CN111850133B - 一种凡纳滨对虾的耐低温关联的snp分子标记、检测引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种凡纳滨对虾的耐低温关联的SNP分子标记、检测引物及其应用。所述的SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示，所述的凡纳滨对虾的SNP分子标记是：SEQ ID NO.1所示序列的第1,925碱基位置的G/C基因型或G/G基因型；或第3,414、3,475和3,537碱基完全连锁，其为A/A基因型或A/C基因型；或第3,776碱基位置的T/T基因型或T/G基因型；或第6,679碱基位置的A/C基因型或A/A基因型。根据本发明提供的方法，有利于快速提升凡纳滨对虾子代的耐低温性状，缩短耐低温对虾品系的选育周期，具有较大的潜在应用价值。

Description

一种凡纳滨对虾的耐低温关联的SNP分子标记、检测引物及其 应用

技术领域：

本发明属于水产动物分子标记辅助育种领域，具体涉及一种凡纳滨对虾低温耐受性状关联的微小染色体维持基因2(MCM2)的SNP分子标记、检测引物、分子功能及其应用。

背景技术：

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei，俗称南美白对虾)是中国最重要的对虾养殖品种，2018年中国凡纳滨对虾养殖年产量超过176万吨，种苗年需求量超过10000亿尾，良种繁育对凡纳滨对虾养殖业具有重要意义。耐低温是凡纳滨对虾的重要抗逆性状。一方面，由于凡纳滨对虾具有较高的市场需求、环境适应性广，该种对虾已被推广到中国北方水域进行养殖，其中包括山西、陕北、山东等北方省份的海、淡水水域，耐低温成为中国北方凡纳滨对虾养殖业追求的重要抗逆性状；另一方面，在中国的春节时期，鲜活凡纳滨对虾的市场价格是平常季节的3倍以上，广东等地的对虾养殖农户经常冒险的将上市时间拖到冬季，又往往因冬季寒潮造成水温骤降引起养殖对虾大规模死亡，耐低温品种的选育也是中国南方凡纳滨对虾养殖业的迫切需求。

传统的选育方法依赖于表型选择，具有周期长、不稳定等不利因素。分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择的技术，分子育种方法根据有效的分子标记进行后备亲本选择，能更快速地提升子代的经济性状。SNP(SingleNucleotide Polymorphism)是指基因组上单核苷酸的多态性，是目前应用最广、最新的分子标记。高质量的DNA分子标记是开展分子育种的基础。目前，虽开发出了众多针对不同性状的对虾分子标记，但多未阐明分子标记的分子功能。

微小染色体维持基因2，英文名：Minichromosome Maintenance ComplexComponent 2(MCM2)，是参与启动真核基因组复制的小染色体维持基因家族的成员。在凡纳滨对虾中从未有MCM2基因的报道，也从未有研究发现该基因与低温性状相关。

发明内容：

本发明旨在提供一种凡纳滨对虾低温耐受性状关联的微小染色体维持基因2(MCM2)的SNP分子标记、检测引物、分子功能及其应用，本发明公开的凡纳滨对虾MCM2基因的SNP分子标记、检测引物、分子功能及其应用方法，是目前已知的常规知识或方法无法预测的，本发明的SNP分子标记可用于检测凡纳滨对虾亲本的耐低温性状，根据本发明提供的方法，可筛选耐低温能力更强的后备亲本，有利于快速提升凡纳滨对虾子代的耐低温性状，缩短耐低温对虾品系的选育周期。

本发明的凡纳滨对虾微小染色体维持基因2(MCM2)的耐低温性状关联的SNP分子标记，所述的SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示，所述的凡纳滨对虾的SNP分子标记是：SEQ ID NO.1所示序列的第1,925碱基位置的G/C基因型或G/G基因型；或第3,414、3,475和3,537碱基完全连锁，其为A/A基因型或A/C基因型；或第3,776碱基位置的T/T基因型或T/G基因型；或第6,679碱基位置的A/C基因型或A/A基因型。

