CN112239779A - 一种卵形鲳鲹性别快速鉴定引物、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种卵形鲳鲹性别快速鉴定引物，所述引物为引物P18‑1，所述引物P18‑1包括正向引物P18‑1‑F和反向引物P18‑1‑R，所述正向引物P18‑1‑F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物P18‑1‑R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。还公开了包括上述引物的试剂盒以及利用上述引物快速鉴定卵形鲳鲹性别的方法，以及上述引物、试剂盒以及方法在鉴定卵形鲳鲹性别方面的应用。该引物，特异性好，灵敏度好，准确度高，鉴定成功率高达97％，相比于毛细管电泳鉴定方法，本申请方法不需复杂的设备，缩短了检测周期，降低了检测成本。

Description

一种卵形鲳鲹性别快速鉴定引物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于卵形鲳鲹技术领域，具体涉及一种卵形鲳鲹性别快速鉴定引物、试剂盒及其应用。

背景技术

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)，属鲈形目，鲹科，鲳鲹属，俗称金鲳、黄腊鲳、黄腊鲹。从2000年以后，国内开始大规模养殖，目前已经发展成为我国重要的海水养殖品种，是深远海大规模养殖的最佳品种，2016年国内的产量为已达到12万吨。虽然其养殖规模发展迅速，但是育种工作却相对滞后。卵形鲳鲹雌雄个体在早期胚胎发育和幼鱼阶段并不表现出形态学上的差异，从体型大小和生殖器官体表特征无法对其雌雄进行鉴定。而在育种的研究和生产中必须进行活体性别鉴定，现有的分子生物学方法利用毛细管电泳才能进行性别鉴定，成本高昂。

现有技术存在的问题是：

(1)在科研工作中，可以通过解剖等方式对卵形鲳鲹的生理性别进行鉴定，但解剖必然造成解剖个体的死亡，且该方式效率低下，无法实现大规模鉴定。

(2)目前的生物技术能够活体鉴别性别，但是采用的检测技术是毛细管电泳，对设备要求高、成本高昂、步骤繁琐。

而琼脂糖凝胶电泳具有对设备要求低、成本低和操作简单的优点，在当前技术条件下，如能开发出适合于琼脂糖电泳检测的性别分子标记及引物，则可解决上述缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种卵形鲳鲹性别快速鉴定引物和试剂盒，该引物是适合于琼脂糖电泳检测的性别分子标记引物，该引物特异性好，准确率和效率高。

本发明的目的还在于提供一种卵形鲳鲹性别快速鉴定方法，该方法对设备要求低、成本低，且操作简洁。

本发明的最后一个目的在于提供上述引物、试剂盒以及方法在鉴定卵形鲳鲹性别方面的应用。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种卵形鲳鲹性别快速鉴定引物，所述引物为引物P18-1，所述引物P18-1包括正向引物P18-1-F和反向引物P18-1-R，所述正向引物P18-1-F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物P18-1-R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

具体的，引物P18-1的碱基序列如下：

正向引物P18-1-F：5’-atgggacacagacctcttcct-3’；

反向引物P18-1-R：5’-cacccagcagcataaacaaat-3’。

本发明还提供了一种卵形鲳鲹性别快速鉴定试剂盒，该试剂盒包括上述卵形鲳鲹性别快速鉴定引物。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种卵形鲳鲹性别快速鉴定方法，包括以下步骤：

(1)合成上述引物；

(2)提取待测卵形鲳鲹的基因组DNA；

(3)采用步骤(1)中的引物，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，采用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物，电泳结果表明，雌性卵形鲳鲹扩增出两个条带，条带大小分别为1824bp和1689bp，雄性卵形鲳鲹扩增出一个条带，条带大小为1689bp。

