KR101499689B1 - 넙치 암수 구분 단일염기다형성 마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 넙치 암수 유전체를 비교 분석하여 넙치 종묘의 암수를 유전적으로 판별할 수 있는 단일염기다형성(SNP) 마커를 제공한다.

Description

넙치 암수 구분 단일염기다형성 마커{SNP markers for discriminating the sex in the olive flounder}
본 발명은 암수 구분 마커에 관한 것으로서, 더 상세하게는 넙치의 암수 구분 마커에 관한 것이다.
넙치(Paralichthys olivaceus) 암컷은 수컷보다 성장이 빠르고 경제적 가치가 높기 때문에 양식 현장에서는 수컷보다 암컷 종묘를 매우 선호한다. 일반적으로 양식 넙치 종묘의 암수 비율은 거의 1:1이므로 수컷을 성장이 빠른 암컷으로 대체한다면 양식생산단가를 절감할 수 있어, 양식생산성을 크게 향상시킬 수 있을 것이다. 그러나 종래의 암컷 종묘를 생산하는 기술은 매우 어렵고 복잡한데다 보통 어류의 성 결정 기작은 종마다 매우 다양하다. 넙치의 경우, 태어날 때 암수가 결정되는 유전적 성결정 시스템과 성이 분화하는 시기에 고수온 또는 저수온에 의해 암컷이 수컷으로 바뀌는 환경적 성결정 시스템을 동시에 가지고 있어 암컷으로 태어났지만 고수온 또는 저수온에서 사육하여 수컷으로 성전환된 가짜수컷(pseudo male)을 암컷과 교배하면 유전적으로 암컷인 종묘가 생산될 수 있어 종묘 생산시 암컷의 비율을 높일 수 있다.
대한민국 공개특허 제2012-0027843호는 넙치 암수판별용 프라이머 세트를 이용하여 aromatase 유전자 발현량 비교를 통해 조기 성판별이 가능한 넙치 암수 판별방법을 개시하고 있다.
그러나, 상기 선행기술의 경우 성분화 이후에 성판별이 가능한 방법으로 현재까지 성분화 이전의 어린 종묘의 암수를 판별할 수 있는 방법은 개발되지 못한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 성분화 이전의 넙치 종묘의 암수를 판별할 수 있는 마커를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 일 관점에 따르면, ⅰ) 서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 1의 523번째 염기가 C 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; ii) 서열번호 2의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 2의 150번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; iii) 서열번호 3의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 3의 252번째 염기가 A 또는 C인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; ⅳ) 서열번호 4의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 4의 329번째 염기가 T 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; ⅴ) 서열번호 5의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 5의 108번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; ⅵ) 서열번호 6의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 6의 150번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; ⅶ) 서열번호 7의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 7의 322번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; ⅷ) 서열번호 8의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 8의 367번째 염기가 C 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; ⅸ) 서열번호 9의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 9의 253번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; ⅹ) 서열번호 10의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 10의 150번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 xi) 서열번호 11의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 11의 249번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 넙치 암수 판별용 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는, 넙치 암수 판별용 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 넙치 암수 개체로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계; 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 상기 제1항의 폴리뉴클레오티드를 증폭할수 있는 프라이머쌍으로 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 증폭단계; 및 상기 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는, 넙치 암수 판별방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 성체 넙치를 대상으로 복부 압박법으로 정소의 유무를 판별하여 형태학적 수컷을 선발하는 단계를 포함하는 형태학적 수컷 선발단계; 상기 선별된 형태학적 수컷으로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계; 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머쌍으로 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 하기 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 증폭단계; 및 상기 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는, 형태학적 수컷 중 가짜 수컷의 판별 방법이 제공된다:
ⅰ) 서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 1의 523번째 염기가 C 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅱ) 서열번호 6의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 6의 150번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅲ) 서열번호 7의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 7의 322번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅳ) 서열번호 9의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 9의 253번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅴ) 서열번호 10의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 10의 150번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및
ⅵ) 서열번호 11의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 11의 249번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 넙치 암수 판별용 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 넙치 암수 유전체의 비교분석을 통해 개발한 암수 판별 마커를 이용하여 넙치 종묘의 조기 암수 판별 효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 넙치 암수간 유전체를 비교 분석하여 동정된 SNP 마커를 토대로 24개 염색체별로 SNP-based map을 작성한 그래프이다. 빨간색 부분은 암컷 SNP 영역을 나타내고, 파란색 부분은 수컷 SNP 영역을 나타낸다.
도 2는 넙치 암수개체로 부터 SNP #9 마커의 전기영동도(electropherogram)를 나타낸 그래프이다.
도 3은 넙치 암수개체로 부터 SNP #10 마커의 전기영동도(electropherogram)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 넙치 암수개체로 부터 SNP #11 마커의 전기영동도(electropherogram)를 나타낸 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "넙치(Paralichthys olivaceus)"는 가자미목 넙치과에 속하는 바닷물고기로 몸이 넙적하고 눈이 왼쪽으로 몰려 있고 광어(廣魚)라고도 한다. 연안의 조수가 고여 있는 곳으로부터 수심 1,000 m의 심해에까지 서식하며 몸길이는 5 ㎝ 정도인 소형종에서 80 ㎝에 달하는 종류까지 있다. 꼬리지느러미는 등지느러미와 뒷지느러미에서 명확하게 분리되어 있고 몸색깔은 눈 있는 쪽은 갈색 또는 어두운 색이고, 반대쪽은 흰색이다. 산란기는 2-7월이고 남쪽지방이 약간 빠르다. 이 시기에는 수심 20 ~ 70 m의 조수가 잘 통하는 모래진흙ㅇ모래자갈 또는 암초지대로 이동해 산란한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "자성발생성 이배체(gynogenetic diploid)"는 수컷의 유전인자를 완전히 제거하고 암컷의 유전물질만으로 만들어진 이배체성 개체를 말하며 제2극체 방출을 억제시켜 자성발생성 개체를 만들면 유전적으로 매우 순수한 개체를 얻을 수 있다. 더욱이 성결정 양식에서 암컷이 동형접합형(XX)일 경우 이러한 기작에 의해 유도된 모든 개체는 암컷이 된다. 현재 우리나라에서 양식되고 있는 넙치나 참돔 등은 암컷의 성장이 빠르므로 이러한 기법에 의해 실제 그 종묘생산을 하고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "가짜 수컷(pseudo male)"은 유전적으로 암컷으로 태어난 넙치가 성분화 시기(부화 후 약 60일 전후)에 고수온 또는 저수온에서 사육하면 수컷으로 성전환 되어 정소를 가진 개체를 말한다. 따라서 유전학적으로 암컷이나 외형은 수컷인 어미(가짜수컷)를 찾아 암컷과 교배하면 유전적으로 암컷인 종묘가 생산될 수 있어 종묘 생산 시 암컷의 비율을 높일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)"은 집단 내에서 또는 개체 내의 대립유전자 사이에 특정 좌위의 한 개 염기의 변화가 나타는 것을 의미한다.
