KR101281529B1

KR101281529B1 - 넙치 암수판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 넙치의 암수 판별방법

Info

Publication number: KR101281529B1
Application number: KR1020100089645A
Authority: KR
Inventors: 임봉수; 서종표; 정형복; 강봉조
Original assignee: 임봉수; 한용옥; 제주광어주식회사
Priority date: 2010-09-13
Filing date: 2010-09-13
Publication date: 2013-08-01
Also published as: KR20120027843A

Abstract

본 발명은 넙치 암수판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 넙치의 암수 판별방법에 관한 것이다.
본 발명의 넙치 암수 판별방법은 FArom-F3 (5' - TGGCTACAGGGTACCAAAGG - 3')와 FArom-R3 (5' - GAACCGAATGGCTGGAAGTA - 3')의 염기서열을 갖는 넙치 암수 판별용 PCR 아로마테이즈 프라이머 세트 또는 F-EF1α-F1 (5' - GCAGCTCATTGTTGGAGTCA - 3')와 F-EF1α-R1 (5' - ACACTTGCAGGGTTGTAGCC - 3')의 염기서열을 갖는 넙치 암수 판별용 PCR 에론게이션 팩터-1 알파 프라이머 세트(Elongation Factor-1 alpha primer set) 중 어느 하나를 이용한 PCR을 통해 넙치에서 추출한 DNA를 증폭하는 단계와, 상기 증폭된 산물들의 aromatase 유전자 발현량을 각각 측정한 후, 각 산물들간의 aromatase 유전자 발현량을 상대비교하여 넙치 자어의 성별을 판별하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 발명에 의해, 조기 성판별이 가능하도록 한 넙치 암수 판별방법이 제공된다.

Description

넙치 암수판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 넙치의 암수 판별방법{PRIMER SET FOR SEX DETERMINATION IN FLATFISH AND METHOD FOR SEX DETERMINATION IN FLATFISH USING THESE PRIMERS}

본 발명은 넙치 암수판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 넙치의 암수 판별방법에 관한 것으로써, 특히, 조기 성판별이 가능하도록 한 넙치 암수 판별방법에 관한 것이다.

최근들어 넙치 치어를 입식한 제주지역 양식어가에서 넙치의 더딘성장으로 인한 출하지연때문에 경제적 피해가 발생되고 있다.

이는, 종묘 본래의 유전적 형질의 문제가 아니라, 성분화시기의 고수온 사육으로 인하여 암컷에 비해 성장이 더딘 수컷으로의 분화가 촉진되어 일어나는 현상때문이다.

또한, 이러한 웅성화로 인한 생산성 저하로 발생되는 경제적 손실은 1회성에 그치지 않고, 연간 2~3회의 입식과 출하를 반복하는 제주지역의 양식생산 시스템에서 다음 입식시기의 지연을 초래하는 악순환으로 연결되고 있다.

이러한 이유로 제주지역 양식생산자 단체에서는 수컷보다 성장이 상대적으로 빠른 넙치의 암컷을 종묘단계에서 선별할 수 있는 기술개발을 요구하고 있는 실정이다.

넙치양식업의 발전을 위해서는 우선, 생산성 향상 및 생산비 절감을 위한 여러 가지 방면에서의 기술 개발이 다각적으로 이루어져야 할 필요가 있다.

이러한 기술개발에는 앞서 언급한 육종기술뿐만 아니라, 환경요인 조절을 통한 성장촉진 기술 개발 또는, 넙치의 성별 성장률 차이를 이용한 암컷 위주의 종묘생산 기술개발, 종묘의 암수판별기술 개발 등을 비롯한 여러 가능한 기술개발들이 동시에 이루어질 필요가 있다.

이에, 넙치 양식 시 필요한 양적 형질(속성장, 질병내성, 환경내성, 산란시기, 산란량, 육질, 체색)을 선발하여 우수한 형질의 종묘를 생산하는 넙치 육종 프로그램도 시도되고 있다.

한편, 넙치의 경우 생후 1년을 기준으로 할 때 암컷이 수컷보다 2배 이상 빠르기 때문에, 넙치종묘의 자성화를 유도하는 것이 무엇보다도 효과적이며 중요하다.

특히, 이러한 암·수의 판별에 있어 종묘단계에서의 조기판별이 중요한데, 기 활용중인 암컷 특이적 단백질(vitellogenin)을 이용하는 방법은 성숙시기에만 유용한 것으로, 넙치가 약 8~9개월(평균체중 약 600 g)이상 성장한 이후에나 판별이 가능한 문제점이 있다.

본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위한 것으로써, 조기 성판별이 가능하도록 넙치 암수판별용 프라이머 세트를 제공하는데 목적이 있다.

또한, 성장이 좋은 넙치 암컷만을 선택하여 사육할 수 있도록 넙치 암수 판별방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 넙치 암수 판별용 PCR 아로마테이즈 프라이머 세트(aromatase primer set)는 하기 염기서열을 갖는 것이 특징이다.

FArom-F3 (5' - TGGCTACAGGGTACCAAAGG - 3')

FArom-R3 (5' - GAACCGAATGGCTGGAAGTA - 3')

본 발명의 넙치 암수 판별용 PCR 에론게이션 팩터-1 알파 프라이머 세트(Elongation Factor-1 alpha primer set)는 하기 염기서열을 갖는 것이 특징이다.

F-EF1α-F1 (5' - GCAGCTCATTGTTGGAGTCA - 3')

F-EF1α-R1 (5' - ACACTTGCAGGGTTGTAGCC - 3')

본 발명의 넙치 암수 판별방법은 상기 프라이머 셋트 들 중 어느 하나를 이용한 세트를 이용한 PCR을 통해 넙치에서 추출한 DNA를 증폭하는 단계와, 상기 증폭된 산물들의 aromatase 유전자 발현량을 각각 측정한 후, 각 산물들간의 aromatase 유전자 발현량을 상대비교하여 넙치 자어의 성별을 판별하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 발명에 의해, 종묘단계에서의 정확한 넙치 암수 판별이 가능해진다.