在上述卵形鲳鲹性别快速鉴定方法中：

优选的，PCR扩增时采用的PCR反应体系为：20ng/μL DNA模板1.0μL，10×Taqbuffer(Mg²⁺ free)2.5μL，浓度2.5mMdNTPs2.0μL，浓度25mM MgCl₂ 1.5μL，10mM正向引物和反向引物(P18-1-F和P18-1-R)各0.5μL，5U/μL Taq0.1μL，ddH₂O补齐25.0μL。

优选的，PCR扩增时采用的PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性10sec，55℃退火40sec，72℃延伸60sec，循环35次，72℃延伸10min。

本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的引物或试剂盒或所述的方法在鉴定卵形鲳鲹性别方面的应用。

因此，本发明卵形鲳鲹性别快速鉴定引物的成功开发，为卵形鲳鲹活体性别鉴定的广泛应用提供了工具。可促进对卵形鲳鲹性别决定、性别控制等研究工作的开展和育种工作的开展。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明设计的卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物，特异性好，灵敏度好，准确度高，鉴定成功率高达97％；

(2)相比于当前毛细管电泳鉴定方法，该方法不需复杂的设备，缩短了检测周期，降低了检测成本，单个样本检测成本降低约15元；

(3)本发明方法可一次性快速批量准确鉴定卵形鲳鲹的性别；

(4)本发明引物、试剂盒和方法对于卵形鲳鲹性别决定、性别控制具有重要的科研价值和实际应用价值。

附图说明

图1为实施例1中利用P18-1引物对卵形鲳鲹个体进行琼脂糖凝胶电泳的电泳图，其中雌性具有两个条带，条带大小分别为1824bp和1689bp，雄性具有一个条带，条带大小为1689bp。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生化试剂原料，使用的实验仪器均为实验室常规仪器，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1

本实施例提供的卵形鲳鲹性别快速鉴定引物，该引物为引物P18-1，该引物P18-1包括正向引物P18-1-F和反向引物P18-1-R，其中正向引物P18-1-F的碱基序列如SEQ IDNO：1所示，反向引物P18-1-R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

具体的，引物P18-1的碱基序列如下：

正向引物P18-1-F：5’-ATGGGACACAGACCTCTTCCT-3’；

反向引物P18-1-R：5’-CACCCAGCAGCATAAACAAAT-3’。

收集卵形鲳鲹34个体，包括16个雌性和16个雄性，性别通过解剖鉴定。利用高体鰤性别决定区间序列(NCBI登录号AP018739.1)比对到卵形鲳鲹基因组参考序列，定位到一个区间。选取收集的雌雄个体各1个进行二代测序，检测定位到的区间内的结构变异，选取大于100bp的结构变异利用Primer3设计引物，通过琼脂糖凝胶电泳检测剩余32个个体的性别，筛选到一个性别特异的结构变异。电泳结果如图1所示，其中雌性具有两个条带，条带大小分别为1824bp和1689bp，雄性具有一个条带，条带大小为1689bp。该段序列如下：

AAATAGGGGATGGCAATTGATTTATTTGCTTCTCCTGTCTCCAGCGCACATTCATGCACTCAGACATGCTGAATATATGATAAACAACACAGACTGTGTCACTCACACAACACAAAATGTTCGTCTTGTAATGGGTGACTAATGCAGTAATTTTTTTTCCTATGCCTCCTTCATGCATGTTGCATTTGCTGTTGTCAAATCAGTGAATACTGAATTGCCCCTCAGTTCATGCTGGGCTGTTGTAACTTGAATATTTGGTTTGTTTGTGGAAAT

GCTTAGCAGCGGGCTTTGGAGGTGGATCTTACATATATGAGAAAGGCCATCATGGGGGTCTCCCTGACCTGCGCTCCCATGGAAGTGCTGTTTCGACAGCTTGTTCTAATTCCCCCGTCTCTCCAAACTCCTGTAGGACAAACAGGGAGGAGGAAGCACTGAAGCCCCACATCGCTACAATAAGAGCAGCCTCAGGGGCACAAGGAGGAAGAGGGTCAATGCAATCACAGTGGGGCTTGAGGCACAGGAGTGAGGGGGTCGCAAACAACGGAAATGGGTAGCCCACGCCCTCATATACTAGGGAATTTCTCTCCTTCACATGGGGTCCGCTGTTTTTGTGGTTTTACACAAACTGGCCTTCAGTCCCAGACTGTTTGAAGTTCTTCTGAAACCTAAGTCTTCGGTTAAGATCTCT

