KR101845027B1 - 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마이크로새틀라이트 마커군 및 이를 이용한 분석방법 - Google Patents

전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마이크로새틀라이트 마커군 및 이를 이용한 분석방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101845027B1
KR101845027B1 KR1020160118408A KR20160118408A KR101845027B1 KR 101845027 B1 KR101845027 B1 KR 101845027B1 KR 1020160118408 A KR1020160118408 A KR 1020160118408A KR 20160118408 A KR20160118408 A KR 20160118408A KR 101845027 B1 KR101845027 B1 KR 101845027B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
nucleotide sequence
marker
primer
group
Prior art date
Application number
KR1020160118408A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180029802A (ko
Inventor
이제희
완창
이숙경
산자야 바티제
겔샨 이마르샤나 고다헤와
Original Assignee
제주대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제주대학교 산학협력단 filed Critical 제주대학교 산학협력단
Priority to KR1020160118408A priority Critical patent/KR101845027B1/ko
Publication of KR20180029802A publication Critical patent/KR20180029802A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101845027B1 publication Critical patent/KR101845027B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/151—Modifications characterised by repeat or repeated sequences, e.g. VNTR, microsatellite, concatemer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석하는데 유용하게 사용될 수 있는 마이크로새틀라이트 (Mircrosatellite, MS) 마커군, 상기 마커군을 포함하는 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트 및 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석 방법에 관한 것이다.

Description

전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마이크로새틀라이트 마커군 및 이를 이용한 분석방법 {Mircrosatellite marker group for the abalone species distinction, analysis of genetic diversity and parentage profile, and method of analyzing using the same}
본 발명은 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석하는데 유용하게 사용될 수 있는 마이크로새틀라이트 (Mircrosatellite, MS) 마커군, 상기 마커군을 포함하는 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트 및 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석 방법에 관한 것이다.
우리나라의 전복 양식생산량은 중국에 이어 세계 2위로 국내 전복 생산량 및 생산금액, 수출실적은 매년 증가하고 있는 추세이며 전복 먹이인 양질의 다시마와 미역을 대량 공급하는데 유리한 환경이 조성되어있다. 또한, 최근 전 세계적으로 잠재적 시장가치가 큰 양식 산업으로 각광받고 있고, 국내 전복양식 현장에서는 성장성, 내병성에 대한 한계에 직면하여 우량 전복 육종에 대한 수요는 날로 커지고 있다.
주요국의 관련 연구를 살펴보면, 미국의 전복 교잡 연구팀은 H. rufescens, H. sorenseni, H. corrugata의 종간 교잡 또는 역 교배 육종 기술을 이용하여 패각 형질의 개발 예를 보고하고 있고, 중국은 고급 종으로서 참전복 (H. discus hannai, 일본 이와테산)과 둥근전복 (H. discus discus, 중국 대련산 )의 교잡종(hybrid)인 大連1호(Dalian No.1)를 중국과학원해양연구소에서 개발 보급하여 국가 신품종 및 우량 종 승인위원회에서 승인, 국가농업부에서 신품종 인증서를 발급하여 교잡 신품종으로서 확대 보급하여 양식 확산 중이다. 또한, 일본은 Cosmo해양목장주식회사에서 참전복보다 성장이 빠르고, 환경 적응 능력이 뛰어나 사육이 용이한 참전복과 말전복의 교잡종을 양식 전용 품종으로 판매하고 있다. 호주 또한 GSW (Great Southern Waters Pty Ltd.)와 호주연방과학산업연구기구 (CSIRO)와 공동으로 blacklip abalone과 greenlip abalone의 교잡종 (Jade Tiger Abalone, JTA)을 선발 육종 프로그램을 통해 개발하여 수준 높은 연구가 진행되고 있다.
이와 같이 유전자원 수집/관리 및 종자 대량생산 시스템 개발을 목표로 좋은 형질의 전복들의 유전자원을 확보 및 특성을 분석하여 좋은 형질을 보유한 교잡종의 개발이 요구되는 실정이다.
우리나라에 서식하는 대표적인 전복은 둥근전복(까막전복, Haliotis discus discus), 왕전복(Haliotis madaka), 말전복(Haliotis gigantea), 북방전복(참전복, Haliotis discus hannai)의 4종으로서, 패각의 형태와 크기, 생식주기, 서식환경 등으로 구별된다.
그러나 양식장의 환경 악화, 밀식으로 인한 대량 폐사 발생, 종묘 열성화 등의 문제가 발생하면서 전복의 안정적인 생산을 도모하고자 속성장, 내병성의 우량 전복 품종을 개발하기 위해, 상기 4종의 전복의 종간 차이와 유전자 다양성을 간편한 방법으로 정확하게 분석할 수 있는 분자 마커의 개발이 요구되고 있다.
이러한 분자 생물학적 마커의 예로는, 지노믹 DNA (Genomic DNA, gDNA) 중에서 반복 DNA는 카피(copy) 수가 적거나 많은 두 종류로 나누어지며, 대부분은 고도의 반복적인 DNA가 대부분을 차지한다. 이러한 DNA상의 염기들의 구조와 유전체 상에서의 분포도를 분석한 결과, 이러한 부위들의 양말단 부위(flanking region) 들은 개체마다 동일한 DNA 구조로 잘 보존되어 있다는 것이 밝혀지면서 이들 염기 서열을 DNA 마커(marker)로 사용할 수 있으며, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 이용하여 잘 보존된 영역의 염기서열에 상보적인 프라이머 쌍을 이용하여 특정 영역을 증폭시킴으로써 다형성을 구별할 수 있다.
또 다른 반복 염기 서열로는 tandem repeated sequence motif가 있다. 이들 염기 서열은 새틀라이트(satellite) DNA 보다 카피(copy) 수가 적어 미니새틀라이트(minisatellites) 라고도 불리는데 반복 단위가 10 내지 50bp 정도이다. 그리고 마이크로새틀라이트(microsatellite: 미소부수체)는 핵심 염기서열이 반복된다는 점에서 미니새틀라이트(minisatellites)와 비슷하다. 그러나, 전형적인 미니새틀라이트(minisatellites)의 핵심 염기서열이 10개 이상의 염기서열 길이를 가지는 반면, 마이크로새틀라이트에서 핵심 염기서열은 대개 2 내지 6 bp 길이로 훨씬 적은점에서 차이가 있다.
단순 서열 반복체 (SSRs: simple sequence repeats)로도 불리는 마이크로새틀라이트 마커에 대한 연구는 1980년대 인간 게놈 연구에서부터 비롯되었다. 인간의 게놈에는 10만개 이상의 마이크로새틀라이트가 존재하는 것으로 알려져 있으며, 높은 다형성을 나타내므로 혈액형, 동위효소 및 단백질 다형에 비해 비교할 수 없을 만큼 높은 식별력과 정보력을 갖는다. 따라서, 마이크로새틀라이트 마커들은 개인 식별이나 친자 확인 등 법의학적 활용은 물론, 염색체 지도 작성 및 질병 관련 유전자들의 탐색에 매우 유용하게 활용되고 있다.
1992년에 Jean Weissenbach 등은 2개 염기서열 반복을 포함한 814개의 마이크로새틀라이트를 기초로 전체 인간게놈의 연관지도를 만들었다. 마이크로새틀라이트를 포함하는 DNA를 구분할 수 있는 PCR 프라이머(primer)를 디자인하여 분석한 결과 PCR 산물은 한 유전좌에서 하나의 마이크로새틀라이트 내의 반복 수에 따라 각각 다르며 개인에 따라서도 다르게 나타났다. 따라서 마이크로새틀라이트는 고도로 변이(polymorphic)된 것을 알게 되었다. 이러한 점에서 마이크로새틀라이트는 연관지도와 물리적 지도를 위한 마커로 매우 이상적이다.
이러한 마이크로새틀라이트 마커는 인간의 경우뿐 아니라, 식물 또는 동물의 유전 육종이나 질병 및 분자생물학적 연구에 매우 유용한 것으로도 확인되는바, 이를 이용하여 상기 4종의 전복의 종간 차이와 유전자 다양성 및 교잡 대상 종의 모패와 다음 세대인 치패 간의 친자확인 간편한 방법으로 정확하게 분석할 수 있는 마커의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마커 염기서열을 포함하는 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마커군을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마커 염기서열을 포함하는 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마커군의 중합효소연쇄반응용(polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석하는데 유용하게 사용될 수 있는 마이크로새틀라이트 (Mircrosatellite, MS) 마커군, 상기 마커군을 포함하는 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트 및 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석 방법에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다
본 발명의 하나의 양태로서, 본 발명은 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마커군에 관한 것이다.
상기 마커군은 둥근전복, 북방전복, 왕전복 및 말전복의 종을 구별할 수 있는 유전자 또는 이의 단편을 포함하는 것일 수 있다.
상가 마커군은 서열번호 148, 서열번호 149, 서열번호 150, 서열번호 151, 서열번호 152, 서열번호 155, 서열번호 156, 서열번호 159, 서열번호 160, 서열번호 166, 서열번호 167, 서열번호 168 및 서열번호 169 및 서열번호 172로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 마이크로새틀라이트(Mircrosatellite, MS) 마커 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 마커군은 서열번호 166, 서열번호 167, 서열번호 168 및 서열번호 169로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 마커 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 166으로 이루어진 마커 염기서열, 서열번호 167로 이루어진 마커 염기서열, 서열번호 168로 이루어진 마커 염기서열 및 서열번호 169로 이루어진 마커 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 마커군은 서열번호 148, 서열번호 149, 서열번호 150, 서열번호 151, 서열번호 152, 서열번호 155, 서열번호 156, 서열번호 159, 서열번호 160, 서열번호 172로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 마커 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 148으로 이루어진 마커 염기서열, 서열번호 149로 이루어진 마커 염기서열, 서열번호 150로 이루어진 마커 염기서열, 서열번호 151로 이루어진 마커 염기서열, 서열번호 152로 이루어진 마커 염기서열, 서열번호 155로 이루어진 마커 염기서열, 서열번호 156으로 이루어진 마커 염기서열, 서열번호 159로 이루어진 마커 염기서열, 서열번호 160으로 이루어진 마커 염기서열 및 서열번호 172로 이루어진 마커 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
MS 마커 서열번호 서열목록(5'->3') 그룹
JH1 148 GCCTGACAAGACAAACTGATCCATTGGCAGGGTTTTTACTACTACTACTACTACTTCTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTTCTACTATTACTACTACTTATAATAATAATTATATAATATTCATAATCATAATCATGATTATGATGATAATGATTAGTTCAGATATATATGTGCCACATGATATGATATTTTATCAATTTTTttGTCATCATTGTAAACATGTGCTGGTTTTATTTATAACCGGGGCACAGTGTACCGACCTGACCTGT D
JH2 149 CGAGAGTCATACATCATTAGGCCCTTCGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGCATTGAGTACCAGGAAACCGGAGGTT D
JH5 150 ACGCTGGAGGTAGATGGTTTGTAGATATAATTTATTTATTGCGAAGAAGGAAATCATTCAACATATTTTCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACATTTTAAGACGTAAAAGACAATGACCATTTGGCTGCCTTTAGTTGGCGGATCGGTCCACATATAGATATAATTTTCAATATCACTGTTTGATGTGAGCAGCGAG D
JH6 151 CGATGCTGTTGTGCCCTCATAGTACCAAATTGAGCCTTGAATAAGTTATTTGATTTATCTTTTAGTTCATATTGTATTGATATATCTTTTAGTTCATATTTCTTAAAAGTTAAAATAATATTCGAAACCATTATTGAGCACAATTTAATTGTTTTGTCCTTGTTGAaCAATGTTATTGTTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTAACGtATTTCGCTTGTGTTTATTATCAAAGGAAAAGTTTGGGTATTTCGGATACTTATCTTGACTATATTGCCTAGGGT D
JH8 152 CACTGTTACCAAGTCCCATCAAAGGTTCAGAAATAaTTATTGAATAATAAAAaTAAAAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAACAACAGTCTTTGCAGAATATTCTTTTGTATATTCAACCACCTTAAAGAGTTCAGTTATTACAGCAATAGCTCG D
JH9 153 GCTCACTGATCAATTGACCGGGTTACTAAAGGTGTAGCGCTTTGATCATGAACTGCTACATGGCTAGCGCATTATAAGTGCACATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATtATTATCGATCGTGGAATGTGCTATTtGTACAcTTTCACATGGTCGATGAACAaTGtCATATGATGGATG
JH12 154 CGTGGGTCGTCTATTTCCGTTAACAACGTGTGCAGTTAAAGTATACATTCAACCAAAAATATATTCATGCTTTAATGATAATGATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAAGTGCATTTACAATGCGCCAGATTCCATGCACCAAGTGATTATTAGCCCGGTCAATGGATCAGTGAGCACTCGATTTTCATTCTCAGCTCTCTTGGGAGTATACAACCCAAGCCACATTACCATCTCATCCTACTCTACCCTTCCCATCCCATTTTCCCAGGAAATATTTCCAGTGTATTGGTAATATGGTGCATCATTAATATCATAACAGTTCAACTTTTTTCATGACCTTCCCCAAATTGCATATTTGTTTCCATTATTCTCCCCTGCCTGTGATACTTTGGTA
JH14 155 CGAAGCTCCAGGGTTATAGTTCCATTTGATTGAACACTTTGAACACCCTTAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAaTTAAAGCTGCAAGCAGCAATGGCG D
JH16 156 GACTGAACTCTAAGACCTGAAGACGTGTCCATTCCTCTCTTGTTCTGGTCACCAAGACGTAATACAGACGTAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAaTAAAAAAGTGCATTTATAATGGATGCTCATAGCGCTACA D
MS 마커 서열번호 서열목록(5'->3') 그룹
JH23 157 CTGCACAGATTCATAAGTTGCACTGAGAATTATTTAACTCCTAATGTGGCGTTAATAATTATGCAATGCGTTTtATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATatAAAAAAAATTCTGTATAAATAGTTTATACAAGTTTATTTATGTTGTTCTCCAGAAAACTTGCACtGTTTTTGCGCTGATGTTTTCGTACAGAGATCG
JH26 158 AGAAATGGGCTTCACACTCACCGTCATGGAAGATGCATGTGTATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATCAACGGATTAGAATAGAACGGAATTGGTATTGGTCCTTGTCTCTTCAGAAGTTACTTTGCCGCAGTTATGGTTCAAAGGATGTGAAGATCAAAGTGTGTCTACGCT
JH27 159 CCAGTGGCAAGGGTAATAATAACGCTTTGAGGATGCCCCTGTGTGGTATTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTTCTTGGTGGTCAGCTTGATTGCGTTTCACCATACCCTGACAAAATTTGACATTGCAACGGAGGTTTGATTAATTACAGGCCGCCATGTTGAGCTGGAATGTTGCTGA D
JH32 160 CCGGACCAAGCTGTAACAGAACAATTTTAACTGTATATACATAACTACCAACATTAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATCCTTAATGAATTGCTGCTAAGCCCAACTGAGATGTATTCGCAGGGGCAGATGGTGACTTCATAACCCATTTCTATTAGCAGAAGAATATTTCAGGGTGATTCTTTTAGTCCTTTGTTTTTCTGTGTGTCACTAAATCCTTTCAGCTTATCAAGAGGAAGGTTGTCATCATCATGGACCTCC D
JH33 161 CGAACAGTTAACCGGACAGCGAAATCCAGATTAGCAGGGTGTCGCTGTATGTCATGTATAATGGGGATACAAAGTTACGCAACATGTTCAAAAATTGAAGGTTTACCCACTCCTGAATTCCCGTTCCCATTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGAGAGAGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGAGTGAGCGAGTGGTATCA
JH37 162 CTGAACATGCTGGCTTCAGACTGGTATTTAAAGTTGCAGACTGTAACTTTGTAACATACAAAACCCACTGATGTTCCCATTAATGAAGAAATATTACCTCATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATTGAGATAGAGATGGGTTATCTCTGCACAGCTCAATATTCAG
JH39 163 AGCAGACAATACCTGGATACCTGCGGTATATACATGTATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATGATAATAATAATAATAATAATAATAATATACTTATAATAATAATCATCATCATCATCATCATCATATCAAACATGAAACATGTTCAAGGGTACAGAATTTTATCTCATGTATGTGTTATTGATACAGTGACCTCCAACATGGCAATGTT
JH41 164 GCATTCACAGACAATGTGTTGGACAGTCTCATTAAATTCATCGCATAATCTACATTTCATATTTACATTTTGATGCAAAATCACAAATTGACAGTTTCGAGGGGGAAATGAGTCCTGAGCAGCATATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATACTGCACTTATCCAGGTATTATATTGTATTATACTATATTGCTGGAATATTGATAAGTGCAGCGTAAAAGCCAACACAC
JH45 165 GGCATCAGTCCGGACTAGTACAAGCAGCCACACACACACACACACACACGTGCATGCACGTCGCTATATCAGTGCACGTCG
JH50 166 GACACGCATTCTATTGCAATTGCAACATGACAGGGTAACATCAGGGGCTGCCGACCTACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACTACTAAGCGAAAAGTAAAGGCTCATGAAAATCTCACGAAAGCGTATGCTTGATGCTCTCATGCAGTTGGCACAAATG A3
MS 마커 서열번호 서열목록(5'->3') 그룹
JH53 167 CCGCTGAATAAAGGCTTATGGTCTTGGCAATTTTACCTAGGTGTCGTTTAAAATTTATGTTATGTGCCGATAAATAAGAAAATTCGCTTGTTGCCTCGCTAAAATGTTTGAAGAGAAAAACAACGTTACTTCAAAATCACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTCTCTCTCGTTTTAATTGTACATGATTTATTAAATATTTTCCTTCATATTCAGGTCCGGGGTATGA A3
JH56 168 CAGCTATTTGATGGCGGTCCATGAACCGGTGATTGACAAACAAGAAGTAATTAGTGAGTAGGTAGTATTGAAACATCATCATCATCATCATCATCATCATCATGTGTCAGCTTAAAGCTGTGTGAGGAAAGCCCGAATTGATGCAGGTCTCAGATGTTTATCACTTTGGTATAATTGCCAACGAGCAAGGTATAGTGC A3
JH74 169 CCGCACCTCTTCTGTTGTGTGAGTGAGTGAGTGTGTTTGTGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGCGTGTGCGTCCGTGCGTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGCGTGAGTCAAGTGGCGAGGA A3
JH77 170 CTCGCTTCCGTCAGAGAGCTGCAGCATAAAACATATACTTGAGAATTGACCTACATATGTTTTGGCGTTTATGGAGGAATATATATATTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTATTCACATATGTATGGAGCATCCGTCAACTCAGTACTTACAAACTGTTGAAGGCGACGTTAAACTGACTCGCAGAGGAGAGATAAAACA
Hn1 171 TGATGTATTTGATAAGGGTATCATCAGGTATATTACACGCATCATATCAATGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGAGAGTTGGATTTATCGTCGCTTTTAACAGTATTCCAAGTTACATCACGGCGTGTCAGCTTGATGTGGGATGAAAGCCCGAAGTGATGCAGGTCTCAGACGTTTACCATTTCGGTGAAACCCACGAGCATGGGTATGGTGCTGACAAACCTAGAAACATAAT
Hn2 172 ACATGTCGTGATTGTTTCCCACCCCACCCTCTCTGGGTGAATGTCAGCCCTGCACAGGTTATCTGGTAGGTGTGGGTCTGCACATACCGGCCCGGCCACACCATGCAGATCCACACACACACACACACACACACACACACACACCAAGGTCACACATGTGCTGGATGCAATTCAGAGAAGGATCAAACACTAATGTGAACAGTATGTGGTCAGGA D
Hn3 173 TTGACTTACTGAAACTTAAATGGATTTCTCAGCCGGCAGTGTGGTGTTCTGAAATATATTCCTGTAGTATTATGGAACCAGCTGGGAATGTAAGCTTCTGCCATGTTTGTGTGTGTGTGTTGTGAGCAGCATTGTGAGACACATTTTGTTTGTATGTAGCTGGAGATGGTGTTGTCTCAAGTGCATAGGTAGAATACAGCA
Hn4 174 CATGACTAGATCTGTCATCCAAACAGTTTCTTCATGTGCAATCACTCTGTACTTCCCACCCACAAAATACCCACACACCCACACACCCACACACCCACACACCCACACAGAATATTTGCAGATGAAAAAAGTATCCCAGTTCGTCTTTTCACAGTATAATGGGACAC
Hn5 175 TATACTGCACTCGGGCCTCAGCTTGAGCAATTCCTGAAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATGCAATCAGCAAGGTAGGGCTTCAAGTCACATTTCTATGAATTGGATTAATCTGTTTGACATACATGAAGGTCCATTTTGAGGGTCTA
Hn6 176 TCGTTGTTCAAAGATAAAGATGTGAAAATAGATGTTTATAGGAATTGATTGCATAGGGCCCAGTGAATATTATTATTATTATTATTATTAAAAAAACATTTATTCAGCGCTTAAATCCAACTAAAATGAACTGCTCGAGAGGGCTGTCTGAGACCGCATAACACTGGACGTAAG
MS 마커 서열번호 서열목록(5'->3') 그룹
Hn7 177 TACCCCTCAATCATAATATTGTATTGCCAAAGAAACTGTTGTCAATTATTATTATTATTATTATTATTGGCACTATTCATTCTTTCACATGAAAACATATTTGATGATCCATAAGTAAACCATTCAGCATGATCTCAATGATATTGATATTACAATTCTGGGACATAGATAGAGAAAATCTACATGTTATGGGGTGTTTTTAAATTAGACAGACTTATCACCAGAATGTAGACAA
Hn8 178 GCCTCTTGGGCACTCTTAGAAATCATATTTTCATAATATGATGCTTATTACATGAAGTCAGTTGATTGATATACCTTCTAGACGAAGAAACGGAAAATGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGGTTTTACATCACTTTTCGTTTGCAATATTCCAGCAAGAAGGAGGCTAGGGA
Hn9 179 GCTTAGAAGGGACATAACTCGCAATAGCCACTGGTGGCGCTACGATCGAGCCCAGGAATTCCAGCCTAGTTCGGCAAGAGTGGAAACTGGACTTTCAAAGTCAGTTAACTCTCTTGCCTCGGGAAGATCGAAAATTCAGGACAAATTCTATCGAATGTCCACTTTCCCTGCTTCACATCATCATCATCATCATCATCATCATTGTAATCTTATTTTCCTCGCTTGTAGAATGTCTATT
Hn10 180 TTCTGAGATGAGACGCACCACAACCACACACGACCACACGCACACAATACCACGCACACACACACACATCTACACTCACACCAACATTCACACCCACACCCACATCATACCACACACCCGCAAAAGCATCCACACCCACGCCCACACCACCCACACCACCAAAATCCACACCCACACACGCACACCCACTCGCAACCCCCCTACACACACACAAGCACGCACGCACGCACGCACGCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACGACGCCTGCTGCCAA
Hn11 181 GTCCAACACAACCAACTCCTCCCTCCATTGTGTGGTGTGGTGTGGTGTGCTGTGCTGTGCTGTGCTGTGCTGTGGTGTGGTGTGGTGTGGTGTGGTGTGGTGTGGTGTGGTGTGGTGTGGTGTGGTGTGGTGTGGTGTGTGTGTCTGTGGTTTGGTGTGATGGTGTGTGCGTGTGCCGTGCGTGTGTGGTGTGTTTAGGTGTGGTGTGGTTTGGTGTGCGTGTGTGTGGTGTGGTGTGTGTGGGGTGTGCGTGTGTGGTGTGGTGTGGTTTGGTTTGGTGTGTGTGGTGGTGTGCGTGTGCMGTGCGTGTGTGGTGTGGTGTGGTGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTTAATGTACTATGTGTTGTGATAAGCATACAAGAAGTTGTTATCCACAAACATGCTCAGG
Hn12 182 CACCTGTGTTTCGTACCCACATGGGTATAATGTGGCTCGGCTCCGCTCCACGCCACGCCACGCCACGCCACGCCACGCCACGCCACGCCACGCCACGCCACGCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACGCCACACGCTCCACTCTACTCCACTCCACACACTCCACTCCTATCCTATCCACTCCACTCCACTCTGCTCCATGCCACGCTGCCCCAATCCACTCCGCTCCACGCCACTCCCCTCCTCTCCACTCCACTCCGCTCCGCTCCACGCCACACGCTCCACTCCACTCCTATCCACTCCACACACACCACTCCGCGCCGGCTGCCCCACGCCGCGCCGCTCCACTCCACGCCGCTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACGCCACGCCACGCCACACGCTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCCACTCATGTTAGTTTACACTGACCCACCATTGTCATCATGTACATTCATTCTTTCAAGAACTTCCTCTGTATTGTAGTGTTGTGGATAGAGCATCTACTTGGAATTGTCCC
Hn13 183 GTCGAAACTAGCACAAACATCTACACACACAGCAAACACACACATATACATGCACGTCGCTATATAACAATAACCTTGGACGGGACGTTAAACCCCATTTCACCTCACCTCACCTCACCTCACCTCACCTCACCTCACTTCACCTCACCTCACCTCACGGTATGATGTGACCGGTGATC
MS 마커 서열번호 서열목록(5'->3') 그룹
Hn14 184 ACCTGACAGCGAAACGTTGTTCTGTTTCGAGAATAACACACTCACACACACACACACACACACACACACGCACGCACGCACGCACGCACGCACGCACGCAGCACGCACGCACACACACACACACCGATTGGTAACATCCGGGTGTGATGAGGATCCGGATATAA
Hn15 185 TAGCTAAACGCAGCGAAGAAAGAHAATCATCGTCATCATCATCATCATCATCATCAATATTATACATATCGAGAGAGAGAGAGAGACACACACACACACACACACACACACACACACACACACTCACTCACTCACTCACTCACTCACTCACTCACACTCACACACCTTGGACCATGGCTGTCTTACCCTGTTGTAATTGACGGGGTCGTT
Hn16 186 CTGAAGCAGCAAAACCACACACACACACAGGCACACACCCACACAATAAAATAATAACAT
Hn17 187 ATAAGACTACCATTACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAATTACTAACTTTTAA
Hn18 188 TTAAATGGAGTAGCAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGTGGGTTTAACGAC
Hn19 189 ATGTTGAGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGTGTGTGTGTGCGTGTTGGGA
Hn20 190 AGAAACTGTGACACACACACACACACACACTCACACACACACACACACATACACACGTGCATGCAC
Hn21 191 AAAATCTACCACACACACACACACACACACACACACACTCCCACACACACACACACGCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACCACACACACACCCCGNGGTCG
Hn22 192 TATGCACATGCACATACACACACACACTCACACAACACACATACATACTTG
Hn23 193 AGTTTTCGCGTTGTTGTTGTTGTTGGGACATGCAAAGCACTCCCTCCTTAGTTGTCTTTTCTTATTTCCCATGTATCTGGTTGTTGTTGTTGTTCATTATTA
Hn24 194 CTCCCAAACACTCCCAAACACACACATATACACACACGATATAAACTTAGATGG
Hn25 195 CCGCACACATACGCACGCACGCACGCACACACGCACACACGCACACACTTGTAAGTGC
본 명세서에서 용어 "마이크로새틀라이트(microsatellite)"는 2 내지 6개 정도의 염기서열이 반복되는 DNA 군 (repetitive DNA group)으로 게놈 내에 골고루 분포하고 매우 높은 다형성을 나타내는 비암호화 DNA 서열 (non-coding DNA sequence)을 의미한다. 마이크로새틀라이트 DNA는 특정 좌위에서 반복단위의 반복수에 따라 개체간의 다양성이 인정되는데, 반복수에 품종간 다형이 있는 경우에 인접영역에 설계한 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)과 같은 유전자증폭 반응을 행하면, 증폭반응 산물 길이에 다형이 관찰되고, DNA 다형을 검출하는 것이 가능해진다.