또한, 성장이 좋은 넙치 암컷만을 선택하여 사육할 수 있다.

도 1은 샘플 채취과정을 나타낸 사진.
A: 샘플의 체중과 체장 측정
B: 개복해부를 하여 생식선 부위를 적출
도 2는 미분화상태의 넙치 생식선 조직을 나타낸 사진.
A: 복강막에 연수된 상태의 생식선 원기
B: A(생식선원기)의 확대사진
도 3은 정소로 분화된 개체들의 생식선 조직을 나타낸 사진.
A: 수컷으로 분화된 개체(No. 3)
B: 수컷으로 분화된 개체(No. 5)
C: 수컷으로 분화된 개체(No. 6)
D: 수컷으로 분화된 개체(No. 12)
E: 수컷으로 분화된 개체(No. 13)
F: 수컷으로 분화된 개체(No. 17)
도 4는 암컷으로 분화된 개체들의 생식선 조직을 나타낸 사진.
A: 암컷으로 분화된 개체(No. 2)
B: 암컷으로 분화된 개체(No. 4)
C: 암컷으로 분화된 개체(No. 8)
D: 확대상. 감수분열중인 생식선
E: 수컷으로 분화된 개체(No. 20)
F: 암컷으로 분화된 개체(No. 14), 주변인기 난모세포까지 분화한 정소.
도 5는 본 발명의 프라이머 디자인(primer design)에서 참고한 GenBank 등록 아로마테스 뉴클레오티드 염기서열(aromatase nucleotide sequences)을 나타낸 도면.
AB017182.1: Paralichthys olivaceus aromatase mRNA 서열
AY902192.1: Paralichthys lethostigma aromatase mRNA 서열.
도 6은 본 발명의 primer design에 참고한 GenBank 등록 에론게이션 팩터-1a 뉴클레오티드 염기서열(Elongation Factor-1a nucleotide sequences)을 나타낸 도면.
AB017183.1, AB240552.1, AB240549.1: Paralichthys olivaceus EF-1 alpha mRNA 서열
AY884199.1: Paralichthys lethostigma EF-1 alpha mRNA 서열
도 7은 넙치 cDNA로부터의 각 유전자에 대한 PCR결과 전기영동결과를 나타낸 사진.
A: aromatase 유전자
B: EF1-a 유전자
도 8은 넙치의 aromatase와 EF1-a 유전자들이 삽입된 플라스미드(plasmid) DNA의 전기영동결과를 나타낸 사진.
A: aromatase 유전자가 삽입된 plasmid
B: EF1-a 유전자가 삽입된 plasmid
도 9는 넙치 각 유전자들이 삽입된 plasmid DNA에 대한 PCR 전기영동 결과를 나타낸 사진.
A: aromatase 유전자가 삽입된 plasmid DNA들
B: EF1-a 유전자가 삽입된 plasmid DNA들
도 10은 본 발명의 primer set 1 조건을 통해 확인된 넙치 EF1-a 유전자서열에 대한 유전자은행 등록서열과의 비교를 나타낸 도면.
Genbank: 유전자은행에 등록되어 있는 넙치 EF1-a 유전자의 nucleotide 서열(accession nuber AB017183.1);
This-study: 본 발명으로 확인된 넙치 EF1-a 유전자의 nucleotide 서열.
도 11은 본 발명의 primer set 1 조건을 통해 확인된 넙치 aromatase 유전자서열에 대한 유전자은행 등록서열과의 비교를 나타낸 도면.
Genbank: 유전자은행에 등록되어 있는 넙치 aromatase 유전자의 nucleotide 서열(accession nuber AB017182.1)
This-study: 본 발명으로 확인된 넙치 aromatase 유전자의 nucleotide 서열.
도 12는 넙치 자어의 성 판별을 위한 Real-Time quantitative PCR 결과(Group A)를 나타낸 그래프.
20개의 시료: out-data인 16번 시료를 제외한 19개 시료의 결과.
가장 낮은 값을 나타낸 10번 시료의 값을 1로 하여, EF1-a 유전자의 발현값으로 정량화(normalization) 시킨 aromatase 유전자의 각 개체 간의 상대적 발현량을 단위화 함.
*: Control.
도 13은 넙치 자어의 성 판별을 위한 Real-Time quantitative PCR 결과(Group B)를 나타낸 그래프.
40개의 시료: out-data인 30번 시료를 제외한 39개 시료의 결과.
가장 낮은 값을 나타낸 24번 시료의 값을 1로 하여, EF1-a 유전자의 발현값으로 normalization 시킨 aromatase 유전자의 각 개체 간의 상대적 발현량을 단위화 함.
A: 넙치 자어의 성 판별을 위한 시료 1~20번까지의 결과.
B: 넙치 자어의 성 판별을 위한 시료 21~40번까지의 결과.
*: Control.

본 발명은 FArom-F3 (5' - TGGCTACAGGGTACCAAAGG - 3')와 FArom-R3 (5' - GAACCGAATGGCTGGAAGTA - 3') 또는 F-EF1α-F1 (5' - GCAGCTCATTGTTGGAGTCA - 3')와 F-EF1α-R1 (5' - ACACTTGCAGGGTTGTAGCC - 3')로 이루어지는 것을 특징으로 하는 넙치 암수 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머 세트는 넙치 암수 판별용 유전자 마커를 특이적으로 증폭하는데 필요한 20bp로 이루어지는 프라이머들로 구성된다.

상기 프라이머들은 당업자에게 공지된 뉴클레오티드의 합성방법에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명의 상기 프라이머 세트는 프라이머 세트를 구성하는 개별 염기서열의 일부에 변이가 일어난 변형서열을 포함할 수도 있다.