TTTCCCCAGAGCGTGCTGGGTTTACCCTCAACTTTAATGTTTCCATGTGGTCCCAGTGACAGTGTGTAGGAGTGATCTGGATAAGGCAGTGAGAGTTCATTTTCAAATAAGACGATAAAGAAAACTGCATAGTAATATTTAACAAAATTTATGGATCTGGTGTAATTCCTTTACAAAAAACCACATTTCACCCACTGCAATTAGGCACCACCACCCCTGTGGTTGCTGAAATCAAGGCTAAATGAATGAACGTGGGGCACTGTTTAAATAATGATCACATCTGACACTCAGGAAGGAGACATCAAAGGCAAGCAAAATGTGGCAAGTCCTTAGGAATCTTTTCGTTTACTTGAAGTCAGAAAGTCCCTTCTGTGACAGCACTGAAGGGGCCCAAGTGACTAATGCCTGGATTTCCTTTTCAGCACAGCCCTTGCAAAATACGTTTTCCATCATGTCATGTCTTGGACAAAGAAGTGTTGAGTGGATAGCTGAATTTAGTGAGTGATACTAAATGATGCAGGATAAAAAGTACCAGGCCTACAAGTATGACAGATATTATTTTTCCTTTTGGGAAATTTTATTGAAATGTGTGACTAAAAATTAAAATTTTGGTTTTAGCAAAGCCAAGTGCAGTTTTCAGATTTTAAATGATGTGATACTTAGAGAGGACAGGTCTGACCTTGACCGAGGTGAGTGAAGCCATTGAACAGGTGGTGGTTTCACTGTGACACACTCTGAATTGAAAGTCTTTTTTTTTTTTTTTGGATGTTTGGTCTTCTTTACACACATGTGGCTCATACAAGATCTTCACCACTGCTTTAACAAGGCCAAAATGTGTTTCATCTCTCTGTGCTGATGGGGGCTGCAGCCTGAACGCTGGCATGTTCAAAGCAACAAGAACTCTAAAGTGACAGGCATTCAGGGCATACAATCCTCCTGATGACAGAAACACATGCTCTGTGTGGGCTAGCAGTTGGCTTTATGGCCCTAAATGACTCAGCCTGGCACTCTGCACATTGTAATGTTTTCCACTTTTCAGTCATGTCCAGCTCACTACATCCTCCTATGACTATTGCTCCCATACCCTAATGAGACTTTATACTCCTATCCCTAGCAGACATGTTGCAGCCAGGCTACAATGTGCAGGTTTCAGTAGCTCTGATGCTTCAGTAAATGAGGTCTCGGTGCATCTCATCTGCTGGTCCACATGCAGATGTGGCAGGCTGTGTGT

AGGGGACTCTGTGTGGGAAAAGCGGCTCTCCATGGTTGCGATCGATGCGGGAGAGATAAGGGTGCTCTGTGGCCTTGGTTGAGCATGCATGAAAATAATTTTCTCGTGTGAAACCATTTTGTATTTTCTCCATCATATGAGCACCAGCAA。

其中方框表示正向引物，下划线表示反向引物(正向序列，反向互补后即P18-1-R的碱基序列，方括号表示检测的目标变异，具体如序列表SEQ ID NO：3所示。

为了验证该引物的准确性，本实施例通过以下实施例2中的验证试验来进行进一步的说明，具体如下。

实施例2

本实施例提供的卵形鲳鲹性别快速鉴定方法，包括以下步骤：采用PCR扩增在雌雄个体的基因组DNA中扩增出特异性片段，具体包括：设计实施例1中的引物，按照实施例1中方法提取待测卵形鲳鲹的基因组DNA，采用实施例1中的引物，以提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，采用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物，根据电泳结果鉴定雌雄个体。

