CN116287391A - 用于检测烟草靶斑病的rpa引物、引物/探针组合及其应用 - Google Patents
用于检测烟草靶斑病的rpa引物、引物/探针组合及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测烟草靶斑病的RPA引物、引物/探针组合及其应用，属于植物病原真菌的检测领域。其中RPA引物由正向引物RPA‑F3、反向引物RPA‑R3构成，引物/探针组合由探针RPA‑P、正向引物RPA‑F3、用生物素标记的反向引物RPA‑R3组成。本发明还提供了RPA试剂盒、LFD‑RPA试剂盒及其在靶斑病快速检测中的运用，具有操作简便、快捷、不受检测现场限制的优点，并且灵敏度高、特异性好，对病菌DNA的检测灵敏度可达1.40×102copies/μL，LFD‑RPA检测体系的检测准确率高达95.83％，与其他近缘种病原菌均无交叉反应，可应用于烟草靶斑病的快速检测工作中。
Description
技术领域
本发明涉及植物病原真菌的检测领域，特别涉及一种用于快速检测烟草靶斑病的RPA引物、引物/探针组合及其应用。
背景技术
烟草靶斑病是由瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris(Frank)Donk)引起的、在烟草苗床期至大田成熟期均能侵染烟草叶片造成危害，其无性世代为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)，在大田成熟期，主要侵染叶片，病斑初期呈水渍状斑点，常有同心轮纹，容易与其他叶部病害如烟草赤星病等混淆，不易分辨。立枯丝核菌(R.solani)具有菌丝融合的现象，其中侵染烟草造成烟草靶斑病的主要是AG-3融合群。而靶斑病一旦流行便发展迅速，难以控制。因此，有必要开发出一种快速而又能够特异性检测烟草靶斑病的方法。
目前，靶斑病的主要检测方法有：qPCR、RT-PCR。这些方法对实验室的要求比较高，且耗时长、步骤繁琐、试验结果准确性的影响因素多。恒温核酸扩增技术的出现克服了上述缺点，是一种快速检测方式，反应时间段、操作简单，不受检测现场限制。恒温核酸扩增技术主要包括环介导等温扩增技术、滚环扩增技术、依赖解旋酶的恒温基因扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术等。现有技术中，发明专利CN112442548A虽然公开了环介导等温扩增技术在检测烟草靶斑病中的运用，但其说明书0023段公开的扩增温度需要保持60-66℃、94-96℃，扩增时间总共需要37-48min，说明运用环介导等温扩增技术对烟草靶斑病的检测条件还是比较苛刻，因此，开发出一种检测现场和检测时间不受限制、检测结果快速可视化、且特异性高的烟草靶斑病检测方法对烟草病害的防治具有重要意义。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明针对烟草靶斑病菌的ITS序列，设计并评估验证了用于检测烟草靶斑病的RPA引物和引物/探针组合。因此，所述RPA引物和引物/探针组合物对烟草靶斑病的ITS序列具有较高的特异性和敏感性，进而包含RPA引物的RPA试剂盒、包含引物/探针组合的LFD-RPA试剂盒能够实现烟草靶斑病的快速检测，具有灵敏度高、特异性好的优点。
上述RPA引物与常规PCR的引物不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度不低于45bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择增加了难度。而RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物设计软件和探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。本发明分别设计了三对引物，通过对引物和探针的组合进行扩增效果评价以及不断优化，最终筛选出特异性最好的一对引物。
为了实现上述目的，本发明首先提供了用于检测烟草靶斑病的RPA引物和引物/探针组合，RPA引物的核苷酸序列如下：
正向引物RPA-F3：5’-tgtaatataaagatgataagtcattgaaccc-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
反向引物RPA-R3：5’-ttcaaagattcgatgattcactgaattctg-3’(如SEQ ID NO.2所示)。