발명의 상세한 설명:
본 발명은 일 관점에 따르면,
ⅰ) 서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 1의 523번째 염기가 C 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ii) 서열번호 2의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 2의 150번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
iii) 서열번호 3의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 3의 252번째 염기가 A 또는 C인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅳ) 서열번호 4의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 4의 329번째 염기가 T 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅴ) 서열번호 5의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 5의 108번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅵ) 서열번호 6의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 6의 150번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅶ) 서열번호 7의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 7의 322번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅷ) 서열번호 8의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 8의 367번째 염기가 C 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅸ) 서열번호 9의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 9의 253번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅹ) 서열번호 10의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 10의 150번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및
xi) 서열번호 11의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 11의 249번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 넙치 암수 판별용 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
상기 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드가 대립 유전자 특이적 프로브(probe) 또는 대립 유전자 특이적 프라이머(primer)인 폴리뉴클레오티드 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는, 넙치 암수 판별용 키트가 제공된다. 상기 키트는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이(microarray)로 제공되는 키트 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 넙치 암수 개체로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계;
상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할수 있는 프라이머쌍으로 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 증폭단계; 및
상기 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는, 넙치 암수 판별방법이 제공된다.
상기 넙치 암수 판별방법에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계는, 유전자 염기서열 결정(sequencing), 대립유전자 특이적 마이크로어레이를 이용한 혼성화 분석, 대립유전자 특이적 PCR, 모세관 전기영동, SSCP(single-strand conformation polymorphism), DGGE(denaturation gradient gel electrophoresis), 변성 HLPC, 질량분석법(mass spectrometry), 제한효소 단편 길이 다형분석(RFLP) 및 TaqMan SNP genetyping assay 등 종래에 보고된 SNP를 확인할 수 있는 다양한 방법을 통해 수행될 수 있다.
이때, 상기 유전자 염기서열 결정(sequencing)은 넙치의 게놈 DNA로 부터 대용량 염기서열을 분석하고 맵핑(mapping)을 통한 변이체 탐색(variant calling)하여 수행될 수 있다. SNP calling할 때 정확도(quality vaule)가 최소 30 이상인 변이체만 동정하고 최종적으로 이전에 넙치 유전체 완전 해독에 사용한 수컷 유전체를 표준유전체로 사용하여 변이체를 최종적으로 탐색한다. 동정된 SNP 마커를 분석하여 정자를 가지고 있는 수컷은 헤테로형을 보이고, 난자를 가지고 있는 암컷은 호모형을 보여, 암수간 구별은 단 하나의 염기 차이로 가능하다. 본 발명에 사용된 넙치 자성발생성 이배체는 암컷의 염색체만을 가지고 있기 때문에 유전적으로 암컷이므로 유전자형은 암컷 유전자형과 같은 호모형이었고 가짜 수컷의 유전자형도 암컷과 같이 호모형을 보였다. 이것은 가짜수컷이 형태학적으로는 수컷일지라도 유전학적으로 암컷이기 때문이다. 이런 결과에서 보면, 유전학적으로 수컷은 헤테로형, 유전학적으로 암컷은 호모형의 SNP 유전자형을 보임을 알 수 있으므로 유전학적 암수 판별이 가능하다. 현재까지 넙치 암수 판별에는 육안적 관찰, 생식소의 조직학적 관찰, 혈중 성스테로이드 호르몬 측정, 난황단백질 측정, CT 측정 및 아로마타아제 유전자 발현 측정 등이 있으나 이런 방법들은 대부분 일정한 크기 이상이거나 성숙된 넙치에서만 가능하고, 검사자의 판별 능력에 따라 오차가 크며, 넙치를 죽여 해부해서 생식소를 이용해야 하므로 성분화 이후에서만 성판별이 가능하다. 그러나 상기 판별 방법은 성분화 이전의 어린 종묘의 유전학적 암수를 판별하는데 유용하게 사용될 수 있다.
아울러, 상기 방법은 하기의 경우 중 어느 하나인 경우 넙치 종묘를 수컷으로 판정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다:
서열번호 1의 핵산서열 기준으로 523번째 염기에 상응하는 염기가 C;
서열번호 2의 핵산서열 기준으로 150번째 염기에 상응하는 염기가 T;
서열번호 3의 핵산서열 기준으로 252번째 염기에 상응하는 염기가 A;
서열번호 4의 핵산서열 기준으로 329번째 염기에 상응하는 염기가 T;
서열번호 5의 핵산서열 기준으로 108번째 염기에 상응하는 염기가 C;
서열번호 6의 핵산서열 기준으로 150번째 염기에 상응하는 염기가 T;
서열번호 7의 핵산서열 기준으로 322번째 염기에 상응하는 염기가 C;
서열번호 8의 핵산서열 기준으로 367번째 염기에 상응하는 염기가 C;
서열번호 9의 핵산서열 기준으로 253번째 염기에 상응하는 염기가 A;
서열번호 10의 핵산서열 기준으로 150번째 염기에 상응하는 염기가 G;및
서열번호 11의 핵산서열 기준으로 249번째 염기에 상응하는 염기가 G.
