CN113444842B

CN113444842B - 一种用于狐狸逆转录病毒检测的特异引物组及pcr检测试剂盒的应用

Info

Publication number: CN113444842B
Application number: CN202110970292.1A
Authority: CN
Inventors: 王玉茂; 韩强; 于新友; 郭广君; 付石军; 庄金秋; 王建军; 沈志强
Original assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Current assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Priority date: 2021-08-23
Filing date: 2021-08-23
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2041-08-23
Also published as: CN113444842A

Abstract

本发明提供了一种用于狐狸逆转录病毒检测的特异引物组及PCR检测试剂盒的应用，引物组包括两对引物，其中：第一对引物：上游引物1如SEQ ID No.1‑F所示、下游引物1如SEQ ID No.1‑R所示；第二对引物：上游引物2如SEQ ID No.2‑F所示；下游引物2如SEQ ID No.2‑R所示。该特异性引物组在PCR检测中的应用，具体为将该特异性引物组在PCR检测试剂盒中进行应用。使用该特异性引物组，可提高PCR的敏感性和特异性，进而提高对狐狸逆转录病毒检测的准确性，将该特异性引物应用于PCR检测试剂盒中，可实现对该狐狸逆转录病毒进行快速、准确的检测，且样品处理过程和检测过程简单。

Description

一种用于狐狸逆转录病毒检测的特异引物组及PCR检测试剂盒的应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于狐狸逆转录病毒检测的特异引物组及PCR试剂盒的应用。

背景技术

狐狸养殖以生产狐皮为主要目标，而狐皮的质量好坏直接影响养狐的经济效益。近些年，在狐狸养殖中出现了由狐狸逆转录病毒引起了狐狸发育不良、肾脏肿大、发育停滞的疾病，该病无明显传染性，但是窝发特征显著，当狐狸出现该病的症状后，对狐狸的生长产生严重影响，最直观影响则是狐狸皮小、皮毛粗糙、稀少、狐狸死亡，导致狐皮减产或者绝产。

目前，针对狐狸的上述病症并没有具体的治疗和预防措施，使该病难以防控，在当前的状况下，为减少养殖损失，对患病狐狸及时发现、及时止损是最有效的降低损失的方式，因此，如何对狐狸是否患病进行准确检测具有重要意义。

对狐狸进行日常检测，需要检测方法易于操作和实施，降低对检测人员的技术要求，因此，提供一种易于操作、检测准确度高的方法对狐狸逆转录病毒进行日常检测具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种用于狐狸逆转录病毒检测的特异引物组及PCR检测试剂盒的应用；使用该特异性引物组，可提高PCR的敏感性和特异性，进而提高对狐狸逆转录病毒检测的准确性，将该特异性引物应用于PCR检测试剂盒中，可实现对该狐狸逆转录病毒进行快速、准确的检测，且样品处理过程和检测过程简单。

本发明的技术方案如下：

一种用于狐狸逆转录病毒检测的特异引物组，包括两对引物，其中：

第一对引物：

上游引物1如SEQ ID No.1-F所示：5’-CCACTCAGTTGCCTAATGA-3’；

下游引物1如SEQ ID No.1-R所示：5’-TCTTCTAACCGCTCTAACTT-3’；

第二对引物：

上游引物2如SEQ ID No.2-F所示：5’-CTCTCATTGACCTTCTCACA-3’；

下游引物2如SEQ ID No.2-R所示：5’-TGACTTCATTAGGCAACTGA-3’。

进一步，第一对引物PCR产物预期大小为340bp；第二对引物PCR产物预期大小为465bp。

进一步，以上引物组均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

将上述特异性引物组进行应用，具体为该特异性引物组在PCR检测中的应用。

进一步，将该特异性引物应用于PCR检测时，扩增过程如下：

(1)采集疑似患病狐狸样本(肾，肺，脑，脾，肝)，提取狐狸逆转录病毒RNA；

(2)将步骤(1)的狐狸逆转录病毒RNA合成cDNA；

(3)使用特异性引物进行扩增，形成PCR产物；然后对产物进行标识、测序。

进一步，将上述特异性引物组进行应用，具体为将该特异性引物组在PCR检测试剂盒中进行应用。

优选的，在将该特异性引物应用在PCR检测试剂盒中时，SEQ ID No.1-F和SEQ IDNo.1-R及SEQ ID No.2-F和SEQ ID No.2-R所示的引物的浓度均为10pmol/μL。