优选，第1,925碱基位置的G/C基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于G/G基因型个体；第3,414、3,475和3,537碱基完全连锁，其A/A基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于A/C基因型个体；第3,776碱基位置的T/T基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于T/G基因型个体；第6,679碱基位置的A/C基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于A/A基因型个体。

本发明的第二个目的是提供上述SNP分子标记的检测引物，如下任一检测引物对所示

(1)第1,925位置检测引物对

g.MCM2-1,925-F：5’-GTCTGAGTTATCGGTAGTATTGG-3’；

g.MCM2-1,925-R：5’-CATAGGAACACTTGTTGCAGTC-3’；

(2)第3,414位置检测引物对

g.MCM2-3,414-F：5’-CTGAGGTGACTGGTGTGTACAC-3’；

g.MCM2-3,414-R：5’-GAGTACCTGTGGTGAAGACAGC-3’；

(3)第3,776位置检测引物对

g.MCM2-3,776-F：5’-TGAGAGGATTGTGGCCTCAATT-3’；

g.MCM2-3,776-R：5’-CACCTCATACGAGGTCATATTGTC-3’；

(4)第6,679位置检测引物对

g.MCM2-6,679-F：5’-CTCTATGAGTTGACATTGGATGGG-3’；

g.MCM2-6,679-R：5’-CTCTTGCCGTCATGTGAGAAGTT-3’。

本发明的第三个目的是提供一种检测试剂盒，其包括上述SNP分子标记的检测引物对。

本发明的第四个目的是提供上述耐低温性状关联的SNP分子标记、SNP分子标记的检测引物和检测试剂盒在凡纳滨对虾耐低温抗逆育种中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种检测凡纳滨对虾耐低温性能的方法，包括：提取待测凡纳滨对虾的基因组DNA，利用上述SNP分子标记的检测引物对进行扩增，并测序获得测序结果，基于测序结果确定SNP分子标记的基因型，再判断该待测凡纳滨对虾的耐低温性能。

具体是：第1,925碱基位置的G/C基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于G/G基因型个体；第3,414、3,475和3,537碱基完全连锁，其A/A基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于A/C基因型个体；第3,776碱基位置的T/T基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于T/G基因型个体；第6,679碱基位置的A/C基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于A/A基因型个体。

耐低温是凡纳滨对虾的重要抗逆性状，在凡纳滨对虾耐低温抗逆育种工作中，可利用本发明的SNP分子标记和方法对后备亲本群体进行筛选，及早排除对低温敏感的凡纳滨对虾亲本个体，将有助于快速增强凡纳滨对虾子代的耐低温能力。根据本发明提供的方法，有利于快速提升凡纳滨对虾子代的耐低温性状，缩短耐低温对虾品系的选育周期，具有较大的潜在应用价值。

附图说明：

图1是：A:对虾MCM2基因SNP多态性位点位置图，数字代表多态性位点的碱基位置；B:对虾MCM2基因SNP多态性位点连锁分析图,黑色代表完全连锁；C:个体基因型的统计结果,“***”表示显著性检验P<0.001；D:表示突变位点测序峰图；E:SNP位点氨基酸与低温性状的相关性分析,纵坐标大小表示与低温性状的相关性大小。

图2是：A:对照温度条件下，MCM2基因被干扰表达后，大部分对虾个体仍能正常存活；B:在15℃条件下，MCM2基因被干扰表达后，对虾的存活率降到50％左右；C:在更低13℃条件下，MCM2基因被干扰表达后，对虾的存活率降到30％.红色线条代表注射MCM2基因的RNAi干扰序列的生存曲线，蓝色代表注射无义RNAi干扰序列的生存曲线，黑色代表注射DEPC水的生存曲线.