상기 변형서열은 변이가 이루어진 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과와 미변형서열로 이루어진 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과가 실질적으로 동일한 범위 내에서의 결실 또는 치환된 서열을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 넙치 암수판별용 PCR키트를 제공한다.

상기 PCR키트는 넙치 암수판별용 유전자 마커를 특이적으로 증폭하는데 유용하다.

상기 PCR 키트에는 넙치 암수판별용 유전자 마커의 염기서열에 특이적으로 어닐링(annealing)되는 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 포함하고, 여기에 PCR의 수행에 필요한 반응 Taq DNA 중합효소, 완충액, dNTP를 포함한다.

또한, 본 발명은 서열번호5 또는 서열번호6 중 선택된 1종을 포함하여 구성된 넙치 암수판별용 유전자 마커를 제공한다.

상기 유전자 마커 들 중 서열번호 5는 2046 bp 길이로 구성된 넙치(Paralichthy olivaceus)의 aromatase 유전자 DNA이며, 서열번호 6은 665 bp 길이로 구성된 넙치(Paralichthy olivaceus)의 Elongation Factor-1 alpha 유전자 DNA이다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 조직학적 관찰을 통한 넙치의 암수판별방법

상업적으로 중요한 어종인 넙치는 암컷이 수컷보다 성장이 빠른 특징이 있기 때문에, 암컷만 생산하는 편이 양식에 있어 유리하다.

하지만, 유전적으로 암컷이라 하더라도 성분화시기의 사육수온에 따라 수컷이 높은 비율로 출현하기 때문에 종묘단계에서 적정 수온관리를 통해 암컷으로의 분화를 유도하는 것이 매우 중요하다.

하지만, 아직까지 넙치의 자성화 유도에 적절한 수온이나 수온관리 시기에 대한 연구보고는 이루어지지 않고 있는 현실이다.

넙치이외에도 어류에서는 암·수에 따라 경제적 가치가 상이한 경우가 많다.

예를 들어, 뱀장어나 넙치 등에서는 암컷의 성장속도가 더 빠르지만, 틸라피아에서는 수컷의 성장속도가 더 빠르다.

또한, 암·수의 체색에 있어서도 연어나 참돔의 경우 암컷에 대한 기호성이 더 높으며, 생식소를 식용하는 숭어와 은어에서는 알을 가지고 있는 암컷에 대한 산업적 가치가 높다.

따라서, 종묘단계에서 산업적 가치가 있는 성만을 선별하여 사육하는 것이 양식에 있어서 매우 가치 있는 일이지만, 어류의 치어단계에서 육안으로 구별하기란 불가능하다.

일반적으로 어류는 자웅이체이지만, 체색(놀래기, 붉돔, 납자루 등)이나 형태(연어, 해마 등)로 암·수를 구별할 수 있는 어류는 적고, 식용으로 익숙한 정강이, 정어리, 고등어, 넙치, 그리고 복어류 등의 경우, 외형만으로는 구별할 수 없다.

연어, 쥐치, 쏨뱅이 등과 같이 자웅이 함께 산란하는 어종에서는 상대방의 성별을 알리기 위해 외관상의 차이를 보이는 경우도 있다.

암컷의 몸에 기생하는 일부 아귀류를 제외하고 어류의 성별은 몸의 크기로 구별하기 어려우나, 암·수의 성장속도가 다르거나, 최대체장이 다른 경우가 있다.

예를 들어, 아귀와 넙치는 암컷이 최소 성숙체장 면에서 수컷에 비해 크다.

이에, 본 실시예에서는 아래와 같은 방법으로 넙치의 성분화전후 과정중의 생식선 발달을 관찰하여 성판별의 기초자료로서 활용하고자 한다.

1. 실험방법 및 결과

1) 샘플링(Sampling)- 도 1

넙치 치어의 생식선 발달상태를 조직학적으로 관찰하기 위하여 도 1과 같이 샘플을 채취한 후, 넙치 생식선은 Bouin's solution에 하루 동안 고정한 후 70% 에탄올(EtOH)로 치환시켜주었다.

고정된 조직은 단계별 탈수 과정을 거친 후 파라핀으로 포매하였으며, 절편법에 의해 7 ㎛의 두께의 조직표본으로 만들었다.

조직표본은 Hansen's 헤마톡실린(haematoxylin)과 0.5% 에오신(eosin)으로 비교염색을 실시하여 광학현미경하에서 검경하였다.

2) 미분화상태- 도 2

도 2에 나타나 있듯이, 넙치에서 미분화된 상태의 생식선은 복강의 아래 양쪽으로 길게 뻗어나온 상태로 연승되어 있었다.

이 상태에서 암수간의 조직학적 특징은 관찰할 수 없었다.

다만 추후에 난소로 발달할 것으로 예상되는 개체에서는 난소강의 안쪽에 해당하는 부위에 세포들의 낭포(cyst)가 형성되는 것을 관찰할 수 있었다.

3) 정소로의 분화- 도 3

도 3에 나타나 있듯이, 전 개체에서 성분화가 종료된 상태로 정소로 분화된 개체에서는 생식세포의 분화는 관찰되지 않았으며, 생식선 중간에 공포상이 관찰되어 전형적인 정소의 조직 특성이 관찰되었다.

또한, 생식선의 크기도 암컷과 비교하여 상대적으로 작았다.

이에, 조직학적 관찰을 통한 생식선의 암수판별에 있어서는 2가지 관점에 유의하여야 한다.

우선 생식선의 생식세포의 발달상태를 바탕으로 판별하는 것이 가장 일반적이지만, 성적으로 미성숙상태에서는 생식세포가 분화되지 않기 때문에 판단하기 어려운 점이 있다.