优选的，在PCR检测试剂盒中应用时，引物组中，SEQ ID No.1-F和SEQ ID No.1-R的摩尔比为1:1；SEQ ID No.2-F和SEQ ID No.2-R的摩尔比为1:1。

优选的，上述应用中，PCR检测试剂盒还包括核酸释放剂、阴性对照、阳性对照和酶混合液。

优选的，所述核酸释放剂为200mM Tris-HCl(pH 8.0)，500mM NaCl，5mM EDTA，1％十二烷基磺酸钠(SDS，W/V)，2％的十二烷基硫酸锂(LLS，W/V)和1％的甜菜碱(W/V)组成，阳性对照为构建pMD18T-GAG质粒，所述阴性对照为无核酸酶水。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供了一组引物，该引物具有特异性，可提高PCR的敏感性和特异性，进而提高对狐狸逆转录病毒检测的准确性。

2、将该特异性引物应用于PCR检测试剂盒中，可实现对该狐狸逆转录病毒进行快速、准确的检测，且样品处理过程和检测过程简单。

3、该引物组应用于PCR检测试剂盒中对狐狸逆转录病毒检测时，使PCR检测试剂盒具有准确度高的优点，且该检测对待测模板的取样点无特殊要求、对检测人员的水平要求低，因此，使用该引物的试剂盒适于广泛推广应用，能够满足对狐狸逆转录病毒检测的要求。

附图说明

图1为实施例4中SEQ ID No.1-F和SEQ ID No.1-R引物PCR扩增狐狸各组织逆转录病毒结果；

图2为实施例4中SEQ ID No.2-F和SEQ ID No.2-R引物PCR扩增狐狸各组织逆转录病毒结果；

图3为实施例5中SEQ ID No.1-F和SEQ ID No.1-R引物PCR扩增狐狸各组织逆转录病毒结果；

图4为实施例5中SEQ ID No.2-F和SEQ ID No.2-R引物PCR扩增狐狸各组织逆转录病毒结果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1用于对狐狸逆转录病毒检测的PCR方法的建立

本方法针对狐狸逆转录病毒基因序列进行筛选分析工作，选定gag基因(NC_007815.2)作为靶标基因，该基因源自异嗜性小鼠白血病病毒相关病毒(XMRV)。基因序列如SEQ ID No.3所示，如下：

ATGGGACAGACCGTAACCACTCCCTTGAGTCTGACCCTTGAACACTGGGGAGACGTCCAGCGCATTGCGTCCAACCAGTCCGTGGACGTCAAGAAGAGACGCTGGGTCACCTTCTGCTCTGCCGAGTGGCCAACTTTCGATGTGGGGTGGCCGCAAGATGGTACTTTTAATTTGGACATTATTTTACAGGTTAAATCTAAGGTGTTCTCTCCCGGTCCCCACGGACACCCGGATCAGGTCCCATACATTGTCACCTGGGAGGCTATTGCCTATGAACCCCCTCCGTGGGTCAAGCCTTTTGTCTCTCCCAAACTCCCCCTCTCTCCAACCGCTCCCATCCTCCCATCCGGTCCTTTGACCCAACCTCCGCCCCGATCTGCCCTTTACCCTGCTCTTACCCCCTCTATGAAACCCAGACCTTCTAAACCTCAGGTTCTCTCCGATAACGACGGACCTCTCATTGACCTTCTCACAGAAGACCCTCCGCCGTACGGAGAACAGGGACCGTCCTCCTCTGACGGGGATGGCGACAGAGAAGAGGCCACCTCCACTTCTGAGATTCCTGCCCCCTCTCCCATGGTGTCTCGCCTGCGGGGCAAAAGAGACCCCCCCGCGGCAGATTCCACCACCTCTCGGGCTCTCCCACTCCGTTTGGGGGGTAATGATCAGTGGCAGTACTGGCCGTTTTCCTCCTCTGATCTATATAACTGGAAAAATAATAACCCTTCCTTCTCTGAAGATCCAGGTAAATTGACTGCCTTAATCGAGTCTGTCCTCACCACCCACCAGCCTACCTGGGACGACTGTCAGCAGTTGTTGGGGACTCTGCTGACAGGAGAAGAAAAACAGCGGGTGCTCCTAGAGGCCAGAAAGGCAGTCCAGGGCGACGATGGACGCCCCACCCAGTTGCCTAATGAAGTCAATTCCGCCTTCCCCCTCGAACGTCCACTTCTGAAGGTAGGAACCACCTAG。