引物/探针组合是由探针RPA-P、正向引物RPA-F3和用生物素标记的反向引物RPA-R3组成；所述正向引物RPA-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物RPA-R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针RPA-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且具有下述任一修饰或其组合：
A1)所述探针RPA-P包含空碱基位，在所述空碱基位标记四氢呋喃，探针的5’端距四氢呋喃的位点至少间隔30个碱基，探针的3’端距四氢呋喃的位点至少间隔15个碱基；
A2)在所述探针RPA-P的5’端标记荧光基团；
A3)在所述探针RPA-P的3’端用胺基、磷酸基团或C3-spacer标记。
进一步地，所述探针RPA-P的5’端用FAM(羧基荧光激素)标记，并且距所述探针RPA-P的5’端第31位空碱基位用四氢呋喃标记以及在3’端用C3 Spacer标记。
本发明还提供了含有上述RPA引物的RPA试剂盒及其应用、含有上述引物/探针组合的LFD-RPA试剂盒及其应用。
上述RPA试剂盒包括上述RPA引物、含RPA冻干酶粉的反应管、RPA缓冲液、MgAc。其应用包括以下步骤：提取待检测DNA；以所述待检测DNA为模板，采用所述的RPA试剂盒进行RPA扩增反应，得到反应产物；将所述反应产物进行琼脂电泳检测，判定试验结果。
上述RPA缓冲液为Rehydration Buffer。
上述RPA试剂盒的50μL扩增反应体系为：29.5μL Rehydration Buffer、2.4μLRPA-F3(10μM)、2.4μL RPA-R3(10μM)、12.2μL ddH2O、1μL模板DNA(40ng/μL)、2.5μL MgAc(280nM)。
作为优选，上述RPA扩增反应的条件为：39℃孵育30min。
上述判定实验结果的方法为：当琼脂电泳检测结果为207bp的特异性条带，则检查样品为阳性。
上述LFD-RPA试剂盒包括上述引物/探针组合、含RPA冻干酶粉的反应管、LFD-RPA反应缓冲液、乙酸镁、分析缓冲液、侧流层析试纸条。其应用包括以下步骤：提取待检测DNA；以所述待检测DNA为模板，采用所述的LFD-RPA试剂盒进行LFD-RPA扩增反应，得到反应产物；将所述反应产物与分析缓冲液混合后使用侧流层析试纸条检测并观察，判定试验结果。
上述LFD-RPA反应缓冲液为缓冲液V；分析缓冲液为HybriDetect Assay Buffer；测流层析试纸条为HybriDetect侧流层析试纸条。
上述LFD-RPA试剂盒的50μL扩增反应体系为：25μL缓冲液V、2.1μLRPA-F3、2.1μL用生物素标记的RPA-R3、0.6μL RPA-P(引物和探针浓度均为10μM)、15.7μL ddH2O、2μL DNA模板、2.5μL乙酸镁。
作为优选，上述LFD-RPA扩增反应的条件为：37℃孵育15min。
进一步地，上述判定实验结果的方法为：当所述HybriDetect侧流层析试纸条上的C线(质控线)和T线(检测线)都出现条带，则检测样品为阳性；当所述HybriDetect侧流层析试纸条上的C线出现条带，T线未有条带，则检测样品为阴性。
上述两种试剂盒中的RPA冻干酶粉都包含噬菌体重组酶、辅助因子、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTPS。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
1、本发明提供的RPA试剂盒和LFD-RPA试剂盒具有灵敏度强、特异性高的优点，本发明反应最低检测的DNA浓度为1.40×102copies/μL，能够实现特异性检测烟草靶斑病的目的，且LFD-RPA技术让检测结果肉眼可见、快速可视化，对检测人员的专业要求低。
2、同时具有扩增条件不受温度、时间、检测现场限制的优点。(1)反应温度低，无需变性，不需要热循环仪，只需要在37-42℃下就可完成DNA的扩增过程，可在手心或腋窝中完成该反应；(2)反应速度快，本发明反应不需要很长的时间，只需要在15min内就可完成DNA的扩增过程；(3)操作简单，本发明反应不需要昂贵的仪器与设备，可在田间环境下对烟草靶斑病进行快速检测。
附图说明
图1为实验例2中的RPA检测结果图，图中M：DL 2000DNA marker；1、5、9分别是RPA-F1/R1、RPA-F2/R2与RPA-F3/R3对分离得到的病原菌(R.solani AG-3)的扩增；2、6、10分别是RPA-F1/R1、RPA-F2/R2与RPA-F3/R3对Colletotrichum fructicola的扩增；3、7、11分别是RPA-F1/R1、RPA-F2/R2与RPA-F3/R3对Alternaria alternata的扩增；4、8、12分别是RPA-F1/R1、RPA-F2/R2与RPA-F3/R3对Phoma.herbarum的扩增；