더 나아가, 본 발명의 일 관점에 따르면, 성체 넙치를 대상으로 복부 압박법으로 정소의 유무를 판별하여 형태학적 수컷을 선발하는 단계를 포함하는 형태학적 수컷 선발단계;
상기 선별된 형태학적 수컷으로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계;
상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머쌍으로 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 하기 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 증폭단계; 및
하기 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 형태학적 수컷 중 가짜 수컷의 판별 방법이 제공된다:
ⅰ) 서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 1의 523번째 염기가 C 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅱ) 서열번호 6의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 6의 150번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅲ) 서열번호 7의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 7의 322번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅳ) 서열번호 9의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 9의 253번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅴ) 서열번호 10의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 10의 150번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및
ⅵ) 서열번호 11의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 11의 249번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 넙치 암수 판별용 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드.
상기 가짜 수컷의 판별방법에 있어서, 하기 폴리뉴클레오티드의 유전자형을추가로 분석할 수 있다:
ⅶ) 서열번호 2의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 2의 150번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅷ) 서열번호 3의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 3의 252번째 염기가 A 또는 C인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅸ) 서열번호 4의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 4의 329번째 염기가 T 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
ⅹ) 서열번호 5의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 5의 108번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및
xi) 서열번호 8의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 8의 367번째 염기가 C 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드.
상기 가짜 수컷의 판별방법에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 단일염기다형성의 유전자형이 호모형일 때 가짜수컷으로 판별하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 가짜 수컷 판별방법을 이용함으로써 성체 중 유전학적으로 암컷인데도 수컷으로 성전환된 가짜 수컷을 판별하여, 이를 교배친으로 하여 암컷과 교배시킬 경우 100% 유전학적으로 암컷만 생산할 수 있기 때문에, 넙치의 종묘 생산에 매우 효율적으로 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 자성발생성 이배체 및 가짜수컷 생산
본 발명의 일 실시예에 따라 자성발생성 이배체를 생산하기 위하여 성숙한 2∼3년생 참돔 수컷(개인 가두리양식장)의 복부를 눌러 정자를 얻고, 링거액으로 희석한 후 자외선 조사장치하에서 교반하면서 4,800 erg/mm2의 자외선을 조사하여 정자를 불활성화시켰다. 상기 참돔 정자를 넙치의 난과 인공 수정시킨 후 반수체를 배수화(2n)하기 위해 0∼2℃에서 저온 처리하여 자성발생성 이배체를 만들고 5톤 수조에서 사육하였다. 상기 자성발생성 이배체를 수컷화하기 위하여, 즉 가짜수컷(pseudomale)을 만들기 위하여 남성 호르몬인 17α-methyltesterone(MT)를 최종 농도 10 ppb와 100 ppb가 되도록 하여 사용하였으며, 3개 수조에 각 농도별로 2,000마리씩 분류하여 부화 후 33일부터 호르몬 처리를 시작하였다. 그 후, 60일간 매일 2시간동안 침지 처리하였고 유도된 가짜 수컷을 5톤 수조에서 사육하였다.
실시예 2: 유전체 분석(genome analysis)
본 발명의 일 실시예에 따라 수컷 및 암컷 넙치로부터 게놈 DNA를 분리하여 암수 유전체 대량염기서열을 분석하였다.
구체적으로, 수컷 친어 1마리 및 암컷 친어 14마리(국립수산과학원 육종연구센터)의 혈액, 정자 및 난자 조직을 CsCl-EtBr gradient를 이용한 고원심분리(ultracentrifugation) 방법으로 고순도의 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리한 DNA를 이용하여 short-read 라이브러리를 제작하였고, 넙치의 대용량 염기서열 분석을 위해 차세대 염기서열분석기(next generation sequencer) HiSeq2000(Illumina, USA)를 사용하여 넙치의 대용량 염기서열을 분석하였다.
실시예 3: SNP 마커 동정
본 발명의 일 실시예에 따라 분석한 대용량 염기서열을 이용하여 넙치 암수 유전체를 비교 분석하였다. 본 발명자들은 넙치 성과 연관된 염색체 또는 마커를 동정하기 위하여 분자마커 중에서 변이와 재현성이 높은 SNP 마커를 선택하였다. 상기 SNP 마커는 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A, T, G, C)의 차이를 보이는 유전적 변이이기 때문에 암수간 차이를 나타내는 마커를 찾는데 가장 적절한 마커이다.
구체적으로, 실시예 2에서 분석한 암수 대량 염기서열을 SOAPdenovo를 이용하여 어셈블리하였고, CASAVA 프로그램의 파이프라인을 통해 basecalling과 맵핑(mapping)을 통해 변이체 탐색(variant calling)을 수행하였다. 맵핑은 Illumina사에서 개발한 ELAND 프로그램을 사용하였고, SNP 변이체 동정은 Samtools의 Mpileup 프로그램을 사용하였다. SNP calling할 때 정확도(quality value)가 최소 30이상인 변이체만 동정하였고 SNP 영역의 유전자형을 알아보기 위하여 개체별 염기서열을 Seqman 프로그램을 이용하여 수정한 후 배열하였다. reference sequence를 기준으로 염기서열에서 프라이머를 포함하고 있는 암수 개체의 sequence를 배열한 후 암수간 차이가 있는 SNP를 동정하였다. 그리고 최종적으로 이전에 넙치 유전체 완전 해독에 사용한 수컷 유전체를 표준유전체(reference)로 사용하여 위에서 분석된 암수 개체를 BWA 맵핑 프로그램을 이용하여 맵핑하고 변이체를 최종적으로 탐색하였으며 동정된 SNP 마커를 토대로 24개 염색체별로 SNP-based map을 작성하였다.