该基因具有高度的灵敏性，针对该基因序列进行引物的设计，所合成的两对引物如下：

第一对引物(引物对1)：

上游引物1如SEQ ID No.1-F所示：5’-CCACTCAGTTGCCTAATGA-3’；

下游引物1如SEQ ID No.1-R所示：5’-TCTTCTAACCGCTCTAACTT-3’；

第二对引物(引物对2)：

上游引物2如SEQ ID No.2-F所示：5’-CTCTCATTGACCTTCTCACA-3’；

下游引物2如SEQ ID No.2-R所示：5’-TGACTTCATTAGGCAACTGA-3’。

第一对引物PCR产物预期大小为340bp；第二对引物PCR产物预期大小为465bp。

引物设计软件为Primer 5.0；引物合成公司为上海捷瑞生物工程有限公司；

该特异性引物组在PCR检测中的应用，扩增过程如下：

(1)采用Total RNA Kit(Omega)提取疑似患病狐狸组织的逆转录病毒总RNA，使用反转录试剂盒获得cDNA；

(2)以cDNA为模版，采用上述两对引物，分别进行PCR扩增；

(3)扩增产物经凝胶电泳检测，将目的条带清晰且单一的PCR产物送测序公司双向测序，获得扩增产物的序列。

上述提及PCR扩增的反应体系组成为：2×Taq PCR预混液5μL(成分为0.1U/μL TaqDNA Polymerase(DNA聚合酶)、2×PCR反应缓冲液、3mM MgCl₂，0.4mM dNTPs)、每对引物1μL(上、下游引物各0.5μL)、cDNA模板0.5μL及用灭菌双蒸水加至10μL；

PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环后72℃延伸10min，4℃条件下保存；

其中，Total RNA Kit购自Omega公司；RNA反转录试剂盒购自TAKARA公司；2×TaqPCR预混液购自TAKARA公司；所述的凝胶电泳中使用1％琼脂糖。

实施例2用于对狐狸逆转录病毒PCR检测试剂盒

PCR检测试剂盒包括核酸释放剂、阴性对照、阳性对照、酶混合液和引物。

其中，引物为实施例1提供的特异性引物；核酸释放剂为所述核酸释放剂为200mMTris-HCl(pH 8.0)，500mM NaCl，5mM EDTA，1％十二烷基磺酸钠(SDS，W/V)，2％的十二烷基硫酸锂(LLS，W/V)和1％的甜菜碱(W/V)；酶混合液为0.1U/μL Taq DNA Polymerase(DNA聚合酶)、2×PCR反应缓冲液、3mM MgCl₂，0.4mM dNTPs；阳性对照为pMD18T-GAG质粒，所述阴性对照为无核酸酶水。

根据gag基因序列，设计扩增gag基因全长引物SEQ ID No.4-F和SEQ ID No.4-R。通过PCR获得gag基因，并将其连接至pMD18T载体，构建pMD18T-GAG质粒，将通过测序及双酶切鉴定正确的质粒作为阳性对照。