图2为实验例3中的RPA(A)与LFD-RPA检测(B)结果图，图中DL 2000DNA marker；1～19分别是CK、C.fructicola、C.siamense、C.karstii、C.kahawae、C.nymphaeae、A.alternata、Botrytis cinerea、P.herbarum、Didymella bellidis、Boeremia exigua、FSolani、F.oxysporum、F.verticillioides、F.trcinctum、R.solani AG1-1A、XFQJ2-4(R.solani AG-3，湖北省烟草科学研究院实验室分离获得)、XEHL3-5(R.solani AG-3，湖北省烟草科学研究院实验室分离获得)、R.solani AG-3PT；
图3为实验例4中建立的荧光定量PCR标准曲线图(A)与荧光定量PCR扩增R.solani质粒DNA溶解曲线图(B)；
图4为实验例4中的引物TqF1/TqR1的常规PCR扩增图(A)、LFD-RPA扩增图(B)与荧光定量PCR扩增图(C)，图中M：DL 5000DNA marker；1～6分别是1.40×100～1.40×105copies/μL浓度梯度的质粒DNA标准样品；
图5为实验例5中的RPA(A)与LFD-RPA检测(B)结果图，图中M：DL 2000DNA marker；其中1～24是阳性样品，25～32是阴性样品。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1RPA引物的设计
重组酶聚合酶扩增技术是恒温扩增技术，其引物设计区别于PCR与LAMP，需要一对30～35bp的长引物才能够在37～42℃的条件下进行对模板DNA的特异性扩增。根据R.solani ITS序列(HQ241274.1)设计RPA引物，发明人经过大量、重复试验验证后，最后获得了RPA引物的特异性核苷酸序列，如下所示：
正向引物RPA-F3：5’-tgtaatataaagatgataagtcattgaaccc-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
反向引物RPA-R3：5’-ttcaaagattcgatgattcactgaattctg-3’(如SEQ ID NO.2所示)。
实验例2RPA扩增和检测
本实施例使用了用于检测烟草靶斑病的RPA试剂盒，包括含有实验例1中RPA引物、含RPA冻干酶粉的反应管、RPA缓冲液、MgAc。该试剂盒应用步骤为：提取待检测DNA；以所述待检测DNA为模板，采用所述的RPA试剂盒进行RPA扩增反应，得到反应产物；将所述反应产物进行琼脂电泳检测，判定实验结果。具体步骤为：
1、病原菌的分离纯化
采用常规组织分离法进行病原菌的分离，将采集的烟草病害样本冲洗干净，在无菌条件下用吸水纸吸干表面多余水分后用灭菌剪刀剪取病健交界部位，再剪成5mm×5mm的小块，经75％乙醇消毒30s，1％次氯酸钠溶液消毒30s，无菌水冲洗3次(每次30s)后，置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA、含头孢霉素200μg/mL)平板上培养，待残余水分自然晾干后密封置于恒温培养箱中25℃培养72h，从病组织挑取边缘菌丝块置于新鲜PDA平板上纯化培养以获得单个菌株的纯培养，将获得的纯培养的菌株保存于PDA斜面4℃保存。
2、病原菌DNA的提取
使用十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyltrimethylammonium Bromide，CTAB)法进行提取待测真菌菌株基因组DNA，具体步骤为：1)收集PDA中培养72h的菌丝于2mL离心管中，加入3颗小钢珠，在样品快速研磨仪中打碎，加入650μL65℃预热的CTAB，颠倒混匀，65℃水浴30min，期间颠倒混匀2次。2)将水浴的混合物取出，加入350μL Tris饱和酚(Coolaber公司，Beijing)和350μL氯仿/异戊醇(体积比＝24:1)颠倒混匀，12000r/min离心15min。3)将上清液转移至新的2mL灭菌离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比＝24:1)颠倒混匀，12000r/min离心15min，重复此操作一次。4)将上述的上清液转移至新的1.5mL灭菌离心管中，加入2倍上清体积的预冷的无水乙醇，混匀后于-20℃沉淀1h以上，12000r/min离心10min回收沉淀。5)弃上清，沉淀用1mL 75％的冰乙醇颠倒漂洗，12000r/min离心10min回收沉淀。6)弃上清，沉淀在37℃温和干燥，50μL的无菌ddH2O溶解，使用紫外分光光度计测定病原菌DNA浓度，提取的病原菌DNA在-20℃保存备用。