그 결과, 염색체 9번, 22번, 23번을 제외한 모든 염색체는 암수의 모든 영역에서 SNP가 동일하게 분포하였다. 염색체 9번의 경우, 암컷은 모든 영역에서 SNP가 분포하지만, 수컷은 SNP가 존재하지 않는 영역이 매우 많았다. 이들 영역은 다른 염색체에 비해 매우 보존되어 있어, 수컷에 중요한 기능을 하는 유전자를 가지고 있다고 할 수 있다. 염색체 22번과 23번의 경우는 이와 반대의 경향을 보이므로 이들 영역에서는 암컷에 중요한 기능을 하는 유전자를 가지고 있다고 할 수 있다. 따라서 염색체 9번, 22번, 23번에 넙치 성과 연관된 유전자 또는 마커가 존재할 것으로 판단하였고, 특히 9번 염색체가 수컷 특이적이므로 성 염색체일 것으로 추정하였다(도 1).
실시예 4: SNP 마커의 유전자형 분석
본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 분석을 통해 염색체 9번에 존재하는 SNP 마커 중에서 암수간 높은 차이를 보이는 55개 SNP 영역을 1차적으로 선택하였다. 형태적(phenotype) 또는 조직적 관찰로 구별한 암수 각각 6개체를 사용하여 55개 SNP 영역에 대한 유전자형(genotype)을 조사하여, 이중 표현형과 유전자형이 암수간 일치하는 17개 SNP 마커를 후보 성 연관 SNP 마커로 명명하였다. 이들 17개 SNP 마커가 넙치의 성과 연관이 있는지를 검증하기 위하여 다양한 집단(유전적으로 암컷인 자성발생성 이배체, 유전적으로는 암컷이지만 표현형이 수컷인 가짜수컷 및 암컷 어미, 수컷 어미)을 대상으로 SNP 유전형을 분석하였다.
구체적으로, 양식산 암컷 개체 75마리(복부압박으로 난 보유 여부로 암컷 확인)와 자성발생성이배체 40마리(유전적으로 암컷 넙치)에 대한 SNP 마커의 유전자형을 분석하였고 수컷 개체 70마리 (복부압박으로 정자 보유 여부로 수컷 확인)와 자성발생성 이배체를 남성호르몬을 처리한 가짜수컷 40마리(유전적으로는 암컷이나 정자를 보유하고 있는 수컷)를 대상으로 SNP 마커의 유전자형을 분석하였다. 상기 SNP가 포함된 영역의 염기서열 정보를 토대로 OLIGO 5.0 프로그램을 이용하여 프라이머를 설계하였고 GENOTECH사에서 합성한 후 PCR 반응에 이용하였다(표 1 참조). 또한 암수 개체, 자성발생성 이배체 및 가짜수컷(pseudomale) 개체의 게놈 DNA는 MagExtractor-Genomic DNA Purification Kit를 이용하여 지느러미에서 분리하였고 PCR 증폭은 게놈 DNA 100 ng, 0.2 mM dNTP, 20 mM Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 정방향 및 역방향 프라이머 2 ㎕, 0.25 U EX-taq 폴리머라아제가 포함된 총 10 ㎕의 반응용액을 이용하여 PTC-220 thermocycler를 통해 SNP가 포함되어 있는 부위를 증폭하였다. PCR 조건은 처음 95℃에서 5분간 DNA를 변성한 다음, 94℃에서 30초간 변성단계를 거친 후, 표 1에 표시된 온도에서 45초간 어닐링 단계 및 72℃에서 45초간 연장단계를 35회 반복한 후, 최종 DNA 합성을 72℃에서 10분간 수행하였다. 상기 증폭된 반응산물은 Acroprep 96-well plate를 이용하여 분리하고, 증폭시 사용한 프라이머로 양방향 direct sequencing을 하였으며, ABI 3130xl 자동염기서열분석기를 통해 염기서열을 결정하였다.
그 결과, 17개중 11개 SNP 마커가 성과 밀접한 관련이 있음을 확인하였다. 암컷 개체와 자성발생성 이배체에서 11개 SNP 마커들의 유전자형은 대부분 호모형(AA, CC, TT, GG)이었다(표 2 참조). 암컷 개체에서 호모형 비율은 96.0%∼100%였으며, 자성발생성 이배체의 호모형 비율은 100%로 나타났다. 또한 수컷 개체에서 11개 SNP 마커들의 유전자형은 대부분 헤테로형(CT, AT, AC, GT, CG, AG)이었으며, 헤테로형 비율은 77.1% ∼ 80.0%이었다(표 3 참조). 그러나 성전환된 가짜수컷의 헤테로형 비율은 0%로 모두 호모형을 보였다. 이것은 성전환된 가짜수컷은 유전적으로는 암컷이기 때문에 모두 호모형으로 나타났고 수컷의 경우 헤테로형 비율이 100%를 보이지 않은 이유는 넙치의 경우 성분화 시기에 환경적 요인(주로 고수온 또는 저수온)에 의해 성전환이 일어날 수 있기 때문에 호모형의 유전자형을 보인 수컷 개체는 태어날 때 유전적으로 암컷이다가 성분화 시기에 수온의 영향을 받아 수컷으로 성전환된 것을 말해준다. 넙치 자성발생성 이배체는 암컷의 염색체만을 가지고 있기 때문에 유전적으로 암컷이므로 유전자형은 암컷 유전자형과 같은 호모형이었고 가짜 수컷의 유전자형은 암컷과 같이 호모형을 나타낸 것은 가짜수컷이 형태학적으로는 수컷일지라도 유전적으로 암컷이기 때문이다. 이런 결과에서 보면, 유전적으로 수컷은 헤테로형, 유전적으로 암컷은 호모형의 SNP 유전자형을 나타냄을 알 수 있다. 또한 본 연구에 사용된 자성발생성 이배체와 성전환시킨 가짜수컷 시료는 부화후 30일째 종묘를 이용하였기 때문에 환경적인 요인에 의해 성전환되었을 가능성은 없을 것으로 생각된다.