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、

以13℃±0.5为应激条件，对150头凡纳滨对虾“普瑞莫”与“迈阿密”群体杂交来源的后代进行低温耐受性实验，统计个体的耐受时间，将首先死亡的30头虾作为低温敏感组，将最后仍然存活的30头虾作为低温耐受组。在实验过程中，及时将死亡个体置于95％酒精中保存。低温敏感组和低温耐受组对虾基因组DNA提取方法按照天根海洋动物组织基因组提取试剂盒进行(TIANGEN，天根生化科技有限公司)。

利用本发明公开的检测引物(F：5‘-CGCTACCCTCAACACACTACA-3’，R：5‘-CAACAGCCTTACAACACTAC-3’)，对低温敏感组和低温耐受组对虾个体的MCM2基因进行PCR检测，反应程序为：95℃预变性4分钟，(95℃变性30秒、52-57℃退火20秒、72℃延伸1分钟)×35个循环，最后72℃延伸10分钟。对PCR产物进行测序，MCM2基因的序列如SEQ ID NO.1所示，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，经个体基因型的统计，发现：

(1)、第1,925碱基位置的G/C基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于G/G基因型个体；第3,414、3,475和3,537碱基完全连锁，其A/A基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于A/C基因型个体；第3,776碱基位置的T/T基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于T/G基因型个体；第6,679碱基位置的A/C基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于A/A基因型个体(图1-C，表1)；

(2)、第1,925碱基位置G>C错义突变导致该基因编码氨基酸由天冬氨酸(Asp，D)突变成谷氨酸(Glu，E)；第3,414碱基位置A>C错义突变导致该基因编码氨基酸由谷氨酰胺(Gln，Q)突变成赖氨酸(Lys，K)；第3,776碱基位置T>G错义突变导致该基因编码氨基酸由甲硫氨酸(Met，M)突变成异亮氨酸(Ile，I)；第6,679碱基位置A>C错义突变导致该基因编码氨基酸由脯氨酸(Pro，P)突变成组氨酸(His，H)；第3,475和3,537碱基处于MCM2基因的内含子上，不导致编码氨基酸改变(图1-A,D,E)；

(3)、对低温性状的影响重要性进行分析，由高到低为：第1,925碱基位置G>C错义突变；第6,679碱基位置A>C错义突变；第3,414碱基位置A>C错义突变；第3,776碱基位置T>G错义突变(图1-E)；

表1对虾MCM2基因SNP位点与低温性状的关联分析

二、

采用本发明的MCM2基因的RNAi序列(siRNA sense：5’-AGGCTTCCCTGTGTTCGCGACTGTT-3’，siRNA antisense：5’-CAGTCGCGAACACAGGGAAGCCTTT-3’)，分别对25℃、15℃、13℃的对虾进行注射处理，对照组注射DEPC水及无义RNA链，具体是：按照RNA/体重为3μg/g的剂量注射siRNA溶液及无义RNA链(溶解于DEPC水中)，对照组注射相同体积的DEPC水溶液，注射总体积应小于50μl，注射部位为虾的腹部肌肉。人工合成的RNA链干粉及溶液应保存于干冰中，冰上解冻后在半小时内注射完毕。结果如图2所示，从图2可以看出，本发明公开的人工合成的RNAi干扰序列能够显著的降低对虾在低温中的成活率，说明本发明公开的RNAi干扰序列能够干扰对虾MCM2基因的正常表达，说明该基因在低温压力条件下具有重要的分子功能(图2)。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物科学研究所

<120> 一种凡纳滨对虾的耐低温关联的SNP分子标记、检测引物及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7322