다음으론 체세포의 발달 양상으로도 암수의 판별이 가능하다.

다시말해 정소에서는 초기 분화단계에서는 생식세포의 발달이 둔화되고 생식선에 공포상이 관찰이 되며, 난소에서는 난소강이 형성되어 형태적으로 암수의 구분이 가능하였다.

4) 난소로의 분화- 도 4

도 4에 나타나 있듯이, 암컷으로 분화한 개체들에서는 대부분 난소강의 형성이 완료되었으며 난소소협이 발달, 생식세포의 체세포분열이 많이 진행되고 있었으며, 일부 개체에서는 감수분열이 이루어져 주변인기 난모세포까지 분화한 개체들도 관찰되었다.

<실시예 2> 암수판별을 위한 marker개발

성염색체에 의해 성이 결정되는 포유류의 경우, Y염색체에 존재하는 수컷 특이적 반복염기서열을 이용한 PCR법에 의한 배(胚)의 성판별법이 확립되어 있다.

그러나, 어류에서는 성염색체를 갖는 종이 많지 않을 뿐 아니라, 성염색체만으로는 기능적 성이 결정되지 않으며, 성분화시기의 수온 등과 같은 환경적인 영향에 의해 성이 변하는 종이 많다.

성염색체에 존재하는 암·수간의 유전자 차이를 이용하는 방법이 아니라, 동일한 게놈을 갖더라도 암·수간에 발현량이 다른 유전자를 이용하는 방법이 필요하다.

이러한 목적에 합당한 유전자는 그 발현이 암·수간에 시간적 또는 공간적으로 차이가 있어야만 한다.

따라서, 유전적 성(genetic sex)과는 달리 표현되는 생식선의 기능적 성(gonadal sex)을 치어단계에서 빠르고 정확하게 구별할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.

넙치의 성은 통상적으로 유전적으로 결정되어 XX개체는 암컷으로, XY개체는 수컷으로 분화한다.

하지만, XX개체에 안드로겐(androgen; 17α-methyltestosterone)투여 또는 고수온처리를 하면 수컷으로의 성 분화가 일어나고, XY개체에 에스트로겐(estrogen; estradiol-17β)투여를 실시하면 암컷으로 분화하는 것으로 알려졌다.

또한, 유전적 암컷(XX개체)이라 하더라도 고수온 및 저수온에서 사육을 하면 기능적 수컷으로 성분화가 이루어지며, 이와 같이 넙치의 성 분화에 있어 유전적 암컷에서 수컷으로의 성전환과정에서 일어나는 estrogen량 감소 현상의 원인은 아직 구체적으로 밝혀진 것은 없으나, 수온차에 의해 estrogen 생성에 중요한 효소인 aromatase 발현이 억제됨으로 나타나는 E₂의 감소가 주요한 요인으로 작용할 것이라 보고되고 있다.

대부분의 척추동물에서 수컷과 암컷은 수정 시에 성염색체의 조합에 의해 유전적으로 결정되어진다.

하지만, 어류를 비롯한 파충류, 양서류 등과 같은 일부 종에서는 성염색체의 조합뿐만 아니라, 환경조건에 의해서도 성 결정 및 분화가 좌우되는 것으로 알려져 있다.

종래 어류의 성 판별법에는 암컷 특유의 단백질(vitellogenin)을 이용하는 방법이 주로 알려져 있었다.

하지만, 이 방법은 난소가 성숙하는 시기에 이르러야 암·수를 구별할 수 있기 때문에, 조기 성판별이 어려운 문제점이 있어, 현실적으로는 성어가 된 이후에 나타나는 외견상의 특징 및 생식선의 형태로 구별하는 수 밖에 없었다.

이에, 본 발명에서는 아래와 같은 방법으로 넙치 생식선에서 aromatase mRNA를 활용한 암수판별marker를 개발하였다.

1. 실험방법 및 결과

1) Primer 제작

넙치 Genomic DNA로부터 해당 유전자를 Polymerase Chain Reaction(PCR)법으로 증폭, 자성화 초기단계에 발현하는 유전자인 aromatase(P450)와 normalization을 위한 house-keeping 유전자인 Elongation Factor1-a(EF1-a)를 분리하기 위한 primer set들은 기 보고된 유전자 서열들을 참고로 제작하였다(도 5, 6).

각 참고서열의 유전자은행 accession number는 다음과 같다.

Aromatase: AB017182.1(Paralichthys olivaceus P450arom mRNA for P450 aromatase, complete cds), AY902192.1(Paralichthys lethostigma aromatase cytochrome P450 (cyp19) mRNA, partial cds).

Elongation Factor1-a: AB017183.1(Paralichthys olivaceus EF-1-alpha mRNA, partial cds), AY 884199.1(Paralichthys lethostigma elongation factor-1 alpha (EF-1 alpha) mRNA, partial cds), AB240552.1(Paralichthys olivaceus mRNA for elongation factor 1 alpha, partial cds), AB240549.1(Paralichthys olivaceus mRNA for elongation factor 1 alpha, partial cds).

각 primer들은 20-bp 길이, 53.2~53.9 Tm, 45~55%의 GC 함량을 갖게 구성하였고, 제작된 primer stock은 100pmole/ul의 농도로, working primer는 10pmole/ul의 농도로 neclease-free water에 녹였다.

제작한 각 primer들의 정보는 아래의 표 1과 같다.