본 발명의 도 하나의 양태로서, 본 발명은 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마커군에 포함된 마이크로새틀라이트(Mircrosatellite, MS) 마커 염기서열을 포함하는 유전자 중합효소연쇄반응용(polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머에 관한 것이다.
상기 프라이머는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다.
상기 정방향 프라이머는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 및 서열번호 49의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 역방향 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44 및 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 정방향 프라이머는 5'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 형광단은 플루오리신 (fluorescein, 예를 들어, 6-Carboxyfluorescein(FAM)), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), Cy3 및 Cy5 들 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정 등의 방법에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 의하면, 본 발명의 프라이머는 형광단, 바람직하게는 플루오리신 (fluorescein), 더욱 바람직하게는 FAM(6-Carboxyfluorescein), PET, VIC, NED으로 표지 된 것일 수 있다.
그룹 MS
마커명		 형광
dye		 서열
번호		 프라이머쌍 Sequence
(5'->3')		 Repeat type
A3 JH50 6-FAM 37 JH50-F GACACGCATTCTATTGCAATTGCAACATGA (AAC)10 tri
38 JH50-R CATTTGTGCCAACTGCATGAGAGCA
JH53 6-FAM 39 JH53-F CCGCTGAATAAAGGCTTATGGTCTTGG (ACT)19 tri
40 JH53-R TCATACCCCGGACCTGAATATGAAGGA
JH56 6-FAM 41 JH56-F CAGCTATTTGATGGCGGTCCATGA (ATC)9 tri
42 JH56-R GCACTATACCTTGCTCGTTGGCA
JH74 6-FAM 43 JH74-F CCGCACCTCTTCTGTTGTGTGA (GT)11 di
44 JH74-R2 TCCTCGCCACTTGACTCACG
D
(BC3+
NEW)		 JH1 PET 1 JH1-F2 GCCTGACAAGACAAACTGATCCATTGG (ACT)22 tri
2 JH1-R2 ACAGGTCAGGTCGGTACACTGT
JH2 PET 3 JH2-F2 CGAGAGTCATACATCATTAGGCCCTTCG (AGT)17 tri
4 JH2-R2 AACCTCCGGTTTCCTGGTACTCAAT
JH5 PET 5 JH5-F ACGCTGGAGGTAGATGGTTTGTAGA (AC)21 di
6 JH5-R CTCGCTGCTCACATCAAACAGTGA
JH6 NED 7 JH6-F CGATGCTGTTGTGCCCTCATAGTAC (ATT)12 tri
8 JH6-R ACCCTAGGCAATATAGTCAAGATAAGTATCCGA
JH8 PET 9 JH8-F2 CACTGTTACCAAGTCCCATCAAAGGTTCAG (AAT)11 tri
10 JH8-R2 CGAGCTATTGCTGTAATAACTGAACTCTTTAAGGTGG
JH14 VIC 15 JH14-F2 CGAAGCTCCAGGGTTATAGTTCCATTTGATTG (AAT)17 tri
16 JH14-R2 CGCCATTGCTGCTTGCAGCTTTAAT
JH16 NED 17 JH16-F GACTGAACTCTAAGACCTGAAGACGTGTCC (AAT)13 tri
18 JH16-R2 TGTAGCGCTATGAGCATCCATTATAAATGCA
JH27 VIC 23 JH27-F CCAGTGGCAAGGGTAATAATAACGCTTTGAG (GTT)15 tri
24 JH27-R TCAGCAACATTCCAGCTCAACATGG
JH32 VIC 25 JH32-F CCGGACCAAGCTGTAACAGAACAA (AAT)12 tri
26 JH32-R GGAGGTCCATGATGATGACAACCTTC
Hn2 NED 49 Hn2-F ACATGTCGTGATTGTTTCCCAC (CA)16 di
50 Hn2-R TCCTGACCACATACTGTTCACATTAG
본 발명의 또 하나의 양태로서, 본 발명은 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마커군에 포함된 마이크로새틀라이트(Mircrosatellite, MS) 마커 염기서열을 포함하는 유전자 중합효소연쇄반응용(polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머 세트에 관한 것이다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 및 서열번호 49의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머; 및
서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44 및 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 프라이머 세트는,
서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 23, 서열번호 25 및 서열번호 49의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머; 및
서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 24, 서열번호 26 및 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머;
를 포함하는 것일 수 있으며,
예를 들어, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 7의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 9의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 15의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 17의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 23의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 25의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및
서열번호 49의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 포함하고 있는 것일 수 있으며,
바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 7의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 9의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 15의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 17의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 23의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 25의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및
서열번호 49의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
을 포함하고 있는 것일 수 있다.
또한, 상기 프라이머 세트는 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41 및 서열번호 43의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머; 및
서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42 및 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머;
를 포함하는 것일 수 있으며,
예를 들어, 서열번호 37의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 39의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 40의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 41의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 42의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및
서열번호 43의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 포함하고 있는 것일 수 있으며,
바람직하게는 서열번호 37의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 39의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 40의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
서열번호 41의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 42의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및
서열번호 43의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
을 포함하고 있는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
본 명세서에서 용어 "프라이머 쌍"은 정방향 프라이머 1개와 역방향 프라이머 1개로 이루어진 것을 의미한다. 또한, "프라이머 세트"는 상기 프라이머 쌍을 1개 이상 포함하고 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "뉴클레오티드" 는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 마이크로새틀라이트 마커의 분석으로 구별 가능한 전복의 품종은 둥근전복, 북방전복, 왕전복 및 말전복을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 키트를 제공한다.
상기 키트는 완충용액, DNA 중합효소, dNTP 및 증류수를 포함할 수 있으며, 이는 당업계에서 통상적으로 사용되는 용액, 효소 등이 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 포함하는 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석하는 방법은,
전복류에서 추출한 시료에 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 및
상기 PCR 산물이, 서열번호 148, 서열번호 149, 서열번호 150, 서열번호 151, 서열번호 152, 서열번호 155, 서열번호 156, 서열번호 159, 서열번호 160, 서열번호 166, 서열번호 167, 서열번호 168 및 서열번호 169 및 서열번호 172로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마커 염기서열을 포함하는지를 분석하는 단계;
를 포함하는 것일 수 있다.
상기 PCR 산물을 얻는 단계는 전복류에서 추출한 시료를,
서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 및 서열번호 49의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머; 및
서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44 및 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머;
를 포함하는 중합효소연쇄반응용(polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 것일 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응은 서열번호 148, 서열번호 149, 서열번호 150, 서열번호 151, 서열번호 152, 서열번호 155, 서열번호 156, 서열번호 159, 서열번호 160, 서열번호 166, 서열번호 167, 서열번호 168 및 서열번호 169 및 서열번호 172로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마커 염기서열을 포함하는 마이크로새틀라이트 (Mircrosatellite, MS) 마커가 포함된 말전복의 유전자를 증폭하는 것일 수 있다.
상기 정방향 프라이머는 5'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 형광단은 플루오리신 (fluorescein, 예를 들어, 6-Carboxyfluorescein(FAM)), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), Cy3 및 Cy5 들 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정 등의 방법에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 의하면, 본 발명의 프라이머는 형광단, 바람직하게는 플루오리신 (fluorescein), 더욱 바람직하게는 FAM(6-Carboxyfluorescein), PET, VIC, NED으로 표지 된 것일 수 있다.
상기 PCR 산물을 분석하는 단계는, PCR 산물의 염기서열을 분석하거나 또는 PCR 산물의 크기를 분석하여 PCR 산물의 유전자형을 분석하는 것일 수 있다.
효율적인 전복 교잡 육종을 위해서는 모패로 사용된 전복에 대한 유전적 다양성이 먼저 분석되어야하며 이를 토대로 체계적인 전복 가계도와 교잡/교배 시스템을 작성할 수 있다. 이를 위해 최종적으로 선발된 14개의 MS 마커를 활용하여 수집된 4종의 전복 모패 1467마리에 대한 genotyping을 수행하였다. 14개 MS 마커에 대한 평균 Ho, He, PIC 값은 각각 0.8829, 0.8675, 0.8528로 기준치(Ho/He > 0.5, PIC > 0.6)보다 높아 locus에 대한 다형성이 충분하다고 판단되었다.
또한, MS 마커를 이용하여 4종의 전복 각각에 대한 유전적 다양성을 분석하였을 때 I 값은 0보다 높아 하나의 대립유전자형이 우세한 것이 아닌 다양한 대립유전자형을 보유하고 있는 것으로 확인되었고 F 값의 경우 음의 값으로 나타나 각 종 집단내의 근친도는 낮다고 추정되었다.
다만 북방전복의 F 값은 0에 가까워 다른 전복에 비해 근친도가 높다고 생각된다. 전복 전체에 대한 요인대응분석(FCA)를 실시하였을 때 4 종의 전복은 크게 2개의 군집으로 형성되는 것으로 보아 말전복은 다른 전복과 유전적으로 확연히 차이가 나고 다른 3종의 전복은 유전적으로 가깝다고 판단된다.
이는 집단 간의 유전적거리(Nei's genetic distance 1978) 계산 결과와 같다. 다만 전체 전복을 원산지에 따라 7 집단으로 나누어 FCA를 실시하였을 때 중국산 둥근전복은 다른 둥근전복과는 유전적으로 다소 차이가 있는 것으로 보인다. 4종 1467마리에 대한 유전적 다양성 분석 결과를 종합하자면 말전복은 다른 전복과 유전적으로 확연히 분리되며 둥근전복, 북방전복, 왕전복의 경우 서로 유전적 차이는 있으나 그 구분이 말전복처럼 뚜렷하지 못하다. 특히 왕전복은 수집된 개체수가 10마리로 매우 적기 때문에 왕전복에 대한 유전적 분석을 위해서 많은 개체가 수집되어야 할 것으로 보인다.
14개의 MS 마커를 모두 사용하게 될 경우 동일개체 출현빈도(PI)는 9.1 X 10-23로 매우 낮고, 친자감정확률은 99% 이상으로 높아 전복 개체를 식별하고 친자감정에 활용하기에 적합할 것으로 생각되었다. 이에 MS 마커 locus에 대한 대립유전자형의 빈도를 기반으로 중국산과 양식산 둥근전복에서 생산된 치패 60마리에 대한 친자감정을 실시하였고 교배에 사용된 모패에 대한 정보가 정확할 경우 친자감정확률이 더 명확해짐을 알 수 있었다. 앞으로 전복 교잡육종에 있어서 개체에 대한 유전적 다양성 분석 및 가계도 작성에 있어 이번에 개발된 14개의 MS 마커가 충분히 활용 및 적용 될 수 있을 것이다.
본 발명은 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석하는데 유용하게 사용될 수 있는 마이크로새틀라이트 (Mircrosatellite, MS) 마커군, 상기 마커군을 포함하는 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트 및 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 MS 마커군을 이용하여 기존의 기술보다 보다 신속하고 경제적인 방법으로 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH16 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 JH26 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH37 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 JH45 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 JH50 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH74 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 Hn2 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 Hn5 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 Hn7 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 Hn9 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 Hn26 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 Hn27 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH5 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 JH27 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 JH32 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH41 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH56 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH8 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 JH9 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH14 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH53 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 JH77 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH1 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 JH2 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 JH6 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH12 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH15 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH23 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 29는 본 발명의 일 실시예에 따른 JH26 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH29 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 31은 본 발명의 일 실시예에 따른 JH33 MS 마커의 4종 전복에 대한 유효성 검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 32는 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 그룹 1에 대한 프라이머 혼성화 온도에 따른 multiplex PCR 결과를 나타낸 사진이다.
도 33은 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 그룹 1에 대한 프라이머 혼성화 단계 시간에 따른 multiplex PCR 결과를 나타낸 사진이다.
도 34는 본 발명의 일 실시예에 따른 조합 구성을 변경한 MS 마커 그룹 2에 대한 증폭시간에 따른 multiplex PCR 결과를 나타낸 사진이다.
도 35는 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 그룹 2에 대한 Type-it Microsatellite PCR kit를 이용한 multiplex PCR 결과를 나타내는 사진이다.
도 36은 본 발명의 일 실시예에 따른 조합된 MS 마커 그룹 3에 대하여 둥근전복에 적용한 multiplex PCR 결과를 나타내는 사진이다.
도 37은 본 발명의 일 실시예에 따른 조합된 MS 마커 그룹 3에 대하여 북방전복에 적용한 multiplex PCR 결과를 나타내는 사진이다.
도 38은 본 발명의 일 실시예에 따른 조합된 MS 마커 그룹 3에 대하여 왕전복에 적용한 multiplex PCR 결과를 나타내는 사진이다.
도 39는 본 발명의 일 실시예에 따른 조합된 MS 마커 그룹 3에 대하여 말전복에 적용한 multiplex PCR 결과를 나타내는 사진이다.
도 40은 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 그룹 3의 3-G4에 속한 7개의 MS 마커를 말전복에 각각 적용한 PCR 결과를 나타내는 사진이다.
도 41은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광표지 된 MS 마커 그룹 구성 1의 A, B, C를 둥근전복#1에 적용한 multiplex PCR 결과를 나타내는 사진이다.
도 42는 본 발명의 일 실시예에 따른 형광표지 된 MS 마커 그룹 구성 1의 A, B, C를 둥근전복#5에 적용한 multiplex PCR 결과를 나타내는 사진이다.
도 43은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광표지 된 MS 마커 그룹에 대한 fragment analysis service와 peak value 분석의 예를 나타내는 사진이다.
도 44는 본 발명의 일 실시예에 따른 변형된 형광표지 된 MS 마커 그룹 구성 2의 A', B', C'에 대한 multiplex PCR 결과를 나타내는 사진이다.
도 45는 본 발명의 일 실시예에 따른 형광표지 된 MS 마커 그룹 구성 3에 해당하는 그룹을 둥근전복 4마리에 각각 적용시킨 multiplex PCR 결과를 나타내는 사진이다.
도 46은 본 발명의 일 실시예에 따른 최종적으로 조합된 MS 마커 그룹에 대한 multiplex PCR 결과를 나타내는 사진이다.
도 47은 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 JH74의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 48은 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 JH50의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 49는 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 JH56의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 50은 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 JH53의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 51은 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 JH16의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 52은 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 Hn2의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 53은 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 JH6의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 54는 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 JH2의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 55는 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 JH8의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 56은 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 JH5의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 57은 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 JH14의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 58은 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 JH27의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 59는 본 발명의 일 실시예에 따른 MS 마커 JH32의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 60은 본 발명의 일 실시예에 따른 14개 MS 마커에 대한 대립유전자의 빈도를 기반으로 분석된 유전자 거리를 통해 얻은 UPGMA 계통수를 보여주는 그래프이다.
도 61은 본 발명의 일 실시예에 따라 14개 MS 마커에 대한 대립유전자의 빈도를 기반으로 분석된 4종 전복 개체의 요인대응분석 (FCA) 결과를 보여주는 그래프이다.
도 62는 본 발명의 일 실시예에 따라 MS 마커의 대립유전자 빈도를 기반으로 Codominant genotypic distance를 계산한 후 작성된 전복 개체의 UPGMA phylogenetic tree이다.
도 63은 본 발명의 일 실시예에 따라 14개 MS 마커에 대한 대립유전자의 빈도를 기반으로 분석된 전복 7개 집단 내 개체의 요인대응분석 (FCA) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 64는 본 발명의 일 실시예에 따라 전복 7개 집단의 유전적 거리(Nei's genetic distance 1978) 분석 결과를 토대로 작성된 UPGMA phylogenetic tree이다.
도 65는 본 발명의 일 실시예에 따라 V-6. K=3일 때의 양식산 둥근전복 모패와 중국산 둥근전복 모패, F1 세대 치패의 유전적 실제분포 추정을 나타낸 그래프이다. (1. 양식산 둥근전복, 2: 중국산 둥근전복, 3: F1 세대)
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 1차 MS 마커 후보 선정 및 검증
실험실에서 보유하고 있는 둥근전복 BAC 라이브러리에서 내병성 유전자를 비롯한 주요 유전자를 포함하는 BAC 클론으로부터 마이크로새틀라이트(microsatellite; 이하, MS) 마커 후보 237개를 탐색하였다. 여기서 motif가 di- 또는 tri-면서 반복횟수(repeats number, copy)가 10 이상인 MS 마커 후보 197개를 선정하여 이를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 설계 및 제작하였다. 이들 MS 마커 후보는 제주도 전복양식장과 제주해양수산연구원으로부터 제공받은 둥근전복에 적용하여 PCR로 서열의 증폭 여부를 확인한 뒤 증폭밴드가 뚜렷한 57개의 마커 후보를 선별하였다.
57개의 마커 후보에 대하여 프라이머쌍 중에서 정방향 프라이머(forward primer)의 5'말단 부위에는 첫 번째 PCR 산물을 가지고 두 번째 PCR를 진행할 때 형광표지가 부착된 정방향 프라이머를 공통적으로 사용하고자 TAG 서열(5'-gagctgtaaaacgacggccagt-3')을 포함하도록 프라이머를 제작하였다. 또한, 두 번째 PCR용 공통의 정방향 프라이머에는 증폭된 MS 단편의 검출 및 유전자형 분석을 용이하게 하기 위해서 5'말단에 FAM(6-carboxyfluorescein)로 수식(modification)하고 TAG 서열이 오도록 하였다.
첫 번째 PCR은 제주도 전복양식장과 제주해양수산연구원으로부터 제공받은 둥근전복 25마리로부터 분리한 각각의 genomic DNA (50 ng/㎕) 2 ㎕, 10X reaction buffer 5 ㎕, dNTP(each 2.5mM) 5 ㎕, tag-forward primer 2.5 ㎕, reverse primer 2.5 ㎕, Extaq polymerase 0.25 ㎕, reaction water 32.75 ㎕을 혼합하였고 94 에서 5분간 반응시킨 뒤, 94 에서 30초, 58 에서 30초, 72 에서 30초간 총 35회 걸쳐 서열을 증폭시키고 마지막으로 72 에서 1분간 안정화시켜 PCR를 마무리하여 첫 번째 PCR 산물을 수득하였다.
두 번째 PCR은 각각의 시료를 첫 번째 PCR 산물 1 ㎕, 10X reaction buffer 5 ㎕, dNTP(each 2.5mM) 5 ㎕, FAM-tag primer 1.5 ㎕, reverse primer 1.5 ㎕, Extaq polymerase 0.25 ㎕, reaction water 35.75 ㎕을 혼합하였고 94 에서 5분간 반응시킨 뒤, 94 에서 30초, 58 에서 30초, 72 에서 30초간 총 35회 걸쳐 서열을 증폭시키고 마지막으로 72 에서 1분간 안정화시켜 PCR를 마무리하여 두 번째 PCR 산물을 수득하였다.
증폭된 DNA는 10 ㎕의 반응액에 2 ㎕의 6X Gel loading buffer 를 첨가한 뒤, EtBr(Ethidium Bromide)가 첨가된 1.5％ 아가로스(agarose) 젤에서 전기영동을 통해 밴드를 확인하여, 두 번째 PCR 증폭 산물을 확인하였다.
두 번째 PCR 증폭 산물은 마크로젠(한국)에 보내 Fragment Analysis Service (Genescan Service)를 의뢰하였고 Peak Scanner Software 2 (version 2, Applied Biosystems)로 마커와 개체마다의 대립유전자 유형을 분석하여 다형성정보지수 (Polymorphism Information content; 이하 PIC)를 계산하고, 그 값이 0.5 이상인 44개의 MS 마커 후보를 선별하였다. 선별된 마커 후보는 다시 말전복과 왕전복에 적용하여 PCR로 증폭여부를 확인함으로써 모든 전복에 적용 가능성이 있는 MS 마커 후보를 선별하였다(표 7 및 8).
MS
마커		 서열
번호		 명명 서열목록(5'->3') Tm
(℃)		 Repeats
motif		 예상 산물
크기 (bp)
JH1 1 JH1-F GAATATTGCTGATTGCGGTGCCAAACAAC 59.6 (ACT)22 357
2 JH1-R GGTACACTGTGCCCCGGTTATAAAT 58.9
JH2 3 JH2-F GGAAGGTTAGCCCTAACTGGGTGAT 60.2 (AGT)17 263
4 JH2-R TATATCATATGCTTGGCTACAGGGGCAT 59.3
JH5 5 JH5-F ACGCTGGAGGTAGATGGTTTGTAGA 59.3 (AC)21 238
6 JH5-R CTCGCTGCTCACATCAAACAGTGA 59.4
JH6 7 JH6-F CGATGCTGTTGTGCCCTCATAGTAC 59.4 (ATT)12 317
8 JH6-R ACCCTAGGCAATATAGTCAAGATAAGTATCCGA 59.3
JH8 9 JH8-F ACCTTAGCACCACTGTTACCAAGT 58.2 (AAT)11 194
10 JH8-R CGAGCTATTGCTGTAATAACTGAACTCTTTAAGG 58.6
JH9 11 JH9-F GCTCACTGATCAATTGACCGGGT 59.4 (ATT)25 246
12 JH9-R CATCCATCATATGACATTGTTCATCGACCATG 59.1
JH12 13 JH12-F CGTGGGTCGTCTATTTCCGTTAACAACG 60.9 (AAT)23 464
14 JH12-R TACCAAAGTATCACAGGCAGGGGAG 60.1
JH14 15 JH14-F TATCTCACACTGGGTGCTTC 54.2 (AAT)17 486
16 JH14-R CGGAGTTGGTACAAGCAAAC 54.2
JH16 17 JH16-F GACTGAACTCTAAGACCTGAAGACGTGTCC 61 (AAT)13 237
18 JH16-R GGTTGTATACTTCCCAGGGAGCTGAGAATG 61.4
JH23 19 JH23-F CTGCACAGATTCATAAGTTGCACTGAGAAT 59 (AAT)17 248
20 JH23-R CGATCTCTGTACGAAAACATCAGCGC 59.7
JH26 21 JH26-F AGAAATGGGCTTCACACTCACCGT 60.7 (AAT)15 217
22 JH26-R AGCGTAGACACACTTTGATCTTCACATCC 60.1
JH27 23 JH27-F CCAGTGGCAAGGGTAATAATAACGCTTTGAG 60.8 (GTT)15 224
24 JH27-R TCAGCAACATTCCAGCTCAACATGG 59.8
JH32 25 JH32-F CCGGACCAAGCTGTAACAGAACAA 59.3 (AAT)12 294
26 JH32-R GGAGGTCCATGATGATGACAACCTTC 59.1
JH33 27 JH33-F CGAACAGTTAACCGGACAGCGAAATC 59.9 (GT)12 259
28 JH33-R TGATACCACTCGCTCACTCTCACT 59.1
JH37 29 JH37-F CTGAACATGCTGGCTTCAGACTGGTA 60.5 (GAT)14 207
30 JH37-R CTGAATATTGAGCTGTGCAGAGATAACCCATC 60.1
JH39 31 JH39-F AGCAGACAATACCTGGATACCTGCG 60.4 (AGT)14 249
32 JH39-R AACATTGCCATGTTGGAGGTCACTGTATC 60.6
JH41 33 JH41-F GCATTCACAGACAATGTGTTGGACAGTCTC 61.0 (ATT)13 267
34 JH41-R GTGTGTTGGCTTTTACGCTGCACT 60.5
MS
마커		 서열
번호		 명명 서열목록(5'->3') Tm
(℃)		 Repeats
motif		 예상 산물
크기 (bp)
JH45 35 JH45-F GGCATCAGTCCGGACTAGTACAAGC 60.8 (AC)10 103
36 JH45-R CGACGTGCACTGATATAGCGACGT 60.7
JH50 37 JH50-F GACACGCATTCTATTGCAATTGCAACATGA 60.1 (AAC)10 188
38 JH50-R CATTTGTGCCAACTGCATGAGAGCA 60.4
JH53 39 JH53-F CCGCTGAATAAAGGCTTATGGTCTTGG 59.6 (ACT)19 282
40 JH53-R TCATACCCCGGACCTGAATATGAAGGA 60.5
JH56 41 JH56-F CAGCTATTTGATGGCGGTCCATGA 59.4 (ATC)9 220
42 JH56-R GCACTATACCTTGCTCGTTGGCA 59.5
JH74 43 JH74-F CCGCACCTCTTCTGTTGTGTGA 59.6 (GT)11 190
44 JH74-R GCTTCTGACCTAAGGCATGCCAG 60.1
JH77 45 JH77-F CTCGCTTCCGTCAGAGAGCT 58.9 (GT)28 256
46 JH77-R TGTTTTATCTCTCCTCTGCGAGTCAGT 59.0
MS 마커 후보를 더 선발하기 위해 Genebank에 등록된 북방전복의 마이크로세틀라이트 서열을 참고하여 50개 서열에 대한 MS 마커용 프라이머쌍을 설계 및 제작하였다(표 9 내지 12). 둥근전복, 북방전복, 왕전복, 말전복에 적용하여 PCR로 프라이머쌍의 유효성을 확인하였다.