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 1

agaaacgcta ccctcaacac actacaaaat gtcggtgagt atttttctct ccttttcgag 60

gtatttttga gggttacaaa cgctatttca cctcttaata gaactataag gcacgatgga 120

agattcctgt atggaaataa taaccgaaaa gagtggttta gggtcgaaaa gaaggagaga 180

aggtgaggtg acttcatgtt cgtgttgtct ttatgaaagg gagtttctcg gttatcttta 240

tctctctatt ttacgctttc agtggattta aagctatttt aacactcaca gataacgaaa 300

atgcatcatc tagagtaaat atgtcttagc ctaacctccg aaatacaata aatatgagta 360

aataggccta cattcctaag agctgtcggg accacaaaca aaaccttttc gagtaatata 420

tatatatttt tttccttttt tttcacccaa gaatcagttt tgagaagaga ttttcgtctt 480

gtgatatcgt gaatgtgtag ttttgtgaga aatagaatca taacagtaat tttttttttt 540

ctatttttca taagccagtg tgtttctcaa cctcgtttcc ccagaaaagg aagactaaat 600

tatgtcaaag tatttgtgtc tccattatat ttttcgcgta tgtacgattg cctcacattt 660

ctaagcgttg atatgtaaag cgcaagccca aatccgccag ccttctcact cccctgacct 720

tccttccaac aggaccagcc cacctctccc tcggccgtca tgagctcccc ggagcccacc 780

accccgagcc gctccagcat gtcgggtcgc aggaggagga ggtcgtcgag gggctccaac 840

gtagacccag tgacctcctc cccgggccgt gacctccccg ccttcgagga cgagagcgac 900

ctcatgggta acgatgtgcc ggtcgaggag gaggacgggg aggagctctt cggagataac 960

atggagaagt aagtttgctg tgttctgctt cgtgtttgag aaatcgatac ctgttttctg 1020

tgctgcattt attgaggcaa actgtgctgt gtttattggg acaaaatgtt tcatagacat 1080

ctacaatgcc tctctatcaa aatctgacta aatctgcttc aactttaatt caaatagcta 1140

ttaaaccttt caatttatat tatttgttcc aactattcac tagcatgtgc attaacctgt 1200

ttatgttttc catgacccca tgaatcataa tccttcctga ctaaggggct tcacccctgg 1260

acccccactg aatgcctatg ggctcagttg ccacacagca tttgtcacat cctgtcatct 1320

tcactaattg taacatctgc aatttcagcg actaccgaca cattcctgaa ctagatgtct 1380

atgaccagga caatcttgat gactctgaat actcgatgat gagtgaaggt gatcgcgcag 1440

cagcagaagg agcaatgaga aagcgtgatc gggatgaggg actaatcaca ggtcgcatga 1500

gaagaggtct tctgtatggt aagtcaaatc agtgatatat tgtctgagtt atcggtagta 1560

ttggttgcaa ctgaaaagaa acatttttat ctttgcagtt acttgaatat agctctcagt 1620

actgagaatt tcttatgtac ctttgcaagt tacatgaatt atattgtatt aaacatttag 1680

ctcatggagg aaatgcattt gatcagatga gagcgatgat gaggaagata gaccagccag 1740

aaaacggcgc atggcagaaa gagccgcaga aggagatgtt gcagaggatg aggaggtgat 1800

aaagcagtgt tttatgtttg gtgaagtaaa cccccagcag gatacaaatt gattatattg 1860

tcacaattga taagacttaa aactttgaat atattagttt tattgtgtta ttgcagatga 1920

ttgagtccat tgagaatctg gaggacatga aaggccacag tgtgagggaa tgggtgtcca 1980

tgcttgggcc cagaactgaa atttacaaca gattcaagaa cttcctgaga acctatgtca 2040

acgacaaggg caacaacctc ttcaaggaca agatccgtca gatgtgcgag gagaacaagt 2100

cttcctttga ggtggattac aacatcattg tgtcagagga gcaggttctc gcatacttcc 2160

ttcctgaggc tcctaccgag atgttagaga tcatggactc ggctgccaag gatgtcacac 2220

tctccatgtt cccacaatac gagagaatca cacgcgagat ccacgtcaga atcacagacc 2280