Primer Name	Sequence	mer	Tm	GC%	Target
FArom-F1	5' - CTCCCACAGACCAACAACCT - 3'	20	53.4	55	P. olivaceus Aromatase(P450)
FArom-F2	5' - AGGCACAGCCTGCAACTACT - 3'	20	53.8	55
FArom-F3	5' - TGGCTACAGGGTACCAAAGG - 3'	20	53.8	55
FArom-R1	5' - GAGTGTTTGCCAGCTTCCTC - 3'	20	53.6	55
FArom-R2	5' - TCCCAAAACGTGACGTGTAA - 3'	20	53.6	45
FArom-R3	5' - GAACCGAATGGCTGGAAGTA - 3'	20	53.9	50
real FArom-F1	5' - CTCCCACAGACCAACAACCT - 3'	20	53.4	55
real FArom-F2	5' - AGGCACAGCCTGCAACTACT - 3'	20	53.8	55
real FArom-F3	5' - TGGCTACAGGGTACCAAAGG - 3'	20	53.8	55
real FArom-R1	5' - GAGTGTTTGCCAGCTTCCTC - 3'	20	53.6	55
real FArom-R2	5' - TCCCAAAACGTGACGTGTAA - 3'	20	53.6	45
real FArom-R3	5' - GAACCGAATGGCTGGAAGTA - 3'	20	53.9	50
F-EF1α-F1	5' - GCAGCTCATTGTTGGAGTCA - 3'	20	53.2	50	P. olivaceus Elongation Factor1-α(EF1-α)
F-EF1α-R1	5' - ACACTTGCAGGGTTGTAGCC - 3'	20	53.9	55
F-EF1α-F2	5' - TGGAACCTCTCAGGCTGACT - 3'	20	53.4	55
F-EF1α-R2	5' - GTGGTTCCATTGGCATTACC - 3'	20	53.8	50

2) cDNA 합성

분리된 RNA들로부터, 넙치의 aromatase와 EF1-a 유전자 증폭 확인을 위한 주형으로 사용되는 cDNA를 합성하였다.

AdvanTAge RT-for-PCR Kit(Clonetech)를 사용, 0.5 ㎍의 total RNA를 nuclease-free water에 희석하여 총 부피를 6.25 ㎕ 되게 하였다.

희석된 RNA에 0.5 ㎕의 oligo(dT)를 넣고 70℃에서 2분간 가열냉각(annealing)한 후, 2 ㎕의 5×reaction buffer, 0.5 ㎕의 dNTP mix(각 10mM), 0.25 ㎕의 RNase inhibitor, 0.5 ㎕의 MMLV 역전사 효소를 더하여, 42 ℃에서 1시간 동안 반응하였다.

반응 후, 94 ℃에서 5분간 가열하여 cDNA합성을 중지시키고, 40 ㎕의 nuclease-free water로 최종부피를 50 ㎕되게 희석하였다.

3) Polymerase Chain Reaction(PCR)을 통한 넙치 유전자 증폭

합성된 cDNA들 중 1번 시료의 것과 제작한 primer를 가지고 넙치의 aromatase와 EF1-a 유전자들을 증폭하였다.

합성된 cDNA 5㎕를 주형으로 하여, 각 5pmole의 primer set과 250uM/each의 dNTP mix, 그리고 1 rxn/tube의 reaction buffer와 polymerase(i-Taq;iNtRON)를 사용하여 final 20㎕에 반응시켰다.

반응 조건은 95℃에서 pre-denature 후, 95℃에서 45초간 denature, 55℃에서 45초간 annealing, 72℃에서 60초간 extension을 1 cycle로 하여, 총 30 cycle을 반응시킨 뒤, 72℃에서 5분간 post extension하였다.

사용된 primer set의 구성은 다음과 같다.

Aromatase set 1; FArom-F1과 FArom-R1

set 2; FArom-F2와 FArom-R2

set 3; FArom-F3와 FArom-R3

EF1-a set 1; F-EF1a-F1과 EF1a-R1

set 2; F-EF1a-F2와 EF1a-R2

증폭산물을 확인하기 위한 전기영동은 1% agarose gel에 PCR 산물을 모두 로딩(loading)한 후, 100 volt에서 30분(EF1-a) 및 50분(aromatase) 간 수행하였다(도 7).

증폭산물의 크기를 비교하기 위한 marker DNA는 100bp DNA Ladder(Fermentas) 4㎕를 사용하였다.

증폭된 각 유전자들은 용출(elution)하여 클로닝(cloning)하였다.

전기영동 결과, 각 primer set에 대하여 모두 양호한 증폭산물을 확인할 수 있었다.

4) 용출(Elution)

PCR을 통하여 증폭이 확인된 산물들의 sub-cloning을 위하여 Agarose Gel Extraction-Ultra Kit(SolGent)로 elution하였다.

정제할 증폭산물을 포함하는 gel 부분을 잘라내어 무게를 측정한 후, 1.5 ㎖ microtube로 옮긴 뒤, 잘라낸 gel의 3배 부피의 UB buffer를 첨가한 후 60℃에서 10분간 처리하였다.

gel이 완전히 녹은 뒤, gel 부피만큼의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 섞어주고, 100㎕의 Super Binder^TM Solution으로 활성화(activation) 시킨 spin column으로 옮겨 10,000rpm에서 30초간 원심분리하여 증폭된 DNA만을 column에 결합시킨 후, 80%의 에탄올로 12,000rpm에서 30초씩 2회 세척하고, 동일 조건으로 3분간 더 원심분리하여 건조시켰다.

건조된 column을 새 마이크로튜브(microtube)로 옮기고 nuclease-free water 35 ㎕를 처리하여 상온에서 1분간 보관 후, 12,000rpm에서 1분간 원심분리하여 원하는 DNA만을 용출하였다.

각 DNA들을 확인하기 위한 전기영동은 1% agarose gel에 1 ㎕를 loading한 후, 100 volt에서 30분간 수행하였고, 양호한 결과를 얻었다.

5) 넙치의 두 유전자와 pGEM-T easy 벡터 간의 결찰(ligation)

Elution을 통하여 정제한 넙치의 각 유전자들은 cloning을 위하여 pGEM-T easy 벡터(Promega)에 결찰(ligation) 시켰다.