SEQ ID No.4-F：ATGGGACAGACCGTAACCA，SEQ ID No.4-R：CTAGGTGGTTCCTACCTTC。

实施例3样品制备

分别制备患病狐狸的肾部样本，肺部样本，脑部样本，肝部样本及脾部样本，样本的制作方法如下：

取生病狐狸肾，肺，脑，肝，脾，用研磨器研磨至粉碎，冻融三次，8000rpm离心5min，去沉淀，取上清备用。

进一步的，将肾部样本，肺部样本，脑部样本，肝部样本及脾部样本分别标记为A，B，C，D，E，待用。

其中，由患病狐狸肾部组织获得的狐狸逆转录病毒毒株命名为PreXMRV-20，分类命名为γ逆转录病毒；该狐狸逆转录病毒毒株于2021年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21898，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院，邮编：100101。

实施例4样本检测1

使用实施例1的PCR方法，对样本A，B，C，D，E进行检测，过程如下：

取实施例3中各样本上清液，使用Total RNA Kit提取狐狸逆转录病毒RNA，使用RNA反转录试剂盒获得cDNA；

以cDNA为模版，采用实施例1提供的两对引物，分别进行PCR扩增；

PCR体系按照表1进行PCR反应液的配制：

表1：PCR反应液配制

试剂	加样体积(μL)
		2×Taq PCR预混液	5
正向引物	0.5
		反向引物	0.5
cDNA模板	0.5
		ddH<sub>2</sub>O(无核酸酶水)	3.5
总计	10

加样完成后，在PCR仪中进行扩增，反应条件按照表2进行：

表2：PCR扩增条件

将扩增产物经凝胶电泳检测，PCR结果见图1、图2，结果显示，扩增条带单一且大小正确；

在图1中，M：DL2000 Marker；1为样品A，即肾部样本；2为样品B，即肺部样本；3为样品C，即脑部样本；4为样品D，即肝部样本；5为样品E，即脾部样本；6为阳性对照；7为阴性对照；8为空白对照；

在图2中，M：DL2000 Marker；1为样本A，即肾部样本；2为样本B，即肺部样本；3为样本C，即脑部样本；4为样本D，即肝部样本；5为样本E，即脾部样本；6为阳性对照；7为阴性对照；8为空白对照；

结合图1和图2可以看出，无论是使用实施例1提供的引物对1还是引物对2，都能够准确、有效的对目的基因进行扩增，并且引物敏感性高，特异性强，满足临床检验的需求及使用。

实施例5样本检测2

使用实施例2的试剂盒检测，对样本A，B，C，D，E进行检测，过程如下：

1)用灭菌ddH₂O(无核酸酶水)对各样本进行100倍稀释，再加入试剂盒中核酸释放剂，核酸释放剂/样本(V/V)＝1/10；混匀，65℃孵育30min，核酸即得到有效释放，获得核酸释放液；

2)以取得的核酸释放液为模版，采用上述两对引物，按照实施例4中PCR体系及程序分别进行PCR扩增；

3)扩增产物经凝胶电泳检测；

4)PCR结果如图3，图4，结果显示，扩增条带单一且大小正确；

在图3中，M：DL2000 Marker；1为样本A，即肾部样本；2为样本B，即肺部样本；3为样本C，即脑部样本；4为样本D，即肝部样本；5为样本E，即脾部样本；6为阳性对照；7为阴性对照；8为空白对照；

在图4中，M：DL2000 Marker；1为样本A，即肾部样本；2为样本B，即肺部样本；3为样本C，即脑部样本；4为样本D，即肝部样本；5为样本E，即脾部样本；6为阳性对照；7为阴性对照；8为空白对照。

通过实施例4和实施例5的检测结果可以看出，SEQ ID No.1-F和SEQ ID No.1-R引物PCR扩增产物大小均为340bp左右，SEQ ID No.2-F和SEQ ID No.2-R引物PCR扩增产物大小均为465bp左右，均与预期大小一致；对患病狐狸组织样本进行PCR检测，结果可以看出，本发明提供的引物对1和引物对2，能够准确、有效的对目的基因进行扩增，并且敏感性高，特异性强。两种方法相比较，实施例4中方法可获得纯化cDNA，方便保存且可长期作为模板使用，稳定性高；实施例5中方法一步操作，简单快捷，核酸裂解产物(DNA和RNA)可直接用于核酸检测，但不适合长期保存。在患病狐狸的肾部，肺部，肝部，脑部及脾部均可以检测到该狐狸逆转录病毒，说明该狐狸逆转录病毒存在于狐狸多个器官中，降低了对于取样的要求。