MS
마커		 서열
번호		 명명 서열목록(5'->3') Tm
(℃)		 Repeats
motif		 Reference asscetion No.
Hn1 47 Hn1-F TGATGTATTTGATAAGGGTATCATC 50.5 (TGAG)6 AB177910
48 Hn1-R ATTATGTTTCTAGGTTTGTCAGCAC 53.6
Hn2 49 Hn2-F ACATGTCGTGATTGTTTCCCAC 55.8 (CA)16 AB177912
50 Hn2-R TCCTGACCACATACTGTTCACATTAG 56.3
Hn3 51 Hn3-F TTGACTTACTGAAACTTAAATGGAT 50.7 (TG)6 AB177914
52 Hn3-R TGCTGTATTCTACCTATGCACTTG 54.6
Hn4 53 Hn4-F CATGACTAGATCTGTCATCCAAAC 53.2 (ACCCACAC)5 AB177915
54 Hn4-R GTGTCCCATTATACTGTGAAAAGA 52.7
Hn5 55 Hn5-F TATACTGCACTCGGGCCTCAGCT 61.9 (AAT)17 AB177918
56 Hn5-R TAGACCCTCAAAATGGACCTTCA 55.7
Hn6 57 Hn6-F TCGTTGTTCAAAGATAAAGATGTGA 52.9 (ATT)7 AB177923
58 Hn6-R CTTACGTCCAGTGTTATGCGGTCTC 59.1
Hn7 59 Hn7-F TACCCCTCAATCATAATATTGTATT 49.7 (ATT)8 AB177929
60 Hn7-R TTGTCTACATTCTGGTGATAAGTCT 53.5
Hn8 61 Hn8-F GCCTCTTGGGCACTCTTAGAAATCA 58.8 (TGAG)6(GAGT)6 AB177935
62 Hn8-R TCCCTAGCCTCCTTCTTGCTGGAAT 61.5
Hn9 63 Hn9-F GCTTAGAAGGGACATAACTCGCAATA 56.6 (ATC)8 AB177936
64 Hn9-R AATAGACATTCTACAAGCGAGGAAA 54.1
Hn10 65 Hn10-F TTCTGAGATGAGACGCACCAC 56.9 (CGCA)4(CA)18 AB084076
66 Hn10-R TTGGCAGCAGGCGTCGTGT 62.9
Hn11 67 Hn11-F GTCCAACACAACCAACTCCTC 55.9 (CA)9TA(CA)9?(CCACA)13 AB084078
68 Hn11-R CCTGAGCATGTTTGTGGATAAC 54.0
Hn12 69 Hn12-F CACCTGTGTTTCGTACCCAC 55.9 (CGCCA)11(CTCCA)6...(CTCCA)15...(CTCCA)9 AB084079
70 Hn12-R GGGACAATTCCAAGTAGATGC 53.5
Hn13 71 Hn13-F GTCGAAACTAGCACAAACATCT 53.2 (CACCT)7CACTT(CACCT)3 AB084077
72 Hn13-R GATCACCGGTCACATCATAC 52.8
Hn14 73 Hn14-F ACCTGACAGCGAAACGTTGTTCT 59.1 (CA)2CT(CA)13(CGCA)11(CA)6 AB025387
74 Hn14-R TGTGACGGCGGTCTGTAAATTATCTA 57.6
Hn15 75 Hn15-F TAGCTAAACGCAGCGAAGAAA 54.6 (TCA)8(AT)2(TA)2X6(GA)8(CA)18(CTCA)8X4(CA)3 AB047107
76 Hn15-R AACGACCCCGTCAATTACAAC 55.4
MS
마커		 서열
번호		 명명 서열목록(5'->3') Tm
(℃)		 Repeats
motif		 Reference asscetion No.
Hn16 77 Hn16-F ACAACAAACAAAGCATACTGA　 50.6 (CA)7GG(CA)3 AY948316
78 Hn16-R GCTACTCATCGGTGGAAT 51.5
Hn17 79 Hn17-F CCAGATAAGACTACCATTAC　 46.8 (AC)20 AY948312
80 Hn17-R TATGTCAGTTTATCGTTATCC 47.1
Hn18 81 Hn18-F CAGCGAACATACACGAGATTA　 52.3 (GT)21 AY948314
82 Hn18-R ACTGTGCTAAACGATGGAGA 53.6
Hn19 83 Hn19-F CTTAAACTATCCACCGGATGT　 51.9 (TG)27TA(TG)5 AY948317
84 Hn19-R CATGGAAATGTCAATCACGTA 50.7
Hn20 85 Hn20-F TGATAGAAGCGACGTAAAACA　 51.7 (AC)13TC(AC)8AT(AC)3 AY948320
86 Hn20-R GGTGAGGTGAAATGGGATT 52.3
Hn21 87 Hn1-F CCCCTCTCGAAATAAACTCTC　 52.4 (AC)14TCCC(AC)7GC(AC)35C(AC)5 AY948321
88 Hn1-R GAACCCAACACAAGACAAAC 52.1
Hn22 89 Hn21-F CACGCACGTATGCACAT　 53.3 (CA)2TA(CA)5CT(CA)3A(CA)3 AY948318
90 Hn21-R GAACCACCTCAAGTGTCACTA 54.1
Hn23 91 Hn23-F GGGACCTGTTTGGGACA　 54.6 (TTC)5(TTG)4 AY948319
92 Hn23-R GACAAAGTAGCCAACATCTCA 52.6
Hn24 93 Hn24-F ATTAGTGTTTGGGCCAGTT　 51.9 (AC)4(AT)2(AC)4 AY948325
94 Hn24-R GGCCTATAACACATGAATGAA 50.3
Hn25 95 Hn25-F CAGCCGCACACATACG　 54.0 (ACGC)4(AC)3GC(AC)3GC(AC)3 AY948326
96 Hn25-R ATCAAAACACGCAGATTACAC 51.4
MS
마커		 서열
번호		 명명 서열목록(5'->3') Tm
(℃)		 Repeats
motif		 Reference asscetion No
Hn26 97 Hn26-F GGCCTGCTTTTGTTTTCT　 51.2 (AAC)8AAT(AAC)3 AY948327
98 Hn26-R ATTTGGGATACAAGTGTGACA 51.8
Hn27 99 Hn27-F TGATCTGTGTAATCCCCTTTC　 51.9 (AC)8 AY948328
100 Hn27-R TTTTCATCGTCCTCCTGTTAT 51.3
Hn28 101 Hn28-F AGTGACTTACACAGGCCTTT　 53.8 (GAGT)5 ...(GAGT)6GA(GAGT)3 AY948329
102 Hn28-R CCCCATGGAGGGTCTG 54.9
Hn29 103 Hn29-F CAGAAGACAACGTGTTTATCG　 51.6 (GT)12GC(GT)3(GCGT)5GCAT(GCGT)8 AY948331
104 Hn29-R AGCCAGTTTCTTGTGTCACTT 54.7
Hn30 105 Hn30-F ACTCACGGCTTTTGAACTAAG　 53.0 (TCAC)3 ...(TG)17TA(TG)38 AY948332
106 Hn30-R GAACAAACAGCCAGCCA 53.3
Hn31 107 Hn31-F AGTTGTTGAACCTTTCTGTTG　 51.3 (AC)2AT(AC)4(AC)5 AY948315
108 Hn31-R GAAAACTTCACCCACTACTTG 51.3
Hn32 109 Hn32-F CACACGCACACTCACACATA　 55.3 (AC)10(AC)5 AY948336
110 Hn32-R ACTAGTTTTCCTTCCCTTGCT 53.8
Hn33 111 Hn33-F ATCCATATTGCTGGCGATACG 55.0 (CA)25 AB058283
112 Hn33-R GGATGTTGGATTAGTCTTGTCCAG 55.3
Hn34 113 Hn34-F CGTTCCATTATCTGAGGGGCAAGC 60.0 (TG)21 AB058284
114 Hn34-R TCGGCATCATTAGGGACCAG 56.7
Hn35 115 Hn35-F TACATTGGCTGAATGGGGTG 55.2 (CA)38 AB058285
116 Hn35-R ACTTAACTGCAGTGTCAGGACC 56.9
Hn36 117 Hn36-F CACACTGTGTTGGAATCCCCA 57.5 (GT)36 AB058286
118 Hn36-R TCATTCAACCTGTTGTGAGGTG 55.3
Hn37 119 Hn37-F TTACTGGCGAAATCAAGGCGTA 56.7 (TG)34 AB058287
120 Hn37-R TCCCTCACATCAAAACAATCGCC 57.9
Hn38 121 Hn38-F GGGTGAGATGTAGTGGTCTACG 56.4 (TG)15 AB058288
122 Hn38-R AGCACAATAAATCGGCATCAGTCC 57.7
Hn39 123 Hn39-F ACCGTTGTGTCATTTCCT 51.5 (GAGT)14 AB058289
124 Hn39-R ATATTGCTACAAGCGGTG 49.8
Hn40 125 Hn40-F GCTTCTCTGTGGAGAGAGTGG 56.9 (GAGGT)9 AB058290
126 Hn40-R AGTGCAATAATCCTGGACGTGAG 56.9
Hn41 127 Hn41-F AGATTTCTGGGGAGACATGC 54.6 (CA)19 AB551426
128 Hn41-R ATCGGCATCAGTCTGGACT 55.8
MS
마커		 서열
번호		 명명 서열목록(5'->3') Tm
(℃)		 Repeats
motif		 Reference asscetion No
Hn42 129 Hn42-F AGAACAGACAACAACCGAGG 54.8 (AC)44 AB551428
130 Hn42-R CATAGCGATATGTATGCGCGTG 56.1
Hn43 131 Hn43-F AGTCATTGTGCGGTAGACTC 54.4 (ACGC)10 AB551429
132 Hn43-R GGACCAGACACATAGCAACG 55.7
Hn44 133 Hn44-F TTTAAGACCCAACTTGTAGACATCC　 54.7 (GACT)2(CTCA)7(CA)2CT(CA)9 AB025367
134 Hn44-R AACGCCGCCTTGATTCGTTTGTTTGT 61.9
Hn45 135 Hn45-F CTAAATTAATAACAGGCCGTCATTGA　 53.6 (CA)8(CG)4 AB025388
136 Hn45-R TTATGTTAAAGATCCGATCGGTTCAG 54.8
Hn46 137 Hn46-F ACTGTTATTCGACATCCAGTCCGG 58.5 (CA)30 AB025384
138 Hn46-R GGCATTGTAGAGGATCTGAGGGAGAA 59.6
Hn47 139 Hn47-F TAGTTGTTGAACCTTTCTGTTG 51.0 (CA)7 AB091480
140 Hn47-R TAGACAAACAGAAAACTTCACC 50.8
Hn48 141 Hn48-F CCGAGATGTTTACAGAGAGA 51.0 (GA)23 AB091482
142 Hn48-R CACACTCGCTTTCTCACTCA 54.8
Hn49 143 Hn49-F GAGACAGACTGAGTGAGAAA 51.2 (GA)34 AB091483
144 Hn49-R TAACATGCTTACATTCTTCCTC 50.3
Hn50 145 Hn50-F ATCAGGATGGGAATGTACCTG 54.0 (CA)7 AB091479
146 Hn50-R CCAATGGTGCGTGTGTAATTCA 56.0
1차 선별과정에서 선별된 MS 마커 후보는 31개로 마커 크기 범위(size range)별로 분류하면 100내지 200 base pair(bp)인 후보 6개, 200내지 300 bp인 후보 11개, 300 내지 400bp인 후보 5개, 400 내지 500 bp인 후보 9개의 선정되었다(표 13).
마커 크기 범위 (size range, 단위: bp)
100 내지 200 201 내지 300 301 내지 400 401 내지 500
JH16 Hn2 JH8 JH1
JH26 Hn5 JH9 JH2
JH37 Hn7 JH14 JH6
JH45 Hn9 JH53 JH12
JH50 Hn26 JH77 JH15
JH74 Hn27 JH23
JH5 JH26
JH27 JH29
JH32 JH33
JH41
JH56
그 다음, 다시 둥근전복 5마리, 북방전복 5마리, 왕전복 5마리, 말전복 5마리로부부터 genomic DNA를 뽑고 31개의 MS 마커 후보의 프라이머쌍과 함께 PCR를 수행하였다. PCR은 각각의 시료를 gDNA(50 ng/㎕) 2 ㎕, 10X reaction buffer 5 ㎕, dNTP(each 2.5mM) 5 ㎕, forward primer 1 ㎕, reverse primer 1 ㎕, taq polymerase(Geneall) 0.20 ㎕, reaction water 11.8 ㎕을 혼합하였고 94 에서 5분간 반응시킨 뒤, 94 에서 30초, 58 에서 30초, 72 에서 1분간 총 35회 걸쳐 서열을 증폭시키고 마지막으로 72 에서 5분간 안정화시켜 PCR를 마무리하였다. 증폭된 DNA는 3 ㎕의 반응액에 4 ㎕의 6X Gel loading buffer 를 첨가한 뒤, EtBr(Ethidium Bromide)가 첨가된 2％ 아가로스(agarose) 젤에서 전기영동을 통해 밴드를 확인하여, PCR 증폭 산물을 확인하여 그 결과를 도 1 내지 31에 나타내었다.
도 1 내지 31에서 확인할 수 있듯이, 크기범위가 100 내지 200bp인 경우 JH26을 제외한 나머지에서 PCR로 증폭된 DNA 밴드가 뚜렷이 확인되었고, JH74로 증폭된 DNA는 말전복에서만 여러 개의 밴드로 확인되었다. 200 내지 300 bp의 크기범위에서는 Hn2, Hn26, Hn27, JH27, JH32, JH56에 대한 DNA 증폭밴드가 뚜렷하게 확인되었고, 나머지는 증폭밴드가 뚜렷하지 않거나 20마리 전부에서 확인되지 않았다. 300 내지 400 bp 범위에서는 JH8, JH9, JH14, JH53에서 예상된 크기에 맞는 DNA 밴드를 확인할 수 있었다. JH2, JH6, JH15, JH29, JH33에서는 예상되는 크기범위인 400 내지 500bp의 DNA 밴드가 뚜렷하게 확인되었다.
실시예 2. Multiplex PCR 조건 확립
2-1. MS 마커 그룹 조합 1
2-1-1. 그룹 구성
MS 마커그룹에 대한 최적의 multiplex PCR 조건을 찾기 위해 첫 번째로 프라이머 혼성화 온도와 시간을 조절하고자 하였다. 먼저, 하기 표 14와 같이 4개의 MS 마커가 하나의 그룹에 포함되도록 하여 총 5개 그룹으로 구성하였다.
그룹 MS 마커 명 프라이머쌍 Size range Tm(℃)
1-G1 JH74 JH74-F 100-200 58
JH74-R
Hn27 Hn27-F 200-300 58
Hn27-R
JH53 JH53-F 300-400 58
JH53-R
JH29 JH29-F 400-500 58
JH29-R
1-G2 JH37 JH37-F 100-200 58
JH37-R
JH27 JH27-F 200-300 58
JH27-R
JH9 JH9-F 300-400 58
JH9-R
JH2 JH2-F 400-500 58
JH2-R
1-G3 JH16 JH16-F 100-200 58
JH16-R
Hn26 Hn26-F 200-300 58
Hn26-R
JH6 JH6-F 300-400 58
JH6-R
JH15 JH15-F 400-500 58
JH15-R
1-G4 Hn2 Hn2-F 200-300 58
Hn2-R
JH32 JH32-F 200-300 58
JH32-R
JH14 JH14-F 300-400 58
JH14-R
JH33 JH33-F 400-500 58
JH33-R
1-G5 JH45 JH45-F 100-200 58
JH45-R
JH50 JH50-F 100-200 58
JH50-R
JH56 JH56-F 200-300 58
JH56-R
JH8 JH8-F 300-400 58
JH8-R
2-1-2. 혼성화 온도에 따른 분석
각 그룹에 해당하는 프라이머의 농도는 10 pmole/㎕가 되도록 희석하여 준비하였다. PCR 조성물은 둥근전복 genomic DNA 2 ㎕, 10X reaction buffer (Geneall, 한국) 3 ㎕, dNTP(each 2.5mM) 3 ㎕, forward primer 1 ㎕ * 4 종류, reverse primer 1 ㎕ * 4종류, taq DNA polymerase (Geneall, 한국) 0.3 ㎕, reaction water 13.7 ㎕을 혼합하여 총 부피 30 ㎕가 되도록 하였고 PCR 조건은 94 ℃에서 5분간 반응시킨 뒤, 94 ℃에서 변성(denaturation) 시간 30초, 58 또는 60, 62 ℃의 혼성화(hybridization) 시간 30초, 72 ℃에서 합성(synthesis　또는 annealing) 시간 30초로 하여 총 35회 걸쳐 서열을 증폭시키고 마지막으로 72 ℃에서 5분간 안정화시켜 PCR를 마무리하였다. 그 다음, 전기영동으로 증폭된 DNA를 확인하여 그 결과를 도 32에 나타내었으며, 확인할 수 있듯이 혼성화 온도에 따른 증폭산물의 차이는 확인되지 않았다.
2-1-3. 혼성화 시간에 따른 분석
상기 실시예 2-1-2와 같은 조성과 조건에서 taq DNA polymerase를 TaKaRa Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa Code RR001A)로 교체 사용하였고 혼성화 온도는 58 ℃ 고정, 혼성화 단계의 시간은 30초에서 45초 또는 60초로 연장하여 PCR를 수행하였다. 그 다음, 전기영동으로 증폭된 DNA를 확인하여 그 결과를 도 33에 나타내었으며, 확인할 수 있듯이 혼성화 시간에 따른 증폭 차이는 크게 확인되지 않았다.
2-2. MS 마커 그룹 조합 2
2-2-1. 그룹 구성
처음의 5개 그룹은 하나의 그룹에 포함되어 있는 MS 마커의 수가 적어 그 수를 늘리고자 새로운 그룹을 하기 표 15와 같이 총 4개 그룹으로 구성하였다.
그룹 MS 마커 명 프라이머쌍 Size range Tm(℃)
2-G1 JH45 JH45-F 100-200 58
JH45-R
JH74 JH74-F 100-200 58
JH74-R
JH50 JH50-F 100-200 58
JH50-R
JH56 JH56-F 200-300 58
JH56-R
JH53 JH53-F 300-400 58
JH53-R
JH8 JH8-F 300-400 58
JH8-R
JH2 JH2-F 400-500 58
JH2-R
JH15 JH15-F 400-500 58
JH15-R
2-G2 JH16 JH16-F 100-200 58
JH16-R
Hn2 Hn2-F 200-300 58
Hn2-R
JH32 JH32-F 200-300 58
JH32-R
JH1 JH1-F 400-500 58
JH1-R
2-G3 JH37 JH37-F 100-200 58
JH37-R
JH27 JH27-F 200-300 58
JH27-R
JH6 JH6-F 300-400 58
JH6-R
JH29 JH29-F 400-500 58
JH29-R
2-G4 Hn5 Hn5-F 100-200 58
Hn5-R
JH5 JH5-F 200-300 58
JH5-R
JH41 JH41-F 200-300 58
JH41-R
JH9 JH9-F 300-400 58
JH9-R
JH12 JH12-F 400-500 58
JH12-R
JH14 JH14-F 400-500 58
JH14-R
도 36 내지 39에서 확인할 수 있듯이, 3-G1, 3-G2, 3-G4 또는 3-G1+G2, 3-G1+G4, 3-G2+G4로 조합하여 PCR를 수행하였을 때 4개의 전복에서 전체적으로 예상되는 DNA 밴드가 뚜렷하게 확인되는 것으로 보아 그룹 또는 그룹조합에 포함된 MS 마커가 4개의 전복에 모두 적용할 수 있으며 충돌 없이 크기별로 잘 증폭된다고 판단되었다.
다만, 3-G4 그룹에 대해서는 말전복의 DNA 밴드는 2개만 확인되었다. 이에 3-G4 그룹에 속한 마커들이 말전복에서만 증폭되지 않는 것인지 다른 이유가 있기 때문인지를 확인하기 위해 7개 마커 각각에 대한 PCR를 진행하였다. 그 결과를 도 40에 나타내었다.
도 40에서 확인할 수 있듯이, Hn5, JH5, JH37, JH27에 대한 증폭 밴드의 크기가 서로 유사한 것으로 보아 그룹으로 PCR을 수행하였을 때 각각 마커는 증폭되나 전기영동에서 보이는 DNA 산물은 크기가 서로 겹쳐 하나의 밴드처럼 보이는 것으로 판단되었다. 3-G4에서 400 내지 500 bp 크기의 밴드는 JH14에 의한 것이었고 JH9과 JH12는 DNA가 제대로 증폭되지 않았다. 이번 실험 결과를 토대로 3-G4에서 JH5, JH14, JH27 만을 선택하였고 나머지는 제외시켜 다음 실험을 진행하였다.
실시예 3. 형광표지 및 Genescan에 따른 MS 마커 구성
3-1. 형광표지된 MS 마커 그룹 구성 1
Multiplex PCR에 적합한 MS 마커군의 프라이머쌍 중에서 정방향 프라이머(forward primer)는 서열 앞부분에 형광dye를 부착하여 새로이 제작하였다. Genotyping application에 적합한 형광dye로 DS-33를 선택하였고 파란색의 6-FAM, 초록색의 VIC, 노란색의 NED, 빨간색의 PET, internal standard size marker인 LIZ가 구성되어있다. 형광 표지된 프라이머를 이용하여 다시 multiplex PCR를 수행한 뒤 마크로젠에서 제공하는 Fragment Analysis Servece(Genescan service)로 증폭시킨 PCR 산물의 fragment에 대한 형광 peak value 결과를 얻고 Peak Scanner Software 2 (version 2.0)으로 분석하였다. Genescan을 통한 peak 분석으로 그 값이 확인되지 않거나 정확하지 않은 경우 MS 마커를 제거하거나 새로이 추가하여 다시 최적의 MS 마커군을 조합하고자 실험을 반복 수행하였다.
Multiplex PCR를 수행하였을 때 각각의 마커가 제대로 증폭되는 프라이머 중에서 정방향 프라이머(forward primer)에 형광 dye를 표지하여 증폭산물의 형광 값(peak value)을 읽고 분석하고자 하였다. 앞서 확인된 MS 마커 그룹 중에서 3-G4 그룹의 JH5, JH14, JH27를 제외한 나머지 정방향 프라이머 5'-말단에 형광으로 표지한 프라이머를 새롭게 제작하였다(표 16). 둥근전복 genomic DNA와 형광 표지된 프라이머를 사용하여 multiplex PCR를 진행하였고 증폭된 산물은 전기영동으로 DNA 밴드를 확인한 뒤 마크로젠에 보내 Fragment Analysis Service (Genescan service, 이하 Genescan)를 의뢰하였다. [.FSA] 포맷으로 제공되는 결과는 Peak Scanner Software 2로 각각의 형광과 MS 마커에 따른 peak value를 분석하였다(표 17).