각 유전자들에 대하여 사용한 벡터의 양은 25ng 이었으며, molar ration는 3으로 통일하였고, ligation에 필요한 insert(각 elution DNA들)의 양은 벡터의 크기인 약 3kb를 기준으로 하여, "사용한 벡터의 양(ng) × 사용한 insert DNA의 크기(kb) × molar ratio / 사용한 벡터의 크기" 공식에 대입함으로 계산하였다.

Ligase는 T4 DNA Ligase(Promega)를 사용하였고, 30mM Tris-HCl, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 1mM ATP, 5% PEG를 포함하여 최종 volume이 10 ㎕ 되게 하였다(표 2).

Ligation 반응은 4℃에서 16시간 동안 처리하였고, 바로 형질전환에 사용하였다.

유전자	Insert(ng)	Buffer(㎕)	Insert(㎕)	Vector(㎕)	Ligase(㎕)	D.W(㎕)	Final(㎕)
Aromatase	3.5	2	0.49	0.5	1	6.01	10
EF1-α	7.8	2	1.04	0.5	1	5.46	10

6) 넙치 각 유전자에 대한 JM-109 수용성세포로의 형질전환

pGEM-T easy 벡터에 ligation시킨 넙치 각 유전자들을 수용성세포에 형질전환시켰다.

수용성세포는 E. coli 세포주인 JM-109(Promega) 20 ㎕를 사용하였고, ligation mixture 4㎕를 Inoue 방법으로 형질전환시켰다.

-80℃에 보관중인 수용성세포를 얼음에 꽂아 녹이고, ligation mixture를 첨가한 후, 20분간 반응시켰다.

42℃에서 45초간 heat shock을 주고, 다시 얼음에 꽂아 두었다가 37℃에 보관해 두었던 LB broth 배지 300 ㎕를 추가하여 37℃, 180rpm shaking incubator에서 90분간 배양한 뒤 100 ㎕를 LB agar 배지 plate에 spreading bead를 사용하여 도말하였다.

LB agar 배지에는 80mg/ml의 X-gal, 0.5mM의 IPTG, 50ug/ml의 ampicillin을 처리하였다.

넙치 각 유전자들이 형질전환된 수용성세포들이 도말된 plate는 37℃ incubator에서 15시간 동안 배양하였다.

배양결과, aromatase와 EF1-a 유전자가 형질전환된 수용성세포들이 도말된 plate 모두에서 blue 및 white-colony가 양호하게 형성되어 있었음을 확인하였다.

형질전환이 성공적으로 이루어졌다고 판단되는 white colony에 대해 각 유전자별로 1개씩 innoculation하여 50 ug/ml의 농도로 ampicillin이 처리된 LB broth 배지 4ml에 넣고 37℃에서 180rpm으로 10시간 배양하여 plasmid DNA를 분리하였다.

7) 넙치 aromatase와 EF1-a 유전자를 함유하는 plasmid DNA의 분리

LB broth 배지에서 배양된 넙치 각 유전자를 함유하는 수용성세포로부터의 plasmid DNA는 GeneAll^TM Exprep^TM Plasmid Isolation Kit(GeneAll)을 사용하여 분리하였다.

배양된 2ml의 세포배양액을 microtube에 넣고 30초간 spin-down하여 모으고 상등액을 제거한 후, RNase가 함유된 resuspension buffer(S1 buffer) 170 ㎕에 잘 현탁하였다.

현탁된 세포에 cell lysis buffer 170 ㎕를 첨가하여 inverting 시킴으로 세포벽을 파괴하고, 250 ㎕의 Neutralization buffer(G3 buffer)를 첨가하여 중성화시킴으로 cell debris를 뭉치게 하였다.

내용물 모두를 EzClear^TM Column에 옮기고 15,000rpm에서 30초간 원심분리하여 넙치의 각 유전자들이 삽입된 plasmid DNA를 SV Column에 binding 시켰다.

80% 에탄올 700 ㎕를 넣고 15,000rpm에서 30초간 원심분리하여 column 내의 salt등을 제거한 후, 동일 조건에서 1분간 추가 원심분리하여 건조시키고, 60 ㎕의 nuclease-free water에 녹여 plasmid DNA를 분리하였다.

분리된 넙치 각 유전자들이 삽입된 plasmid DNA 2 ㎕씩을 취하여 1% agarose gel에 loading 한 후, 100 volt에서 50분간 전기영동을 수행하였다(도 8).

Plasmid DNA의 크기를 비교하기 위한 marker DNA는 4 ㎕의 100bp DNA Ladder(Fermentas)를 사용하였다.

8) Plasmid DNA 내의 넙치 유전자 확인을 위한 PCR

분리된 넙치 각 유전자를 포함하는 plasmid DNA들에 대하여 sequencing에 사용할 M13 primer set를 사용하여 PCR을 수행함으로 클로닝 여부를 확인하였다.

분리한 plasmid DNA 0.5 ㎕를 주형으로 하여, 각 5pmole의 primer set과 250uM/each의 dNTP mix, 그리고 1 rxn/tube의 reaction buffer와 polymerase(i-Taq DNA Polymerase; iNtRON)를 사용하여 final 20 ㎕에 반응시켰다.

반응 조건은 95℃에서 pre-denature 후, 95℃에서 50초간 denature, 55℃에서 50초간 annealing, 72℃에서 60초간 extension을 1 cycle로 하여, 총 25 cycle을 반응시킨 뒤, 72℃에서 5분간 post extension하였다.

증폭산물을 확인하기 위한 전기영동은 1% agarose gel에 PCR 산물을 모두 loading 한 후, 100 volt에서 50분간 수행하였다(도 9).

증폭산물의 크기를 비교하기 위한 marker DNA는 100bp Plus DNA Ladder(Bioneer) 4㎕를 사용하였고, 확인된 각 plasmid DNA들은 sequencing을 의뢰하였다.