3、RPA扩增
选择与烟草靶斑病病害症状相似以及同时分离得到的其他烟草病害的病原菌DNA进行专化性评价，本实验例选择了C.fructicola、A.alternata、P.herbarum、F.solani(湖北省烟草科学研究院分离纯化获得)进行RPA反应初步筛选RPA引物的专化性。
将上述病原菌DNA作为扩增的模板，利用实验例1中提供的引物RPA-F3/RPA-R3用RPA试剂盒进行扩增反应，并将实验过程中的其他两组引物设置为对照，引物名称为RPA-F1/RPA-R1(如SEQ ID NO.6-7所示)与RPA-F2/RPA-R2(如SEQ ID NO.8-9所示)，具体的核苷酸序列如表1所示。
表1本发明中设计的RPA引物
扩增反应体系为：29.5μL Rehydration Buffer、2.4μL Primer F、2.4μL PrimerR(引物浓度为10μM)、12.2μL ddH2O、1μL模板DNA(40ng/μL)。然后将预混液加入到含有冻干酶粉的
Basic反应管中，涡旋振荡后再加入2.5μL MgAc(280nM)激活反应，将反应管放入PCR仪中39℃孵育30min，得到扩增产物。
4、产物检测
将上述扩增产物使用DNA Pure-cycle Kit(Omega Bio-tek，USA)纯化后吸取4μL与1μL的10×Loading Buffer(Takara Bio，JP)混合后使用1％琼脂糖凝胶进行显色反应检测。上述扩增产物纯化的步骤为：
1)在回收管中加入500μL的CP Buffer，将扩增完成的基因片段全部加入回收管中混匀；2)将混合液加到网柱中，12000r/min离心1min；3)加入700μL的Wash Buffer，12000r/min离心1min，重复；4)空管12000r/min离心2min；5)加入30μL的EB Buffer，静置2min，12000r/min离心1min；6)将回收产物使用Nano Vue Plus紫外分光光度计(NanoDropTechnologies，USA)测定产物浓度，-20℃保存备用。
结果如图1所示，3对RPA引物均能够对模板DNA进行特异性扩增，但只有引物对RPA-F3/RPA-R3在对阴性对照进行扩增时无条带，说明引物RPA-F3/RPA-R3的特异性扩增效果最好。
实验例3LFD-RPA扩增和检测
本实施例使用了用于检测烟草靶斑病的LFD-RPA试剂盒，包括正向引物RPA-F3(如SEQ ID NO.1所示)、用生物素标记的反向引物RPA-R3(如SEQ ID NO.2所示)、探针RPA-P(如SEQ ID NO.3所示)、含RPA冻干酶粉的反应管、缓冲液V、乙酸镁、HybriDetect AssayBuffer、HybriDetect侧流层析试纸条。其中用生物素标记的反向引物RPA-R3具体为在反向引物的5’端用生物素标记，探针RPA-P的5’端用FAM标记、距5’端第31位空碱基位用四氢呋喃标记以及3’用C3 Spacer标记，探针RPA-P具体的核苷酸序列如下：
RPA-P：5’-FAM-gatgataagtcattgaacccttctgtctac/THF/caactcatataaact-C3Spacer。
本实验例使用上述LFD-RPA试剂盒进行LFD-RPA扩增反应，具体步骤为：
1、病原菌的分离纯化(详细步骤参见实验例1)
2、病原菌DNA的提取(详细步骤参见实验例1)
3、LFD-RPA扩增
选择与烟草靶斑病病害症状相似以及同时分离得到的其他烟草病害的病原菌DNA进行专化性评价，例如C.fructicola、C.siamense、C.karstii、C.kahawae、C.nymphaeae、A.alternata、B.cinerea、P.herbarum、D.bellidis、B.exigua、F Solani、F.oxysporum、F.verticillioides、F.trcinctum与R.solani AG1-1A、标准菌株R.solani AG-3PT遗传上相近、引起病状容易混淆，因此，本实验例选择了上述的病原菌DNA(除R.solani AG1-1A为沈阳农业大学赠送获得，其他菌株都为湖北省烟草科学研究院实验室分离纯化获得)，使用LFD-RPA试剂盒进行扩增，评价了该检测体系的专化性。
扩增反应体系为：25μL缓冲液V、2.1μL RPA-F3、2.1μL用生物素标记的RPA-R3、0.6μL RPA-P(引物和探针浓度均为10μM)、15.7μL ddH2O、2μL病原菌DNA模板。然后将预混液加入到提供的含有冻干酶粉的反应管中最后加入2.5μL的乙酸镁激活反应，将反应管放入PCR仪中37℃孵育15min，得到扩增产物。
4、产物检测
