CN107012255B - 一种与凡纳滨对虾耐低盐性状相关的snp标记、扩增引物及其应用 - Google Patents

一种与凡纳滨对虾耐低盐性状相关的snp标记、扩增引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与凡纳滨对虾耐低盐性状相关的SNP标记、扩增引物及其应用。本发明以从NCBI中获得的凡纳滨对虾Na,K‑ATPaseα亚基的mRNA序列(GenBank：KF765670.1)为基础设计引物，分别以耐低盐和不耐低盐凡纳滨对虾的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，分别获得长度为533bp的PCR产物。对测序结果进行比对分析，在该段序列中共检测到11个SNP位点，通过对这些模板在每个SNP位点的基因型的关联分析，确定了1个与耐低盐相关的SNP标记。本发明建立了凡纳滨对虾耐低盐优良品种分子标记辅助选育的技术体系，为快速选育凡纳滨对虾耐低盐优良品种奠定基础。

Description

一种与凡纳滨对虾耐低盐性状相关的SNP标记、扩增引物及其 应用
技术领域：
本发明涉及水产生物技术领域，具体涉及一种与凡纳滨对虾耐低盐性状相关的SNP标记、扩增引物及其应用。
背景技术：
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是全世界产量最大的养殖对虾。近年来，凡纳滨对虾淡水养殖发展很快，养殖产业对凡纳滨对虾耐低盐优良品种的需求逐渐加大。因此，很多科研机构和对虾公司开始着手进行凡纳滨对虾耐低盐优良品种的选育工作。
在国际上，以分子标记为基础的分子标记辅助选育技术已成为当代水产育种的关键技术。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)即SNP，是指由基因组单核苷酸变异(包括碱基转换、颠换、单碱基插入或缺失等)所引起的DNA序列多态性，是最新的第三代DNA分子标记。因其具有数量巨大、分布广泛、遗传稳定、测定准确简便、能显示其他技术无法检测的隐藏多态性以及可能与基因功能相关的众多优点，在分子标记辅助育种中得到广泛应用。
Na,K-ATPase基因是甲壳动物重要的渗透压调节基因，研究表明Na,K-ATPase基因是一个与凡纳滨对虾盐度抗逆相关的功能基因。因此，本发明针对凡纳滨对虾Na,K-ATPaseα亚基开发与凡纳滨对虾耐低盐性状相关的SNP标记，以期用于凡纳滨对虾耐低盐优良品种的辅助选育，从而加快凡纳滨对虾耐低盐优良品种的选育进程。
发明内容：
本发明的目的是提供一种与凡纳滨对虾耐低盐性状相关的SNP标记、扩增引物及其应用。用于凡纳滨对虾耐低盐优良品种的辅助选育，从而加快凡纳滨对虾抗逆优良品种的选育进程。
为实现上述发明目的，本发明以耐低盐和不耐低盐凡纳滨对虾的基因组DNA为模板，通过PCR扩增和测序来检测这些模板在Na,K-ATPaseα亚基一段基因组序列所包含的每个 SNP位点的基因型，通过关联分析方法确定耐低盐相关的SNP标记，并提供SNP位点扩增引物，建立凡纳滨对虾耐低盐优良品种分子标记辅助选育的技术体系，为快速选育凡纳滨对虾耐低盐优良品种奠定基础。
本发明的第一个目的是提供一种与凡纳滨对虾耐低盐性状相关的SNP标记，所述的SNP 标记位于SEQ ID NO.2所示序列自5’端起第379位碱基处，碱基为C或T。SEQ ID NO.2序列在379bp处的Y代表C或T，斜体部分代表内含子序列。
本发明的第二个目的是提供一种与凡纳滨对虾耐低盐性状相关的SNP标记的扩增引物，包括以下引物：
Lv-F：5’-TGATGAGCACAAGGTCCCA-3’；
Lv-R：5’-GAGAAACCACCGAAGAGG-3’。
本发明的第三个目的是提供上述的与凡纳滨对虾耐低盐性状相关的SNP标记在凡纳滨对虾分子标记辅助育种中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种耐低盐凡纳滨对虾品种的选育方法，包括以下步骤：
a、提取待测凡纳滨对虾基因组DNA；
b、采用上述的扩增引物Lv-F和Lv-R对待测凡纳滨对虾基因组DNA进行PCR扩增；
c、对扩增产物进行测序，确定所述的SNP标记的基因型，选择TT基因型的个体作为后备亲本进行耐低盐凡纳滨对虾品种育种。
所述的PCR扩增，其反应体系优选为25μL，包括：不含Mg2+的10×PCR buffer 2.5μL、 25mM MgCl2 2.0μL，10mM dNTP 0.5μL、5U/μL Prime
Figure BDA0001302434040000031
HS DNA Polymerase 0.2μL、 10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、DNA模板12.5ng，其余由无菌水补足至25 μL。
所述的PCR扩增，其反应程序优选为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃再延伸10分钟。
本发明以从NCBI中获得的凡纳滨对虾Na,K-ATPaseα亚基的mRNA序列(GenBank：KF765670.1)为基础设计引物，分别以耐低盐和不耐低盐凡纳滨对虾的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，分别获得长度为533bp的PCR产物，其中包含1个长度为353bp的内含子。对测序结果进行比对分析，在该段序列中共检测到11个SNP位点，通过对这些模板在每个SNP位点的基因型的关联分析，确定了1个与耐低盐相关的SNP标记。本发明建立了凡纳滨对虾耐低盐优良品种分子标记辅助选育的技术体系，为快速选育凡纳滨对虾耐低盐优良品种奠定基础。
附图说明：
图1是Lv-HR08位点的基因型峰图。
具体实施方式：
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或者按照试剂盒说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。克隆测序和引物合成工作由上海生物工程有限公司完成。
1、耐低盐和不耐低盐凡纳滨对虾样本的收集
1.1淡水应激试验
将体长2厘米左右的凡纳滨对虾虾苗放入淡水中，记录不同时间虾苗的死亡数量及应激 10小时后的存活数量。结果见下表1：
表1淡水应激试验结果
试验虾苗数量(条) 426
应激1h死亡数量(条) 0
应激2h死亡数量(条) 186
应激4h死亡数量(条) 137
应激7h死亡数量(条) 31
应激10h死亡数量(条) 19
应激10h存活数量(条) 53
1.2耐低盐和不耐低盐凡纳滨对虾样本的收集
取应激10h后仍存活的凡纳滨对虾虾苗作为耐低盐样本，应激2h死亡的虾苗作为不耐低盐样本。
2.耐低盐SNP标记的开发
2.1耐低盐和不耐低盐凡纳滨对虾基因组DNA的提取
选取耐低盐和不耐低盐虾苗各48条，分别取肌肉组织，采用海洋动物组织基因组DNA 提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取凡纳滨对虾基因组DNA，操作步骤严格按照说明书进行。基因组DNA定量采用NanoDropTM2000分光光度计完成，质量采用琼脂糖电泳来检测。
2.2PCR引物设计