그룹 MS 마커 명 형광 dye Repeat type Size range (bp)
A JH45 6-FAM (AC)10 di 100-200
JH74 6-FAM (GT)11 di 100-200
JH50 6-FAM (AAC)10 tri 100-200
JH56 6-FAM (ATC)9 tri 200-300
JH53 6-FAM (ACT)19 tri 300-400
JH8 6-FAM (AAT)11 tri 300-400
JH2 6-FAM (AGT)17 tri 400-500
JH15 6-FAM (GT)15 di 400-500
B JH16 NED (AAT)13 tri 100-200
Hn2 NED (CA)16 di 200-300
JH32 VIC (AAT)12 tri 200-300
JH1 NED (ACT)22 tri 400-500
JH6 NED (ATT)12 tri 400-500
JH29 VIC (ATC)14 tri 400-500
C JH5 PET (AC)21 di 200-300
JH14 VIC (AAT)17 tri 400-500
JH27 VIC (GTT)15 tri 200-300
그룹 MS 마커 형광 dye Repeat type A A+B A+C B+C, D1 B+C, D5 A+B+C
A JH45 6-FAM di N/A N/A N/A . . N/A
JH74 6-FAM di 128
130		 128
130		 128
130		 . . 128
JH50 6-FAM tri 149
176		 149
176		 149
176		 . . 149
176
JH56 6-FAM tri 210 204
210		 204
210		 . . -
JH53 6-FAM tri 266 266 266 . . 204
210
JH8 6-FAM tri 364 364 364 . . 266
JH2 6-FAM tri 430 - - . . 364
JH15 6-FAM di 459 - - . . -
B JH16 NED tri . 150 . 147 147
150		 147
150
Hn2 NED di . 206
208		 . 206 206
208		 206
208
JH32 VIC tri . 272
278		 . 278 272
278		 272
278
JH1 NED tri . - . - 417
423		 -
JH6 NED tri . - . 316
319		 304 -
JH29 VIC tri . - . 455
458		 - -
C JH5 PET di . . 215 223
231		 215 215
JH14 VIC tri . . - - 464 -
JH27 VIC tri . . 209
212		 215 209
212		 209
212
A 그룹에 대한 분석 결과, 8개의 MS 마커 중에서 JH45를 제외한 7개의 마커에서 증폭이 잘되었으며 peak value 분석에서도 각각에 특이적인 peak과 그 값이 확인되었다(표 17). 그러나 A 그룹이 속해있는 조합인 A+B 또는 A+C에서 A 그룹의 증폭 크기가 큰 MS 마커에 대한 peak가 전부 확인되지 않았다. 이에 반해 B+C 조합에서는 전복 개체(둥근전복 D1과 D5)에 따른 차이가 있었고 MS 마커 전체적으로 peak가 확인되었다(표 17). 다만 D1에서는 B그룹의 JH29가, D5에서는 C그룹의 JH14에 대한 peak가 확인되지 않았다. A 그룹의 6-FAM으로 표지된 마커인 JH2, JH15가 다른 그룹과 조합하여 PCR을 하였을 때 그 peak가 확인되지 않는 이유는 비슷한 크기의 마커와 서로 충돌 또는 교란되어 형광 값이 나타나지 않는 것으로 생각되며 6-FAM dye의 문제로 보인다. 게다가, 전체적으로 300 bp 이상의 MS 마커인 경우 peak value가 다른 마커에 비해 낮아 효율성이 떨어진 것으로 판단된다. 이번 실험 결과를 토대로 각 그룹에서 효용성이 떨어지는 JH45, JH2, JH15, JH1, JH14를 각 그룹에서 제외시켰고 다음 실험을 진행하였다.
3-2. 형광표지된 MS 마커 그룹 구성 2
앞의 실험에서 JH45, JH2, JH15, JH1, JH14를 각 그룹에서 제외시킨 그룹을 각각 A', BC'이라 새롭게 명명하였다(표 18). Multiplex PCR을 통해 각 그룹 또는 조합의 마커를 증폭시키고 마크로젠에 보내 Genescan 분석을 의뢰하였다. 300 bp 이상의 크기를 가진 마커의 peak value는 다른 마커에 비해 그 값이 낮은 것으로 확인되었다. A'와 BC' 결과에 비해 ABC' 조합에서 몇몇 마커의 peak가 확인되지 않았다(표 11). 이는 형광 dye 간의 충돌 또는 교란에 의한 것일 수 있다고 생각된다. 이에 위와 같은 문제점을 해결하고자 크기가 크나 peak값이 낮았던 마커(JH53, JH8, JH6, JH29)의 프라이머 농도를 높여 다시 실험을 진행하였으나 별다른 차이를 보이지 않았다.
그룹 MS 마커 명 형광 dye Repeat type Size range (bp)
A' JH74 6-FAM (GT)11 di 100-200
JH50 6-FAM (AAC)10 tri 100-200
JH56 6-FAM (ATC)9 tri 200-300
JH53 6-FAM (ACT)19 tri 300-400
JH8 6-FAM (AAT)11 tri 300-400
BC' JH16 NED (AAT)13 tri 100-200
Hn2 NED (CA)16 di 200-300
JH32 VIC (AAT)12 tri 200-300
JH6 NED (ATT)12 tri 400-500
JH29 VIC (ATC)14 tri 400-500
JH5 PET (AC)21 di
JH27 VIC (GTT)15 tri 200-300
그룹 MS 마커 명 형광 dye Repeat type A' BC' ABC'
A' JH74 6-FAM di 126.63
131.01		 . 125.77
130.12
JH50 6-FAM tri 152.11 . 152.17
JH56 6-FAM tri 195.37
204.62		 . 195.31
204.6
JH53 6-FAM tri 262.01 . 262.1
263.87
JH8 6-FAM tri - . -
BC' JH16 NED tri . 143.46
146.79		 146.86
Hn2 NED di . 205.08
207.27		 205.11
207.32
JH32 VIC tri . 267.42
278.87		 267.83
278.97
JH6 NED tri . 317.04
320.33		 -
JH29 VIC tri . - -
JH5 PET di . 224.1
231.88		 -
JH27 VIC tri . 203.39
216.68		 203.41
216.7
3-3. 형광표지된 MS 마커 그룹 구성 3
앞의 조합에서 peak value가 확인되지 않은 JH8과 JH29를 제외하여 그룹을 구성하였고 둥근전복 4마리에 적용시켜 multiplex PCR를 수행하였다. 둥근전복 4마리의 개체에서 A3, BC3 그룹에 속한 마커들의 높은 peak value를 전체적으로 확인할 수 있었다(표 20). 다만, JH50의 경우 둥근전복 D3에서는 peak를 확인할 수가 없었다. ABC3 조합을 살펴보면, JH53의 경우 peak value가 다른 6-FAM 마커들의 비해 그 값이 340 내지 1620으로 낮았다(표 13). JH6의 경우 peak를 확인 할 수 없었다. VIC으로 표지한 마커의 peak value는 1000이하로 매우 낮았다. 다시 말해 A3, BC3 그룹을 각각 적용하였을 때는 그룹에 포함되어 있는 마커의 peak value를 확인할 수 있었으나 ABC3 조합으로 한꺼번에 적용된 실험에서는 peak가 확인되지 않거나 그 값이 낮은 마커들이 나타났다. 이번 실험 결과를 토대로 A3 그룹에서 JH74, JH50, JH56, JH53의 4개 마커 및 BC3 그룹에서 JH16, Hn2, JH32, JH6, JH5, JH27의 6개 마커가 전복 genomic DNA에 동시에 적용되는 것을 확인하였다.
그룹 MS 마커 명 형광 dye Repeat type D1 D3 D4 D5
A3 JH74 6-FAM di 127.78
129.94		 130.93
133.01		 133.08
135.18
(132.14/134.22)		 125.72
130.05
(126.64/130.98)
JH50 6-FAM tri 149.09
175.33		 148.87
151.91		 151.93 151.91
JH56 6-FAM tri 195.28
204.44
210.74		 210.69
216.89
(220.08)		 195.33
207.59		 195.32
204.6
JH53 6-FAM tri 256.1
267.42		 239.88
251.26		 255.98
258.76		 261.87
263.68
BC3 JH16 NED tri 146.84
150.19		 146.5
153.17		 146.51
153.15
(165.18)		 143.36
146.74
Hn2 NED di 207.232209.1
(205.26)		 207.15
211.13
(205.15)		 205.02
207		 205.06
207.22
JH32 VIC tri 272.22
278.97		 281.53
295.55		 264.69
270.22		 267.61
278.81
JH6 NED tri 304.44 304.3 301.09
304.34
(289.42/292.42)		 317.08
320.31
JH5 PET di 201.88
216.1		 213.78
215.77
(223.77/225.74)		 207.94
209.92		 223.84
231.76
JH27 VIC tri 210.04
213.4		 193.59
196.66		 203.22
206.53
(213.12/216.4)		 203.38
216.53
그룹 MS 마커 명 형광 dye Repeat type D1 D3 D4 D5
ABC3 JH74 6-FAM di 127.72
129.86		 130.04
132.13		 132.2
134.27		 125.74
130.13
JH50 6-FAM tri 149.09
175.33		 148.77
151.83		 152.01 152.01
JH56 6-FAM tri 195.28
204.54
210.75		 210.73
216.96
(220.06)		 195.27
207.57		 195.27
204.45
JH53 6-FAM tri 256.16
[～839]
267.53
[～638]		 239.75
[～1358]
251.19
[～1620]		 256.1
[～1033]
258.93
[～834]		 261.7
[～601]
263.53
[～340]
JH16 NED tri 146.74
150.1		 146.4
153.27		 146.53
153.24		 143.35
146.74
Hn2 NED di 207.18
209.06
(205.1)		 207.13
211.11
(205.14)		 205.02
207		 205.02
207.19
JH32 VIC tri - 281.53
[～281]
295.55
[～217]		 264.76
[～520]
270.33
[～346]		 267.53
[～332]
278.76
[～192]
JH6 NED tri - - - -
JH5 PET di 201.8
[～700]		 215.83
[～582]		 207.94
[～285]
210.02
[～948]		 -
JH27 VIC tri 209.91
213.28		 193.59
[～680]
196.66		 206.53
216.5		 203.31
216.4
3-4. 새롭게 형광표지된 MS 마커 그룹
앞의 실험에서 10개의 MS 마커(JH74, JH50, JH56, JH53, JH16, Hn2, JH32, JH6, JH5, JH27)를 선정하였으나 목표치보다 부족하여 형광 표지된 MS 마커를 추가적으로 더 선별하고자 하였다. 기존 실험을 통해 MS 마커의 크기가 300 bp 이상일 경우 peak 분석에는 적절하지 않다는 것을 인지하고 앞에서 탈락시켰던 JH8, JH2, JH15, JH1, JH29, JH14에 대한 프라이머쌍을 다시 설계하여 증폭크기를 줄이는 방향으로 실험을 진행하였다. 이때 증폭크기는 6개의 마커가 서로 비슷하도록 하였고 다른 형광 dye를 표지하였다(표 22). 새롭게 설계된 프라이머쌍을 가진 그룹은 NEW로 명명하고 A3, BC3와 함께 NEW 그룹을 조합하여 multiplex PCR를 진행하였다. 개별 마커의 peak와 multiplex PCR로 한꺼번에 증폭한 산물의 peak를 비교하여 나타내었다(표 15). JH1의 경우 multiplex PCR에서는 peak가 확인되지 않았고 다른 5개 마커의 peak는 적절한 값으로 확인되었다. BC3 그룹에 NEW 그룹의 4개 마커(JH8, JH2, JH1, JH14)를 조합하였을 때 10개의 마커 모두 완벽하게 증폭되었으며 peak value도 높게 확인되었다. A3와 NEW 그룹을 조합한 경우 JH53, JH1의 경우 peak가 확인되지 않았으며 JH50, JH56, JH29, JH14의 경우 peal value가 다소 낮았으나 그 값은 확인되었다. 그 외 나머지 5개의 마커는 peak value를 확실히 확인할 수 있었다.
그룹 MS 마커 명 형광 dye 프라이머쌍 Repeat type Size range (bp)
NEW JH8 PET JH8-F2 (AAT)11 tri 100-200
JH8-R2
JH2 PET JH2-F2 (AGT)17 tri 100-200
JH2-R2
JH15 PET JH15-F2 (GT)15 di 100-200
JH15-R2
JH1 PET JH1-F2 (ACT)22 tri 200-300
JH1-R2
JH29 VIC JH29-F2 (ACT)14 tri 200-300
JH29-R2
JH14 VIC JH14-F2 (AAT)17 tri 100-200
JH14-R2
그룹 MS 마커 명 형광 dye Repeat type Individual peaks Multiplex peaks
NEW JH8 PET tri 151.44
163.21		 151.43
163.18
JH2 PET tri 120.87
117.8		 120.74
117.67
JH15 PET di 204.99
198.11		 204.87
198.2
JH1 PET tri 297.55
294.69		 -
JH29 VIC tri 166.68
178.46		 166.63
178.42
JH14 VIC tri 130.11
133.18
(118.15/115.15)		 130.13
133.17
(118.13/115.17)
그룹 MS 마커 명 형광 dye Repeat type Individual peaks Multiplex peaks

D
(BC3+
NEW)		 JH16 NED tri 146.74
143.36		 146.58
143.23
Hn2 NED di 205.06
207.22		 204.92
207.09
JH32 VIC tri 267.61
278.81		 267.08
278.35
JH6 NED tri 317.08
320.31		 316.51
319.7
JH5 PET di 223.84
231.76		 223.4
231.21
JH27 VIC tri 203.38
216.53		 203.12
216.12
JH8 PET tri 151.44
163.21		 151.45
163.31
JH2 PET tri 120.87
117.8		 120.8
117.71
JH1 PET tri 297.55
294.69		 297.55
294.67
JH14 VIC tri 130.11
133.18
(118.15/115.15)		 129.21
132.27
(117.24/114.36)
그룹 MS 마커 명 형광 dye Repeat type Individual peaks Multiplex peaks
E
(A3+
NEW)		 JH74 6-FAM di 126.64
130.98		 125.63
130.06
(119.94)
JH50 6-FAM tri 151.91 152.01
JH56 6-FAM tri 195.32
204.6		 195.25
204.41
JH53 6-FAM tri 261.87
263.68		 0
JH8 PET tri 151.44
163.21		 151.53
JH2 PET tri 120.87
117.8		 120.69
117.72
JH15 PET di 204.99
198.11		 204.97
198.21
JH1 PET tri 297.55
294.69		 0
JH29 VIC tri 166.68
178.46		 166.82
178.51
JH14 VIC tri 130.11
133.18
(118.15/115.15)		 130.11
(119.85)
실시예 4. MS 마커군 최종 선정
앞의 실험을 종합하자면 A3 그룹의 6-FAM으로 표지된 마커를 multiplex PCR와 Genescan에 적용하였을 때 각각에 대한 피크를 정확하게 구분할 수 있었다. BC3+NEW(D) 조합에 대한 peak 분석 결과 조합에 속한 10개의 마커가 해당하는 형광 peak를 정확하게 구분할 수 있었다. 그러나 A3+NEW(E) 조합에서는 peak 분석 결과는 다른 조합에 비해 좋지 못하였고 peak가 확인되지 않는 경우나 그 값이 너무 약한 경우가 확인되었다. 추측하건데 6-FAM으로 표지된 프라이머가 다른 마커의 증폭을 방해하는 것으로 생각된다. 이 조합에서는 6-FAM으로 표지된 A3의 4개 마커만이 정확하게 증폭되어 peak value를 나타내었다. 이러한 결과를 토대로 A3 그룹의 마커 4개와 BC3+NEW(D) 그룹의 마커 10개가 포함된 2그룹 14개의 마커가 최종 선정되었다(표 26). 이들 마커는 4종 전복에 모두 적용할 수 있어 종구별에 사용하거나 유전자 다양성을 분석하는데 이용하고자 하였다.
그룹 MS 마커 명 형광 dye 프라이머쌍 Sequence
(5'-3')		 Repeat type
A3 JH74 6-FAM JH74-F CCGCACCTCTTCTGTTGTGTGA (GT)11 di
JH74-R2 TCCTCGCCACTTGACTCACG
JH50 6-FAM JH50-F GACACGCATTCTATTGCAATTGCAACATGA (AAC)10 tri
JH50-R CATTTGTGCCAACTGCATGAGAGCA
JH56 6-FAM JH56-F CAGCTATTTGATGGCGGTCCATGA (ATC)9 tri
JH56-R GCACTATACCTTGCTCGTTGGCA
JH53 6-FAM JH53-F CCGCTGAATAAAGGCTTATGGTCTTGG (ACT)19 tri
JH53-R TCATACCCCGGACCTGAATATGAAGGA
D
(BC3+
NEW)		 JH16 NED JH16-F GACTGAACTCTAAGACCTGAAGACGTGTCC (AAT)13 tri
JH16-R2 TGTAGCGCTATGAGCATCCATTATAAATGCA
Hn2 NED Hn2-F ACATGTCGTGATTGTTTCCCAC (CA)16 di
Hn2-R TCCTGACCACATACTGTTCACATTAG
JH32 VIC JH32-F CCGGACCAAGCTGTAACAGAACAA (AAT)12 tri
JH32-R GGAGGTCCATGATGATGACAACCTTC
JH6 NED JH6-F CGATGCTGTTGTGCCCTCATAGTAC (ATT)12 tri
JH6-R ACCCTAGGCAATATAGTCAAGATAAGTATCCGA
JH5 PET JH5-F ACGCTGGAGGTAGATGGTTTGTAGA (AC)21 di
JH5-R CTCGCTGCTCACATCAAACAGTGA
JH27 VIC JH27-F CCAGTGGCAAGGGTAATAATAACGCTTTGAG (GTT)15 tri
JH27-R TCAGCAACATTCCAGCTCAACATGG
JH8 PET JH8-F2 CACTGTTACCAAGTCCCATCAAAGGTTCAG (AAT)11 tri
JH8-R2 CGAGCTATTGCTGTAATAACTGAACTCTTTAAGGTGG
JH2 PET JH2-F2 CGAGAGTCATACATCATTAGGCCCTTCG (AGT)17 tri
JH2-R2 AACCTCCGGTTTCCTGGTACTCAAT
JH1 PET JH1-F2 GCCTGACAAGACAAACTGATCCATTGG (ACT)22 tri
JH1-R2 ACAGGTCAGGTCGGTACACTGT
JH14 VIC JH14-F2 CGAAGCTCCAGGGTTATAGTTCCATTTGATTG (AAT)17 tri
JH14-R2 CGCCATTGCTGCTTGCAGCTTTAAT
실시예 5. 종 구별
4종 39마리의 전복으로부터 추출한 genomic DNA와 앞서 개발된 MS 마커 조합(2그룹 14개 마커)에 적용하여 multiplex PCR를 진행하였다. PCR조건과 조성은 앞에 언급된 내용과 같다. 두 그룹의 PCR 산물은 동량으로 혼합하여 마크로젠에 보내 fragment analysis를 진행하였다. 마크로젠에서 제공된 peak value 결과는 Peak Scanner software 2로 분석하여 개체와 마커에 따른 대립유전자(allele)를 확인하였다. 이 결과 값을 Excel과 Microsatellites toolkit add-in Excel로 정렬하고 GenAIEx 6.5 (Genetic Analysis in Excel) 프로그램으로 마커의 분포와 빈도, 유전적 거리 등을 분석하였다. 계산된 값을 활용하여 MEGA 6.0으로 UPGMA 방법의 계통수를 작성하여 도 60에 나타내었다.
도 60에서 확인할 수 있듯이, 우리나라에서 서식하는 전복 중에서 말전복은 다른 전복과 뚜렷이 구분되고 다른 전복의 경우 그 종마다의 cluster를 형성하는 것을 확인하였다.
2그룹 14개의 MS 마커군을 사용하여 multiplex PCR를 수행하였고 증폭산물에 대한 전복 개체별, 마커별 peak value(대립유전자; allele)를 분석하여, 그 결과를 하기 표 17에 나타내었으며, 전복 종에 따라 각 마커의 대립유전자 빈도를 계산하여 도 47 내지 59에 나타내었다.
명명 JH74 JH50 JH56 JH53 JH16 Hn2 JH6 JH2 JH8 JH5 JH1 JH14 JH27 JH32
D1 128 149 195 256 147 207 301 106 157 202 268 120 209 271
130 176 204 268 150 209 304 109 175 216 274 123 212 280
D2 124 152 195 259 147 209 298 109 160 230 298 117 209 268
128 152 207 268 159 213 301 115 187 232 331 117 212 280
D3 130 149 210 241 147 207 301 106 151 216 271 111 194 280
132 152 216 250 153 211 304 109 163 226 274 123 197 295
D4 132 152 195 256 147 205 289 106 175 208 268 117 206 265
134 152 207 259 153 207 304 109 187 210 295 117 215 271
D5 126 152 195 259 144 205 316 118 151 224 295 114 203 268
130 152 204 262 147 207 319 121 163 232 298 117 215 277
D6 118 152 195 241 141 211 298 112 160 212 265 117 191 277
126 161 207 259 144 223 301 127 190 218 271 126 191 292
D7 126 149 195 259 138 211 301 106 136 208 265 120 203 271
126 152 204 295 150 209 298 112 172 224 271 117 200 295
D8 126 152 195 256 150 211 274 106 166 224 286 111 200 268
124 152 204 259 156 207 310 109 187 222 295 117 206 265
D9 122 149 195 259 159 207 292 115 169 220 283 117 203 271
128 152 207 265 156 217 301 121 187 226 274 120 206 268
D10 126 152 195 259 132 211 310 - 166 212 271 153 203 277
124 152 207 265 150 207 307 - 175 224 277 147 200 277
명명 JH74 JH50 JH56 JH53 JH16 Hn2 JH6 JH2 JH8 JH5 JH1 JH14 JH27 JH32
Hn1 124 149 195 241 147 209 310 106 142 214 304 105 200 271
126 152 204 259 150 217 307 115 154 228 301 111 203 289
Hn2 120 149 195 253 135 207 295 124 157 202 268 114 200 283
128 149 207 256 153 213 310 127 163 226 286 120 206 313
Hn3 126 149 195 265 159 215 313 106 157 222 292 129 203 292
128 152 204 292 162 217 316 112 175 224 295 132 215 298
Hn4 126 149 195 253 147 205 313 103 157 216 280 108 200 277
132 149 204 256 150 207 319 115 160 220 283 111 221 286
Hn5 126 149 195 247 129 211 319 136 166 240 274 114 197 277
130 152 207 250 150 209 301 121 205 242 277 123 203 301
Hn6 128 152 195 274 138 207 292 91 154 216 274 114 203 274
126 176 210 256 153 205 289 112 151 226 271 120 191 295
Hn7 130 149 195 256 147 211 301 130 154 218 295 108 161 283
126 152 207 259 150 205 322 124 157 204 292 111 203 298
Hn8 126 149 195 259 147 211 292 106 160 202 283 93 203 274
130 149 207 262 144 209 319 109 154 240 289 90 212 283
Hn9 132 149 195 259 147 211 295 109 154 230 280 129 206 277
122 152 210 262 159 209 322 106 154 202 304 132 215 274
Hn10 126 149 195 253 129 211 295 109 154 226 268 138 188 283
122 152 207 256 126 209 307 106 157 236 274 129 206 265
명명 JH74 JH50 JH56 JH53 JH16 Hn2 JH6 JH2 JH8 JH5 JH1 JH14 JH27 JH32
K1 126 176 210 256 132 207 289 148 202 232 268 126 191 274
128 176 216 253 135 221 304 148 199 230 271 132 209 280
K2 132 152 204 244 138 207 295 103 136 206 289 108 194 277
128 152 204 253 156 211 298 106 157 228 277 111 209 274
K3 122 173 210 268 147 207 274 109 142 204 259 114 191 277
124 179 210 268 159 209 289 106 142 202 262 111 197 280
K4 124 152 204 262 144 207 274 88 151 210 265 105 191 295
122 176 210 274 147 223 271 100 157 228 262 114 203 307
K5 134 152 210 256 150 211 292 97 160 220 268 90 155 271
132 152 213 262 156 207 307 94 157 224 298 108 188 277
K6 122 152 195 244 144 207 274 97 154 204 265 117 191 277
124 152 210 253 147 219 289 94 151 202 262 111 197 274
K7 124 173 195 - 147 207 289 100 154 210 274 108 191 286
122 176 210 - 159 217 286 112 160 212 271 120 218 292
K8 122 149 213 250 147 207 286 112 154 204 268 117 203 295
120 152 216 256 159 219 316 115 151 228 298 111 251 292
K9 128 152 222 244 147 209 301 97 157 212 274 111 185 286
132 179 225 259 150 217 307 115 166 226 280 114 209 301
K10 118 152 195 259 147 207 289 100 154 216 259 90 200 274
122 152 210 268 150 217 307 115 151 230 256 120 203 271
명명 JH74 JH50 JH56 JH53 JH16 Hn2 JH6 JH2 JH8 JH5 JH1 JH14 JH27 JH32
H1 120 149 198 247 150 215 298 106 160 194 268 90 185 277
118 149 201 253 156 221 313 112 178 196 274 105 182 286
H2 114 149 201 247 171 221 304 115 160 196 274 96 185 268
112 161 204 253 168 219 310 118 157 194 283 114 206 271
H3 120 152 198 244 147 219 298 109 160 194 271 108 191 274
122 158 204 250 162 221 307 115 160 196 295 117 194 277
H4 120 149 201 256 150 219 304 115 148 194 271 108 191 262
122 152 210 262 153 221 307 118 151 196 292 117 194 286
H5 102 158 204 247 159 219 301 106 151 188 292 105 185 277
128 164 204 250 165 221 304 118 163 190 295 114 188 283
H6 120 158 195 250 135 219 298 97 151 194 268 114 185 277
122 161 204 253 153 221 301 103 163 194 271 120 194 289
H7 114 149 195 247 132 213 310 97 154 194 274 114 200 268
122 152 204 250 138 219 307 118 157 198 286 123 209 280
H8 120 149 195 244 153 213 298 103 160 194 271 99 185 271
122 158 198 247 156 221 304 106 163 196 280 114 200 262
H9 114 149 195 250 156 209 295 112 157 190 271 108 185 262
120 152 210 256 174 219 298 127 160 194 274 117 197 271
전체적으로 말전복에서 나타나는 마커별 대립유전자 유형과 빈도는 다른 전복과는 다소 상이하였고 둥근전복, 북방전복, 왕전복의 경우 그 유형과 빈도가 유사했으나 종에 따른 차이가 있는 것으로 보인다. 이를 토대로 전복 39마리의 개체에 대한 계통수를 작성하였다(도면 60). 말전복의 경우 하나의 뚜렷한 말전복만의 cluster를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 둥근전복, 북방전복, 왕전복의 경우 cluster가 서로 혼재되어있는 것으로 보였으나 몇몇을 제외한 대부분의 개체는 종에 따라 각기 다른 cluster를 이루는 것으로 보인다. 그러나 그 구분이 말전복과 같이 뚜렷하게 구분되는 것은 아니다. 둥근전복, 북방전복, 왕전복의 cluster에 포함되지 않는 개체들은 자연 상태에서 서로 교잡된 개체일 것이라 추측된다.