1)将上述扩增产物使用DNA Pure-cycle Kit(Omega Bio-tek，USA)纯化后吸取4μL与1μL的10×Loading Buffer(Takara Bio，JP)混合后使用1％琼脂糖凝胶进行显色反应检测，得到反应产物。
2)吸取5μL反应产物加入到100μL HybriDetect分析缓冲液中，室温下孵育2-3min，然后将侧流试纸条样品端浸入反应管中，在2-3min内观察质控线和检测线中显示可见的颜色。
检测结果如图2所示，从检测结果可知，RPA-F3/用生物素标记的RPA-R3与探针RPA-P只对烟草靶斑病菌R.solani AG-3融合群的检测结果有特异性条带，且C线和T线都出现条带，对其他病原菌样品不产生特异性条带，说明本发明建立的LFD-RPA检测系统对烟草靶斑病菌的检测具有良好的专化性。
实验例4LFD-RPA检测体系的灵敏度评价
1、常规PCR体系与质粒标准样品的制备
使用R.solani AG-3融合群的特异性引物TqF1/TqR1用于常规PCR与荧光定量PCR反应，其扩增长度为98bp。常规PCR扩增体系(总体系为25μL)：2×HeffTM PCR Master Mix(YEASEN，上海)12.5μL，TqF1(上游引物)1μL，TqR1(下游引物)1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃终延伸5min。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后使用DNA Pure Cycle Kit(Omega Bio-Tek，USA)回收，克隆至
-T1(全式金，北京)，转至大肠杆菌感受态DH5α(Takara，USA)细胞中，经氨苄青霉素抗性筛选后，获得阳性转化子并测序，转入LB液体培养基，于37℃，200r/min震荡培养12h后使用质粒小提试剂盒(天根生物，北京)提取过表达质粒DNA，使用NanoDropTMLite分光光度计(Thermo Scientific，USA)测定质粒DNA浓度为61.7ng/μL，质粒拷贝浓度(copies/μL)＝6.02×1023×质粒质量浓度(g/μL)/质粒分子质量MW(g/mol)，质粒分子质量MW(g/mol)＝质粒碱基数(bp)×650daltons/bp。式中质粒碱基数为4026bp(其中
-T1载体片段大小为3928bp，目的片段扩增长度为98bp)，计算得到质粒DNA拷贝数为1.40×1010copies/μL，经10倍梯度稀释后，制成1.40×10-1-1.40×1010copies/μL 12个浓度梯度的质粒标准品(Standard plasmid)，-20℃保存待用。
上述引物TqF1/TqR1的核苷酸序列如下：
TqF1：5’-aagagtttggttgtagctggtctattt-3’(如SEQ ID NO.4所示)
TqR1：5’-aattccccaactgtctcacaagtt-3’(如SEQ ID NO.5所示)
2、实时荧光定量PCR与标准曲线的制作
将稀释好的1.40×101-1.40×105copies/μL 5个浓度梯度的质粒DNA进行实时荧光定量PCR检测，扩增体系为：10μL的2×
Green qPCR SuperMix(全式金，北京)，10μM的上下游引物TqF1和TqR1各0.4μL，模板DNA 2μL，加入ddH2O补足到20μL。qPCR反应在CFX96 Real-Time PCR System(Bio-Rad，USA)中进行，反应程序为：初始阶段95℃15min，95℃反应15s，56℃反应30s，共扩增40个循环，在进行溶解曲线的检测中，从60℃到95℃每30s增加0.5℃。每个浓度处理3次，荧光定量PCR扩增完成后，根据Ct值(y)与其相对应的质粒DNA(copies)的对数(x)在Microsoft Office Excel 2016中绘制标准曲线并计算相关系数。
结果如3所示，该引物溶解曲线单一峰值，Tm值为80.5℃，表明该引物为特异性扩增(图3B)，根据Ct值(y)与其相对应的质粒DNA(copies)的对数(x)绘制标准曲线(图3A)，线性关系表达式为y＝-3.495x+37.836，相关系数R2＝0.9985，扩增效率E＝93.25％，符合高效率扩增条件，表明该标准曲线可以用于下一步中根据Ct值计算检测样品的DNA浓度。
3、LFD-RPA检测体系的灵敏度评价
以浓度为1.40×100-1.40×105copies/μL 6个浓度梯度的质粒标准样品为模板，使用RPA-F3/R3引物进行LFD-RPA反应灵敏度评价，反应结果如图4所示，LFD-RPA进行扩增的最低浓度是1.40×102copies/μL。
实验例5田间样品的RPA和LFD-RPA检测
1、田间样品的DNA提取