ttcctctcat tgaagagctt cggtcactta ggtaatattt acagtttatt ttacttttta 2340

tgtatgtgca gatgaattat cttttggggg cttagtttag ttttatatat gtaagtatac 2400

atgcatttga tataaccttt tatcagaata ttaccttgga aaatcgatat atcacattgc 2460

taagaagagc agactctcac aagaaatgtt tattacagac aactccacct gaatcagctc 2520

attcgtactt ctggagtggt tacatcgacc accggtatcc ttccccagtt atctgttgtc 2580

aagtatgact gcaacaagtg ttcctatgtc cttggcccat ttgtccagtc tcagaattca 2640

gaggtaaagc caggctcctg tcctgagtgt cagagcagag gacctttctc catcaacatg 2700

gaagagactg tataccagaa ctaccagaga atcaccctcc aagaatctcc tggcaaggta 2760

aactcagcag actcaacttt tgaaaatatt ttgcattgtt tctttaaagt gatcaatgtc 2820

tctagtatgt aaagctaact ttttgcacca gaaattaatt aaaaacacac tttctcctag 2880

gttgctgctg gccgcttgcc acgttccaaa gatgtcattc ttctcggtga cttgtgtgat 2940

tcatgtaagc ctggagatga aactgaggtg actggtgtgt acacaaataa ttatgatggc 3000

tccctcaaca caaaccaagg cttccctgtg ttcgcgactg ttattatggc aaatcacatt 3060

gctaagaagg acaatgcaaa tgctatcaaa ggtcagtttt cagaatgtct atttggaaat 3120

gatatagtaa gggtaatctg tatgagtact ttacctcaga taattattgt cctataatga 3180

tcattatcag tttctagcaa aaagtgcaaa taaaagattt aaattggtaa atgagtaaat 3240

ccctattttg aatcgcgtct gcagctctca ctgatgaaga catcaaggcc atcgtatccc 3300

tgagcaaaga tgagcgcatt gctgagagga ttgtggcctc aattgctccc tccatctatg 3360

gccatgatga catcaagagg gcccttgcac tctccctctt cggtggcgag accaagaacc 3420

ccggttggtt taatttttta ttttaagttg atttatgatc gttattatat atacaaatgt 3480

taatttttca ctgaaagtat tttaatgagt ggctttttat tttgtatgct tcatacagtt 3540

tgaataagtt tttttttttt ttctttcttt cttttttcac tttgtgttaa tatattcata 3600

tatttatttg tttacttaat tctctattta tttcagttta attgcattga cttatctgaa 3660

attaattttg cttgtataca ggtcagaaac acaaggtccg tggtgacatc aatgtcctgg 3720

tctgtggtga tcctggtaca gccaagtctc agttcctcaa gtacacagag aagattgctc 3780

ctcgtgctgt cttcaccaca ggtactcttt cttttggcag actggagttg tgagaaatat 3840

ttaaaagtac ctttgatatg tttttgattt ttctttcata tttagaaaaa ttcaaaacca 3900

agagcattgt atactgattg cttattgcat tacattatga tgacaatatg acctcgtatg 3960

aggtgaacat ttgactaagt ttttacaaat ttccataggc caaggtgcta gcgctgttgg 4020

tttgacggcc tatgtgcagc gttctccagt tacgcgagag tggaccctag aggctggtgc 4080

ccttgtcttg gctgataagg gaatgtgtct gattgatgag tttgacaagg tgtgttattg 4140

cagtaatggc aactgcctgt taattattat tattatttga aaagtaagaa ataatgaaat 4200

aaaataaatc atatttctca tgcattattt ttaactctct ctcttaccaa cagatgaatg 4260

atgcagacag aacaagtatc cacgaagcca tggaacagca gagcatttct atctccaagg 4320

ctggtattgt gacatctctt caggctcgct gcgctgtcct tgcagctgct aaccctatcg 4380

gaggcagata tgatccatcc atgacctttg ctgaaaatgt aaggacctcc tttctcattt 4440

tctttctttt gtttgcttgt tataagtaat agtttttaat atgggtcttt ctttaattta 4500

atttttggtt aagtctctta attttttaaa gatattttta ttttttgata aatgcaggtt 4560