Locus(대립유전자 유형)에 대한 종별 이형접합성(heterozygosity)와 PIC (polymorphism information content)을 분석하였다(표 31).
Locus 유전적 다양성 둥근전복 북방전복 왕전복 말전복
JH74 He 0.868 0.811 0.858 0.817
Ho 0.900 1.000 1.000 1.000
PIC 0.804 0.744 0.792 0.739
JH50 He 0.489 0.542 0.668 0.778
Ho 0.500 0.700 0.500 0.889
PIC 0.420 0.424 0.595 0.692
JH56 He 0.726 0.689 0.811 0.817
Ho 1.000 1.000 0.800 0.889
PIC 0.640 0.603 0.744 0.736
JH53 He 0.821 0.895 0.908 0.837
Ho 1.000 1.000 0.889 1.000
PIC 0.758 0.834 0.841 0.759
JH16 He 0.895 0.900 0.847 0.954
Ho 1.000 1.000 1.000 1.000
PIC 0.833 0.840 0.783 0.893
Hn2 He 0.816 0.858 0.779 0.719
Ho 1.000 1.000 1.000 1.000
PIC 0.744 0.790 0.714 0.622
JH6 He 0.884 0.937 0.911 0.863
Ho 1.000 1.000 1.000 1.000
PIC 0.824 0.880 0.852 0.790
JH2 He 0.850 0.916 0.932 0.902
Ho 1.000 1.000 0.900 1.000
PIC 0.776 0.858 0.874 0.834
JH8 He 0.932 0.832 0.895 0.843
Ho 1.000 0.900 0.900 0.889
PIC 0.874 0.765 0.833 0.769
JH5 He 0.942 0.958 0.947 0.693
Ho 1.000 1.000 1.000 0.889
PIC 0.886 0.903 0.891 0.603
JH1 He 0.921 0.953 0.942 0.876
Ho 1.000 1.000 1.000 1.000
PIC 0.862 0.897 0.886 0.806
JH14 He 0.784 0.937 0.900 0.889
Ho 0.800 1.000 1.000 1.000
PIC 0.722 0.880 0.839 0.821
JH27 He 0.916 0.884 0.911 0.869
Ho 0.900 1.000 1.000 1.000
PIC 0.856 0.824 0.852 0.802
JH32 He 0.879 0.932 0.911 0.908
Ho 0.900 1.000 1.000 1.000
PIC 0.813 0.875 0.850 0.842
* He = Expected heterozygosity, Ho = Observed heterozygosity, PIC = Polymorphism Information Content
각 MS 마커의 locus 마다의 H e (expected heterozygosity) 또는 H o (observed heterzygosity) 값을 보면 종에 상관없이 0.7 이상의 높은 값을 보인다. 단, JH50의 경우는 다른 마커에 비해 낮았다. 마커의 PIC 값은 종에 상관없이 JH50을 제외한 나머지에서 0.6이상으로 높게 나타났다. 마커의 PIC 값이 높다는 것은 그 마커 부위의 유전적 다양성이 높다는 것을 의미하며 마커 서열 내의 반복되는 부분이 다양하다는 것을 반영한다.
실시예 6. 전복의 유전자 다양성 분석
6-1. 전복 조직 채취 및 genomic DNA 추출
모패로 사용할 수 있는 4종의 전복은 제주특별자치도 해양수산연구원 수산종묘연구센터에서 수집하였고 각 전복 개체를 식별을 할 수 있도록 동물용 태그 SMC-S1321(S-RFiD)를 전복 패각에 경화수지를 사용하여 부착하였다. 전복의 암수 구분이 가능한 경우 성별을 확인하였고 tentacle이 있는 근육 부위 일부를 절제하였다. 절제한 조직은 드라이아이스에서 냉동시키고 genomic DNA를 추출하기 전까지 -20에서 보관하였다. 냉동된 조직은 10～25 mg으로 잘라 QIAGEN(독일)의 QIAamp DNA Mini Kit를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 25 또는 50 ng/㎕로 희석하여 multiplex PCR에 사용하였다.
6-2. Multiplex PCR 및 genotyping
개발된 14개의 MS 마커를 활용하여 Multiplex PCR를 진행하였다. 먼저 전복 genomic DNA 2 또는 4 ㎕(총 100 ng), 10X 프라이머 혼합물(A3그룹 또는 D그룹, 각 프라이머의 최종농도 0.2 umole/㎕) 3 ㎕, RNase-free water 8 또는 6 ㎕, 2X Type-it multiplex PCR master mixture 15 ㎕를 혼합하여 총 부피 30 ㎕의 PCR 조성물을 준비하였다. PCR 진행은 95에서 5분간 반응시킨 뒤 95에서 30초, 58 에서 90초, 72에서 30초간 총 30회에 걸쳐 서열을 증폭시키고 마지막으로 60에서 30분간 안정화시켜 마무리하였다. 한 전복 개체로부터 얻어진 2개 그룹의 PCR 산물은 2% agarose gel에서 증폭여부를 확인한 뒤 동량으로 하나의 tube에 혼합하고 마크로젠에 보내 Genescan service를 의뢰하였다. 전복 개체마다의 Genescan 결과는 Peak scanner 2로 분석하여 각 MS 마커 locus에 대한 대립유전자형을 확인하였다.
6-3. 자료의 통계분석
먼저 Peak scanner 2로 분석된 MS 마커 locus에 대한 대립유전자형(raw data)을 Excel로 정리하고 GenAIEx version 6.5 (ROD Peakall and Peter E Smouse, 2006)로 data의 오류를 확인하였다. CERVUS version 3.0.7 (TC Marshall et al., 1998)로 MS 마커에 대한 다형성지수인 관측이형접합성(관측이형접합률, observed heterozygosity; H o ), 기대이형접합성(기대이형접합률, expected heterozygosity; H e ) 다형성정보지수(Ploymorphism information content; PIC)를 계산하였으며 FSTAT version 2.9.3 (J Goudet, 1995)로 F-Statistics를 분석하였다. 4종 전복에 대한 유전자 다양성을 분석하기 위하여 CERVUS version 3.0.7과 GenAlEx version 6.5로 MS 마커 locus에 대한 대립유전자유형과 빈도를 계산하였으며, MS 마커별 이형접합성과 다형성은 GenAlEx version 6.5로 분석하였다. 전복 1467마리에 대한 집단 및 개체별 요인대응분석(Factorial Components Analysis, FCA)과 집단 유전적거리(Nei's genetic distance 1978)는 GENETIX version 4.05 (K Belkhir et al., 1996)로 분석하였다. UPGMA tree를 작성하기 위해 GenAlEx version 6.5로 개체별 유전적 거리를 계산하고 이를 MEGA 6.0으로 불러드려 dendrogram를 작성하였다.
6-4. 결과1 MS 마커의 다형성
태그를 부착한 전복은 총 1,467마리로 둥근전복 831 마리, 북방전복 191 마리, 왕전복 10마리, 말전복 435 마리로 확인되었다(표 19). 교잡을 위한 모패로 수집되었기 때문에 폐사에 이르는 상처가 되지 않도록 tentacle이 존재하는 근육 조직 일부를 절제하였고 모든 개체로부터 genomic DNA를 분리하였다. 이를 대상으로 14종의 MS 마커를 활용하여 종간 또는 집단 간의 유전적 다양성을 분석하였다. 14종의 MS 마커에 대한 대립유전자 수(No. of allele), 관측이형접합성(관측이형접합률, observed heterozygosity; H o ), 기대이형접합성(기대이형접합률, expected heterozygosity; H e ) 다형성정보지수(Polymorphism information content; PIC), F-statistics 등을 계산하였다(표 20). MS 마커에 대한 이형접합성 값이 0.6 이상이고 PIC 값이 0.5 이상일 때 높은 다형성을 가지고 있다고 하며, F-statistics은 유전적 고정에 따른 근친도 및 집단 간의 차별성 여부를 나타내고 값이 클수록 집단 내에 속한 개체들 간의 상관정도가 높고 반대로 값이 낮을수록 상관정도가 낮다는 것을 의미한다. 전복의 14개 MS 마커에 대한 평균 대립유전자의 수는 20.214개로 최소 12개(JH56)에서 최대 34개(JH34)까지 다양한 대립유전자 유형이 확인되었다. H o 와 H e 값은 각각 평균 0.8829, 0.8675로 매우 높았고 PIC도 평균 0.8528로 확인되어 14개의 MS 마커가 높은 다형성을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 다만 JH50의 경우 H o 의 값이 0.597, H e 값이 0.658, PIC 값이 0.604로 다른 마커에 비해 낮은 값을 보였다. 각 MS 마커에 대하여 F-statistics 값을 살펴보면 Fit(F)은 평균 -0.005로 낮아 전체 집단에서 유전적 고정 정도가 낮은 것으로 판단되며, Fst(θ)는 평균 0.029로 집단 간의 유전적 유사도도 역시 낮으며, Fis(f)는 평균 -0.036으로 집단 내 근친화가 낮다는 것이 확인되었다.
종명 출처 표기 수량(마리) 합계 (마리)
둥근전복
(H. discus discus)		 자연산 DW 67 831
양식산 DA 516
중국산 DC 248
북방전복
(H. discus hannai)		 양식산 HnA 191 191
왕전복 (H. madaka) K 10 10
말전복
(H. gigantea)		 자연산 HW 271 435
양식산 HA 164
합계(마리) 1467
Locus No. of allele Ho He PIC Fit(F) Fst(θ) Fis(f) allele size (bp)
JH74 16 0.981 0.841 0.823 -0.153 0.029 -0.187 102-136
JH50 15 0.597 0.658 0.604 0.120 0.070 0.054 134-185
JH56 12 0.947 0.815 0.790 -0.145 0.035 -0.187 195-228
JH53 22 0.920 0.897 0.888 -0.016 0.020 -0.038 235-298
JH16 20 0.967 0.887 0.876 -0.082 0.020 -0.104 126-183
Hn2 19 0.978 0.889 0.879 -0.074 0.054 -0.136 203-247
JH6 17 0.908 0.886 0.875 -0.018 0.017 -0.036 274-331
JH2 20 0.911 0.868 0.854 -0.046 0.009 -0.055 85-142
JH8 21 0.888 0.914 0.907 0.036 0.016 0.020 136-199
JH5 34 0.764 0.939 0.935 0.204 0.050 0.162 188-254
JH1 26 0.833 0.899 0.891 0.083 0.021 0.062 256-334
JH14 21 0.825 0.881 0.869 0.069 0.015 0.055 90-159
JH27 16 0.918 0.884 0.873 -0.015 0.054 -0.073 182-227
JH32 24 0.923 0.888 0.877 -0.036 0.008 -0.045 247-331
Mean 20.214 0.8829 0.8675 0.8528 -0.005 0.029 -0.036 -
Ho: Observed heterozygosity calculated by Cervus 3.0.7, He: Expected heterozygosity calculated by Cervus 3.0.7, PIC: Polymorphism information content calculated by Cervus 3.0.7, Fis/Fit/Fst: F-statistics calculated by FSTAT ver 2.9.3
6-5. 결과 2 전복 4종에 대한 유전자 다양성
전복 개체 또는 집단에 따른 유전적 특성을 분석하고자 먼저 전복 4종 각각에 대한 14개 MS 마커의 대립유전자 유형과 빈도를 확인하였다(표 21).
JH74 locus에 대한 전복의 대립유전자는 총 16개로 102-136 bp의 범위를 보였다. 전체적으로 보았을 때 빈도가 높은 대립유전자는 122(빈도 0.2713), 126(0.1997), 120(1333), 128(1.1154)이며 둥근전복에서는 16개의 대립유전자가 모두 확인되었고 다른 전복에서는 빈도가 0인 대립유전자 유형이 많이 확인되었다. 둥근전복에서는 대립유전자 122가 빈도 0.308로 가장 많았으며 북방전복에서는 126(0.218), 왕전복에서는 122(0.450), 말전복에서는 126(0.287)로 확인되었다. JH50 locus의 대립유전자는 총 15개로 134-185 bp의 범위가 확인되었고 전체 개체에서 152의 빈도가 0.4774, 149은 빈도 0.3231로 매우 높았다. 둥근전복에서는 대립유전자형이 15개 모두가 확인되었으며 149(0.387)와 152(0.375)의 빈도가 높았고 북방전복에서는 152(0.461)와 149(0.332)가 높은 빈도로 확인되었다. 왕전복에서의 대립유전자형은 15개 중 3개만이 확인되었으며 152가 빈도 0.600으로 가장 높았고 149는 0.250, 161은 0.150의 빈도를 보였다. 말전복에서는 152가 0.676으로 매우 높았으며 149는 0.198의 빈도로 확인되었다. 12개의 대립유전자형이 확인된 JH56 locus에서는 195-228 bp의 범위 중에서 195와 207이 각각 0.2815, 0.2110의 빈도를 높였다. 둥근전복에서는 195(0.206), 198(0.198), 207(0.195)이 높은 빈도로 확인되었고 북방전복에서는 195(0.401), 207(0.207), 204(0.186)가, 왕전복에서는 198(0.300), 195(0.200)가, 말전복에서는 195(0.376), 207(0.245), 204(0.218)의 빈도가 높게 나타났다. JH53 locus의 대립유전자형은 22개로 235-298 bp의 넓은 범위를 보였다. 둥근전복에서는 대립유전자형 247과 259가 각각 빈도 0.205, 0.169로 확인되었고 북방전복에서는 259(0.193), 268(0.193)이, 왕전복에서는 259(0.250)가, 말전복에서는 259(0.155), 268(0.148)이 다른 대립유전자형에 비해 높은 빈도로 나타났다. JH16 locus에 대한 대립유전자형은 전복 4종에서 20개로 126-183 bp의 범위로 나타났다. 둥근전복에서는 153이 0.234의 빈도를 보였고 북방전복에서는 141이 빈도 0.216, 왕전복에서는 135가 빈도 0.200, 말전복에서는 147이 빈도 0.172를 나타내었다. 북방전복 microsatellite 서열을 참고하여 설계된 Hn2 locus에서는 총 19개의 대립유전자형이 확인되었으며 서열범위는 203-247 bp이다. 둥근전복에서는 221 유형이 0.216의 빈도로 높았고 북방전복에서는 207이 0.285의 빈도를, 왕전복에서는 207이 0.350의 빈도를, 말전복에서도 207이가 0.283의 높은 빈도를 보였다. 274～331 bp 범위와 17개의 대립유전자형을 보인 JH6 locus에 대하여 둥근전복에서는 298 유형이 빈도 0.162로 높았고 북방전복에서는 301가 빈도 0.265로, 왕전복에서는 298이 빈도 0.300으로, 말전복에서는 301이 빈도 0.202로 확인되었다. 20개의 대립유전자형이 확인된 JH2 locus의 증폭범위는 85-142 bp로 매우 짧았고 전체적으로 109의 빈도가 높았으며 둥근전복에서 0.209, 북방전복에서 0.261, 왕전복에서는 0.350, 말전복에서는 0.202의 빈도로 확인되었다. JH8 locus는 21개의 대립유전형으로 나타났고 그 범위는 136-199 bp로 확인되었다. 둥근전복에서는 151 유형이 빈도 0.162로 확인되었고, 북방전복에서는 172 유형이 빈도 0.209를, 왕전복에서는 187 유형이 0.300, 말전복에서는 163 유형이 0.130의 빈도로 전복 종마다 우세한 대립유전자형이 다르게 확인되었다. JH5 locus의 경우 14개의 마커 중에서 대립유전자형이 제일 다양한 34개로 확인되었으며 증폭범위는 188-254 bp이다. 둥근전복에서는 196 유형이 0.217의 빈도를 보였으며 북방전복에서는 214와 218이 각각 빈도 0.129, 0.126로, 분석된 개체수가 적어 34개의 대립유전자형 중에서 5개의 유형만이 확인된 왕전복에서는 214가 빈도 0.350로 확인되었고 말전복에서는 특정 대립유전자형이 우세를 보이지는 않았다. 26개의 대립유전자형을 가진 JH1 locus의 증폭범위는 256-334 bp로 둥근전복에서는 271 유형이 빈도 0.201로 높았고 북방전복과 왕전복, 말전복에서는 295 유형이 각각 0.242, 0.444, 0.256의 높은 빈도를 보였다. JH14 locus의 증폭범위는 90-159 bp로 총 21개의 대립유전자형이 확인되었다. 둥근전복에서는 111이 0.152 빈도로, 북방전복은 120가 0.273, 왕전복은 117이 0.350, 말전복에서는 117이 0.187, 120이 0.172의 빈도로 확인되었다. 16개의 대립유전자형, 증폭범위 182-227 bp를 가진 JH27 locus인 경우 둥근전복에서는 185가 빈도 0.166, 북방전복에서는 206이 0.329의 빈도를, 왕전복에서는 206이 0.350, 말전복에서는 203 유형이 0.321의 빈도로 높게 나타났다. 마지막으로 JH32 locus는 24개의 대립유전자형과 247-331 bp의 증폭범위를 보였고 둥근전복에서는 277이 0.175의 빈도로, 북방전복에서는 265와 277이 각각 0.139, 0.132의 빈도로, 왕전복에서는 277과 283이 각각 0.250의 빈도, 말전복에서는 283이 빈도 0.208로 확인되었다.