상기 도출된 결과를 종합해보면, 상기 11개의 SNP 유전자형이 호모형(homozygote)인 경우 유전학적으로 암컷이고, 헤테로형(heterozygote)인 경우에는 유전학적으로 수컷임을 알 수 있다. 특히, 상기 11개의 SNP 중 SNP #1, #6, #7, #9, #10 및 #11의 여섯 SNP의 경우 호모형인 경우 100% 유전학적으로 암컷으로 확인되었고, 수컷 중 77.1%가 헤테로인 것으로 확인되었다. 수컷 중 상기 6개의 SNP에서 호모형을 나타낸 개체는 성장과정에서 수컷으로 성전환된 가짜수컷일 가능성이 크기 때문에, 해당 단일 SNP 유전자형의 분석만으로도 넙체 개체가 유전학적으로 수컷인지 아니면 암컷인지 조기에 판별할 수 있다. 다른 SNP의 경우에도 유전학적으로 암컷의 경우 호모인 비율이 높았기 때문에, 다른 SNP들과의 조합에 의해 정확성을 높일 수 있으므로, 넙치의 유전학적 성을 조기에 판별하는데 매우 효과적으로 사용될 수 있다.
상기 11개 SNP 마커중에서 대표적인 3개 SNP 마커(SNP #9, #10 및 #11)의 전기영동도(electropherogram)를 통해 확인하였다(도 2 내지 도 4). 또한 상기 설계한 프라이머 정보 및 SNP 유전자형을 분석 결과를 하기 표 1, 2 및 3에 표시하였다.
SNP 마커 프라이머 핵산서열(5'->3') 반응산물 크기
(bp)		 어닐링 온도 (℃) SNP
위치
(bp)		 SNP
유전자형		 서열번호
SNP #1
 9-1055580F CAGCGACGTACTGATCGAAA 830 60 523 CC, CT 12
9-1055580R GACGGTGTGGCTCAAGAAAT 13
SNP #2
 9-3486136F ATCAAGCAGACATGGCAACA 193 60 150 AA, AT 14
9-3486136R GCTCTGATCCCAAGGAAGTG 15
SNP #3
 9-6001823F GGGGCACATCACCAAAAGTA 675 58 252 CC, AC 16
9-6001823R GCACATTCACCTCCAGGTCT 17
SNP #4
 9-6001823-1F GGGGCACATCACCAAAAGTA 675 60 329 GG, GT 18
9-6001823-1R GCACATTCACCTCCAGGTCT 19
SNP #5
 9-6002103F GTGTCCCCAGACTCCACTGT 174 60 108 GG, GC 20
9-6002103R GCACATTCACCTCCAGGTCT 21
SNP #6
 9-9700293F TTTCATCTTGTGCGCAACTC 239 58 150 AA, AT 22
9-9700293R TATGTCGCAGGCAGTTTGAG 23
SNP #7
 9-10858483F TCAGCATGGGCATGAATCTA 808 60 322 GG, CG 24
9-10858483R AGGGCTAGGCCGTAAACAAC 25
SNP #8
 9-11074281F CAATTGTCGCATTCATCCAG 598 60 367 TT, CT 26
9-11074281R ACCACATCCCTCTGCTATGC 27
SNP #9
 9-11115227F CGCATTGCTCCAGTTTACAA 494 60 253 TT, AT 28
9-11115227R GAAACCCCTGTGCTGTGTTT 29
SNP #10
 9-11148483F TGAGGCACCTCTTTTCATCC 170 60 150 AA, AG 30
9-11148483R TGTGAGGGCGTGAATATCTG 31
SNP #11
 9-11185512F GAGAGGCGGCTCAAACATTA 632 60 249 AA, AG 32
9-11185512R GGACATGCATCACAGTTTCG 33
SNP마커
개체		 SNP #1 SNP #2 SNP #3 SNP #4 SNP #5 SNP #6 SNP #7 SNP #8 SNP #9 SNP #10 SNP #11
F1-F4 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
F5 CC AA AC GT CG AA GG TT TT AA AA
F6 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
F7 CC AA CC GG GG AA GG CT TT AA AA
F8-F17 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
F18 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
F19-F21 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
F22 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
F22-F28 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
F29 CC AA CC GG GG AA GG CT TT AA AA
F30-F34 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
F35 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
F36 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
F37 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
F38 CC AA CG GT CG AA GG TT TT AA AA
F39 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
F40-F41 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
F42 CC AA CC GG GG AA GG CT TT AA AA
F46 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
F54 CC AA AC GT CG AA GG TT TT AA AA
F55-F75 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
호모
비율(%)		 100 100 96.0 96.0 96.0 100 100 96.0 100 100 100
Gyno-2N
(1-40)		 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
호모
비율(%)		 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
* 굵은 글씨는 헤테로형이고 그 외에는 호모형임.
* Gyno-2N : 자성발생성 이배체.