gatctgtcag agcccattct ctctcgtttt gatgttctct gtgttgtgcg agacactgtt 4620

gaccctgtac aagatgagca cctggctcgt tttgttgttg gctctcacat ccgccaccac 4680

cctggctcca ccgacactga tgtcgcttct caaatcacgg taggtactcc ttttctttgt 4740

tttgctttat atttttgtaa tattgcacag gccaatctga actgattaat gattttacaa 4800

tatatataaa aactggtcag gttgactgca tatcatacag gaaaataagt agacatacac 4860

atgcatctat atttatttat ttttttgtaa tggatacaag gctattactg ttgaagaaac 4920

tactttaacc tcttcttcta taaacctatt gaagctgggt gcatgaacta tccactgtag 4980

gttttaattt atgatatttg tttactcata gatggcttca caaatattta gttaccaaga 5040

aggcaattag aaggcctaaa gtattttttg ctaatactat tgatcttgtt actgttccta 5100

ttaatattgg caataagatt agcggaatgt cactcagata ctaatagtaa aaatgaatga 5160

caatctttca gaaaatcaag gaaagggaaa ataggttaag aataggacta ttgattgact 5220

ccttggtaac taacttcttg tggagctttt tatgtgtaac gagaaagaaa aagtaaaatc 5280

atagcggaca tttaatttac gtacatgact ccagcggcaa ttggttaaga aagaagaaaa 5340

attgacacag tactattcca ttttctttca tggacaatat ataattccaa aagtgtatgc 5400

catgccaaaa aaatttacat aagcaaaatg aatttttcca ggatgggcca gcaggaggtg 5460

gatcaaacct agccggagtg gagaagatcc ctcaggacct cctcaagaaa tacatcatct 5520

atggccgaga gaaggtccgt cccaagctcc accagatgga ccaggacaaa gtagccaaga 5580

tgtactctga gttgagaaga gagtcaatgg ccacaggtac agcttgttcc tttttctttc 5640

tgtttccttt ctagagatat taaagtggaa agtcatacta aatttcccta ttagtttgaa 5700

gttgaaagat aagaaaggga atgttataaa agcagcagat aacttgtttg tctcttgata 5760

tagttgttca aggtcttgac acagtatcat tatggaaagc agtttggaga cattgaatgt 5820

ttgtgaacag atcagtgctt tggtgccaat ttacatatat ggtaaacttt catggatgcc 5880

ttggttgact ccataatgaa ctgtaaattt ttgacctgga atcaagactc acaagctcgt 5940

atgaattcca ctgtggtact tttggctacg tataatggaa tgaaatagat gataaaagga 6000

agacgagaat gtttagttgg aaaagcacta aaatacaaag tccagacctg gttgaggaaa 6060

agtgccatga gttttcatgt atagcagcat tgccattctc agtttcaact taatgtttag 6120

ggtgttggtc agcacacaca ttctttgtct ctatgagttg acattggatg ggtacaataa 6180

cattttggat caaaataatg aagttgtatc cattattccg caggaagtat ccccatcaca 6240

gtacgtcaca ttgagagcat gatcagaatg gctgaggctc atgccagaat gcaccttcgt 6300

gaatatgtcc atgaagatga tgtgaacatg gctatccgcg tgatgcttga atcattcatc 6360

gacacacaga agttctctgt tatgaggacc atgaaaaagg tagaactaat ttcatttcat 6420

aaagttttat attcaaaatg aagattaaag aattaactgg aaatgctaaa atgtatttgg 6480

ttcctagaga acaagatgaa atctgtttta tgaattaatg tgcacaccaa attataacca 6540

actcttttct ttttcgtttg cagaactttt cacggtattt ggccttcaag cgagacaaca 6600

acgaactctt gttcttcttg ttgcgacagc tggtgcacga gcaaaccaca tacatgcgct 6660

ctcgctatgg acccgaccat gatgttgttc aagtgtcaga gaaggatctc ctggatcggg 6720

taagtaatgc ttatgtgaaa gtatattcca gttctctggg ctgttatttg atttgttaaa 6780

tatcagttca atacagaaat gcaaaacaca caaatttcac taaaaaaaaa acccttgtca 6840

ttcctccagg ctcgccagat caacatcacc aacctacagc cattctttga gagtgacata 6900