本实施例的实施对象是卵形鲳鲹，取50个雌性和50个雄性，性别通过解剖鉴定，然后来验证该引物的可行性。

(1)DNA的提取

从卵形鲳鲹活体上剪取约1平方厘米鳍条(该过程对于卵形鲳鲹活体无实质性伤害，采样后卵形鲳鲹个体重新放回后经观察可健康生长，下同)，保存于95％酒精，采样后卵形鲳鲹个体重新放回。

利用市售DNA提取试剂盒或者常规酚仿法等提取组织DNA。

(2)卵形鲳鲹别特异性标记的扩增

以上述引物P18-1的正向引物P18-1-F(5’-ATGGGACACAGACCTCTTCCT-3’)和反向引物P18-1-R(5’-CACCCAGCAGCATAAACAAAT-3’)为扩增引物，以提取的卵形鲳鲹DNA为模板，用普通的Taq酶进行PCR扩增。

PCR的反应体系为：20ng/μL DNA模板1.0μL，10×Taq buffer(Mg²⁺ free)2.5μL，浓度2.5mMdNTPs2.0μL，浓度25mM MgCl₂ 1.5μL，10mM正向引物和反向引物各0.5μL，5U/μLTaq0.1μL，ddH₂O补齐25.0μL；

PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性10sec，55℃退火40sec，72℃延伸60sec，循环35次，72℃延伸10min。

(3)性别特异性片段检测

将步骤(2)中的扩增产物利用2％(质量百分含量)的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

利用P18-1-F引物对卵形鲳鲹个体进行扩增后利用琼脂糖凝胶电泳图进行检测的结果显示，其中雌性具有两个条带，条带大小分别为1824bp和1689bp，雄性具有一个条带，条带大小为1689bp。

具体如下表1所示，53例的电泳结果跟图1中的杂合型一致，是雌性，47例的电泳结果跟图1中的纯合型一致，是雄性，即结果中有3个生理雄性鉴定为遗传雌性，雌雄鉴定的准确率为97％。

表1性别特异性标记验证结果统计表

注：生理性别中1表示雄性，2表示雌性。

因此，进一步的，可以将上述引物制成试剂盒或生物制剂，用于卵形鲳鲹雌雄的鉴定中。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

<120> 一种卵形鲳鲹性别快速鉴定引物、试剂盒及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggacaca gacctcttcc t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacccagcag cataaacaaa t 21

<210> 3

<211> 2246

<212> DNA

<213> 卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)