SNP마커
개체		 SNP #1 SNP #2 SNP #3 SNP #4 SNP #5 SNP #6 SNP #7 SNP #8 SNP #9 SNP #10 SNP #11
M1 CT AT AC GT CG AT CG CT AT AG AG
M2-M6 CT AT AC GT CG AT CG CT AT AG AG
M7 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
M8 CT AT AC GT CG AT CG CT AT AG AG
M9 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
M10 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
M11-M13 CT AT AC GT CG AT CG CT AT AG AG
M14-M15 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
M16-M22 CT AT AC GT CG AT CG CT AT AG AG
M23 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
M24-M27 CT AT AC GT CG AT CG CT AT AG AG
M28 CT AT AC GT CG AT CG CT AT AG AG
M29 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
M30-M37 CT AT AC GT CG AT CG CT AT AG AG
M38 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
M39-M46 CT AT AC GT CG AT CG CT AT AG AG
M47 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
M48 CT AT AC GT CG AT CG CT AT AG AG
M49 CC AA AC GG CG AA GG CT TT AA AA
M50 CT AT AC GT CG AT CG CT AT AG AG
M51 CT AT AC GT CG AT CG CT AT AG AG
M52-M59 CT AT AC GT CG AT CG CT AT AG AG
M60 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
M61 CC AT AC GG CG AA GG TT TT AA AA
M62-M65 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
M66-M70 CT AT AC GT CG AT CG CT AT AG AG
헤테로
비율(%)		 77.1 78.6 80.0 77.1 80.0 77.1 77.1 78.6 77.1 77.1 77.1
가짜수컷
(1-35)		 CC AA CC GG GG AA GG TT TT AA AA
헤테로
비율(%)		 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
* 굵은 글씨는 헤테로형이고, 그 외에는 호모형임.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> Republic of Korea represented by National Fisheries Research & Development Institute <120> SNP markers for discriminating the sex in the olive flounder <130> PD14-1487 <160> 33 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 830 <212> DNA <213> Paralichthys olivaceus <400> 1 cagcgacgta ctgatcgaaa ggttcgatgc tactttctag tgatggtttg ttcgatatga 60 ccaaaggttt tatttacttt gatcaataaa gaacaactac atgcagcctt gaactagtta 120 gaccatatta cctatattga cattgacatt ttttagatta agaatataag ttgatctggt 180 caaaaatcct tttattaacc atttataata tcagtgccag aattgctgca ttaaaatact 240 ctattgatat ataagcaaaa ttatcaattt aaactatttt ctgtgtttta atgtcaacag 300 atccgtggtt accagcattt taactacatc aatacagaat tgacaatcat aactatctta 360 atttattact ctgacacttc tcaataaatc tttgacataa atttaaaaaa atgtatacat 420 catttttttt ccaaaactga agtaagtgtc ttgttttatc taaccaactg tccaaaaacc 480 taaaaaaaga ataaagtaaa aggtgtgcaa cataaagctt agcccttgaa atgtatatag 540 aaaaaatata tagaccattt ccttttacag cgcttataaa taaaaacttg ctcttttatt 600 gttgtgaaca ttttaactga gattcggccc cagaacatat tttctctcca gatccactac 660 tgccacctgc tgttcaattt gaggttaaac atccttagac ctcaaacatt attccttcaa 720 catcaaataa tctgtgtatt tgtcatcctc cattctctgt tgctcagtaa tagctcagtg 780 tttggtctgc atgtgtgctg cgctgcattt atttcttgag ccacaccgtc 830 <210> 2 <211> 322 <212> DNA <213> Paralichthys olivaceus <400> 2 atgtcatctt ctgactttat ggtgatgtca tgatgacata attcccatta tatggtcatc 60 aattattttg atatcataat ggaggcaatt tggttgttac cctgccaacg ctatgtcgtc 120 acccagggga tcaagcagac atggcaacat gacatttcaa agtgattaaa caagcaaatt 180 aaatggcatt aattatttac tgttacatta aaagaactct atggtataaa cttgtaaaac 240 tacccagtgt ttgtggtgtc tcctagtggt tctaggccag atgctcacat gcgcatcttc 300 ctcacttcct tgggatcaga gc 322 <210> 3 <211> 675 <212> DNA <213> Paralichthys olivaceus <400> 3 ggggcacatc accaaaagta gttgagaaca acagagctaa gatcctgtaa tatttcaagt 60 tccacaagca gctgtttgct aaccaaccac acatatatag gagcagagga gttttgatag 120 atgtggcaat cccaacatca gagagaagaa gcatgatcaa gaagtactcg gggctgaagg 180 aacacctgga acagatgtgg agggtgacgt ctaaagtagt cccagtggga aaaggagcag 240 tcagacccac aacgggagag tggctctacc agatttaggt acaacaactg aggtctctgt 300 ttggaagagt gtagtctgca aatgaaatta catcagtcaa tagaaaatgt ggatgtccaa 360 gaaatcgaga aattatcata cagtacagtg caccatccat agtaaaactt tttcttcact 420 tttccaatct acccaacttt tgtagctcgt ctctgtacat ccagttcaca gacacatcaa 480 catgggcaga cacaggcacc agtgtcccca gactccactg tccaacacag gcctctttca 540 tactgtggtc aggcaaacag ctcgaacact gcaggtgctt tacatgggtt gggtcagagg 600 ggccatttcg aaaggacttt tttgttgttt ttactctgat tcataaatgt ttccaagacc 660 tggaggtgaa tgtgc 675 <210> 4 <211> 675 <212> DNA <213> Paralichthys olivaceus <400> 4 ggggcacatc accaaaagta gttgagaaca acagagctaa gatcctgtaa tatttcaagt 60 tccacaagca gctgtttgct aaccaaccac acatatatag gagcagagga gttttgatag 120 atgtggcaat cccaacatca gagagaagaa gcatgatcaa gaagtactcg gggctgaagg 180 aacacctgga acagatgtgg agggtgacgt ctaaagtagt cccagtggga aaaggagcag 240 tcagacccac aacgggagag tggctctacc agatttaggt acaacaactg aggtctctgt 300 ttggaagagt gtagtctgca aatgaaatta catcagtcaa tagaaaatgt ggatgtccaa 360 gaaatcgaga aattatcata cagtacagtg caccatccat agtaaaactt tttcttcact 420 tttccaatct acccaacttt tgtagctcgt ctctgtacat ccagttcaca gacacatcaa 480 catgggcaga cacaggcacc agtgtcccca gactccactg tccaacacag gcctctttca 540 tactgtggtc aggcaaacag ctcgaacact gcaggtgctt tacatgggtt gggtcagagg 600 ggccatttcg aaaggacttt tttgttgttt ttactctgat tcataaatgt ttccaagacc 660 tggaggtgaa tgtgc 675 <210> 5 <211> 257 <212> DNA <213> Paralichthys olivaceus <400> 5 gtgtccccag actccactgt ccaacacagg cctctttcat actgtggtca ggcaaacagc 60 tcgaacactg caggtgcttt acatgggttg ggtcagaggg gccatttcga aaggactttt 120 ttgttgtttt tactctgatt cataaatgtt tccaagacct ggaggtgaat gtgccgttag 180 actgctcttt