ttcaaagcca acaacttctc acatgacggc aagaggaagc tgattgtcca agcattctaa 6960

catgccccaa ggaattttta tattatgtat atagtgctga aactgagaat gtgtcagatg 7020

cccagtgatg gtccaagcca aaggaagtct gaagtctaaa aggagtacaa aagaatgtta 7080

aagaaagaaa ataccataac taagagaaga tggctctgag tgacagaaga tgagatgagc 7140

attctacata atttttcaag tgctgttata agtatttcaa aagtatgttg tagtgttgta 7200

aggctgttga aagtgttcta ggtaggaaac acttgttaaa tttttagtta caaaaaggat 7260

aattaattga tgatcttctg tgccttaaaa agtgttcttt ttttattaaa aatttatatt 7320

ac 7322

<210> 2

<211> 3138

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 2

agaaacgcta ccctcaacac actacaaaat gtcggaccag cccacctctc cctcggccgt 60

catgagctcc ccggagccca ccaccccgag ccgctccagc atgtcgggtc gcaggaggag 120

gaggtcgtcg aggggctcca acgtagaccc agtgacctcc tccccgggcc gtgacctccc 180

cgccttcgag gacgagagcg acctcatggg taacgatgtg ccggtcgagg aggaggacgg 240

ggaggagctc ttcggagata acatggagaa cgactaccga cacattcctg aactagatgt 300

ctatgaccag gacaatcttg atgactctga atactcgatg atgagtgaag gtgatcgcgc 360

agcagcagaa ggagcaatga gaaagcgtga tcgggatgag ggactaatca caggtcgcat 420

gagaagaggt cttctgtatg atgagagcga tgatgaggaa gatagaccag ccagaaaacg 480

gcgcatggca gaaagagccg cagaaggaga tgttgcagag gatgaggaga tgattgagtc 540

cattgagaat ctggaggaca tgaaaggcca cagtgtgagg gaatgggtgt ccatgcttgg 600

gcccagaact gaaatttaca acagattcaa gaacttcctg agaacctatg tcaacgacaa 660

gggcaacaac ctcttcaagg acaagatccg tcagatgtgc gaggagaaca agtcttcctt 720

tgaggtggat tacaacatca ttgtgtcaga ggagcaggtt ctcgcatact tccttcctga 780

ggctcctacc gagatgttag agatcatgga ctcggctgcc aaggatgtca cactctccat 840

gttcccacaa tacgagagaa tcacacgcga gatccacgtc agaatcacag accttcctct 900

cattgaagag cttcggtcac ttaggcaact ccacctgaat cagctcattc gtacttctgg 960

agtggttaca tcgaccaccg gtatccttcc ccagttatct gttgtcaagt atgactgcaa 1020

caagtgttcc tatgtccttg gcccatttgt ccagtctcag aattcagagg taaagccagg 1080

ctcctgtcct gagtgtcaga gcagaggacc tttctccatc aacatggaag agactgtata 1140

ccagaactac cagagaatca ccctccaaga atctcctggc aaggttgctg ctggccgctt 1200

gccacgttcc aaagatgtca ttcttctcgg tgacttgtgt gattcatgta agcctggaga 1260

tgaaactgag gtgactggtg tgtacacaaa taattatgat ggctccctca acacaaacca 1320

aggcttccct gtgttcgcga ctgttattat ggcaaatcac attgctaaga aggacaatgc 1380

aaatgctatc aaagctctca ctgatgaaga catcaaggcc atcgtatccc tgagcaaaga 1440

tgagcgcatt gctgagagga ttgtggcctc aattgctccc tccatctatg gccatgatga 1500

catcaagagg gcccttgcac tctccctctt cggtggcgag accaagaacc ccggtcagaa 1560

acacaaggtc cgtggtgaca tcaatgtcct ggtctgtggt gatcctggta cagccaagtc 1620

tcagttcctc aagtacacag agaagattgc tcctcgtgct gtcttcacca caggccaagg 1680

tgctagcgct gttggtttga cggcctatgt gcagcgttct ccagttacgc gagagtggac 1740

cctagaggct ggtgcccttg tcttggctga taagggaatg tgtctgattg atgagtttga 1800