<400> 3

aaatagggga tggcaattga tttatttgct tctcctgtct ccagcgcaca ttcatgcact 60

cagacatgct gaatatatga taaacaacac agactgtgtc actcacacaa cacaaaatgt 120

tcgtcttgta atgggtgact aatgcagtaa ttttttttcc tatgcctcct tcatgcatgt 180

tgcatttgct gttgtcaaat cagtgaatac tgaattgccc ctcagttcat gctgggctgt 240

tgtaacttga atatttggtt tgtttgtgga aatatgggac acagacctct tcctgcttag 300

cagcgggctt tggaggtgga tcttacatat atgagaaagg ccatcatggg ggtctccctg 360

acctgcgctc ccatggaagt gctgtttcga cagcttgttc taattccccc gtctctccaa 420

actcctgtag gacaaacagg gaggaggaag cactgaagcc ccacatcgct acaataagag 480

cagcctcagg ggcacaagga ggaagagggt caatgcaatc acagtggggc ttgaggcaca 540

ggagtgaggg ggtcgcaaac aacggaaatg ggtagcccac gccctcatat actagggaat 600

ttctctcctt cacatggggt ccgctgtttt tgtggtttta cacaaactgg ccttcagtcc 660

cagactgttt gaagttcttc tgaaacctaa gtcttcggtt aagatctctg aggggcaatt 720

cagtattcac tgatttgaca acagcaaatg caacatgcat gaaggaggca taggagacga 780

acattttgtg ttgtgtgagt gacacaatct gtgttgttta tcatatattc agcatgtctg 840

agtgtttccc cagagcgtgc tgggtttacc ctcaacttta atgtttccat gtggtcccag 900

tgacagtgtg taggagtgat ctggataagg cagtgagagt tcattttcaa ataagacgat 960

aaagaaaact gcatagtaat atttaacaaa atttatggat ctggtgtaat tcctttacaa 1020

aaaaccacat ttcacccact gcaattaggc accaccaccc ctgtggttgc tgaaatcaag 1080

gctaaatgaa tgaacgtggg gcactgttta aataatgatc acatctgaca ctcaggaagg 1140

agacatcaaa ggcaagcaaa atgtggcaag tccttaggaa tcttttcgtt tacttgaagt 1200

cagaaagtcc cttctgtgac agcactgaag gggcccaagt gactaatgcc tggatttcct 1260

tttcagcaca gcccttgcaa aatacgtttt ccatcatgtc atgtcttgga caaagaagtg 1320

ttgagtggat agctgaattt agtgagtgat actaaatgat gcaggataaa aagtaccagg 1380

cctacaagta tgacagatat tatttttcct tttgggaaat tttattgaaa tgtgtgacta 1440

aaaattaaaa ttttggtttt agcaaagcca agtgcagttt tcagatttta aatgatgtga 1500

tacttagaga ggacaggtct gaccttgacc gaggtgagtg aagccattga acaggtggtg 1560

gtttcactgt gacacactct gaattgaaag tctttttttt tttttttgga tgtttggtct 1620

tctttacaca catgtggctc atacaagatc ttcaccactg ctttaacaag gccaaaatgt 1680

gtttcatctc tctgtgctga tgggggctgc agcctgaacg ctggcatgtt caaagcaaca 1740

agaactctaa agtgacaggc attcagggca tacaatcctc ctgatgacag aaacacatgc 1800

tctgtgtggg ctagcagttg gctttatggc cctaaatgac tcagcctggc actctgcaca 1860

ttgtaatgtt ttccactttt cagtcatgtc cagctcacta catcctccta tgactattgc 1920

tcccataccc taatgagact ttatactcct atccctagca gacatgttgc agccaggcta 1980

caatgtgcag gtttcagtag ctctgatgct tcagtaaatg aggtctcggt gcatctcatc 2040

tgctggtcca catgcagatg tggcaggctg tgtgtatttg tttatgctgc tgggtgaggg 2100

gactctgtgt gggaaaagcg gctctccatg gttgcgatcg atgcgggaga gataagggtg 2160

ctctgtggcc ttggttgagc atgcatgaaa ataattttct cgtgtgaaac cattttgtat 2220

tttctccatc atatgagcac cagcaa 2246

Claims (4)

1.一种卵形鲳鲹性别快速鉴定引物，其特征是：所述引物为引物P18-1，所述引物P18-1包括正向引物P18-1-F和反向引物P18-1-R，所述正向引物P18-1-F的碱基序列如SEQ IDNO：1所示，所述反向引物P18-1-R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种卵形鲳鲹性别快速鉴定试剂盒，其特征是包括权利要求1中的引物。

3.一种卵形鲳鲹性别快速鉴定方法，其特征是包括以下步骤：

(1)合成权利要求1中的引物；

(2)提取待测卵形鲳鲹的基因组DNA；

(3)采用步骤(1)中的引物，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，采用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物，电泳结果表明，雌性卵形鲳鲹扩增出两个条带，条带大小分别为1824bp和1689bp，雄性卵形鲳鲹扩增出一个条带，条带大小为1689bp。

4.权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒以及权利要求3所述的方法在鉴定卵形鲳鲹性别方面的应用。

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