agataaagct aaaatagggc tcagtgactt tgaatatcca gctacgaata 240 agcaaaaaaa gagaaag 257 <210> 6 <211> 334 <212> DNA <213> Paralichthys olivaceus <400> 6 gtttctgtat acacagagac acaggattca tggctctgat caattactac actattacag 60 cgttggtgat gtcaagtcaa caatacatgt caacatttca tcttgtgcgc aactcatttt 120 ggtgatgaaa caaatcttaa tgctctcaat gatctgtggg tcggcgcggt tcactctgac 180 aactgagagg aacacaatat aaacatcgtt tagatcagcc tttttcatag tgtggacccc 240 tagtggtccg caaggtgaca agtaacatat catgttttaa aattgaaaat gtcagtgttt 300 taatttcagt gtttctcaaa ctgcctgcga cata 334 <210> 7 <211> 828 <212> DNA <213> Paralichthys olivaceus <400> 7 tcagcatggg catgaatcta gcaggtactt cacccaggaa accttacaag tctttaactt 60 ttacatgttc tccacaaaca tgctcatctt gctgacatca agccatcaat attttttggg 120 tcactcttgt catctgagaa ctacaagtag cgtgaggatg gagttacaga aaatatttgt 180 gcaatggaag tatttccatg attcagtgac agctcaggca gcaagaccga gctctaatag 240 caacagcatc acaggcaact gtagggcagg gtccttctga catcaaatat catgtttgct 300 gtctcagaac gcaacacatc agctggttca gggccaggaa gcaacctgag tttatattac 360 aaatatttaa gaggagtttt tgttcttcta tgtcagtgtc aacactgaat tacctagact 420 gtggtggcaa atcaacgatt cacaatgaac aaaaaactga ttaacatatc aaaataaaat 480 aaacatctga agtgtttttt ttgttgctta gtattaatat attaatttgt ttttaaatac 540 aaaaaattat accagtcgat actgataagt atcacaataa atgtcacaat attaaatttg 600 ttaagtttta 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atagcagagg gatgtggt 598 <210> 9 <211> 494 <212> DNA <213> Paralichthys olivaceus <400> 9 cgcattgctc cagtttacaa cagacaggga catacagcat tttacccaga gagatcagct 60 attaatccaa atgctctaca gaattggcct agcttgtttg tgcagtccat gtgtgtagct 120 gcattcatag tgttcagagt gggattcctg atagggaaca aaacccttag cagctgcagc 180 agcactgttg cagcaatgca agaatgctct cacactcaca gatgctctct tacgcaaatg 240 ccacagttgt gcagtatgtg gagcagatgt gtgaaaccca aatgagaacc atagtcaatg 300 gttctggcta accaagtcaa tttgtggtac ctaacctatt gcccgatcat gctaactaat 360 ggagattgca cactcacaca gcttctccct aaatcccatt atcagattat gtaaaacagc 420 caattagcat ctgaacacaa aacctccaat gctgcttttg taacatgtac actaaaacac 480 agcacagggg tttc 494 <210> 10 <211> 246 <212> DNA <213> Paralichthys olivaceus <400> 10 gtagatgcag tattcagata agcctgaatt taatggcctt gttgagaata gtcggcatgg 60 tttcaaagtg gctttatgag gcacctcttt tcatcctgtg atatacattt ttttgatcag 120 ttttgcttcc atcacatgtt agaaacgttg tgctctggac aaattcctca cttttgcgca 180 atttttgcaa ggaggctggc aggaaaaact acgtgcagca actgatcaga tattcacgcc 240 ctcaca 246 <210> 11 <211> 632 <212> DNA <213> Paralichthys olivaceus <400> 11 gagaggcggc tcaaacatta tatctgacta tataatgttg gaatgacaag gacattgttg 60 catttaagct tgtttcgtgt aatgtgcctg aagttggtga tgttacagtg aaaaccaaaa 120 tgaaacaagc ctgctctttc attttctcca atcaaacaga aagaatgttt ccgacgaact 180 gataacacgg caaggtcaga tgtacacccg tctaaaccaa gtttatgtag aagcagacca 240 cataggtggt ggagacagga catccctact ttatgttaaa cacaagtctt gctccctaaa 300 ttgccatttg aaaccaaaac taccaaatct gatgtatttc ccactttcat cactcagcaa 360 ctgtaaaatg acagatctgg acaggcaaga catatttatt gttgccttgt tttgctggcc 420 ctggcattat gtaacaaaga cctacactag caagaactaa atattggttt acttcaagag 480 cttgttatta aaattaactg gaattaaaga tgacgtcatg tattgcatcc ctatgttcat 540 tgacatactg ataatttatt ccattaaatg taaatgcaac acataattca ctgctcacaa 600 aaagatgagt gccgaaactg tgatgcatgt cc 632 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-1055580F <400> 12 cagcgacgta ctgatcgaaa 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-1055580R <400> 13 gacggtgtgg ctcaagaaat 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-3486136F <400> 14 atcaagcaga catggcaaca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-3486136R <400> 15 gctctgatcc caaggaagtg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-6001823F <400> 16 ggggcacatc accaaaagta 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-6001823R <400> 17 gcacattcac ctccaggtct 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-6001823-1F <400> 18 ggggcacatc accaaaagta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-6001823-1R <400> 19 gcacattcac ctccaggtct 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-6002103F <400> 20 gtgtccccag actccactgt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-6002103R <400> 21 gcacattcac ctccaggtct 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-9700293F <400> 22 tttcatcttg tgcgcaactc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-9700293R <400> 23 tatgtcgcag gcagtttgag 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-10858483F <400> 24 tcagcatggg catgaatcta 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-10858483R <400> 25 agggctaggc cgtaaacaac 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-11074281F <400> 26 caattgtcgc attcatccag 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-11074281R <400> 27 accacatccc tctgctatgc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-11115227F <400> 28 cgcattgctc cagtttacaa 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-11115227R <400> 29 gaaacccctg tgctgtgttt 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-11148483F <400> 30 tgaggcacct cttttcatcc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-11148483R <400> 31 tgtgagggcg tgaatatctg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-11185512F <400> 32 gagaggcggc tcaaacatta 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-11185512R <400> 33 ggacatgcat cacagtttcg 20