尽管通过参考优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院

<120> 一种用于狐狸逆转录病毒检测的特异引物组及PCR检测试剂盒的应用

<130> 2021

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ccactcagtt gcctaatga 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tcttctaacc gctctaactt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctctcattga ccttctcaca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tgacttcatt aggcaactga 20

<210> 5

<211> 972

<212> DNA

<213> 异嗜性小鼠白血病病毒相关病毒

<400> 5

atgggacaga ccgtaaccac tcccttgagt ctgacccttg aacactgggg agacgtccag 60

cgcattgcgt ccaaccagtc cgtggacgtc aagaagagac gctgggtcac cttctgctct 120

gccgagtggc caactttcga tgtggggtgg ccgcaagatg gtacttttaa tttggacatt 180

attttacagg ttaaatctaa ggtgttctct cccggtcccc acggacaccc ggatcaggtc 240

ccatacattg tcacctggga ggctattgcc tatgaacccc ctccgtgggt caagcctttt 300

gtctctccca aactccccct ctctccaacc gctcccatcc tcccatccgg tcctttgacc 360

caacctccgc cccgatctgc cctttaccct gctcttaccc cctctatgaa acccagacct 420

tctaaacctc aggttctctc cgataacgac ggacctctca ttgaccttct cacagaagac 480

cctccgccgt acggagaaca gggaccgtcc tcctctgacg gggatggcga cagagaagag 540

gccacctcca cttctgagat tcctgccccc tctcccatgg tgtctcgcct gcggggcaaa 600

agagaccccc ccgcggcaga ttccaccacc tctcgggctc tcccactccg tttggggggt 660

aatgatcagt ggcagtactg gccgttttcc tcctctgatc tatataactg gaaaaataat 720

aacccttcct tctctgaaga tccaggtaaa ttgactgcct taatcgagtc tgtcctcacc 780

acccaccagc ctacctggga cgactgtcag cagttgttgg ggactctgct gacaggagaa 840

gaaaaacagc gggtgctcct agaggccaga aaggcagtcc agggcgacga tggacgcccc 900

acccagttgc ctaatgaagt caattccgcc ttccccctcg aacgtccact tctgaaggta 960

ggaaccacct ag 972

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atgggacaga ccgtaacca 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ctaggtggtt cctaccttc 19

Claims

1.一种特异引物组在制备狐狸逆转录病毒PCR检测试剂盒中的应用，其特征在于，特异引物组包括两对引物，其中：

第一对引物：

上游引物如SEQ ID No.1所示：5’-CCACTCAGTTGCCTAATGA-3’；

下游引物如SEQ ID No.2所示：5’-TCTTCTAACCGCTCTAACTT-3’；

第二对引物：

上游引物如SEQ ID No.3所示：5’-CTCTCATTGACCTTCTCACA-3’；

下游引物如SEQ ID No.4所示：5’-TGACTTCATTAGGCAACTGA-3’；

狐狸逆转录病毒为狐狸逆转录病毒PreXMRV-20，分类命名为γ逆转录病毒；该狐狸逆转录病毒毒株于2021年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21898，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院，邮编：100101。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，在将所述特异性引物应用在PCR检测试剂盒制备中时，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2及SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物的浓度均为10 pmol/μL。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，在PCR检测试剂盒制备中应用时，引物组中，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的摩尔比为1:1；SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的摩尔比为1:1。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，PCR检测试剂盒还包括核酸释放剂、阴性对照、阳性对照和酶混合液。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，核酸释放剂为200 mM Tris-HCl，500 mMNaCl，5 mM EDTA，1%十二烷基磺酸钠，2%的十二烷基硫酸锂和1%的甜菜碱组成，阳性对照为构建pMD18T-GAG质粒，阴性对照为无核酸酶水。