JP4992087B2 - ヒラメ類の遺伝的性判別方法並びに遺伝的性判別用キット - Google Patents
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Description
例えば、遺伝的に雄のヒラメは初期発生温度に関係なく表現型も雄であるが、遺伝的に雌のヒラメは、初期発生温度が20℃であれば表現型が雌となり、15℃或いは27℃であれば、表現型が雄となる。
近年、大量のヒラメ稚魚が海に放流されており、平成16年度には全国で2400万尾にも達する。
しかし、性転換した雄と雌とを交配して得られた稚魚は、全て遺伝的に雌であり、このように性比が雌雄いずれかに大きく偏った稚魚を放流すると、自然界における雌雄のバランスが崩れかねない。
実際、種苗の性比が雄や雌に偏る例が多数確認され、放流用種苗を生産するために継代した雄親の中に性転換雄が検定交配で同定された例があり、種苗生産中における遺伝的雌稚魚の雄への性転換や、性転換雄を親魚としてまちがって使用した結果、種苗の遺伝的性が撹乱されていることが指摘されている。つまり、種苗放流がヒラメ類の天然集団の雌雄比ばかりか、遺伝的性の構成に悪影響を及ぼしていることが危惧されている。それゆえ、その解決のために性の管理技術の開発が急がれている。
そのため、全雌生産では、遺伝的に雌でありながらも性転換の結果機能的な雄である個体(=性転換雄)を作出して雄親とし、これを通常の雌親と交配させることによって遺伝的全雌群を得ている。しかしながら、従来、全雌生産に用いる雄親が確実に性転換雄であることをあらかじめ証明するには、雌性発生の利用や、検定交配を実施するなどの大変な努力や年月を要した。
即ち、養殖漁業・栽培漁業のいずれにおいても、性について転換魚と正常魚とを生きたままで判別できることが重要課題であり、どの成長段階においても、とりわけ遺伝的性を迅速に判別する技術を開発することが必要である。
しかし、この方法は、性分化以降の雌雄間で発現を異にする遺伝子を調べるので、性分化時期である約60日を過ぎないと性を判別することができず、2ヶ月もの長期間に亘って無駄な飼育を行うことになりかねない。また、判別をするためには、ある程度のRNAを抽出する必要があり、成魚でない場合は、判別魚全体からの抽出というように、魚を殺してしまう必要があり、増養殖における実用性は必ずしも高くない。
さらに、この方法では機能的性(生理的性)を知ることができるのみであり、個体の遺伝的な性を断定することはできない。
作出したF1集団及びその両親に対してDNAマーカーを用いたQTL解析を行った結果、発明者らが既に見出していたヒラメ類の遺伝子連鎖地図{M.M.Coimbra、東京水産大学博士学位論文(2001);Aquaculture(2003)}と照らし合わせると、このヒラメ遺伝子連鎖地図における遺伝子連鎖群(LG)9のマーカー座Poli185TUF及びPoli109TUFに性決定遺伝子があることがわかった。
本発明のヒラメ類の遺伝的性判別方法は、5’−GTGGACATTT GTACTCCACA GACCA−3’(配列番号1)の内、少なくとも10個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、5’−GTGAGCGGGT ACATGTGTGT GAG−3’(配列番号2)の内、少なくとも10個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分をプライマーとして、ヒラメ類のゲノムDNAにポリメラーゼ連鎖反応法を行い、得られた産物にゲル電気泳動法を施して212bpのバンドを持つものを雄とする。
(1)5’−GTGGACATTT GTACTCCACA GACCA−3’(配列番号1)の内、少なくとも10個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、5’−GTGAGCGGGT ACATGTGTGT GAG−3’(配列番号2)の内、少なくとも10個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分。
(2)5’−CCTCACAAAG ATATTTGTAC AGGTGCA−3’(配列番号3)の内、少なくとも10個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、5’−CATCTTTAGG TCACATTGTC ACTGCTG−3’(配列番号4)の内、少なくとも10個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分。
少なくとも10塩基で構成されるオリゴヌクレオチド部分を含有する配列番号1.2.3.4のプライマーとしては、10〜50塩基のオリゴヌクレオチド部分、より好ましくは20塩基前後のオリゴヌクレオチド部分を含有するプライマーが好ましい。
以下、本発明の実施例について詳細に説明する。
本実施例で用いたのは、標準和名「ヒラメ」であり、学名はParalichthys olivaceus(Temminck et Schlegel,1765)である。ヒラメ属(Genus Paralichthys)には、世界中で約19種があり、多くが産業重要種である。
雌性発生により得たヘテロクローン雌と、鳥取県栽培漁業センターにおいて継代飼育されてきた雄とを交配し、78匹のF1集団を得た。
得られたF1集団の受精卵を100L水槽に収容し、70Lの海水で水温20℃に維持して止水飼育した。受精3日後、500L水槽に移し、20℃で流水飼育した。孵化後25日目までは、餌料としてワムシを与え、15日目から60日目までは、アルテミアを加え、30日以降は市販の配合飼料を与えた。
飼育開始1年後に、F1集団78個体を開腹し、生殖腺を確認することで雌雄の判別を行った。
78個体の性比は、雄が36個体、雌が42個体であった。
尾鰭を1cm角の大きさで採取し、100mM NaCl、20mM Tris−HCl(pH8.0)、100mM EDTA、1.0%SDS、100μg/ml Proteinase Kを含む消化溶液を600μL加え、37℃で一晩静置した。