Claims (11)

  1. ⅰ) 서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 1의 523번째 염기가 C 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ii) 서열번호 2의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 2의 150번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    iii) 서열번호 3의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 3의 252번째 염기가 A 또는 C인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ⅳ) 서열번호 4의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 4의 329번째 염기가 T 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ⅴ) 서열번호 5의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 5의 108번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ⅵ) 서열번호 6의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 6의 150번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ⅶ) 서열번호 7의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 7의 322번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ⅷ) 서열번호 8의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 8의 367번째 염기가 C 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ⅸ) 서열번호 9의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 9의 253번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ⅹ) 서열번호 10의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 10의 150번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및
    xi) 서열번호 11의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 11의 249번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 넙치 암수 판별용 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단일염기다형성 부위를 검출할 수 있는 대립 유전자 특이적 프로브(probe) 또는 대립 유전자 특이적 프라이머(primer)인 폴리뉴클레오티드.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는, 넙치 암수 판별용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이로 제공되는 키트.
  6. 넙치 암수 개체로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계;
    상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 상기 제1항의 폴리뉴클레오티드를 증폭할수 있는 프라이머쌍으로 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 증폭단계; 및
    상기 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는, 넙치 암수 판별방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계는 유전자 염기서열 결정(sequencing), 대립유전자-특이적 마이크로어레이를 이용한 혼성화 분석, 대립유전자-특이적 PCR, 모세관 전기영동, SSCP(single-strand conformation polymorphism), DGGE(denaturation gradient gel electrophoresis), 변성 HLPC, 질량분석법(mass spectrometry), 제한효소 단편 길이 다형분석(RFLP) 또는 TaqMan SNP genetyping assay를 통해 수행되는, 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    하기의 경우 중 어느 하나인 경우 넙치 종묘를 수컷으로 판정하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법:
    서열번호 1의 핵산서열 기준으로 523번째 염기에 상응하는 염기가 C;
    서열번호 2의 핵산서열 기준으로 150번째 염기에 상응하는 염기가 T;
    서열번호 3의 핵산서열 기준으로 252번째 염기에 상응하는 염기가 A;
    서열번호 4의 핵산서열 기준으로 329번째 염기에 상응하는 염기가 T;
    서열번호 5의 핵산서열 기준으로 108번째 염기에 상응하는 염기가 C;
    서열번호 6의 핵산서열 기준으로 150번째 염기에 상응하는 염기가 T;
    서열번호 7의 핵산서열 기준으로 322번째 염기에 상응하는 염기가 C;
    서열번호 8의 핵산서열 기준으로 367번째 염기에 상응하는 염기가 C;
    서열번호 9의 핵산서열 기준으로 253번째 염기에 상응하는 염기가 A;
    서열번호 10의 핵산서열 기준으로 150번째 염기에 상응하는 염기가 G;및
    서열번호 11의 핵산서열 기준으로 249번째 염기에 상응하는 염기가 G.
  9. 성체 넙치를 대상으로 복부 압박법으로 정소의 유무를 판별하여 형태학적 수컷을 선발하는 단계를 포함하는 형태학적 수컷 선발단계;
    상기 선별된 형태학적 수컷으로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계;
    상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머쌍으로 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 하기 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 증폭단계; 및
    상기 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는, 형태학적 수컷 중 가짜 수컷의 판별 방법:
    ⅰ) 서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 1의 523번째 염기가 C 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ⅱ) 서열번호 6의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 6의 150번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ⅲ) 서열번호 7의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 7의 322번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ⅳ) 서열번호 9의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 9의 253번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ⅴ) 서열번호 10의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 10의 150번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및
    ⅵ) 서열번호 11의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 11의 249번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 넙치 암수 판별용 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항에 있어서,
    하기 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 추가로 분석하는 단계를 포함하는, 가짜수컷의 판별방법:
    ⅶ) 서열번호 2의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 2의 150번째 염기가 A 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ⅷ) 서열번호 3의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 3의 252번째 염기가 A 또는 C인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ⅸ) 서열번호 4의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 4의 329번째 염기가 T 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    ⅹ) 서열번호 5의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 5의 108번째 염기가 C 또는 G인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및
    xi) 서열번호 8의 핵산서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되며, 상기 서열번호 8의 367번째 염기가 C 또는 T인 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 10 내지 100 이상의 연속적인 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드의 단일염기다형성의 유전자형이 호모형일 때 가짜수컷으로 판별하는 단계를 추가적으로 포함하는, 방법.




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