Locus , No . of individuals and allele size ( bp ) population
JH74 All * D H M G
No. 1452 827 190 10 425
102 0.0014 0.002 0.000 0.000 0.001
106 0.0003 0.001 0.000 0.000 0.000
108 0.0017 0.003 0.000 0.000 0.000
112 0.0034 0.006 0.000 0.000 0.000
114 0.0403 0.069 0.000 0.000 0.004
116 0.0124 0.010 0.008 0.000 0.020
118 0.0389 0.031 0.111 0.000 0.024
120 0.1333 0.192 0.034 0.100 0.065
122 0.2713 0.308 0.216 0.450 0.221
124 0.0737 0.050 0.103 0.050 0.107
126 0.1997 0.149 0.218 0.300 0.287
128 0.1154 0.098 0.179 0.050 0.122
130 0.0713 0.053 0.068 0.000 0.111
132 0.0110 0.008 0.021 0.000 0.013
134 0.0255 0.021 0.042 0.050 0.026
136 0.0003 0.001 0.000 0.000 0.000
Locus , No . of individuals and allele size ( bp ) population
JH50 All * D H M G
No. 1461 826 191 10 434
143 0.0038 0.002 0.008 0.000 0.005
146 0.0065 0.010 0.000 0.000 0.002
149 0.3231 0.387 0.332 0.250 0.198
152 0.4774 0.375 0.461 0.600 0.676
155 0.0041 0.004 0.003 0.000 0.005
158 0.0746 0.119 0.018 0.000 0.017
161 0.0592 0.054 0.097 0.150 0.050
164 0.0110 0.009 0.034 0.000 0.005
167 0.0010 0.001 0.000 0.000 0.001
170 0.0007 0.001 0.000 0.000 0.001
173 0.0017 0.003 0.000 0.000 0.000
176 0.0243 0.022 0.037 0.000 0.023
179 0.0086 0.005 0.005 0.000 0.016
182 0.0027 0.004 0.003 0.000 0.001
185 0.0014 0.002 0.003 0.000 0.000
Locus , No . of individuals and allele size ( bp ) population
JH56 All * D H M G
No. 1462 827 191 10 434
195 0.2815 0.206 0.401 0.200 0.376
198 0.1443 0.198 0.065 0.300 0.074
201 0.0793 0.107 0.045 0.100 0.041
204 0.1652 0.134 0.186 0.100 0.218
207 0.2110 0.195 0.207 0.150 0.245
210 0.0834 0.127 0.034 0.050 0.023
213 0.0120 0.015 0.010 0.050 0.007
216 0.0154 0.015 0.029 0.050 0.010
219 0.0055 0.005 0.013 0.000 0.003
222 0.0017 0.000 0.010 0.000 0.001
225 0.0003 0.000 0.000 0.000 0.001
228 0.0003 0.001 0.000 0.000 0.000
Locus , No . of individuals and allele size ( bp ) population
JH53 All * D H M G
No. 1434 808 187 10 429
235 0.0003 0.001 0.000 0.000 0.000
238 0.0084 0.011 0.005 0.000 0.006
241 0.0579 0.063 0.032 0.100 0.059
244 0.0324 0.047 0.000 0.050 0.019
247 0.1321 0.205 0.035 0.050 0.040
250 0.0384 0.051 0.005 0.100 0.028
253 0.0401 0.039 0.024 0.000 0.050
256 0.1151 0.093 0.168 0.000 0.136
259 0.1684 0.169 0.193 0.250 0.155
262 0.1175 0.105 0.139 0.100 0.133
265 0.0750 0.058 0.075 0.100 0.107
268 0.1196 0.087 0.193 0.150 0.148
271 0.0352 0.032 0.027 0.050 0.044
274 0.0380 0.021 0.086 0.050 0.049
277 0.0063 0.006 0.000 0.000 0.009
280 0.0056 0.004 0.000 0.000 0.010
283 0.0014 0.001 0.000 0.000 0.002
286 0.0045 0.004 0.013 0.000 0.002
289 0.0014 0.001 0.005 0.000 0.000
292 0.0014 0.002 0.000 0.000 0.000
295 0.0007 0.001 0.000 0.000 0.000
298 0.0003 0.000 0.000 0.000 0.001
Locus , No . of individuals and allele size ( bp ) population
JH16 All * D H M G
No. 1463 829 190 10 434
126 0.0003 0.000 0.000 0.000 0.001
129 0.0031 0.002 0.000 0.000 0.007
132 0.0284 0.026 0.008 0.000 0.043
135 0.0502 0.036 0.074 0.200 0.063
138 0.0697 0.077 0.100 0.050 0.044
141 0.1452 0.138 0.216 0.150 0.129
144 0.0899 0.062 0.116 0.100 0.131
147 0.1200 0.086 0.147 0.150 0.172
150 0.1470 0.181 0.079 0.100 0.113
153 0.1781 0.234 0.071 0.000 0.122
156 0.0468 0.045 0.026 0.100 0.059
159 0.0704 0.065 0.132 0.050 0.055
162 0.0355 0.028 0.026 0.100 0.052
165 0.0072 0.008 0.003 0.000 0.007
168 0.0017 0.002 0.003 0.000 0.001
171 0.0021 0.004 0.000 0.000 0.000
174 0.0017 0.002 0.000 0.000 0.001
177 0.0017 0.003 0.000 0.000 0.000
180 0.0003 0.001 0.000 0.000 0.000
183 0.0007 0.001 0.000 0.000 0.000
Locus , No . of individuals and allele size ( bp ) population
Hn2 All * D H M G
No. 1465 830 191 10 434
203 0.0072 0.002 0.024 0.000 0.010
205 0.0983 0.052 0.207 0.150 0.138
207 0.1802 0.100 0.285 0.350 0.283
209 0.1102 0.080 0.123 0.200 0.160
211 0.1249 0.108 0.099 0.150 0.167
213 0.0573 0.060 0.055 0.000 0.054
215 0.0829 0.082 0.081 0.000 0.088
217 0.0614 0.056 0.071 0.150 0.066
219 0.0846 0.144 0.000 0.000 0.010
221 0.1317 0.216 0.037 0.000 0.016
223 0.0488 0.081 0.010 0.000 0.006
225 0.0038 0.007 0.000 0.000 0.000
227 0.0014 0.002 0.000 0.000 0.000
229 0.0017 0.003 0.000 0.000 0.000
239 0.0003 0.001 0.000 0.000 0.000
241 0.0003 0.001 0.000 0.000 0.000
243 0.0027 0.004 0.003 0.000 0.000
245 0.0017 0.002 0.003 0.000 0.001
247 0.0003 0.000 0.003 0.000 0.000
Locus , No . of individuals and allele size ( bp ) population
JH6 All * D H M G
No. 1453 826 183 10 434
274 0.0241 0.020 0.005 0.000 0.040
286 0.0058 0.005 0.000 0.000 0.010
289 0.0286 0.022 0.025 0.050 0.043
292 0.0351 0.030 0.046 0.000 0.041
295 0.0850 0.084 0.016 0.050 0.116
298 0.1559 0.196 0.101 0.300 0.100
301 0.1776 0.145 0.265 0.250 0.202
304 0.1277 0.120 0.243 0.150 0.092
307 0.0953 0.130 0.046 0.000 0.053
310 0.1232 0.108 0.139 0.050 0.147
313 0.0836 0.087 0.071 0.100 0.082
316 0.0303 0.027 0.027 0.050 0.038
319 0.0182 0.020 0.008 0.000 0.020
322 0.0079 0.005 0.005 0.000 0.014
325 0.0010 0.002 0.000 0.000 0.000
328 0.0003 0.000 0.000 0.000 0.001
331 0.0003 0.001 0.000 0.000 0.000
Locus , No . of individuals and allele size ( bp ) population
JH2 All * D H M G
No. 1442 821 182 10 429
85 0.0007 0.001 0.000 0.000 0.000
88 0.0003 0.001 0.000 0.000 0.000
91 0.0042 0.004 0.000 0.000 0.006
94 0.0087 0.008 0.003 0.000 0.013
97 0.0180 0.010 0.000 0.000 0.041
100 0.0302 0.026 0.014 0.050 0.045
103 0.0359 0.067 0.008 0.000 0.090
106 0.1491 0.144 0.159 0.350 0.150
109 0.2143 0.209 0.261 0.350 0.202
112 0.1751 0.155 0.286 0.100 0.168
115 0.1224 0.127 0.093 0.100 0.127
118 0.0992 0.124 0.058 0.000 0.072
121 0.0447 0.040 0.069 0.000 0.045
124 0.0212 0.030 0.016 0.050 0.005
127 0.0225 0.036 0.000 0.000 0.007
130 0.0087 0.006 0.000 0.000 0.017
133 0.0028 0.002 0.005 0.000 0.004
136 0.0090 0.009 0.019 0.000 0.005
139 0.0007 0.001 0.000 0.000 0.001
142 0.0024 0.001 0.008 0.000 0.002
Locus , No . of individuals and allele size ( bp ) population
JH8 All * D H M G
No. 1460 824 191 10 435
136 0.0041 0.001 0.013 0.000 0.006
142 0.0065 0.005 0.005 0.000 0.010
145 0.0154 0.009 0.000 0.000 0.034
148 0.0360 0.034 0.058 0.000 0.031
151 0.1041 0.162 0.013 0.100 0.034
154 0.0603 0.055 0.042 0.000 0.079
157 0.0613 0.070 0.026 0.000 0.062
160 0.0928 0.114 0.081 0.050 0.059
163 0.1349 0.154 0.068 0.100 0.130
166 0.0483 0.037 0.071 0.000 0.061
169 0.0990 0.087 0.149 0.100 0.099
172 0.1360 0.125 0.209 0.150 0.124
175 0.0661 0.048 0.092 0.050 0.090
178 0.0247 0.023 0.021 0.000 0.030
181 0.0164 0.016 0.005 0.000 0.022
184 0.0271 0.013 0.031 0.150 0.049
187 0.0538 0.038 0.097 0.300 0.059
190 0.0055 0.003 0.010 0.000 0.008
193 0.0055 0.004 0.003 0.000 0.010
196 0.0010 0.001 0.003 0.000 0.000
199 0.0014 0.001 0.003 0.000 0.002
Locus , No . of individuals and allele size ( bp ) population
JH5 All * D H M G
No. 1425 798 190 10 427
188 0.0011 0.002 0.000 0.000 0.000
190 0.0035 0.006 0.000 0.000 0.001
192 0.0039 0.007 0.000 0.000 0.000
194 0.0958 0.170 0.003 0.000 0.001
196 0.1239 0.217 0.003 0.000 0.006
198 0.0625 0.110 0.000 0.000 0.004
200 0.0098 0.009 0.016 0.000 0.008
202 0.0154 0.016 0.013 0.000 0.016
204 0.0253 0.014 0.000 0.000 0.057
206 0.0221 0.018 0.021 0.050 0.030
208 0.0116 0.012 0.003 0.000 0.015
210 0.0288 0.025 0.029 0.000 0.036
212 0.0653 0.046 0.079 0.200 0.093
214 0.0705 0.038 0.129 0.350 0.098
216 0.0302 0.020 0.011 0.150 0.055
218 0.0593 0.031 0.126 0.100 0.082
220 0.0604 0.031 0.111 0.150 0.090
222 0.0505 0.036 0.055 0.000 0.076
224 0.0396 0.021 0.053 0.000 0.069
226 0.0642 0.046 0.100 0.000 0.084
228 0.0533 0.041 0.108 0.000 0.053
230 0.0330 0.027 0.055 0.000 0.035
232 0.0154 0.018 0.005 0.000 0.016
234 0.0172 0.014 0.021 0.000 0.021
236 0.0305 0.019 0.061 0.000 0.039
238 0.0011 0.001 0.000 0.000 0.002
240 0.0011 0.001 0.000 0.000 0.001
242 0.0004 0.000 0.000 0.000 0.001
244 0.0011 0.000 0.000 0.000 0.004
246 0.0014 0.001 0.000 0.000 0.002
248 0.0007 0.001 0.000 0.000 0.000
250 0.0007 0.001 0.000 0.000 0.000
252 0.0004 0.000 0.000 0.000 0.001
254 0.0004 0.000 0.000 0.000 0.001
Locus, No. of individuals and allele size (bp) population
JH1 All* D H M G
No. 1389 798 178 9 404
256 0.0018 0.003 0.000 0.000 0.000
259 0.0047 0.006 0.000 0.000 0.004
262 0.0094 0.010 0.000 0.056 0.011
265 0.0360 0.019 0.056 0.111 0.058
268 0.0569 0.050 0.079 0.056 0.062
271 0.1663 0.201 0.171 0.056 0.099
274 0.0997 0.096 0.087 0.111 0.113
277 0.0774 0.078 0.098 0.056 0.067
280 0.0850 0.100 0.042 0.056 0.076
283 0.0695 0.059 0.121 0.000 0.069
286 0.0644 0.106 0.000 0.000 0.012
289 0.0256 0.039 0.003 0.000 0.009
292 0.0619 0.054 0.020 0.056 0.097
295 0.1753 0.117 0.242 0.444 0.256
298 0.0338 0.034 0.014 0.000 0.042
301 0.0058 0.009 0.003 0.000 0.001
304 0.0007 0.001 0.000 0.000 0.001
307 0.0007 0.001 0.000 0.000 0.000
310 0.0004 0.001 0.000 0.000 0.000
313 0.0011 0.001 0.000 0.000 0.001
316 0.0004 0.000 0.000 0.000 0.001
319 0.0004 0.000 0.000 0.000 0.001
325 0.0040 0.001 0.006 0.000 0.009
328 0.0140 0.012 0.051 0.000 0.002
331 0.0047 0.003 0.006 0.000 0.009
334 0.0004 0.000 0.003 0.000 0.000
Locus, No. of individuals and allele size ( bp ) population
JH14 All * D H M G
No. 1351 732 187 10 422
90 0.0374 0.064 0.000 0.000 0.008
93 0.0496 0.089 0.000 0.000 0.005
96 0.0026 0.004 0.003 0.000 0.000
99 0.0104 0.005 0.000 0.000 0.025
102 0.0159 0.007 0.000 0.000 0.039
105 0.0174 0.021 0.003 0.000 0.018
108 0.0766 0.098 0.000 0.000 0.076
111 0.1310 0.152 0.120 0.100 0.101
114 0.1392 0.125 0.163 0.300 0.149
117 0.1825 0.163 0.238 0.350 0.187
120 0.1628 0.129 0.273 0.200 0.172
123 0.1025 0.083 0.139 0.050 0.121
126 0.0429 0.036 0.037 0.000 0.059
129 0.0181 0.014 0.021 0.000 0.025
132 0.0011 0.001 0.000 0.000 0.001
138 0.0007 0.001 0.000 0.000 0.001
141 0.0007 0.001 0.000 0.000 0.000
150 0.0004 0.001 0.000 0.000 0.000
153 0.0030 0.002 0.003 0.000 0.005
156 0.0007 0.001 0.000 0.000 0.000
159 0.0044 0.003 0.000 0.000 0.008
Locus , No . of individuals and allele size ( bp ) population
JH27 All * D H M G
No. 1462 830 190 10 432
182 0.0065 0.011 0.000 0.000 0.000
185 0.0992 0.166 0.016 0.050 0.008
188 0.0410 0.071 0.000 0.000 0.002
191 0.0356 0.049 0.039 0.050 0.007
194 0.0718 0.113 0.021 0.000 0.017
197 0.0686 0.069 0.074 0.050 0.066
200 0.1341 0.146 0.155 0.000 0.105
203 0.1960 0.128 0.211 0.200 0.321
206 0.1758 0.084 0.329 0.350 0.280
209 0.0342 0.029 0.032 0.050 0.045
212 0.0407 0.039 0.037 0.050 0.045
215 0.0328 0.036 0.050 0.050 0.020
218 0.0513 0.052 0.037 0.150 0.054
221 0.0089 0.004 0.000 0.000 0.022
224 0.0014 0.001 0.000 0.000 0.002
227 0.0021 0.001 0.000 0.000 0.005
Locus , No . of individuals and allele size ( bp ) population
JH32 All * D H M G
No. 1440 825 190 10 415
247 0.0003 0.001 0.000 0.000 0.000
256 0.0003 0.001 0.000 0.000 0.000
259 0.0045 0.007 0.003 0.000 0.000
262 0.0181 0.022 0.026 0.000 0.007
265 0.0736 0.055 0.139 0.050 0.081
268 0.0309 0.033 0.013 0.000 0.035
271 0.1059 0.105 0.116 0.050 0.104
274 0.1170 0.146 0.071 0.000 0.083
277 0.1538 0.175 0.132 0.250 0.119
280 0.1573 0.160 0.116 0.150 0.171
283 0.1618 0.139 0.155 0.250 0.208
286 0.0642 0.047 0.076 0.050 0.093
289 0.0365 0.039 0.021 0.050 0.037
292 0.0222 0.019 0.026 0.050 0.025
295 0.0149 0.018 0.005 0.000 0.014
298 0.0087 0.007 0.016 0.100 0.006
301 0.0052 0.005 0.005 0.000 0.005
304 0.0076 0.008 0.011 0.000 0.005
307 0.0128 0.005 0.068 0.000 0.004
310 0.0024 0.004 0.000 0.000 0.001
313 0.0003 0.001 0.000 0.000 0.000
316 0.0003 0.001 0.000 0.000 0.000
322 0.0007 0.001 0.000 0.000 0.001
331 0.0003 0.001 0.000 0.000 0.000
*Allele frequency of All individuals (*) was calculated by Cervus 3.0.7.
**Allele frequency of each population was calculated by GenAlex 6.5. There is 6% missing data at the locus 'JH1' in the population 'Hannai'. There is 10% missing data at the locus 'JH1' in the population 'Madaka'. There is 7% missing data at the locus 'JH1' in the population 'Gigantea'. There is 11% missing data at the locus 'JH14' in the population 'Discus'.
MS 마커의 대립유전자형의 빈도를 기반으로 전복 종마다의 유전적 다양성을 나타내는 Shannon's Information Index, Ho, He, Fixation Index(F) 등을 분석하였다(표 22). 다양성 지수의 대표적인 Shannon's Information Index(I)는 집단 내에서 하나의 대립유전자형이 매우 우세할 경우 그 값이 0에 가까워진다. 집단 내 근친정도를 나타내는 F(근친교배계수)는 Ho와 He 값에 영향을 받으며 He 값이 Ho 값보다 높을 경우 계획적인 교배가 이뤄지는 집단 내에서 일반적으로 확인되고 이 때 F 값은 양의 값을 나타내어 높은 근친도를 보인다. 반대로 Ho 값이 He 값보다 높아 이형접합체 초과(heterozygote excess) 현상을 보일 때 F 값은 음의 값을 나타내며 근친도가 낮다는 것을 의미한다.
831마리의 둥근전복에 대하여 14개의 MS 마커에서 확인할 수 있는 평균 대립유전자(Na)는 19.286 개였으며 실질적 대립유전자(Ne) 개수는 평균 8.026 개로 계산되었다. I 값은 평균 2.266로 높아 대립유전자형의 다양하게 나타났다는 것을 알 수 있었으며 이와 비슷하게 Ho와 He 값이 각각 평균 0.985, 0.825로 MS 마커에 대한 둥근전복 집단의 다형성이 높다는 것이 확인되었다. F 값은 평균 -0.018로 집단 내 근친도는 낮은 것으로 분석되었다. 분석된 북방전복은 총 191마리로 14개 MS 마커에 대한 Na와 Ne는 각각 13.643, 6.688개이며 I 값은 2.059, Ho와 He는 각각 0.829, 0.832로 그 값이 높게 분석되었다. F는 0에 가까운 -0.003으로 음의 값을 보여 근친도가 크게 낮다고 판단되지 않았다. 수집된 왕전복 모패는 10 마리로 개체수가 매우 적었고 이에 대한 MS 마커의 Na, Ne 값은 각각 7.214, 4.896 개로 다른 전복에 비해 낮은 값을 보였다. I 값은 1.712로 확인되었고 Ho는 0.919, He는 0.774로 높은 값을 보였다. F 값은 -0.189로 수집된 왕전복 집단 내 근친도가 낮음을 알 수 있었다. 435마리의 말전복에 대한 MS 마커의 Na와 Ne는 각각 16.929, 7.863 개로 계산되었고 I 값은 2.175, Ho 값은 0.908, He 값은 0.838로 높은 유전적 다양성과 마커에 대한 높은 다형성을 나타냈으며 F 값은 -0.087로 집단 내 근친도가 낮음을 확인하였다. 전복 4종을 종합적으로 비교 분석하였을 때 Na과 Ne 값은 둥근전복, 말전복, 북방전복, 왕전복 순으로 많았으며 I 값 역시 같은 순서로 나타났다. 집단 내 근친도를 나타내는 F 값인 경우 개체수가 적은 왕전복이 제일 낮게 분석되었고 말전복, 둥근전복, 북방전복 순으로 근친도가 낮았다.
Pop. Locus N Na Ne I Ho He uHe F
Discus JH74 827 16.000 5.715 2.021 0.985 0.825 0.826 -0.194
JH50 826 15.000 3.239 1.450 0.597 0.691 0.692 0.137
JH56 827 10.000 6.056 1.887 0.911 0.835 0.835 -0.091
JH53 808 21.000 8.861 2.414 0.932 0.887 0.888 -0.050
JH16 829 19.000 7.540 2.262 0.986 0.867 0.868 -0.136
Hn2 830 18.000 8.462 2.296 0.977 0.882 0.882 -0.108
JH6 826 16.000 8.357 2.290 0.950 0.880 0.881 -0.080
JH2 821 20.000 7.753 2.264 0.937 0.871 0.872 -0.075
JH8 824 21.000 9.863 2.494 0.860 0.899 0.899 0.042
JH5 798 30.000 9.717 2.716 0.702 0.897 0.898 0.218
JH1 798 23.000 9.749 2.497 0.848 0.897 0.898 0.055
JH14 732 21.000 8.894 2.342 0.764 0.888 0.888 0.140
JH27 830 16.000 9.637 2.410 0.931 0.896 0.897 -0.039
JH32 825 24.000 8.522 2.380 0.949 0.883 0.883 -0.075
Mean 814.357 19.286 8.026 2.266 0.881 0.864 0.865 -0.018
SE 6.994 1.281 0.504 0.083 0.031 0.015 0.015 0.032
Hannai JH74 190 10.000 6.362 2.000 0.968 0.843 0.845 -0.149
JH50 191 11.000 2.984 1.371 0.812 0.665 0.667 -0.221
JH56 191 10.000 4.059 1.692 0.995 0.754 0.756 -0.320
JH53 187 14.000 7.218 2.168 0.765 0.861 0.864 0.112
JH16 190 13.000 7.863 2.201 0.863 0.873 0.875 0.011
Hn2 191 13.000 6.029 2.026 0.979 0.834 0.836 -0.174
JH6 183 13.000 5.878 2.028 0.645 0.830 0.832 0.223
JH2 182 13.000 5.184 1.898 0.676 0.807 0.809 0.163
JH8 191 20.000 9.274 2.476 0.848 0.892 0.895 0.049
JH5 190 20.000 11.426 2.595 0.758 0.912 0.915 0.169
JH1 178 16.000 7.468 2.232 0.736 0.866 0.869 0.150
JH14 187 10.000 5.173 1.774 0.861 0.807 0.809 -0.067
JH27 190 11.000 5.249 1.952 0.826 0.809 0.812 -0.021
JH32 190 17.000 9.464 2.412 0.868 0.894 0.897 0.029
Mean 187.929 13.643 6.688 2.059 0.829 0.832 0.834 -0.003
SE 1.097 0.918 0.609 0.087 0.029 0.017 0.017 0.044
Pop. Locus N Na Ne I Ho He uHe F
Madaka JH74 10 6.000 3.226 1.400 1.000 0.690 0.726 -0.449
JH50 10 3.000 2.247 0.938 0.600 0.555 0.584 -0.081
JH56 10 8.000 5.556 1.878 1.000 0.820 0.863 -0.220
JH53 10 10.000 7.407 2.151 0.900 0.865 0.911 -0.040
JH16 10 9.000 7.692 2.112 1.000 0.870 0.916 -0.149
Hn2 10 5.000 4.348 1.543 1.000 0.770 0.811 -0.299
JH6 10 8.000 5.128 1.822 0.900 0.805 0.847 -0.118
JH2 10 6.000 3.704 1.495 1.000 0.730 0.768 -0.370
JH8 10 8.000 5.882 1.921 0.900 0.830 0.874 -0.084
JH5 10 6.000 4.545 1.639 1.000 0.780 0.821 -0.282
JH1 9 9.000 4.154 1.812 0.667 0.759 0.804 0.122
JH14 10 5.000 3.774 1.431 0.900 0.735 0.774 -0.224
JH27 10 9.000 5.000 1.873 1.000 0.800 0.842 -0.250
JH32 10 9.000 5.882 1.957 1.000 0.830 0.874 -0.205
Mean 9.929 7.214 4.896 1.712 0.919 0.774 0.815 -0.189
SE 0.071 0.547 0.406 0.087 0.035 0.022 0.023 0.039
Giganea JH74 425 12.000 5.683 1.954 0.979 0.824 0.825 -0.188
JH50 434 13.000 1.999 1.069 0.502 0.500 0.500 -0.005
JH56 434 11.000 3.898 1.573 0.995 0.743 0.744 -0.339
JH53 429 18.000 9.343 2.414 0.965 0.893 0.894 -0.081
JH16 434 16.000 9.253 2.355 0.977 0.892 0.893 -0.095
Hn2 434 12.000 5.938 1.972 0.979 0.832 0.833 -0.178
JH6 434 15.000 8.988 2.378 0.940 0.889 0.890 -0.058
JH2 429 18.000 7.858 2.270 0.960 0.873 0.874 -0.100
JH8 435 20.000 12.773 2.700 0.956 0.922 0.923 -0.038
JH5 427 30.000 15.110 2.873 0.876 0.934 0.935 0.062
JH1 404 22.000 8.202 2.386 0.849 0.878 0.879 0.033
JH14 422 17.000 8.056 2.278 0.912 0.876 0.877 -0.042
JH27 432 15.000 4.877 1.934 0.931 0.795 0.796 -0.171
JH32 415 18.000 8.109 2.297 0.894 0.877 0.878 -0.020
Mean 427.714 16.929 7.863 2.175 0.908 0.838 0.839 -0.087
SE 2.387 1.320 0.907 0.122 0.033 0.029 0.029 0.028
* The data was calculated by GenAlex 6.5. N = No. of analyzed individuals. Na = No. of Different Alleles, Ne = No. of Effective Alleles = 1 / (Sum pi^2), I = Shannon's Information Index = -1* Sum (pi * Ln (pi)), Ho = Observed Heterozygosity = No. of Hets / N, He = Expected Heterozygosity = 1 - Sum pi^2, uHe = Unbiased Expected Heterozygosity = (2N / (2N-1)) * He, F = Fixation Index = (He - Ho) / He = 1 - (Ho / He). Where pi is the frequency of the ith allele for the population & Sum pi^2 is the sum of the squared population allele frequencies.
** There is 6% missing data at the locus 'JH1' in the population 'Hannai'. There is 10% missing data at the locus 'JH1' in the population 'Madaka'. There is 7% missing data at the locus 'JH1' in the population 'Gigantea'. There is 11% missing data at the locus 'JH14' in the population 'Discus'.
집단 간의 유연관계를 분석하기 위하여 대립유전자형 출현빈도를 기반으로 요인대응분석(Factorial Components Analysis, FCA)을 실시하여 3D 그래프로 나타내었다. 총 분산치는 73.43 %(Axe 1), 23.53 %(Axe 2), 3.04 %(Axe 3)으로 확인되었고 전복 4종에 대하여 2개의 큰 군집을 형성하는 것을 알 수 있었다. 말전복(하얀색)은 둥근전복(노란색), 북방전복(파란색), 왕전복(검은색)과 유전적으로 확연히 구분되며 몇몇의 개체는 둥근전복과 유전적으로 비교적 가깝게 확인되었다. 둥근전복과 북방전복, 왕전복으로 형성된 커다란 군집 형태로 볼 때 이들 3종의 전복은 유전적으로 유사한 것으로 판단되나 둥근전복의 경우 군집 중앙을 벗어나 분산된 개체들이 다수 확인되었다.
MS 마커에 대한 대립유전자의 유형과 빈도를 토대로 계산된 유전적 거리(Nei's genetic distance 1978)에서도 FCA에서 확인된 결과와 마찬가지로 말전복이 다른 전복과의 유전적 관계가 멀다는 것을 확인할 수 있었다(표 23). 또한 둥근전복과 북방전복의 유전적 거리가 둥근전복과 왕전복의 거리보다 가까웠으며 북방전복과 왕전복, 북방전복과 둥근전복의 거리는 유사했다.
전복 1467마리에 개체간의 유전적 거리를 Codominant genotypic distance로 계산한 후 UPGMA 게통수를 작성하였다. 말전복의 경우 독립된 하나의 큰 cluster를 형성하는 것을 확인할 수 있으며 그 내에서도 유전적 거리에 따라 작은 분지로 나뉘는 것을 볼 수 있다. 둥근전복과 북방전복, 왕전복은 각기 고유의 cluster를 형성하지 못하고 전체적으로 산재되어 있는 것으로 보이나 작은 분지로 나뉜 형태를 살펴본다면 같은 종끼리 가까운 유전적 거리를 보여준다.
4종의 전복 중에서 둥근전복은 자연산(DW), 양식산(DA), 중국산(DC)로, 말전복은 자연산(HW), 양식산(HA)로 세부적으로 나누었고 총 7개 집단에 대한 요인대응분석을 실시하고 유전적 거리를 계산하였다. 7개 집단에 대한 요인대응 분석의 분산은 63.45 5(Axe 1), 18.44 %(Axe 2), 7.64 %(Axe 3)으로 확인되었으며 좌우로 나뉜 2개의 큰 군집이 확인되었다, 전복 4종에 대한 FCA 분석결과와 마찬가지로 자연산 말전복과 양식산 말전복이 하나의 큰 군집을 이루고 있었고 나머지 5개의 집단이 다른 하나의 큰 군집을 형성하고 있었다. 특히 중국산 둥근전복의 경우 다른 둥근전복과의 유전적 차이가 나타나는 것으로 판단되며 개체의 분포가 매우 퍼져있었다. 유전적 거리(Nei's genetic distance 1978)를 비교하면 양식산 말전복과 왕전복의 유연관계가 매우 멀었고 양식산 말전복과 자연산 말전복의 유연관계가 매우 가까웠다(표 51). 유전적 거리를 토대로 작성된 UPGMA 계통수에서도 2개의 큰 cluster로 나뉘면서 한쪽은 말전복을 다른 한쪽은 둥근전복, 북방전복, 왕전복이 포함되어 있었다.
