测序，得到肝胰腺DNA基因的部分序列以及测序峰图，将序列结果进行BLACT比对，筛选出碱基突变位点即SNP位点；所述PCR扩增的扩增反应体系总体积为10ul，并且由以下体积的组分组成：模板1ul、上引物0.2ul、下引物0.2ul、扩增Mix 5ul、余量为超纯水；扩增程序为：94℃预热3min，然后依次94℃30s，60℃30s，72℃40s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；所述引物对B是依据对虾的Penaeus vannamei solute carrier family 26member6-like(GeneBank号NW_020870530.1)基因序列，通过Primer Premier 5软件设计得到的，其具体是引物SCLF25-5和引物SCLR25-5；所述引物SCLF25-5为SEQ ID NO.6所示序列，引物SCLR25-5为SEQ ID NO.7所示序列，SEQ ID NO.6所示序列为TTCTTGAGGCGGCAGGTCT；SEQ ID NO.7所示序列为TCGCCTTTTTTGGAATACTCT；

(4)利用SeqMan软件对测序的峰图进行基因分型分析，若在SNP位点处出现双峰则说明是杂合型，单峰则是纯合子；用SPSS19.0软件的卡方检验对凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮与基因型间的相关性进行分析，得到与凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮显著相关的SNP分子标记B和SNP分子标记C，所述SNP分子标记B是如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，其中自5’端起第192位碱基中的Y为C或T，SEQ ID NO.2所示核苷酸序列如下：

ACTGGCGGACTTTTTTGTGATCYGAGTTATAGTTCAGATTGGCATTTTCAT，大小为170bp～220bp；所述SNP分子标记C是如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，其中自5’端起第275位碱基中的Y为C或T，SEQ ID NO.3所示核苷酸序列如下：

GCATTATGGATATCTTCTTGCTTTAYGATTGAAAAAAGTCCGGCCTAACCC，大小为250bp～300bp。

实施例3：

分别对实施例1和实施例2中得倒的扩增序列进行测序，然后利用SeqMan软件对测序结果进行序列比对，筛选SCL基因的SNP位点，通过查看测序图谱，人工校对判断出每个凡纳滨对虾个体SNP位点的基因型，出现双峰则说明是杂合型，单峰则是纯合型，并统计耐亚硝氮组和敏感组纯合型和杂合型的个体数，两种引物检测到的基因型是TT型，TC型，CC型。引物A检测的1个SNP位点如图1所示，引物B检测的2个SNP位点。

利用SPSS19.0软件的卡方检验方法分析位点169C>T，192C>T及275C>T三个位点与凡纳滨对虾耐亚硝氮的耐受性的关联性，结果表明三个位点的TT、TC和CC这3种不同的基因型的分布与亚硝氮的耐受性存在显著相关(χ²＝6.331,P＝0.036；χ²＝6.510,P＝0.038；χ²＝6.612,P＝0.039)，2种等位基因C和T也在三个位点上显示出于亚硝氮耐受性的关联性(χ²＝6.782,P＝0.09；χ²＝6.772,P＝0.010；χ²＝6.770,P＝0.010)，结果表明SCL基因位点169C>T，192C>T及275C>T的基因型多态性对凡纳滨对虾亚硝氮耐受性有极显著的影响。TT型和TC型个体对亚硝氮的耐受性高于CC型。TT型个体的死亡时间要比TC型的死亡时间长，说明TT型的对虾可优先作为凡纳滨对虾耐亚硝氮选育的亲本。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110> 广西壮族自治区水产科学研究院

<120> 凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记及其筛选

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tggaatacat gctatttcty ttttcgttca tagacaaagg t 41

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

actggcggac ttttttgtga tcygagttat agttcagatt ggcattttca t 51

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gcattatgga tatcttcttg ctttaygatt gaaaaaagtc cggcctaacc c 51

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ccttcaggac agcgtcaatg 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gagcatgtct gacaggaacc ttc 23

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

ttcttgaggc ggcaggtct 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

tcgccttttt tggaatactc t 21

Claims

1.一种凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记的检测引物，其特征在于：包括用于引物对A和引物对B；所述引物对A为引物SCLF25-2和引物SCLR25-2；所述引物对B为引物SCLF25-5和引物SCLR25-5；所述引物SCLF25-2为SEQ ID NO.4所示序列，引物SCLR25-2为SEQ ID NO.5所示序列，所述引物SCLF25-5为SEQ ID NO.6所示序列，引物SCLR25-5为SEQID NO.7所示序列。

2.如权利要求1所述凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记的检测引物的应用，其特征在于：包括如下步骤：

（1）用体积为1000L的塑料圆桶，装入养殖水体为500L，添加药品级的亚硝酸钠并且调节亚硝酸盐氮的浓度为757.18mg/L，然后放入至少30尾凡纳滨对虾进行亚硝酸盐氮胁迫实验，实验过程中不投喂饲料且亚硝酸盐氮的浓度控制在600～757.18mg/L；

（2）亚硝酸盐氮胁迫实验的时间为96小时，实验过程中每隔24小时换新水一次，并重新调节亚硝酸盐氮的浓度为757.18mg/L，当凡纳滨对虾侧翻后用木棍触碰无迅速游走或无明显反应，并且仍然呈侧翻姿势则视为死亡；亚硝酸盐氮胁迫实验结束后，留取存活和死亡的凡纳滨对虾的肝胰腺作为样本，用液氮保存；

（3）用步骤（2）中得到的样本提取DNA，具体是称取样本100mg，加入600 μL DNA提取缓冲液浸泡，并用剪刀剪碎样本后加入12 μL 20 mg/mL蛋白酶K混匀，称取样本100mg，加入600 μL DNA提取缓冲液，剪刀剪碎后加入12 μL 20 mg/mL蛋白酶K，充分混匀后放人56 ℃水浴锅中温浴3 h；取出冷却至室温，加人200 μL/mL 7.5 mmol/L醋酸铵溶液，颠倒混匀2min，14000 r/min离心5 min，取上清至另一离心管，加入等体积预冷异丙醇，在-80 ℃下放置15 min，随后14000 r/min离心5 min，取沉淀用70%乙醇洗涤2～3次，接着自然干燥后，加人100 μL灭菌ddH₂O，再加人1 μL 10 mg/mL胰RNA酶37 ℃水浴30 min，在-20℃下保存备用；将所得到的DNA作为模板，利用如权利要求1所述的引物对A或引物对B进行PCR扩增，获得扩增片段；将扩增片段进行测序，得到肝胰腺DNA基因的部分序列以及测序峰图，将序列结果进行BLAST比对，筛选出碱基突变位点即SNP位点；

（4）利用Seqman软件对测序的峰图进行基因分型分析，若在SNP位点处出现双峰则说明是杂合型，单峰则是纯合子；用SPSS19.0软件的卡方检验对凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮与基因型间的相关性进行分析，得到与凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮显著相关的SNP标记。

3. 根据权利要求2所述凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记的检测引物的应用，其特征在于：步骤（3）中所述PCR扩增的扩增反应体系总体积为10ul，并且由以下体积的组分组成：模板1ul、上引物0.2ul、下引物0.2ul、扩增Mix 5ul、余量为超纯水；扩增程序为：94℃预热 3min，然后依次94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 40s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。

4. 根据权利要求2所述凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记的检测引物的应用，其特征在于：步骤（3）中所述DNA提取缓冲液为10 mmol/L Tris-HCl pH=8.0，100mmol/L EDTA pH=8.0，2% SDS。