caagatgaat gatgcagaca gaacaagtat ccacgaagcc atggaacagc agagcatttc 1860

tatctccaag gctggtattg tgacatctct tcaggctcgc tgcgctgtcc ttgcagctgc 1920

taaccctatc ggaggcagat atgatccatc catgaccttt gctgaaaatg ttgatctgtc 1980

agagcccatt ctctctcgtt ttgatgttct ctgtgttgtg cgagacactg ttgaccctgt 2040

acaagatgag cacctggctc gttttgttgt tggctctcac atccgccacc accctggctc 2100

caccgacact gatgtcgctt ctcaaatcac ggatgggcca gcaggaggtg gatcaaacct 2160

agccggagtg gagaagatcc ctcaggacct cctcaagaaa tacatcatct atggccgaga 2220

gaaggtccgt cccaagctcc accagatgga ccaggacaaa gtagccaaga tgtactctga 2280

gttgagaaga gagtcaatgg ccacaggaag tatccccatc acagtacgtc acattgagag 2340

catgatcaga atggctgagg ctcatgccag aatgcacctt cgtgaatatg tccatgaaga 2400

tgatgtgaac atggctatcc gcgtgatgct tgaatcattc atcgacacac agaagttctc 2460

tgttatgagg accatgaaaa agaacttttc acggtatttg gccttcaagc gagacaacaa 2520

cgaactcttg ttcttcttgt tgcgacagct ggtgcacgag caaaccacat acatgcgctc 2580

tcgctatgga cccgaccatg atgttgttca agtgtcagag aaggatctcc tggatcgggc 2640

tcgccagatc aacatcacca acctacagcc attctttgag agtgacatat tcaaagccaa 2700

caacttctca catgacggca agaggaagct gattgtccaa gcattctaac atgccccaag 2760

gaatttttat attatgtata tagtgctgaa actgagaatg tgtcagatgc ccagtgatgg 2820

tccaagccaa aggaagtctg aagtctaaaa ggagtacaaa agaatgttaa agaaagaaaa 2880

taccataact aagagaagat ggctctgagt gacagaagat gagatgagca ttctacataa 2940

tttttcaagt gctgttataa gtatttcaaa agtatgttgt agtgttgtaa ggctgttgaa 3000

agtgttctag gtaggaaaca cttgttaaat ttttagttac aaaaaggata attaattgat 3060

gatcttctgt gccttaaaaa gtgttctttt tttattaaaa atttatatta caaaaaaaaa 3120

aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3138

Claims (1)

1.一种检测凡纳滨对虾耐低温性能的方法，其特征在于，包括：提取待测凡纳滨对虾的基因组DNA，利用SNP分子标记的检测引物对进行扩增，并测序获得测序结果，基于测序结果确定SNP分子标记的基因型，再判断该待测凡纳滨对虾的耐低温性能；

所述的SNP分子标记的检测引物，如下任一检测引物对所示

(1)如SEQ ID NO.1所示序列的第1,925位置检测引物对

g.MCM2-1,925-F：5’-GTCTGAGTTATCGGTAGTATTGG-3’；

g.MCM2-1,925-R：5’-CATAGGAACACTTGTTGCAGTC-3’；

(2)如SEQ ID NO.1所示序列的第3,414位置检测引物对

g.MCM2-3,414-F：5’-CTGAGGTGACTGGTGTGTACAC-3’；

g.MCM2-3,414-R：5’-GAGTACCTGTGGTGAAGACAGC-3’；

(3)如SEQ ID NO.1所示序列的第3,776位置检测引物对

g.MCM2-3,776-F：5’-TGAGAGGATTGTGGCCTCAATT-3’；

g.MCM2-3,776-R：5’-CACCTCATACGAGGTCATATTGTC-3’；

(4)如SEQ ID NO.1所示序列的第6,679位置检测引物对

g.MCM2-6,679-F：5’-CTCTATGAGTTGACATTGGATGGG-3’；

g.MCM2-6,679-R：5’-CTCTTGCCGTCATGTGAGAAGTT-3’；

所述的基于测序结果确定SNP分子标记的基因型，再判断该待测凡纳滨对虾的耐低温性能是：如SEQ ID NO.1所示序列的第1,925位碱基位置的G/C基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于G/G基因型个体；如SEQ ID NO.1所示序列的第3,414、3,475和3,537位碱基完全连锁，其A/A基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于A/C基因型个体；如SEQ ID NO.1所示序列的第3,776位碱基位置的T/T基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于T/G基因型个体；如SEQ ID NO.1所示序列的第6,679位碱基位置的A/C基因型个体在低温压力条件下的平均存活时间显著的高于A/A基因型个体。

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