9) 넙치 각 유전자의 nucleotide 서열 결정

넙치의 cDNA로부터 분리한 각 유전자의 nucleotide 서열을 확인 및 결정하기 위하여 각 plasmid DNA에 대한 sequencing을 진행하여, forward 및 reverse 방향으로 sequencing하여 data를 분석하였다.

결정된 넙치 각 유전자의 nucleotide 서열들은 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Nucleotide blast search 프로그램(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)을 사용하여 유전자은행에 보고된 넙치 aromatase 및 EF1-a 서열들을 대상으로 비교하여 PCR을 통한 증폭산물이 원하는 유전자인지를 확인하였다.

또한, 결정된 각 넙치유전자의 염기서열들은 유전자은행에 보고된 해당 유전자의 염기서열과 homology를 보이는 부분만을 선별하여 ClustalW (Thompson et al., 1994)를 통해 비교하였다(도 10, 11).

분석결과, 본 발명을 통하여 확인된 넙치 aromatase 및 EF1-a 유전자의 서열은 유전자은행에 보고된 넙치의 해당 유전자와 99% 이상의 상동성을 보였고, 아미노산 수준에서는 100%의 상동성을 나타내었기에, 성 판별을 위한 Real-Time quantitative PCR을 수행하였다.

<실시예 3> 암수판별을 위한 진단기법 개발

상기 실시예 2에서 성판별 marker로 개발된 특이적인 넙치 aromatase 및 EF1-a primer set중에서 특이성이 가장 우수한 aromatase primer set 3와 EF1-a primer set 1을 이용하여 넙치 치어에서의 성판별 가능성을 검토하였다.

성판별의 정확성을 검토하기 위하여 성분화가 종료된 개체(체중 50~90 g)의 생식선에서 조직의 일부를 채취하여 조직학적 관찰을 통해 성판별을 하였고, 나머지 부분은 aromatase mRNA을 측정하여 조직학적 성판별과 비교하였다.

더불어 성분화 직후의 넙치 치어 개체에서의 marker 특이성을 검토하기 위하여 체중 4 g 전후, 체장 7 cm 전후의 개체에서 생식선 부위를 채취하여 aromatase mRNA을 측정하였다.

본 발명에서는 넙치 생식선에서 aromatase mRNA를 활용한 암수판별 marker개발하는데 목표를 두고 검토하였다.

2. 실험방법 및 결과

1) 넙치 시료 Sampling

넙치 성 판별 기술개발을 위한 시료는 도내 양식장으로부터 사육중인 치어를 확보하여 체중인 50~90 g전후 Group A와 체중 4g 전후 Group B로 나누어 측정하였다.

Group A에서는 생식선의 일부는 조직학적 관찰을 위하여 Bouin's solution에 하루 동안 고정하고 나머지는 total RNA 분리시까지 액체질소에 보관하였다.

Group B는 식선 전체를 포함하여 주변 부위의 조직 약 100~200mg을 채취, total RNA 분리 시까지 액체질소에 보관하였다.

2) Total RNA의 분리

Total RNA는 적출된 넙치 자어의 각 조직 100~200mg으로부터 easy-BLUE^TM Total RNA Extraction Kit(iNtRON Biotechnology)를 사용하여 분리하였다.

각 조직에 1ml의 easy-BLUE^TM reagent를 넣고 homogenizer를 사용하여 마쇄한 후, 10초간 vortex하여 RNA를 용출시키고, 다시 200 ㎕의 chloroform을 첨가한 후 vortex하여 지질성분을 제거하였다.

각 시료를 4℃, 13,000rmp에서 10분간 원심분리하여 cell debris를 분리한 후, 옮겨진 상등액에 400 ㎕의 isopropanol을 첨가하여 상온에서 10분간 반응시킴으로 RNA를 침전시켰다.

침전된 RNA는 4℃, 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 RNA pellet을 얻어내고, 1ml의 75% 에탄올을 첨가하여, 4℃에서 10,000rpm으로 5분간 원심분리함으로 남아있는 salt를 제거한 뒤, 상온에서 pellet을 건조시키고 100~200㎕의 nuclease-free water에 녹였다.

분리된 각 RNA들은 260nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 정량하였고, 260/280nm 값이 1.7 이상인 RNA만을 실험에 사용하였다.

분리된 total RNA의 양은 최소 59.1ng/㎕에서부터 2,432.1ng/㎕에 이르렀고, 분리된 핵산의 정성적 척도를 나타내는 흡광도 260/280nm의 값도 대부분이 1.7이상으로서 매우 양호한 것으로 나타났다.

3) Primer 제작

넙치 Genomic DNA로부터 해당 유전자를 Polymerase Chain Reaction(PCR)법으로 증폭, 자성화 초기단계에 발현하는 유전자인 aromatase(P450)와 normalization을 위한 house-keeping 유전자인 Elongation Factor1-a(EF1-a)를 분리하기 위한 primer set들은 기 보고된 유전자 서열들을 참고로 제작하였다.

각 primer들은 20-bp 길이, 53.2~53.9 Tm, 45~55%의 GC 함량을 갖게 구성하였고, 제작된 primer stock은 100pmole/㎕의 농도로, working primer는 10pmole/㎕의 농도로 neclease-free water에 녹였다.

제작한 각 primer들의 정보는 아래의 표 3과 같다.