さらに、フェノール/クロロホルム(1:1)抽出を1回行った後、エタノール沈殿にて染色体DNAを析出させた。回収したDNAは70%エタノールで洗浄、乾燥後、TE溶液(0.01M Tris−HCl pH7.4、2.5mM EDTA pH8.0)50μLに溶解した。
5’−GTGGACATTT GTACTCCACA GACCA−3’(配列番号1)
5’−GTGAGCGGGT ACATGTGTGT GAG−3’(配列番号2)
の一組のプライマーを合成し、2.5pmol Fプライマーと[γ-33P]ATP、T4 polynucleotide kinaseによって標識した0.17pmol Rプライマー、0.175mM each dNTP、20mM Tris−HCl(pH8.4)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、1%BSA、0.25 U Taq DNA polymerase(Takara Bio)、50ngのテンプレートDNAを含む11μlの溶液で、Gene Amp PCR system 9600 thermal cycler(Perkin−Elmer)にて、PCR法を行った。
反応後、等量のLoading dye(95% formamide,10mM EDTA,0.05% bromophenol blue and xylene cyanol)とよく攪拌し、PCR産物を熱変性によって1本鎖にし、6%アクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。
その後、1時間乾燥させたゲルを、Imaging Plate(IP)に3〜12時間感光させ、放射線の感光像が記憶されたIPをBio-imaging Analyzer(BAS1000,Fuji Photo Films)で読み取り、コンピュータで映像化した。
その結果を図1及び図2に示す。
性決定形質(雄性)とこのバンドとの連鎖関係の確かさはLod Score(Lathropet al 1984)で示される。
212bpのバンドと性決定形質(雄性)との矛盾は全く無く、Lod Score=78×log0.5=23.48となり、この連鎖関係は、1/1023.48の危険率で確実である。
従って、実施例1において、PCR産物に212bpのバンドがあるヒラメは雄のヒラメであるといえる。
5’−CCTCACAAAG ATATTTGTAC AGGTGCA−3’(配列番号3)
5’−CATCTTTAGG TCACATTGTC ACTGCTG−3’(配列番号4)
の一組のプライマーを合成してPCR法を行った。
PCR条件、電気泳動等の条件は実施例1とほぼ同様であるが、アニーリング温度のみを46℃に変更した。
実施例2におけるPCR産物のゲル電気泳動像を図3及び図4に示す。
性決定形質(雄性)とこのバンドとの連鎖関係の確かさはLod Score(Lathropet al 1984)で示される。
144bpのバンドと性決定形質(雄性)との矛盾は全く無く、Lod Score=78×log0.5=23.48となり、この連鎖関係は、1/1023.48の危険率で確実である。
従って、実施例2において、PCR産物に144bpのバンドがあるヒラメは雄のヒラメであるといえる。
マイクロサテライトを含むPCRプライマーは、1つの遺伝子座を位置付けることができると共に、同種内のその多型性により各個体間では多くのバンドを検出する(DNAMakers:Protocols,Applications,and Overview,GUSTAVO CAETANO−ANOLLES PETER M.GRESSHOFF)。
よって、この実施例で示されるバンドのサイズは、これに限定されるものではない。
Claims (3)
- 5’−GTGGACATTT GTACTCCACA GACCA−3’(配列番号1)の内、少なくとも10個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、5’−GTGAGCGGGT ACATGTGTGT GAG−3’(配列番号2)の内、少なくとも10個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分をプライマーとして、ヒラメのゲノムDNAにポリメラーゼ連鎖反応法を行い、得られた産物にゲル電気泳動法を施して212bpのバンドを持つものを雄とする、ヒラメ類の遺伝的性判別法。
- 5’−CCTCACAAAG ATATTTGTAC AGGTGCA−3’(配列番号3)の内、少なくとも10個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、5’−CATCTTTAGG TCACATTGTC ACTGCTG−3’(配列番号4)の内、少なくとも10個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分をプライマーとして、ヒラメのゲノムDNAにポリメラーゼ連鎖反応法を行い、得られた産物にゲル電気泳動法を施して144bpのバンドを持つものを雄とする、ヒラメ類の遺伝的性判別法。
- 以下の(1)又は(2)に記載されたオリゴヌクレオチド部分から成るポリメラーゼ連鎖反応用プライマーを含む、ヒラメ類の遺伝的性判別用キット。
(1)5’−GTGGACATTT GTACTCCACA GACCA−3’(配列番号1)の内、少なくとも10個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、5’−GTGAGCGGGT ACATGTGTGT GAG−3’(配列番号2)の内、少なくとも10個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分。
(2)5’−CCTCACAAAG ATATTTGTAC AGGTGCA−3’(配列番号3)の内、少なくとも10個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、5’−CATCTTTAGG TCACATTGTC ACTGCTG−3’(配列番号4)の内、少なくとも10個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分。
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