CN113846172A - 凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记是如序列表中SEQ ID NO.3序列所示核苷酸序列，其中第88位碱基n为T或C，所述SNP分子标记为T/C颠换类型的SNP标记。本发明的SNP分子标记是通过构建凡纳滨对虾SNP遗传连锁图谱并进行QTL分析获得的，与凡纳滨对虾的耐亚硝酸盐性状紧密连锁，为凡纳滨对虾的遗传育种提供了有效途径。本发明还公开了用于检测凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记的引物组合以及检测方法，用于筛选对耐亚硝酸盐性状有利的凡纳滨对虾基因型个体，辅助选育凡纳滨对虾新品种。

Description

凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于凡纳滨对虾育种技术领域，具体涉及一种凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
亚硝酸盐是对虾养殖池中主要的污染物，对虾直接排泄的氨氮或残饵、粪便等有机物降解成为氨氮，再经氧化生成亚硝酸盐。目前，对虾养殖仍以比较粗放的土池半精养方式为主，池塘养殖条件差，残饵、粪便等养殖废物经过累年养殖沉淀，且未进行足够的整饬和休养，富营养化的底泥未能有效处理，在养殖过程中成为了亚硝酸盐等有害氮的缓释基质；另一方面，因缺乏基于工程化生态养殖模式及配套的高效水质调控技术落后，导致亚硝氮富集，虾塘水质恶化。
大量研究表明，水体中亚硝酸盐超过对虾耐受限度时，可严重影响其呼吸、蜕皮和排泄等正常生理功能，阻碍对虾正常生长发育甚至引起死亡，同时可导致对虾对病原微生物抵抗力的下降，提高对病原的易感性，进而引起疫病大规模的爆发，最终导致养殖失败。凡纳滨对虾养殖业是我国海水养殖业的支柱产业，开展凡纳滨对虾抗逆选育，育成并推广耐亚硝酸盐新品种，可为凡纳滨对虾养殖提供抗逆种质保障，但是现阶段缺少耐亚硝酸盐凡纳滨对虾品种的选育方法。
SNP是在基因组DNA上单个核苷酸的变异所产生的序列多态性。SNP分子标记具有在基因组分布广泛、遗传稳定、便于自动化检测等优点。近年来，虽然SNP分子标记已经被广泛应用于分子标记辅助选择育种技术，用以提高育种效率，缩短育种周期，加快育种进程，但是对于凡纳滨对虾亚硝酸盐耐受性相关的SNP分子标记还未有相关报道。
发明内容
针对上述不足，本发明公开了一种凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记及其应用，利用高通量测序技术，构建凡纳滨对虾高密度SNP遗传连锁图谱，并进行QTL分析，筛选显著的QTL区域内的SNP位点，通过群体验证获得与凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状紧密连锁的SNP分子标记。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记是如序列表中SEQ ID NO.3序列所示核苷酸序列，其中第88位碱基n为T或C，所述SNP分子标记为T/C颠换类型的SNP标记。
一种用于检测凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记的引物组合，其包括以下引物：
引物NITR-ID1-F：gcctgctgag gatgacctta（序列表中SEQ ID NO.1序列）；
引物NITR-ID1-R：agtgttcagc tgactggcac（序列表中SEQ ID NO.2序列）。
上述凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记的应用，具体是所述的凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记在筛选耐亚硝酸盐的凡纳滨对虾亲虾的应用，其中是将从凡纳滨对虾提取得到的基因组DNA作为模板，采用引物NITR-ID1-F和引物NITR-ID1-R进行PCR反应，接着将得到的PCR产物进行测序，当PCR扩增序列的核苷酸序列的第88个碱基为TT纯合基因型时，该凡纳滨对虾的耐亚硝酸盐性状比较强，留选作为备选亲虾；而当PCR扩增序列的核苷酸序列的第88个碱基为TC杂合基因型或CC纯合基因型时，该凡纳滨对虾的耐亚硝酸盐性状比较弱，不留做备选亲虾。
所述的基因组DNA的提取，其是在凡纳滨对虾中挑选生长速度快的对虾作为育种核心群，然后在催熟阶段剪下凡纳滨对虾的眼柄，用DNA提取试剂盒提取得到基因组DNA，再使用浓度为1.25%的琼脂糖凝胶对所述得到的基因组DNA进行电泳检测，取合格的基因组DNA备用。
本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：
本发明提供了与凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状紧密连锁的SNP分子标记，可应用于凡纳滨对虾耐亚硝酸盐新品种分子标记辅助选育。本发明的方法相对于传统育种，大幅缩短了育种周期，减少了育种的成本，对于凡纳滨对虾养殖业的健康发展具有重要意义。
附图说明
图1是实施例1中得到的一个凡纳滨对虾亚硝酸盐耐受性相关的QTL图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记筛选：
（1）采用来自广西水产科学研究院南美白对虾遗传育种中心的凡纳滨对虾建立作图家系；为建立作图家系，父本选自耐硝酸盐相对较强的家系，母本选自耐硝酸盐普通的家系；
（2）父本亲虾和母本亲虾进行人工受精，其后代在池塘中养殖；培养一年后，从后代中随机选择一只雄虾和一只雌虾进行人工授精，将他们的后代被用作作图家系；
（3）从作图家系中随机选择150只虾，放在室内水池中养殖；在整个适应期和实验期间，池水保持通气，pH值保持在8.2±0.3，温度保持在27.0℃，盐度保持在30.0‰，溶解氧维持在7～8毫克/升；所有虾每天以平均体重的5%的比例饲喂颗粒饵料；
（4）在亚硝酸盐胁迫试验前，让虾适应5天，并且将分析纯的NaNO2溶解在过滤的海水中以制备浓缩的亚硝酸盐储备液；然后将所述的亚硝酸盐储备液添加到池水中，使得池水中的亚硝酸盐浓度增加到700mg/L；
（5）每1小时收集死虾，当虾失去平衡躺在水池底部、用木棍触摸时没有反应时被认为已经死亡，记录虾存活时间，存活时间代表亚硝酸盐耐受性；将死虾放入液氮中冷冻，然后转移至超低温冰箱，在-80℃下保存备用；
（6）使用DNA提取试剂盒从上述150只虾和它们的父母本的尾部肌肉中提取DNA；分别使用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行电泳，同时用分光光度计测量每个提取的DNA样品的质量和浓度；然后使用限制性内切酶HaeIII和Hpy166II进行基因组片段化，然后使用T4连接酶将双索引接头连接到片段上，并进行聚合酶链反应(PCR)，再使用凝胶提取试剂盒纯化和收集扩增产物，接着使用Illumina HiSeq系统进行SLAF测序；使用BWA软件将过滤后的SLAF测序原始数据与凡纳滨对虾基因组进行比较，具有>95%同一性且两端与凡纳滨对虾基因组中相同位置匹配的测序数据被认为来自相同的SLAF标记，具有多态性的SLAF标记被用于构建连锁图；
（7）将多态性SLAF标记导入HighMap软件，使用成对对数比值(LOD)检验确定连锁群，使用Kosambi函数计算标记之间的遗传距离，使用R/qtl件包进行QTL分析得到结果，其中SLAF测序产生了262Gb数据，共鉴定出1,079,516个SLAF标记，父本平均测序深度为48.99倍，母本为46.61倍，子代为13.19倍，进一步过滤后，确定了219,463个多态性SLAF标记，使用多态性SLAF标记构建了遗传连锁图谱，图谱标记之间的平均遗传距离为0.4cM；基于遗传连锁图谱和上述实验收集的亚硝酸盐耐受性数据，对亚硝酸盐耐受性状进行了QTL分析，结果鉴定了一个亚硝酸盐耐受性相关的QTL（参见图1）；选择QTL区域中LOD值最大的SLAF标记，根据该SLAF标记的核苷酸序列，设计得到SNP两侧的PCR引物，分别为引物NITR-ID1-F和引物NITR-ID1-R。
凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记的应用，其是将所述SNP分子标记用于筛选对凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状有利的基因型个体，具体包括以下步骤：
（1）在凡纳滨对虾中挑选生长速度快的对虾作为育种核心群，然后在催熟阶段剪下凡纳滨对虾的眼柄，用DNA提取试剂盒提取得到基因组DNA，再使用浓度为1.25%的琼脂糖凝胶对所述得到的基因组DNA进行电泳检测，取合格的基因组DNA备用；
（2）以步骤（1）中得到的基因组DNA作为模板，采用引物NITR-ID1-F和引物NITR-ID1-R
进行PCR反应，所述PCR反应的体系总体积为5.000ul，其包含以下体积的组分：1.850ul的超纯水，0.625ul的1.25X PCR Buffer with 15mM MgCl2 ，0.325ul的1.625mMMgCl2，0.100ul的500uM dNTP Mix，1.000ul的Primer Mix，0.100ul的0.5U/rxn HotStarTaq，1.000ul的浓度为20ng/ul的模板；所述Primer Mix中含有浓度为50uM的引物NITR-ID1-F和浓度为50uM的引物NITR-ID1-R；所述PCR反应的程序为：94°C 5min，45个循环包括94°C 20sec，56°C 30sec，72°C 1min，最后72°C延伸3min；接着将得到的PCR产物用DNA纯化试剂盒进行纯化，然后进行Sanger测序以确定扩增序列的核苷酸序列，当PCR扩增序列的核苷酸序列的第88个碱基为TT纯合基因型时，该组凡纳滨对虾的耐亚硝酸盐性状比较强，留选作为备选亲虾；而当PCR扩增序列的核苷酸序列的第88个碱基为TC杂合基因型或CC纯合基因型时，该组凡纳滨对虾的耐亚硝酸盐性状比较弱，不留做备选亲虾；
（3）将备选亲虾经过生长速度、抗病性等其它性能测试后，通过人工授精或自然授精的方法建立新品种家系。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 广西壮族自治区水产科学研究院
<120> 凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctgctgag gatgacctta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtgttcagc tgactggcac 20
<210> 3
<211> 232
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcctgctgag gatgacctta ttacacaact gaccaaagcc atggaccagg ttcctgaaat 60
cagcgttaag gacacatcac cagaaggngt caccatttca gtggatgatg tagcacccca 120
gacagatgac attgccacac cagacattct gaaggagctt ctggactttg gctggtttga 180
gagtaatgct gaaacacagg aagaaaatca gggtgccagt cagctgaaca ct 232

Claims (3)

1.一种凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记是如序列表中SEQ ID NO.3序列所示核苷酸序列，其中第88位碱基n为T或C，所述SNP分子标记为T/C颠换类型的SNP标记。
2.一种用于检测如权利要求1所述的凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记的引物组合，其特征在于：包括以下引物：
引物NITR-ID1-F：gcctgctgag gatgacctta；
引物NITR-ID1-R：agtgttcagc tgactggcac。
3.一种如权利要求1所述的凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记的应用，其特征在于：所述的凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的SNP分子标记在筛选耐亚硝酸盐的凡纳滨对虾亲虾的应用，其中是将从凡纳滨对虾提取得到的基因组DNA作为模板，采用引物NITR-ID1-F和引物NITR-ID1-R进行PCR反应，接着将得到的PCR产物进行测序，当PCR扩增序列的核苷酸序列的第88个碱基为TT纯合基因型时，该组凡纳滨对虾的耐亚硝酸盐性状比较强，留选作为备选亲虾；而当PCR扩增序列的核苷酸序列的第88个碱基为TC杂合基因型或CC纯合基因型时，该组凡纳滨对虾的耐亚硝酸盐性状比较弱，不留做备选亲虾。
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