Primer Name	Sequence	mer	Tm	G.C%	Target
FArom-F3	5' - TGGCTACAGGGTACCAAAGG - 3'	20	53.8	55	P. olivaceus Aromatase(P450)
FArom-R3	5' - GAACCGAATGGCTGGAAGTA - 3'	20	53.9	50	P. olivaceus Aromatase(P450)
F-EF1α-F1	5' - GCAGCTCATTGTTGGAGTCA - 3'	20	53.2	50	P. olivaceus Elongation Factor1-α(EF1-α)
F-EF1α-R1	5' - ACACTTGCAGGGTTGTAGCC - 3'	20	53.9	55	P. olivaceus Elongation Factor1-α(EF1-α)

4) cDNA 합성

희석된 RNA에 0.5 ㎕의 oligo(dT)를 넣고 70 ℃에서 2분 간 annealing한 후, 2 ㎕의 5×reaction buffer, 0.5 ㎕의 dNTP mix(각 10mM), 0.25 ㎕의 RNase inhibitor, 0.5 ㎕의 MMLV 역전사 효소를 더하여, 42 ℃에서 1시간 동안 반응하였다.

반응 후, 94 ℃에서 5분간 가열하여 cDNA합성을 중지시키고, 40 ㎕의 nuclease-free water로 최종부피를 50 ㎕ 되게 희석하였다.

5) 넙치 치어의 성 판별을 위한 Real-Time Quantitative PCR

넙치 치어의 성 판별을 위한 실험은 합성한 cDNA와 제작한 aromatase와 EF1-a 유전자 특이적인 primer set 1을 사용하여 SYBR green 검출법으로 수행하였다.

합성한 cDNA 80ng을 주형으로 하여 각 primer 0.5㎕, iQ SYBR Green Superscript premix(Bio-Rad) 7.5㎕를 첨가, nuclease-free water로 각 시료를 최종 15㎕에 맞게 희석하였다.

한 시료에 대하여 aromatase와 EF1-a에 대해 별도의 tube에 반응시켰고, Chormo4 Real-Time quantitative PCR machine(Bio-Rad)을 사용하였다.

PCR 반응 조건은 아래의 표 4에 제시하였다.

	Action	Temperature(℃)	Duration(sec.)	Cycle
1	Incubate	95	180
2	Incubate	95	20	45
3	Incubate	60	20
4	Incubate	72	30
5	Plate Read	-	-
6	Incubate	72	300
7	Incubate	95	120
8	Incubate	30	60
9	Plate Read(Manual ramp rate of 0.5℃ per second)
10	Melting Curve from 65 to 96 ℃(Read every 0.2℃, Hold 1 second)
11	Incubate	30	1
12	END

상기 실험결과, 각 시료의 aromatase 유전자 발현량을 상대비교함으로 넙치 자어의 성을 판별하였고, 각 aromatase 유전자의 발현값에 대한 normalization은 house-keeping 유전자인 EF1-a의 발현값을 사용하였다.

분석 시, out-data는 제외하였으며, 가장 낮은 aromatase 발현량을 보이는 시료를 control로 하였고, aromatase 유전자의 발현이 base line 이하인 8개의 시료의 값은 0으로 처리하였다.

Group A 분석결과는 out-data 1개 시료를 제외한 19개 시료에서 3, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 15 그리고 17번 시료의 총 9미가 수컷으로, 1, 2, 4, 7, 8, 9, 14, 18, 19 그리고 20번 시료의 총 10미가 암컷인 것으로 판별되어 약 52%의 자성 출현율을 나타내는 것을 확인하였다(도 12, 표 5).

또한, 개체별 암수의 판별은 조직학적 관찰내용과 일치하였다.

Sample	01	02	03	04	05	06	07	08	09	10
Expression	13682	10297	21	7968	28	155	2419	7281	8540	1
Sex	female	female	male	female	male	male	female	female	female	male
Sample	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
Expression	5	2	92	12077	129	out-data	8	2521	2957	5221
Sex	male	male	male	female	male	male	male	female	female	female

Group B의 분석결과는 out-data 1개 시료를 제외한 39개 시료에서 수컷이 14미, 암컷이 25미 인 것으로 판별되어 약 64%의 자성 출현율을 나타내는 것을 확인하였다(도 13, 표 6).

Sample	01	02	03	04	05	06	07	08	09	10
Expression	51063	4211	2978	5833	2452	2241	17929	165	1898	6252
Putative Sex	female	female	female	female	female	female	female	male	female	female
Sample	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
Expression	4096	4673	1269	3692	1531	267	5113	3692	5078	5713
Putative Sex	female	female	female	female	female	male	female	female	female	female
Sample	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30
Expression	2062	1510	322	1	9541	4	0	0	0	out-data
Putative Sex	female	female	male	male	female	male	male	male	male	out-data
Sample	31	32	33	34	35	36	37	38	39	40
Expression	4	0	0	0	3444	0	3373	94	0	2180
Putative Sex	male	male	male	male	female	male	female	male	male	female

서열목록 전자파일 첨부

Claims

FArom-F3 (5' - TGGCTACAGGGTACCAAAGG - 3')와 FArom-R3 (5' - GAACCGAATGGCTGGAAGTA - 3')로 구성된 인공서열(artificial sequence)을 갖되,
상기 염기서열은 넙치의 치어단계에서 발현되며,
상기 발현된 발현량이 수컷 넙치치어보다 암컷 넙치치어에서 더 높게 나타나 넙치 치어의 암,수 판별을 가능하도록 하는,
넙치 치어단계의 암수 판별용 PCR 아로마테이즈 프라이머 세트(aromatase primer set).
삭제
제1항의 프라이머 세트를 포함하여 구성된,
넙치 치어단계의 암수 판별용 PCR 키트.
삭제
제1항의 프라이머 세트를 이용한 PCR을 통해 넙치 치어에서 추출한 DNA를 증폭하는 단계;
상기 증폭된 산물들의 aromatase 유전자 발현량을 각각 측정하는 단계 및,
상기 측정된 각 산물들 간의 aromatase 유전자 발현량을 상대비교하여
상기 넙치 치어의 성별을 판별하는 단계;를 포함하여 구성된,
넙치 치어단계의 암수 판별방법.