以从NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中获得的凡纳滨对虾Na,K-ATPaseα亚基的mRNA序列(GenBank：KF765670.1)为基础，设计引物扩增Na,K-ATPaseα亚基的一段基因组序列。引物设计的要求为：引物长度18-22bp，GC含量为40-60％，Tm值为50-62℃，上下游引物的Tm值之差不大于5，并尽量避免引物二聚体、发夹结构及错配等。引物序列如下：
Lv-F(468-486)：5’-TGATGAGCACAAGGTCCCA-3’；
Lv-R(647-630)：5’-GAGAAACCACCGAAGAGG-3’。
括号中的数字代表引物中的核苷酸在Na,K-ATPaseα亚基mRNA序列中的位置。
2.3PCR扩增和测序
从步骤2.1提取的凡纳滨对虾基因组DNA中随机选取一份作为模板，采用步骤2.2设计的引物Lv-F/Lv-R对该DNA进行PCR扩增，反应体系25μL，包括：10×PCR buffer(without Mg2+)2.5μL、MgCl2(25mM)2.0μL，dNTP(10mM)0.5μL、LA Taq酶(5U/μL)0.2μL、正向引物(10μM)0.5μL、反向引物(10μM)0.5μL、DNA模板(25ng/μL)0.5μL、无菌水18.3μL。反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2 分钟，共35个循环；72℃再延伸10分钟。PCR扩增产物经1％琼脂糖电泳检测，显示该引物对能稳定扩增出单一条带。对扩增产物进行克隆测序，结果显示扩增产物长度为533bp，除包含目的核苷酸序列外，还包一段长度为353bp的含内含子序列，该序列的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示(命名为SEQIDPGLv-NK，SEQ ID NO.1所示序列中的斜体部分代表内含子序列)。
2.4SNP位点的筛查及SNP位点基因型分析
以步骤2.1提取的耐低盐和不耐低盐凡纳滨对虾基因组DNA为模板，采用步骤2.2所述引物Lv-F/Lv-R进行PCR扩增。反应体系和反应程序与步骤2.3中所述基本一致，不同点在于：用于筛选SNP位点的PCR体系中以高保真PCR酶(Prime
Figure BDA0001302434040000062
HS DNA Polymerase)替代了LA Taq酶，72℃延伸由2分钟降为1分钟。PCR扩增产物先用2％琼脂糖电泳进行检测，然后采用3730XL测序仪进行测序。将所有扩增产物的测序峰图进行比对分析以筛查 SNP位点，共检测到11个SNP位点(见表2)。通过SPSS 16.0中的非参数检验方法(卡方检验，X2)对耐低盐和不耐低盐组中各个SNP位点的基因型频率进行差异检验，设置限制性的阈值P＝0.05。结果显示，上述SEQIDPGLv-NK序列379bp处的SNP位点的基因型在耐低盐和不耐低盐凡纳滨对虾中差异显著(P<0.05)，该SNP位点(位于SEQ ID NO.2所示序列自5’端起第379位碱基处，该SNP标记为凡纳滨对虾耐低盐标记，斜体部分代表内含子序列，SNP位点为加粗的混合碱基Y，Y代表T或C)具有CC、CT和TT(峰图见图1)三种基因型，其中TT基因型仅在耐低盐凡纳滨对虾中检测到(表2)，提示TT基因型为耐低盐优势基因型，可作为凡纳滨对虾耐低盐分子标记，用于凡纳滨对虾耐低盐优良品种的辅助选育。
表2SEQIDPGLv-NK序列中的SNP位点、SNP位点的基因型、频率及差异检验
Figure BDA0001302434040000061
Figure BDA0001302434040000071
注：第二列中的数字表示SNP位点在SEQIDPGLv-NK序列中的位置。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种与凡纳滨对虾耐低盐性状相关的SNP标记、扩增引物及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 533
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
<400> 1
tgatgagcac aaggtcccaa ttgaggaact ctttcaacgt ctcactgttaa cccagacac 60
agtaggttta cccgagttct ttgtagtatc cttggtatat tgcctaaatt aagagtattg 120
gtaagattta atccaatagc gacagggaag gaattttggg aaagtgggtt aaggagaagt 180
gtacattagc gtgcacagct ctgcgcattg ggtgattctc cagctatttt ttgtaattac 240
ttgttatgat ttaatctaaa atcacctgtc gctaataggt tagaatagat ctttaagagt 300
agatacacgc agataaccct caaaaataaa tcaaatgtaa ttcttacttg tgtactttaa 360
ttacaaggtg tttttctgtc ttgaacatga ctaaccactc ctataacctt gcagggtcta 420
tcacaaagtg aggctaagcg ccgtattgaa cgagatgggc cgaatgctct taccccaccc 480
aagcagactc cagaatgggt caagttctgc aaaaacctct tcggtggttt ctc 533
<210> 2
<211> 533
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
<400> 2
tgatgagcac aaggtcccaa ttgaggaact ctttcaacgt ctcactgttaa cccagacac 60
agtaggttta cccgagttct ttgtagtatc cttggtatat tgcctaaatt aagagtattg 120
gtaagattta atccaatagc gacagggaag gaattttggg aaagtgggtt aaggagaagt 180
gtacattagc gtgcacagct ctgcgcattg ggtgattctc cagctatttt ttgtaattac 240
ttgttatgat ttaatctaaa atcacctgtc gctaataggt tagaatagat ctttaagagt 300
agatacacgc agataaccct caaaaataaa tcaaatgtaa ttcttacttg tgtactttaa 360
ttacaaggtg tttttctgyc ttgaacatga ctaaccactc ctataacctt gcagggtcta 420
tcacaaagtg aggctaagcg ccgtattgaa cgagatgggc cgaatgctct taccccaccc 480
aagcagactc cagaatgggt caagttctgc aaaaacctct tcggtggttt ctc 533