烟草靶斑病样本病原菌DNA的提取采用NaOH快速裂解法，具体步骤为：1)向每mg烟草叶片组织中加入10μL 0.5mol/L NaOH溶液；2)在研钵中将植物组织充分磨碎成糊后，转入1.5mL离心管中；3)12000rpm离心6min；4)取上清液5μL，加入495μL 0.1mol/L Tris-HCl(pH＝8.0)，混合均匀，得到含有烟草靶斑病菌基因组DNA的溶液。所有烟草病害样品均分为两份，一份进行DNA的快速提取，一份进行常规组织分离法进行病原菌的分离。
2、RPA、LFD-RPA扩增与产物检测
样本1～24能够分离得到烟草靶斑病病原菌，为阳性样本，25～32未分离得到该病原菌，为阴性样本。提取DNA进行RPA和LFD-RPA扩增与产物检测(具体步骤参见实验例2-3)。
结果如图5所示，与常规组织分离法结果进行比较，LFD-RPA体系检测结果中(图5B)24个阳性样本中有1个检测为阴性(样本9)，其他23个阳性样本均能够扩增出阳性条带，而阴性样本检测结果均为阴性，与常规组织分离法结果一致，说明该检测体系的检测准确率为95.83％，可应用于烟草靶斑病的快速检测工作中。
以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.用于检测烟草靶斑病的RPA引物，其特征在于，其正向引物RPA-F3、反向引物RPA-R3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
2.用于检测烟草靶斑病的引物/探针组合，其特征在于，由探针RPA-P、正向引物RPA-F3和用生物素标记的反向引物RPA-R3组成；所述正向引物RPA-F3的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述反向引物RPA-R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针RPA-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针RPA-P具有下述任一修饰或其组合：
A1)所述探针RPA-P包含空碱基位，在所述空碱基位标记四氢呋喃，探针的5’端距四氢呋喃的位点至少间隔30个碱基，探针的3’端距四氢呋喃的位点至少间隔15个碱基；
A2)在所述探针RPA-P的5’端标记荧光基团；
A3)在所述探针RPA-P的3’端用胺基、磷酸基团或C3-spacer标记。
3.根据权利要求2所述的引物/探针组合，其特征在于，所述探针RPA-P的5’端用FAM标记，并且距所述探针RPA-P的5’端第31位空碱基位用四氢呋喃标记以及在3’端用C3 Spacer标记。
4.用于检测烟草靶斑病的RPA试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的RPA引物、RPA酶、RPA反应缓冲液、MgAc。
5.权利要求4所述的RPA试剂盒的应用，其特性在于，包括以下步骤：提取待检测DNA；以所述待检测DNA为模板，采用所述的RPA试剂盒进行扩增反应，得到反应产物；将所述反应产物进行检测，判定试验结果。
6.根据权利要求5所述的RPA试剂盒的应用，其特性在于，检测和判定试验结果的方法为：进行琼脂电泳检测，当琼脂电泳检测结果为207bp的特异性条带，则检查样品为阳性。
7.用于检测烟草靶斑病的LFD-RPA试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物/探针组合、RPA酶、LFD-RPA反应缓冲液、乙酸镁、分析缓冲液、侧流层析试纸条。
8.权利要求7所述的LFD-RPA试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：提取待检测DNA；以所述待检测DNA为模板，采用所述的LFD-RPA试剂盒进行扩增反应，得到反应产物；将所述反应产物与LFD-RPA反应缓冲液混合后使用侧流层析试纸条检测并观察，判定试验结果。
9.根据权利要求8所述的LFD-RPA试剂盒的应用，其特征在于，判定实验结果的方法为：当所述侧流层析试纸条上的C线和T线都出现条带，则检测样品为阳性；当所述侧流层析试纸条上的C线出现条带，T线未有条带，则检测样品为阴性。
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|---|---|---|---|---|
| CN117165715A (zh) * | 2023-10-20 | 2023-12-05 | 中国人民解放军空军特色医学中心 | 引物对、皮肤癣菌rpa试纸条试剂盒及检测方法 |
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