H. discus discus H. discus hannai H. madaka H. gigantea
H. discus discus 0.000
H. discus hannai 0.037 0.000
H. madaka 0.162 0.168 0.000
H. gigantea 0.719 0.706 0.867 0.000
구분 DW DC DA HnA K HW HA
DW 0.000
DC 0.085 0.000
DA 0.039 0.091 0.000
HnA 0.061 0.068 0.053 0.000
K 0.109 0.130 0.218 0.168 0.000
HW 0.759 0.773 0.709 0.689 0.846 0.000
HA 0.805 0.832 0.728 0.740 0.906 0.022 0.000
6-6. 결과 3 동일개체 출현빈도
이번 연구에서 개발된 multiplex PCR 및 MS 마커군을 전복 종이나 원산지를 식별하고 육종이나 양식 산업에서의 생산이력 시스템에 활용할 수 있을지 확인하고자 1467마리의 전복 모패를 무작위 교배 집단으로 가정한 14개의 MS 마커 유전자형의 동일개체 출현확률(PI), 전형매 교배 집단으로 가정하였을 때의 확률(PIsibs)을 분석하였고 더불어 친자감정확률을 다른 부모를 알 경우(PEI), 부모 중 한 쪽을 알 경우(PE2), 양 부모를 알고 있을 경우(PE3)로 나누어 추정 계산하였다(표 52). 14개의 MS 마커를 모두 사용하였을 때 PI는 9.1 X 10-23, PIsibs는 1.4 X 10-7로 매우 낮아 14개의 MS 마커를 활용하면 전복 개체나 종을 식별하기에 부족함이 없을 것이라 생각된다. 또한 14개의 MS 마커 중에서 6개 이상의 마커를 활용한다면 모패와 자식세대간의 친자감정확률 99% 이상으로 분석되었다.
Number of Marker PI PIsibs PE1 (%) PE2 (%) PE3 (%)
1 4.3 X 10-2 3.4 X 10-1 68.893 52.229 86.258
2 7.4 X 10-3 1.6 X 10-1 81.717 64.140 94.439
3 4.4 X 10-4 5.6 X 10-2 93.322 80.610 98.968
4 8.6 X 10-6 1.7 X 10-2 98.611 93.307 99.929
5 2.0 X 10-7 5.4 X 10-3 98.611 97.498 99.994
6 4.6 X 10-9 1.7 X 10-3 99.682 99.079 100
7 1.1 X 10-10 5.3 X 10-4 99.929 99.653 100
8 3.4 X 10-12 1.7 X 10-4 99.984 99.854 100
9 4.7 X 10-14 5.1 X 10-5 99.996 99.957 100
10 3.4 X 10-16 1.4 X 10-5 99.999 99.990 100
11 6.3 X 10-18 4.4 X 10-6 100 99.997 100
12 1.6 X 10-19 1.4 X 10-6 100 99.999 100
13 3.9 X 10-21 4.3 X 10-7 100 100 100
14 9.1 X 10-23 1.4 X 10-7 100 100 100
PI, probability of identity at a locus; PIsibs, probability of identity for Sibs at a locus; PE1, Probability of exclusion when the other parent is known; PE2, probablilty of exclusion when on parent is known but the other genotype is unavailable; PE3, probablility of excluding a putative parent pair.
실시예 7. 모패와 치패의 연관관계 분석
양식산 둥근전복 50 마리와 중국산 둥근전복 42 마리의 교배로 생산된 자식세대(F1 세대)의 치패 60마리를 채집하였고 일부 조직을 절제하였다. 치패의 생산과 관리는 제주특별자치도 해양수산연구원과 제일수산(제주)에서 담당하였다.
친자감정은 CERVUS version 3.0.7의 Parentage analysis (sexes known)으로 확인하였고 둥근전복 집단 내 개체별 유전적 거리는 GenAlEx version 6.5로 계산하였다. 모패와 치패 집단에 대한 유전적 균일성 및 실제분포 추정은 STRUCTURE software version 2.3.4 (JK Pritchard et al, 2000)을 이용하여 분석하였다. 전체에서 분류 가능한 집단/군락 수(K 값)을 추정하기 위하여 K=1~4에 대한 평균 추정치 Pr(X|K)와 표준편차를 계산하고자 Buin-in period 100,000회, MCMC(markov chain monte carlo) 반복 수 100,000회 조건에서 분석하였다. 이를 20회에 걸쳐 반복된 계산된 결과를 STRUCTURE HARVESTER program (DA Earl, 2012)을 사용하여 Delta K 값을 계산하여 최적의 K 값을 선정하였고, 이에 대한 모패와 치패의 실제분포를 추정하였다. 부모 세대와 자식 세대 간의 유연관계, 즉 친자관계를 확인하는 방법을 수립하기 위해 MS 마커를 활용하고자 하였다. 앞서 개발된 14개의 MS 마커를 모두 활용하였을 때 친자감정확률은 100%로 전복 모패로부터 생산된 자식세대(F1 세대)의 친자를 확인하는데 적합하다고 판단되었다.
50마리의 국내 양식산 둥근전복과 42마리의 중국산 둥근전복 모패, 60마리의 F1 세대 치패(표 53)에 대하여, MS 마커 locus의 대립유전자형을 분석하였고 이에 대한 친자감정(parentage analysis)을 실시하여 그 결과를 표 54에 나타내었다.
구분 명명 내용 채묘날짜 장소
P 세대 P01～P50 양식산 둥근전복
암컷 42마리, 수컷 8마리		 - 제주특별자치도 해양수산연구원
P51～P92 중국산 둥근전복
암컷 24마리, 수컷 18마리		 - 제주특별자치도 해양수산연구원
F1 세대 F1-01 ～ F1-20 중국산 둥근전복 암컷
X 양식산 둥근전복 수컷,
20마리		 2015.05.01 제주특별자치도 해양수산연구원
F1-21 ～ F1-40 양식산 둥근전복 암컷
X 중국산 둥근전복 수컷,
20마리		 2015.05.01 제주특별자치도 해양수산연구원
F1-41 ～ F1-60 중국산 둥근전복 암컷
X 양식산 둥근전복 수컷,
20마리		 2015.04.18 제주특별자치도 해양수산연구원 (생산),
제일수산 (사육)
치패 교배 모계 Pair confidence 부계 Pair confidence Trio confidence 유전적 거리
F1-01 중국♀*양식♂ p80 + P07 + - 21
F1-02 중국♀*양식♂ P61 + P15 * * 24
F1-03 중국♀*양식♂ P61 * P03 + - 27
F1-04 중국♀*양식♂ P61 * P03 + - 27
F1-05 중국♀*양식♂ P61 * P03 - - 27
F1-06 중국♀*양식♂ P61 * P15 * - 20
F1-07 중국♀*양식♂ P61 * P15 * * 20
F1-08 중국♀*양식♂ P61 * P15 * * 20
F1-09 중국♀*양식♂ P61 * P15 * * 20
F1-10 중국♀*양식♂ P61 * P15 * * 20
F1-11 중국♀*양식♂ P61 * P15 * * 20
F1-12 중국♀*양식♂ P61 * p31 - - 17
F1-13 중국♀*양식♂ P61 * p31 + - 17
F1-14 중국♀*양식♂ P73 + P07 - - 21
F1-15 중국♀*양식♂ P61 * P03 * * 27
F1-16 중국♀*양식♂ P61 * P03 * * 27
F1-17 중국♀*양식♂ P61 * P03 + - 17
F1-18 중국♀*양식♂ p85 * P15 * * 22
F1-19 중국♀*양식♂ P61 + P15 * * 20
F1-20 중국♀*양식♂ P61 * P15 * * 20
F1-21 중국♂*양식♀ P24 + P81 - 20
F1-22 중국♂*양식♀ P02 P75 - - 26
F1-23 중국♂*양식♀ P32 + P89 - 22
F1-24 중국♂*양식♀ P01 * P52 - - 23
F1-25 중국♂*양식♀ P35 P86 - - 22
F1-26 중국♂*양식♀ P01 P75 - - 24
F1-27 중국♂*양식♀ P01 + P86 - 21
F1-28 중국♂*양식♀ P14 P54 + - 21
F1-29 중국♂*양식♀ P19 P89 - 20
F1-30 중국♂*양식♀ P01 + P52 * + 23
치패 교배 모계 Pair confidence 부계 Pair confidence Trio confidence 유전적 거리
F1-31 중국♂*양식♀ P01 　 P74 - - 23
F1-32 중국♂*양식♀ P33 　 P76 　 - 20
F1-33 중국♂*양식♀ P33 　 P60 　 - 22
F1-34 중국♂*양식♀ P01 　 P59 - - 19
F1-35 중국♂*양식♀ P24 + P79 * - 22
F1-36 중국♂*양식♀ P01 　 P59 + - 19
F1-37 중국♂*양식♀ P28 　 P75 　 - 25
F1-38 중국♂*양식♀ P18 　 P75 　 - 22
F1-39 중국♂*양식♀ P23 　 P56 + - 20
F1-40 중국♂*양식♀ P01 + P75 　 - 24
F1-41 중국♀*양식♂ P53 - P03 　 - 24
F1-42 중국♀*양식♂ P67 　 P08 * - 25
F1-43 중국♀*양식♂ P87 * P13 + - 22
F1-44 중국♀*양식♂ P90 　 P40 + - 22
F1-45 중국♀*양식♂ P53 - P15 + - 21
F1-46 중국♀*양식♂ P87 - P31 + - 19
F1-47 중국♀*양식♂ P73 　 P31 　 - 20
F1-48 중국♀*양식♂ P71 　 P31 　 - 25
F1-49 중국♀*양식♂ P51 　 P13 　 - 22
F1-50 중국♀*양식♂ P61 　 P03 + - 27
F1-51 중국♀*양식♂ P91 　 P40 + - 25
F1-52 중국♀*양식♂ P67 　 P40 + - 25
F1-53 중국♀*양식♂ P87 - P40 * - 20
F1-54 중국♀*양식♂ P78 　 P15 + - 20
F1-55 중국♀*양식♂ P71 　 P07 + - 25
F1-56 중국♀*양식♂ P71 - P13 　 - 25
F1-57 중국♀*양식♂ P67 * P40 　 - 25
F1-58 중국♀*양식♂ P67 * P40 + - 25
F1-59 중국♀*양식♂ P92 + P03 + - 25
F1-60 중국♀*양식♂ P69 　 P31 + - 23
*: High confidence
+: moderate confidence
-: low confidence
모패 간 유전적 거리는 전체 둥근전복 831 마리로부터 계산됨(집단 내 최소 3～ 최대 40)
부(양식)
모(중국)		 P03 P07 P08 P13 P15 P31 P40
P51 O 1
P53 O 1 O 1
P61 O 7 O 9 O 2
P67 O 1 O 3
P69 O 1
P71 O 1 O 1 O 1
P73 O 1 O 1
P78 O 1
P80 O 1
P85 O 1
P87 O 1 O 1 O 1
P90 O 1
P91 O 1
P92 O 1
부(중국)
모(양식)		 P52 P54 P56 P59 P60 P74 P75 P76 P79 P81 P86 P89
P01 O 2 O 2 O 1 O 2 O 1
P02 O 1
P14 O 1
P18 O 1
P19 O 1
P23 O 1
P24 O 1 O 1
P28 O 1
P32 O 1
P33 O 1 O 1
P35 O 1
K Repeats Mean LnP(K) SD LnP(K) Ln'(K) |Ln'(K)| Delta K
1 20 -9166.9950 0.8581 NA NA NA
2 20 -8889.1600 4.0667 277.835000 4.885000 1.201210
3 20 -8606.4400 2.6309 282.720000 236.645000 89.949354
4 20 -8560.3650 7.9696 46.075000 NA NA
공시집단 Inferred Clusters 집단 크기
1 2 3
양식산 둥근전복 모패 0.121 0.269 0.610 50
중국산 둥근전복 모패 0.079 0.063 0.859 42
F1 세대 치패 0.327 0.301 0.373 60
중국산 둥근전복 암컷과 양식산 둥근전복 수컷으로부터 생산된 치패 40마리에 대한 친자감정 결과 부모로 확인된 모패는 중국산 암컷 14마리, 양식산 수컷 7마리였다. 엄마에서는 P61로부터 유래된 치패가 40마리 중 18마리로 가장 많았고 아빠에서는 P15로부터 유래된 치패가 40마리 중 10마리로 많았으며, P61 X P15로부터 유래된 치패는 40마리 중 9마리로 집계되었다. 양식산 둥근전복 암컷과 중국산 둥근전복 수컷에서 생산된 치패 20마리를 분석하였을 때 엄마로 확인된 양식산 암컷은 11마리, 아빠로 확인된 중국산 수컷은 12마리로 확인되었다. 엄마에서는 P01로부터 유래된 치패가 20마리 중 8마리로 가장 많았고, 아빠에서는 P75으로부터 유래된 치패가 20마리 중 5마리로 파악되었다. 60마리 치패 전체로 살펴보았을 때 엄마 또는 아빠로 확인된 모패가 매우 다양했으며 이는 종묘를 생산하는 과정에서 오는 다양성이라고 판단된다. 실제로 제주특별자치도 해양수산연구원에서 수정란을 최대한으로 모으기 위해 여러 개체로부터 채집된 알과 정자를 혼합하여 수정하였다고 설명하였다.
전복 모패와 이로부터 생산된 치패가 몇 개의 군락으로 분류가 되는지 추정하고자 STRUCTURE software로 K 값을 1 내지 내지 4로 설정하여 이를 20회 반복 계산하고 이 결과를 토대로 최적의 K을 찾고자 Delta K을 계산하였다. 3 개의 공시집단과 마찬가지로 군락 수가 3(K=3)일 때 Delta K 값이 가장 높았으며 이는 전복 모패와 치패가 유전적으로 크게 3개의 군락으로 나뉜다는 것을 의미한다. 양식산 둥근전복과 중국산 둥근전복 모패는 유전적으로 유사하였고 이들 사이에서 나온 치패는 3개의 군락으로 나누어져 분포하였다.
<110> Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Mircrosatellite marker group for the abalone species distinction, analysis of genetic diversity and parentage profile, and method of analyzing using the same <130> DPP20160800KR <160> 195 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH1-F <400> 1 gaatattgct gattgcggtg ccaaacaac 29 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH1-R <400> 2 ggtacactgt gccccggtta taaat 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH2-F <400> 3 ggaaggttag ccctaactgg gtgat 25 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH2-R <400> 4 tatatcatat gcttggctac aggggcat 28 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH5-F <400> 5 acgctggagg tagatggttt gtaga 25 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH5-R <400> 6 ctcgctgctc acatcaaaca gtga 24 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6-F <400> 7 cgatgctgtt gtgccctcat agtac 25 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6-R <400> 8 accctaggca atatagtcaa gataagtatc cga 33 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH8-F <400> 9 accttagcac cactgttacc aagt 24 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH8-R <400> 10 cgagctattg ctgtaataac tgaactcttt aagg 34 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH9-F <400> 11 gctcactgat caattgaccg ggt 23 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH9-R <400> 12 catccatcat atgacattgt tcatcgacca tg 32 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH12-F <400> 13 cgtgggtcgt ctatttccgt taacaacg 28 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH12-R <400> 14 taccaaagta tcacaggcag gggag 25 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH14-F <400> 15 tatctcacac tgggtgcttc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH14-R <400> 16 cggagttggt acaagcaaac 20 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH16-F <400> 17 gactgaactc taagacctga agacgtgtcc 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH16-R <400> 18 ggttgtatac ttcccaggga gctgagaatg 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH23-F <400> 19 ctgcacagat tcataagttg cactgagaat 30 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH23-R <400> 20 cgatctctgt acgaaaacat cagcgc 26 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH26-F <400> 21 agaaatgggc ttcacactca ccgt 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH26-R <400> 22 agaaatgggc ttcacactca ccgt 24 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH27-F <400> 23 ccagtggcaa gggtaataat aacgctttga g 31 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH27-R <400> 24 tcagcaacat tccagctcaa catgg 25 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH32-F <400> 25 ccggaccaag ctgtaacaga acaa 24 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH32-R <400> 26 ggaggtccat gatgatgaca accttc 26 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH33-F <400> 27 cgaacagtta accggacagc gaaatc 26 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH33-R <400> 28 tgataccact cgctcactct cact 24 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH37-F <400> 29 ctgaacatgc tggcttcaga ctggta 26 <210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH37-R <400> 30 ctgaatattg agctgtgcag agataaccca tc 32 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH39-F <400> 31 agcagacaat acctggatac ctgcg 25 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH39-R <400> 32 aacattgcca tgttggaggt cactgtatc 29 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH41-F <400> 33 gcattcacag acaatgtgtt ggacagtctc 30 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH41-R <400> 34 gtgtgttggc ttttacgctg cact 24 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH45-F <400> 35 ggcatcagtc cggactagta caagc 25 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH45-R <400> 36 cgacgtgcac tgatatagcg acgt 24 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH50-F <400> 37 gacacgcatt ctattgcaat tgcaacatga 30 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH50-R <400> 38 catttgtgcc aactgcatga gagca 25 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH53-F <400> 39 cccgctgaat aaaggcttat ggtcttggv 29 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH53-R <400> 40 tcataccccg gacctgaata tgaagga 27 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH56-F <400> 41 cagctatttg atggcggtcc atga 24 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH56-R <400> 42 gcactatacc ttgctcgttg gca 23 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH74-F <400> 43 ccgcacctct tctgttgtgt ga 22 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH74-R <400> 44 gcttctgacc taaggcatgc cag 23 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH77-F <400> 45 ctcgcttccg tcagagagct 20 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH77-R <400> 46 tgttttatct ctcctctgcg agtcagt 27 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn1-F <400> 47 tgatgtattt gataagggta tcatc 25 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn1-R <400> 48 attatgtttc taggtttgtc agcac 25 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn2-F <400> 49 acatgtcgtg attgtttccc ac 22 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn2-R <400> 50 tcctgaccac atactgttca cattag 26 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn3-F <400> 51 ttgacttact gaaacttaaa tggat 25 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn3-R <400> 52 tgctgtattc tacctatgca cttg 24 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn4-F <400> 53 catgactaga tctgtcatcc aaac 24 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn4-R <400> 54 gtgtcccatt atactgtgaa aaga 24 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn5-F <400> 55 tatactgcac tcgggcctca gct 23 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn5-R <400> 56 tagaccctca aaatggacct tca 23 <210> 57 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn6-F <400> 57 tcgttgttca aagataaaga tgtga 25 <210> 58 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn6-R <400> 58 cttacgtcca gtgttatgcg gtctc 25 <210> 59 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn7-F <400> 59 tacccctcaa tcataatatt gtatt 25 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn7-R <400> 60 ttgtctacat tctggtgata agtct 25 <210> 61 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn8-F <400> 61 gcctcttggg cactcttaga aatca 25 <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn8-R <400> 62 tccctagcct ccttcttgct ggaat 25 <210> 63 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn9-F <400> 63 gcttagaagg gacataactc gcaata 26 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn9-R <400> 64 aatagacatt ctacaagcga ggaaa 25 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn10-F <400> 65 ttctgagatg agacgcacca c 21 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn10-R <400> 66 ttggcagcag gcgtcgtgt 19 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn11-F <400> 67 gtccaacaca accaactcct c 21 <210> 68 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn11-R <400> 68 cctgagcatg tttgtggata ac 22 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn11-R <400> 69 cacctgtgtt tcgtacccac 20 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn12-R <400> 70 gggacaattc caagtagatg c 21 <210> 71 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn13-F <400> 71 gtcgaaacta gcacaaacat ct 22 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn13-R <400> 72 gatcaccggt cacatcatac 20 <210> 73 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn14-F <400> 73 acctgacagc gaaacgttgt tct 23 <210> 74 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn14-R <400> 74 tgtgacggcg gtctgtaaat tatcta 26 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn15-F <400> 75 tagctaaacg cagcgaagaa a 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn15-R <400> 76 aacgaccccg tcaattacaa c 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn16-F <400> 77 acaacaaaca aagcatactg a 21 <210> 78 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn16-R <400> 78 gctactcatc ggtggaat 18 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn17-F <400> 79 ccagataaga ctaccattac 20 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn17-R <400> 80 tatgtcagtt tatcgttatc c 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn18-F <400> 81 cagcgaacat acacgagatt a 21 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn18-R <400> 82 actgtgctaa acgatggaga 20 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn19-F <400> 83 cttaaactat ccaccggatg t 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn19-R <400> 84 catggaaatg tcaatcacgt a 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn20-F <400> 85 tgatagaagc gacgtaaaac a 21 <210> 86 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn20-R <400> 86 ggtgaggtga aatgggatt 19 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn1-F <400> 87 cccctctcga aataaactct c 21 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn1-R <400> 88 gaacccaaca caagacaaac 20 <210> 89 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn21-F <400> 89 cacgcacgta tgcacat 17 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn21-R <400> 90 gaaccacctc aagtgtcact a 21 <210> 91 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn23-F <400> 91 gggacctgtt tgggaca 17 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn23-R <400> 92 gacaaagtag ccaacatctc a 21 <210> 93 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn24-F <400> 93 attagtgttt gggccagtt 19 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn24-R <400> 94 ggcctataac acatgaatga a 21 <210> 95 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn25-F <400> 95 cagccgcaca catacg 16 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn25-R <400> 96 atcaaaacac gcagattaca c 21 <210> 97 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn26-F <400> 97 ggcctgcttt tgttttct 18 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn26-R <400> 98 atttgggata caagtgtgac a 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn27-F <400> 99 tgatctgtgt aatccccttt c 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn27-R <400> 100 ttttcatcgt cctcctgtta t 21 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn28-F <400> 101 agtgacttac acaggccttt 20 <210> 102 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn28-R <400> 102 ccccatggag ggtctg 16 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn29-F <400> 103 cagaagacaa cgtgtttatc g 21 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn29-R <400> 104 agccagtttc ttgtgtcact t 21 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn30-F <400> 105 actcacggct tttgaactaa g 21 <210> 106 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn30-R <400> 106 gaacaaacag ccagcca 17 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn31-F <400> 107 agttgttgaa cctttctgtt g 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn31-R <400> 108 gaaaacttca cccactactt g 21 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn32-F <400> 109 cacacgcaca ctcacacata 20 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn32-R <400> 110 actagttttc cttcccttgc t 21 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn33-F <400> 111 atccatattg ctggcgatac g 21 <210> 112 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn33-R <400> 112 ggatgttgga ttagtcttgt ccag 24 <210> 113 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn34-F <400> 113 cgttccatta tctgaggggc aagc 24 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn34-R <400> 114 tcggcatcat tagggaccag 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn35-F <400> 115 tacattggct gaatggggtg 20 <210> 116 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn35-R <400> 116 acttaactgc agtgtcagga cc 22 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn36-F <400> 117 cacactgtgt tggaatcccc a 21 <210> 118 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn36-R <400> 118 tcattcaacc tgttgtgagg tg 22 <210> 119 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn37-F <400> 119 ttactggcga aatcaaggcg ta 22 <210> 120 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn37-R <400> 120 tccctcacat caaaacaatc gcc 23 <210> 121 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn38-F <400> 121 gggtgagatg tagtggtcta cg 22 <210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn38-R <400> 122 agcacaataa atcggcatca gtcc 24 <210> 123 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn39-F <400> 123 accgttgtgt catttcct 18 <210> 124 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn39-R <400> 124 atattgctac aagcggtg 18 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn40-F <400> 125 gcttctctgt ggagagagtg g 21 <210> 126 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn40-R <400> 126 agtgcaataa tcctggacgt gag 23 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn41-F <400> 127 agatttctgg ggagacatgc 20 <210> 128 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn41-R <400> 128 atcggcatca gtctggact 19 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn42-F <400> 129 agaacagaca acaaccgagg 20 <210> 130 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn42-R <400> 130 catagcgata tgtatgcgcg tg 22 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn43-F <400> 131 agtcattgtg cggtagactc 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn43-R <400> 132 ggaccagaca catagcaacg 20 <210> 133 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn44-F <400> 133 tttaagaccc aacttgtaga catcc 25 <210> 134 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn44-R <400> 134 aacgccgcct tgattcgttt gtttgt 26 <210> 135 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn45-F <400> 135 ctaaattaat aacaggccgt cattga 26 <210> 136 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn45-R <400> 136 ttatgttaaa gatccgatcg gttcag 26 <210> 137 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn46-F <400> 137 actgttattc gacatccagt ccgg 24 <210> 138 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn46-R <400> 138 ggcattgtag aggatctgag ggagaa 26 <210> 139 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn47-F <400> 139 ggcattgtag aggatctgag ggagaa 26 <210> 140 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn47-R <400> 140 tagacaaaca gaaaacttca cc 22 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn48-F <400> 141 ccgagatgtt tacagagaga 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn48-R <400> 142 cacactcgct ttctcactca 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn49-F <400> 143 gagacagact gagtgagaaa 20 <210> 144 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn49-R <400> 144 taacatgctt acattcttcc tc 22 <210> 145 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn50-F <400> 145 atcaggatgg gaatgtacct g 21 <210> 146 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn50-R <400> 146 ccaatggtgc gtgtgtaatt ca 22 <210> 147 <211> 2 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blanc <400> 147 aa 2 <210> 148 <211> 292 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH1 <400> 148 gcctgacaag acaaactgat ccattggcag ggtttttact actactacta ctacttctac 60 tactactact actactacta ctactactac tactactact acttctacta ttactactac 120 ttataataat aattatataa tattcataat cataatcatg attatgatga taatgattag 180 ttcagatata tatgtgccac atgatatgat attttatcaa tttttttgtc atcattgtaa 240 acatgtgctg gttttattta taaccggggc acagtgtacc gacctgacct gt 292 <210> 149 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH2 <400> 149 cgagagtcat acatcattag gcccttcgta gtagtagtag tagtagtagt agtagtagta 60 gtagtagtag tagtagtagt agcattgagt accaggaaac cggaggtt 108 <210> 150 <211> 216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH5 <400> 150 acgctggagg tagatggttt gtagatataa tttatttatt gcgaagaagg aaatcattca 60 acatattttc acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acattttaag 120 acgtaaaaga caatgaccat ttggctgcct ttagttggcg gatcggtcca catatagata 180 taattttcaa