Claims (5)

1.一种与凡纳滨对虾耐低盐性状相关的SNP标记的扩增引物，其特征在于，包括以下引物：
Lv-F：5’-TGATGAGCACAAGGTCCCA-3’；
Lv-R：5’-GAGAAACCACCGAAGAGG-3’。
2.权利要求1所述的与凡纳滨对虾耐低盐性状相关的SNP标记的扩增引物在凡纳滨对虾分子标记辅助育种中的应用。
3.一种耐低盐凡纳滨对虾品种的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、提取待测凡纳滨对虾基因组DNA；
b、采用权利要求1所述的扩增引物Lv-F和Lv-R对待测凡纳滨对虾基因组DNA进行PCR扩增；
c、对扩增产物进行测序，确定权利要求1所述的SNP标记的基因型，选择TT基因型的个体作为后备亲本进行耐低盐凡纳滨对虾品种育种。
4.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其反应体系为25μL，包括：不含Mg2+的10×PCR buffer 2.5μL、25mM MgCl2 2.0μL，10mM dNTP 0.5μL、5U/μL
Figure FDA0002436645030000011
HSDNA Polymerase 0.2μL、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、DNA模板12.5ng，其余由无菌水补足至25μL。
5.根据权利要求3或4所述的选育方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃再延伸10分钟。
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