tatcactgtt tgatgtgagc agcgag 216 <210> 151 <211> 295 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6 <400> 151 cgatgctgtt gtgccctcat agtaccaaat tgagccttga ataagttatt tgatttatct 60 tttagttcat attgtattga tatatctttt agttcatatt tcttaaaagt taaaataata 120 ttcgaaacca ttattgagca caatttaatt gttttgtcct tgttgaacaa tgttattgtt 180 attattatta ttattattat tattattatt attattaacg tatttcgctt gtgtttatta 240 tcaaaggaaa agtttgggta tttcggatac ttatcttgac tatattgcct agggt 295 <210> 152 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH8 <400> 152 cactgttacc aagtcccatc aaaggttcag aaataattat tgaataataa aaataaaaat 60 aataataata ataataataa taataataac aacagtcttt gcagaatatt cttttgtata 120 ttcaaccacc ttaaagagtt cagttattac agcaatagct cg 162 <210> 153 <211> 224 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH9 <400> 153 gctcactgat caattgaccg ggttactaaa ggtgtagcgc tttgatcatg aactgctaca 60 tggctagcgc attataagtg cacattatta ttattattat tattattatt attattatta 120 ttattattat tattattatt attattatta ttattattat cgatcgtgga atgtgctatt 180 tgtacacttt cacatggtcg atgaacaatg tcatatgatg gatg 224 <210> 154 <211> 442 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH12 <400> 154 cgtgggtcgt ctatttccgt taacaacgtg tgcagttaaa gtatacattc aaccaaaaat 60 atattcatgc tttaatgata atgataataa taataataat aataataata ataataataa 120 taataataat aataataata ataataataa taataagtgc atttacaatg cgccagattc 180 catgcaccaa gtgattatta gcccggtcaa tggatcagtg agcactcgat tttcattctc 240 agctctcttg ggagtataca acccaagcca cattaccatc tcatcctact ctacccttcc 300 catcccattt tcccaggaaa tatttccagt gtattggtaa tatggtgcat cattaatatc 360 ataacagttc aacttttttc atgaccttcc ccaaattgca tatttgtttc cattattctc 420 ccctgcctgt gatactttgg ta 442 <210> 155 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH14 <400> 155 cgaagctcca gggttatagt tccatttgat tgaacacttt gaacaccctt aataataata 60 ataataataa taataataat aataataata ataataataa ttaaagctgc aagcagcaat 120 ggcg 124 <210> 156 <211> 148 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH16 <400> 156 gactgaactc taagacctga agacgtgtcc attcctctct tgttctggtc accaagacgt 60 aatacagacg taataataat aataataata ataataataa taataataat aaaaaagtgc 120 atttataatg gatgctcata gcgctaca 148 <210> 157 <211> 226 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH23 <400> 157 ctgcacagat tcataagttg cactgagaat tatttaactc ctaatgtggc gttaataatt 60 atgcaatgcg ttttataata ataataataa taataataat aataataata ataataataa 120 taataatata aaaaaaattc tgtataaata gtttatacaa gtttatttat gttgttctcc 180 agaaaacttg cactgttttt gcgctgatgt tttcgtacag agatcg 226 <210> 158 <211> 195 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH26 <400> 158 agaaatgggc ttcacactca ccgtcatgga agatgcatgt gtataataat aataataata 60 ataataataa taataataat aataataatc aacggattag aatagaacgg aattggtatt 120 ggtccttgtc tcttcagaag ttactttgcc gcagttatgg ttcaaaggat gtgaagatca 180 aagtgtgtct acgct 195 <210> 159 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH27 <400> 159 ccagtggcaa gggtaataat aacgctttga ggatgcccct gtgtggtatt gttgttgttg 60 ttgttgttgt tgttgttgtt gttgttgttg ttgtttcttg gtggtcagct tgattgcgtt 120 tcaccatacc ctgacaaaat ttgacattgc aacggaggtt tgattaatta caggccgcca 180 tgttgagctg gaatgttgct ga 202 <210> 160 <211> 272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH32 <400> 160 ccggaccaag ctgtaacaga acaattttaa ctgtatatac ataactacca acattaataa 60 taataataat aataataata ataataataa tccttaatga attgctgcta agcccaactg 120 agatgtattc gcaggggcag atggtgactt cataacccat ttctattagc agaagaatat 180 ttcagggtga ttcttttagt cctttgtttt tctgtgtgtc actaaatcct ttcagcttat 240 caagaggaag gttgtcatca tcatggacct cc 272 <210> 161 <211> 237 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH33 <400> 161 cgaacagtta accggacagc gaaatccaga ttagcagggt gtcgctgtat gtcatgtata 60 atggggatac aaagttacgc aacatgttca aaaattgaag gtttacccac tcctgaattc 120 ccgttcccat ttgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgaga gagagagtga gtgagtgagt 180 gagtgagtga gtgagtgagt gagtgagtga gtgagtgaga gtgagcgagt ggtatca 237 <210> 162 <211> 185 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH37 <400> 162 ctgaacatgc tggcttcaga ctggtattta aagttgcaga ctgtaacttt gtaacataca 60 aaacccactg atgttcccat taatgaagaa atattacctc atgatgatga tgatgatgat 120 gatgatgatg atgatgatga tgattgagat agagatgggt tatctctgca cagctcaata 180 ttcag 185 <210> 163 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH39 <400> 163 agcagacaat acctggatac ctgcggtata tacatgtata ataataataa taataataat 60 aataataata ataataatga taataataat aataataata ataatatact tataataata 120 atcatcatca tcatcatcat catatcaaac atgaaacatg ttcaagggta cagaatttta 180 tctcatgtat gtgttattga tacagtgacc tccaacatgg caatgtt 227 <210> 164 <211> 245 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH41 <400> 164 gcattcacag acaatgtgtt ggacagtctc attaaattca tcgcataatc tacatttcat 60 atttacattt tgatgcaaaa tcacaaattg acagtttcga gggggaaatg agtcctgagc 120 agcatattat tattattatt attattatta ttattattat tattatactg cacttatcca 180 ggtattatat tgtattatac tatattgctg gaatattgat aagtgcagcg taaaagccaa 240 cacac 245 <210> 165 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH45 <400> 165 ggcatcagtc cggactagta caagcagcca cacacacaca cacacacacg tgcatgcacg 60 tcgctatatc agtgcacgtc g 81 <210> 166 <211> 166 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH50 <400> 166 gacacgcatt ctattgcaat tgcaacatga cagggtaaca tcaggggctg ccgacctaca 60 acaacaacaa caacaacaac aacaacaact actaagcgaa aagtaaaggc tcatgaaaat 120 ctcacgaaag cgtatgcttg atgctctcat gcagttggca caaatg 166 <210> 167 <211> 260 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH53 <400> 167 ccgctgaata aaggcttatg gtcttggcaa ttttacctag gtgtcgttta aaatttatgt 60 tatgtgccga taaataagaa aattcgcttg ttgcctcgct aaaatgtttg aagagaaaaa 120 caacgttact tcaaaatcac tactactact actactacta ctactactac tactactact 180 actactacta ctactctctc tcgttttaat tgtacatgat ttattaaata ttttccttca 240 tattcaggtc cggggtatga 260 <210> 168 <211> 198 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH56 <400> 168 cagctatttg atggcggtcc atgaaccggt gattgacaaa caagaagtaa ttagtgagta 60 ggtagtattg aaacatcatc atcatcatca tcatcatcat catgtgtcag cttaaagctg 120 tgtgaggaaa gcccgaattg atgcaggtct cagatgttta tcactttggt ataattgcca 180 acgagcaagg tatagtgc 198 <210> 169 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH74 <400> 169 ccgcacctct tctgttgtgt gagtgagtga gtgtgtttgt gtgcgtgcgt gcgtgcgtgc 60 gtgcgtgcgc gtgtgcgtcc gtgcgtgcgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gcgcgtgagt 120 caagtggcga gga 133 <210> 170 <211> 237 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH77 <400> 170 ctcgcttccg tcagagagct gcagcataaa acatatactt gagaattgac ctacatatgt 60 tttggcgttt atggaggaat atatatattt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 120 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtttat tcacatatgt atggagcatc cgtcaactca 180 gtacttacaa actgttgaag gcgacgttaa actgactcgc agaggagaga taaaaca 237 <210> 171 <211> 235 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn1 <400> 171 tgatgtattt gataagggta tcatcaggta tattacacgc atcatatcaa tgagtgagtg 60 agtgagtgag tgagagagtt ggatttatcg tcgcttttaa cagtattcca agttacatca 120 cggcgtgtca gcttgatgtg ggatgaaagc ccgaagtgat gcaggtctca gacgtttacc 180 atttcggtga aacccacgag catgggtatg gtgctgacaa acctagaaac ataat 235 <210> 172 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn2 <400> 172 acatgtcgtg attgtttccc accccaccct ctctgggtga atgtcagccc tgcacaggtt 60 atctggtagg tgtgggtctg cacataccgg cccggccaca ccatgcagat ccacacacac 120 acacacacac acacacacac acaccaaggt cacacatgtg ctggatgcaa ttcagagaag 180 gatcaaacac taatgtgaac agtatgtggt cagga 215 <210> 173 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn3 <400> 173 ttgacttact gaaacttaaa tggatttctc agccggcagt gtggtgttct gaaatatatt 60 cctgtagtat tatggaacca gctgggaatg taagcttctg ccatgtttgt gtgtgtgtgt 120 tgtgagcagc attgtgagac acattttgtt tgtatgtagc tggagatggt gttgtctcaa 180 gtgcataggt agaatacagc a 201 <210> 174 <211> 167 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn4 <400> 174 catgactaga tctgtcatcc aaacagtttc ttcatgtgca atcactctgt acttcccacc 60 cacaaaatac ccacacaccc acacacccac acacccacac acccacacag aatatttgca 120 gatgaaaaaa gtatcccagt tcgtcttttc acagtataat gggacac 167 <210> 175 <211> 175 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn5 <400> 175 tatactgcac tcgggcctca gcttgagcaa ttcctgaaat aataataata ataataataa 60 taataataat aataataata ataataatgc aatcagcaag gtagggcttc aagtcacatt 120 tctatgaatt ggattaatct gtttgacata catgaaggtc cattttgagg gtcta 175 <210> 176 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn6 <400> 176 tcgttgttca aagataaaga tgtgaaaata gatgtttata ggaattgatt gcatagggcc 60 cagtgaatat tattattatt attattatta aaaaaacatt tattcagcgc ttaaatccaa 120 ctaaaatgaa ctgctcgaga gggctgtctg agaccgcata acactggacg taag 174 <210> 177 <211> 235 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn7 <400> 177 tacccctcaa tcataatatt gtattgccaa agaaactgtt gtcaattatt attattatta 60 ttattattgg cactattcat tctttcacat gaaaacatat ttgatgatcc ataagtaaac 120 cattcagcat gatctcaatg atattgatat tacaattctg ggacatagat agagaaaatc 180 tacatgttat ggggtgtttt taaattagac agacttatca ccagaatgta gacaa 235 <210> 178 <211> 199 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn8 <400> 178 gcctcttggg cactcttaga aatcatattt tcataatatg atgcttatta catgaagtca 60 gttgattgat ataccttcta gacgaagaaa cggaaaatga gtgagtgagt gagtgagtga 120 ggagtgagtg agtgagtgag tgagtgaggt tttacatcac ttttcgtttg caatattcca 180 gcaagaagga ggctaggga 199 <210> 179 <211> 238 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn9 <400> 179 gcttagaagg gacataactc gcaatagcca ctggtggcgc tacgatcgag cccaggaatt 60 ccagcctagt tcggcaagag tggaaactgg actttcaaag tcagttaact ctcttgcctc 120 gggaagatcg aaaattcagg acaaattcta tcgaatgtcc actttccctg cttcacatca 180 tcatcatcat catcatcatc attgtaatct tattttcctc gcttgtagaa tgtctatt 238 <210> 180 <211> 289 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn10 <400> 180 ttctgagatg agacgcacca caaccacaca cgaccacacg cacacaatac cacgcacaca 60 cacacacatc tacactcaca ccaacattca cacccacacc cacatcatac cacacacccg 120 caaaagcatc cacacccacg cccacaccac ccacaccacc aaaatccaca cccacacacg 180 cacacccact cgcaaccccc ctacacacac acaagcacgc acgcacgcac gcacgcacac 240 acacacacac acacacacac acacacacac acacgacgcc tgctgccaa 289 <210> 181 <211> 425 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn11 <400> 181 gtccaacaca accaactcct ccctccattg tgtggtgtgg tgtggtgtgc tgtgctgtgc 60 tgtgctgtgc tgtggtgtgg tgtggtgtgg tgtggtgtgg tgtggtgtgg tgtggtgtgg 120 tgtggtgtgg tgtggtgtgt gtgtctgtgg tttggtgtga tggtgtgtgc gtgtgccgtg 180 cgtgtgtggt gtgtttaggt gtggtgtggt ttggtgtgcg tgtgtgtggt gtggtgtgtg 240 tggggtgtgc gtgtgtggtg tggtgtggtt tggtttggtg tgtgtggtgg tgtgcgtgtg 300 cmgtgcgtgt gtggtgtggt gtggtggtgt gtgtgtgtgt gtgtgtatgt gtgtgtgtgt 360 gtgtgttaat gtactatgtg ttgtgataag catacaagaa gttgttatcc acaaacatgc 420 tcagg 425 <210> 182 <211> 613 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn12 <400> 182 cacctgtgtt tcgtacccac atgggtataa tgtggctcgg ctccgctcca cgccacgcca 60 cgccacgcca cgccacgcca cgccacgcca cgccacgcca cgccactcca ctccactcca 120 ctccactcca ctccacgcca cacgctccac tctactccac tccacacact ccactcctat 180 cctatccact ccactccact ctgctccatg ccacgctgcc ccaatccact ccgctccacg 240 ccactcccct cctctccact ccactccgct ccgctccacg ccacacgctc cactccactc 300 ctatccactc cacacacacc actccgcgcc ggctgcccca cgccgcgccg ctccactcca 360 cgccgctcca ctccactcca ctccactcca ctccactcca ctccactcca ctccactcca 420 ctccactcca ctccactcca cgccacgcca cgccacacgc tccactccac tccactccac 480 tccactccac tccactccac tccactcatg ttagtttaca ctgacccacc attgtcatca 540 tgtacattca ttctttcaag aacttcctct gtattgtagt gttgtggata gagcatctac 600 ttggaattgt ccc 613 <210> 183 <211> 179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn13 <400> 183 gtcgaaacta gcacaaacat ctacacacac agcaaacaca cacatataca tgcacgtcgc 60 tatataacaa taaccttgga cgggacgtta aaccccattt cacctcacct cacctcacct 120 cacctcacct cacctcactt cacctcacct cacctcacgg tatgatgtga ccggtgatc 179 <210> 184 <211> 164 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn14 <400> 184 acctgacagc gaaacgttgt tctgtttcga gaataacaca ctcacacaca cacacacaca 60 cacacacacg cacgcacgca cgcacgcacg cacgcacgca gcacgcacgc acacacacac 120 acaccgattg gtaacatccg ggtgtgatga ggatccggat ataa 164 <210> 185 <211> 210 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn15 <400> 185 tagctaaacg cagcgaagaa agahaatcat cgtcatcatc atcatcatca tcatcaatat 60 tatacatatc gagagagaga gagagacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 120 cactcactca ctcactcact cactcactca ctcacactca cacaccttgg accatggctg 180 tcttaccctg ttgtaattga cggggtcgtt 210 <210> 186 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn16 <400> 186 ctgaagcagc aaaaccacac acacacacag gcacacaccc acacaataaa ataataacat 60 60 <210> 187 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn17 <400> 187 ataagactac cattacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacaattac 60 taacttttaa 70 <210> 188 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn18 <400> 188 ttaaatggag tagcagtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtggt 60 gggtttaacg ac 72 <210> 189 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn19 <400> 189 atgttgaggg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 60 tgtgtatgtg tgtgtgtgcg tgttggga 88 <210> 190 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn20 <400> 190 agaaactgtg acacacacac acacacacac tcacacacac acacacacat acacacgtgc 60 atgcac 66 <210> 191 <211> 149 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn21 <400> 191 aaaatctacc acacacacac acacacacac acacacactc ccacacacac acacacgcac 60 acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 120 acacacacca cacacacacc ccgnggtcg 149 <210> 192 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn22 <400> 192 tatgcacatg cacatacaca cacacactca cacaacacac atacatactt g 51 <210> 193 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn23 <400> 193 agttttcgcg ttgttgttgt tgttgggaca tgcaaagcac tccctcctta gttgtctttt 60 cttatttccc atgtatctgg ttgttgttgt tgttcattat ta 102 <210> 194 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn24 <400> 194 ctcccaaaca ctcccaaaca cacacatata cacacacgat ataaacttag atgg 54 <210> 195 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hn25 <400> 195 ccgcacacat acgcacgcac gcacgcacac acgcacacac gcacacactt gtaagtgc 58

Claims (21)

  1. 서열번호 149의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 150의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 156의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 159의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 166의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 167의 염기서열로 이루어지는 마커 및 서열번호 169의 염기서열로 이루어지는 마커를 포함하는 마이크로새틀라이트(Mircrosatellite, MS) 마커군을 포함하는 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 마커군은 서열번호 148의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 151의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 152의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 155의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 160의 염기서열로 이루어지는 마커, 및 서열번호 168의 염기서열로 이루어지는 마커로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함하는 것인, 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 조성물.
  5. 삭제
  6. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 17의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 23의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 37의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 39의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 40의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및
    서열번호 43의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 44의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 중합효소연쇄반응용(polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머 세트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 정방향 프라이머는 5'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 추가로 포함하는 것인, 프라이머 세트.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제6항에 있어서, 상기 프라이머 세트는,
    서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 15의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 25의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및
    서열번호 41의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 42의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 추가로 포함하는, 프라이머 세트.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제6항, 제7항 및 제10항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 키트는 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마이크로새틀라이트(Mircrosatellite, MS) 마커가 포함된 유전자 증폭용인 것인, 키트.
  16. 제14항에 있어서, 상기 키트는 완충용액, DNA 중합효소 및 dNTP를 포함하는 것인, 키트.
  17. 전복류에서 추출한 시료에 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 및
    상기 PCR 산물이, 서열번호 149의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 150의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 156의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 159의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 166의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 167의 염기서열로 이루어지는 마커 및 서열번호 169의 염기서열로 이루어지는 마커를 포함하는 마이크로세틀라이트 마커군의 포함 여부를 분석하는 단계를 포함하는 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 PCR 산물을 얻는 단계는 전복류에서 추출한 시료를,
    서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 17의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 23의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 37의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 39의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 40의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및
    서열번호 43의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 44의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하고 있는, 중합효소연쇄반응용(polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 정방향 프라이머는 5'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은
    서열번호 149의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 150의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 156의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 159의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 166의 염기서열로 이루어지는 마커, 서열번호 167의 염기서열로 이루어지는 마커 및 서열번호 169의 염기서열로 이루어지는 마커를 포함하는 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마이크로새틀라이트 마커가 포함된 전복의 유전자를 증폭하는 것인, 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 PCR 산물을 분석하는 단계는, PCR 산물의 염기서열을 분석하거나 또는 PCR 산물의 크기를 분석하여 PCR 산물의 유전자형을 분석하는 것인, 방법.
KR1020160118408A 2016-09-13 2016-09-13 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마이크로새틀라이트 마커군 및 이를 이용한 분석방법 KR101845027B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160118408A KR101845027B1 (ko) 2016-09-13 2016-09-13 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마이크로새틀라이트 마커군 및 이를 이용한 분석방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160118408A KR101845027B1 (ko) 2016-09-13 2016-09-13 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마이크로새틀라이트 마커군 및 이를 이용한 분석방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180029802A KR20180029802A (ko) 2018-03-21
KR101845027B1 true KR101845027B1 (ko) 2018-04-03

Family

ID=61900463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160118408A KR101845027B1 (ko) 2016-09-13 2016-09-13 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마이크로새틀라이트 마커군 및 이를 이용한 분석방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101845027B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102499499B1 (ko) 2022-11-29 2023-02-13 한국수산자원공단 전복 폐사율 저감을 위한 분석시료 채집방법과 이를 이용한 유전자 분석방법

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102491088B1 (ko) * 2021-07-23 2023-01-20 부경대학교 산학협력단 참돔 원산지 판별용 마이크로새틀라이트 마커 및 이의 용도
KR102491092B1 (ko) * 2021-08-17 2023-01-20 부경대학교 산학협력단 방어 원산지 판별용 마이크로새틀라이트 마커 및 이의 용도
KR102654409B1 (ko) * 2023-11-28 2024-04-05 대한민국 전복 친자 감별용 유전자 마커 및 그를 이용한 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015186454A (ja) 2014-03-26 2015-10-29 国立大学法人東京海洋大学 アワビｖａｓａ遺伝子マーカーおよび不稔化アワビの製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015186454A (ja) 2014-03-26 2015-10-29 国立大学法人東京海洋大学 アワビｖａｓａ遺伝子マーカーおよび不稔化アワビの製造方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Aquaculture Research 2010, 41, 1827-1834
Aquaculture. 2005, 243, 33-47
Conservation Genet Resour. 2011, 3. 669-671
Korean J. Malacol. 2009, 25(3) 197-201
Marine Biotechnology. 2005, 7, 373-380
Molecular Ecology Notes. 2006, 6, 11-13

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102499499B1 (ko) 2022-11-29 2023-02-13 한국수산자원공단 전복 폐사율 저감을 위한 분석시료 채집방법과 이를 이용한 유전자 분석방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180029802A (ko) 2018-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Marwal et al. Molecular markers: tool for genetic analysis
Elo et al. Inheritance of RAPD markers and detection of interspecific hybridization with brown trout and Atlantic salmon
Wang et al. A genome scan for quantitative trait loci affecting growth-related traits in an F1 family of Asian seabass (Lates calcarifer)
KR101845027B1 (ko) 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마이크로새틀라이트 마커군 및 이를 이용한 분석방법
US8597887B2 (en) Genetic marker identification in atlantic cod
Liao et al. Construction of a genetic linkage map and mapping of a female-specific DNA marker in half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis)
Alcivar-Warren et al. ShrimpMap: A low-density, microsatellite-based linkage map of the pacific whiteleg shrimp, Litopenaeus vannamei: Identification of sex-linked markers in linkage group 4
Xu et al. Transcriptome profiling of embryonic development rate in rainbow trout advanced backcross introgression lines
KR100960878B1 (ko) 넙치 미세위성마커를 이용한 개체식별 및 친자확인 방법
CN110760599B (zh) 大麻哈鱼微卫星分子标记位点及多态性引物和应用
Kaiser et al. Microsatellite polymorphism between and within broiler populations
CN113862375A (zh) 牛aanat和asmt基因的snp标记及应用
KR101499689B1 (ko) 넙치 암수 구분 단일염기다형성 마커
KR102230553B1 (ko) 범가자미 미세위성 마커를 이용한 개체의 유전적 다양성 식별방법
Rajkumar et al. Genomic heterogeneity of chicken populations in India
Feng et al. Identification of SNP markers correlated with the tolerance of low-salinity challenge in swimming crab (Portunus trituberculatus)
JP2018529377A (ja) 所望のハプロタイプ中の外来対立遺伝子の存在を同定する方法
Harry et al. A first-generation map of the turkey genome
CN113846172B (zh) 凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的snp分子标记及其应用
Uchino et al. Genotyping‐by‐sequencing for construction of a new genetic linkage map and QTL analysis of growth‐related traits in Pacific bluefin tuna
Sodhi et al. Marker assisted selection-applications and evaluation for commercial poultry breeding
Poompuang et al. Microsatellite–centromere mapping in walking catfish Clarias macrocephalus (Günther, 1864) using gynogenetic diploids
Liu et al. Constructing a genetic linkage map and mapping quantitative trait loci for skeletal traits in Japanese flounder
Pathan et al. Inbred zebrafish lines: A genetic repository for zebrafish researchers
Georges Hypervariable minisatellites and their use in animal breeding

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant