CN109762938B

CN109762938B - 用于区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的引物组合及试剂盒

Info

Publication number: CN109762938B
Application number: CN201910105345.6A
Authority: CN
Inventors: 林强; 李宁求; 付小哲; 梁红茹; 刘礼辉; 牛银杰
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2019-02-01
Filing date: 2019-02-01
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2039-02-01
Also published as: CN109762938A

Abstract

本发明提供了用于区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的引物组，所述引物组包括用于反转录的引物和用于荧光定量扩增的引物，所述荧光定量扩增的引物序列如SEQ ID NO:4～9所示。本发明通过在鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA三种不同类型RNA的反转录引物的5’端和3’端分别加上标签序列，对三种不同类型的单链RNA进行反转录，然后用特异的标签序列作为荧光定量的正向引物对获得的cDNA进行扩增，可以区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA，并且具有操作简单、灵敏度高、快速等特点，同时还可以对三种单链RNA进行定量检测。

Description

用于区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的引物组合及试剂盒

技术领域

本发明属于水产病害微生物检测技术领域，具体涉及一种区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的引物组合及试剂盒。

背景技术

鳜鱼弹状病毒(SCRV)是危害鳜鱼养殖产业的重大病原之一，它是一种在自然界广泛分布的有囊膜的、单股负链RNA病毒，感染宿主广、种类多，能引起多种淡水和海水鱼类出现严重的出血性败血症。通过比对发现，鳜鱼弹状病毒与从乌鳢、加州鲈、笋壳鱼上分离到的弹状病毒都属于弹状病毒科，Perchrhabdovirus属。但是目前关于SCRV的研究还非常有限，SCRV的流行特征和增殖复制规律都尚不清楚。因此我们非常有必要建立一种快速、特异和灵敏度高的定量检测方法。

研究者建立了各种弹状病毒的PCR检测方法、Elisa检测方法等，但是这些方法不能定量。刘春等建立了HSHRV的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法灵敏度高，重复性好。但是弹状病毒是负链RNA病毒，在病毒的转录和复制过程中，存在三种不同类型的RNA(病毒基因组RNA，vRNA；互补链RNA，cRNA和信使RNA，mRNA)，只有vRNA才是SCRV病毒粒子的基因组RNA，其他2种都是转录和复制的中间过程。而普通的RT-qPCR检测方法把所有的RNA都检测出来了，并不能区分这几个类型的RNA。但是为了更详细地了解SCRV病毒基因组的转录和复制机制，需要准确的对病毒进行定量，因此，需要建立更加精准地针对病毒三种不同类型的RNA(vRNA，cRNA和mRNA)的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的引物组合以及检测方法。本发明通过在三种不同类型的RNA反转录引物的5’端和3’端分别加上特异性的标签序列，来特异性地反转三种RNA，然后利用特异的引物进行荧光定量区分不同类型的三种RNA。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的引物组，所述引物组包扩用于反转录的引物和用于荧光定量扩增的引物，所述荧光定量扩增的引物序列如SEQ ID NO:4～9所示。

优选地，所述的引物组合中用于反转录的引物，在所述每个引物的5’端和3’端分别加上标签序列；其中反转录引物的5’加上的标签序列区别vRNA，在3’加上的标签序列区别cRNA和mRNA。

优选地，所述的引物组合中用于vRNA反转录的引物序列如SEQID NO:1所示；用于cRNA反转录的引物序列如SEQID NO:2所示；用于mRNA的反转录引物序列如SEQID NO:3所示。

优选地，所述引物组合中用于荧光定量扩增的引物包括：用于vRNA荧光定量PCR的引物，其序列如SEQ ID NO：4～5所示；用于cRNA荧光定量PCR的引物，其序列如SEQ ID NO：6～7所示；用于mRNA荧光定量PCR的引物序列，其序列如SEQID NO:8～9所示。

本发明还提供一种区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的引的试剂盒，包含如上所述的引物组。

本发明的另一目的在于还提供一种区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的方法，采用以下步骤：首先用如权利要求2或3所述用于获得cDNA的特异性引物分步进行反转录，分别获得鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的cDNA；然后用如权利要求4所述对cDNA进行荧光定量扩增的引物进行荧光定量扩增，最后区分vRNA、cRNA和mRNA。

优选地，所述区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的方法中荧光定量扩增的反应体系为：

cDNA模板2μl

10μM正、反向引物各0.5μl

ROX(50×)0.5μl

2×PCR Master Mix 10μl

无菌去离子水补足至20μl。

优选地，所述区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的方法中，荧光定量扩增的反应体系的过程为：95℃预变性10s，然后经95℃，5s和60℃，30s，40个循环，于60℃采集荧光信号。

本发明的有益效果在于：本发明通过在鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA三种不同类型单链RNA的反转录引物的5’加上的标签序列用于区别vRNA，在3’加上的标签序列用于区别cRNA和mRNA，这些标签序列即不与病毒同源也不与宿主同源的标签序列，对三种不同类型的单链RNA进行反转录，然后用特异的标签序列作为荧光定量的正向引物对获得的cDNA进行扩增，该方法可以区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA三种不同类型单链RNA，并且具有操作简单、灵敏度高、快速等特点，同时还可以对三种单链RNA进行定量检测。

附图说明

图1为链特异性RT-qPCR方法的特异性分析结果示意图。

图2为本发明荧光定量PCR检测方法的特异性实验图(vRNA:扩增效率＝100％,R²＝0.9949；cRNA:扩增效率＝101％,R²＝0.9999；mRNA:扩增效率＝91％,R²＝0.9944)。

图3为感染鳜鱼弹状病毒的CPB细胞中vRNA,cRNA和mRNA的动力学曲线图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

1、引物的设计

根据GenBank中鳜弹状病毒基因序列(NC_003494)，应用Primer 5.0软件设计系列引物用于鳜弹状病毒的反转录和特异性定量检测引物，其序列如下：

vRNA反转录特异性引物(vRNAtag-SCRV)：

GGCCGTCATGGTGGCGAATCTGAATCTCCAAGAATGGAAAACC(SEQID NO：1)；

cRNA反转录特异性引物(cRNAtag-SCRV)：

GCTAGCTTCAGCTAGGCATCAAAGTTTTTTTCATATCCCATC(SEQID NO：2)；

mRNA反转录特异性引物(mRNAtag-SCRV)：

CCAGATCGTTCGAGTCGTTTTTTTTTTTTTTTCATATCCCATCACC(SEQID NO：3)

cDNA荧光定量扩增的引物

vRNA-F：GGCCGTCATGGTGGCGAAT(SEQID NO：4)

vRNA-R：GGATAAGTGGCCTGAGCTTC(SEQID NO：5)

cRNA-F：GCTAGCTTCAGCTAGGCATC(SEQID NO：6)

cRNA-R：AGCAATCCTCGAGTCAGAG(SEQID NO：7)

mRNA-F：CCAGATCGTTCGAGTCGT(SEQID NO：8)

mRNA-R：AGCAATCCTCGAGTCAGAG(SEQID NO：9)

2、总RNA提取

向细胞中加300μL裂解液RL(加入β-巯基乙醇)；随后向裂解液中加入590μLRNase-Free ddH₂O和10μL Proteinase K，混匀后56℃处理20min。12,000rpm离心5min，取上清。缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm离心60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60s，弃废液。向吸附柱CR3中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60s，弃废液。向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，12,000rpm离心60s，弃废液。12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3彻底晾干转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μLRNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液，-80℃保存备用。

3、阳性标准品的制备

用北京全式金公司的T7体外合成酶进行RNA的合成，以鳜鱼弹状病毒为模版分别用不同的引物进行PCR，并用PCR产物纯化试剂盒对其进行纯化，获得线性DNA。将1μg的PCR产物，4μL的Transcription Reaction Buffer，8μL的10mM NTP Mix，2μL的TranscriptionEnzyme Mix，加RNase-free water补充至20μL，充分混匀后37℃反应2h。加入1μL DNase I，37℃反应15min后，加入1μL 500mM EDTA(pH8.0)终止反应。然后立即用RNA纯化试剂盒进行纯化。用1％TAE琼脂糖凝胶进行电泳分析RNA完整性，随后用核酸测定仪测定其浓度。体外合成引物序列如下：

vRNA-T7-F：ACGAGAAAAAAAGAAACCAAT

vRNA-T7-R：TAATACGACTCACTATAGGGAAAGTTTTTTTCATATCCCATC

cRNA-T7-F：TAATACGACTCACTATAGGGACGAGAAAAAAAGAAACCAAT

cRNA-T7-R：AAAGTTTTTTTCATATCCCATC

mRNA-T7-F：TAATACGACTCACTATAGGGCGAGAAAAAAAGAAACCAAT

mRNA-T7-R：TTTTTTTTTTTTTTCATATCCCATCACC

4、反转录

根据方案，使用M-MLV逆转录酶(Takara，Japan)和链特异性引物逆转录RNA样品(2μL)。简而言之，将1μg RNA样品，1μL链特异性反转录引物(10μM)和3μL无RNase水混合并在70℃孵育10分钟。然后将混合物在冰上冷却2分钟。然后加入1μL M-MLV逆转录酶(200U/μL，Takara)，2μL5×M-MLV缓冲液，0.5μL Dntp mix(10mM)和0.5μL RNase抑制剂(40U/μL)加入无RNase水使最终体积为10μL。将混合物在42℃反应60分钟，然后在75℃反应15分钟以使逆转录酶变性。

本步骤反转录使用的特异性引物如下：

vRNA反转录特异性引物(vRNAtag-SCRV)：

GGCCGTCATGGTGGCGAATCTGAATCTCCAAGAATGGAAAACC(SEQID NO：1)

cRNA反转录特异性引物(cRNAtag-SCRV)：

GCTAGCTTCAGCTAGGCATCAAAGTTTTTTTCATATCCCATC(SEQIDNO：2)

mRNA反转录特异性引物(mRNAtag-SCRV)：

CCAGATCGTTCGAGTCGTTTTTTTTTTTTTTTCATATCCCATCACC(SEQID NO：3)

5、荧光定量PCR

反应体系为上述步骤所产生的cDNA模板2μL，10μM上、下游引物各0.5μL，2×PCRMaster Mix 10μL、无菌去离子水补足至20μL。反应体系为95℃预变性10s，然后经95℃，5s和60℃，30s，40个循环，于60℃采集荧光信号。

本步骤荧光定量PCR使用的特异性引物如下：

vRNA-F：GGCCGTCATGGTGGCGAAT(SEQID NO：4)

vRNA-R：GGATAAGTGGCCTGAGCTTC(SEQID NO：5)

cRNA-F：GCTAGCTTCAGCTAGGCATC(SEQID NO：6)

cRNA-R：AGCAATCCTCGAGTCAGAG(SEQID NO：7)

mRNA-F：CCAGATCGTTCGAGTCGT(SEQID NO：8)

mRNA-R：AGCAATCCTCGAGTCAGAG(SEQID NO：9)

6、特异性分析实验

为了建立可以区分vRNA，cRNA和mRNA的方法，使用有标签的引物进行cDNA反转录。然后在qPCR中使用与逆转录引物的'标签'部分相同的正向引物和与弹状病毒链RNA互补的反向引物。为了确定引物的特异性，在逆转录和荧光定量PCR过程中用三对病毒链特异性引物的交换进行检测。当使用特异性vRNA引物(vRNAtag-SCRV)时，检测到的vRNA水平比mRNA和cRNA高约30,000倍；类似地，当使用cRNA特异性引物(cRNAtag-SCRV)时，检测到cRNA比vRNA高约40,000倍，比mRNA高3,500倍。mRNA特异性引物(mRNAtag-SCRV)检测到mRNA的水平比vRNA高约70,000倍，比cRNA高3,500倍(如图1所示)。实验结果表明，该方法特异性好，能区分弹状病毒的vRNA，cRNA和mRNA。

7、SCRV-vRNA标准曲线的构建

将制备的vRNA，用核酸测定仪测定标准品的浓度，根据阿伏伽德罗常数换算出每μL RNA的拷贝数，计算公式为：质粒拷贝数＝(RNA质量/RNA分子量)×阿伏伽德罗常数；用双蒸水对标准品进行10×倍比稀释，采用优化好的体系进行荧光定量PCR反应，同时做3个平行样品，确保实验的准确性，建立RNA拷贝数与CT值对应关系的标准曲线，结果如图2所示。

实验结果显示，三种RNA标准曲线在1×10²copy/μL--1×10²copy/μL之间有较好的线性关系，如图2所示，R²值显示标准曲线具有强线性相关性(>0.99)。此外，扩增效率在91％和101％之间，上述结果表明，Ct值与拷贝数之间存在良好的线性相关性。具体结果如下表：

实施例2鳜鱼弹状病毒感染CPB细胞期间其不同种类RNA的定量分析

将CPB细胞在12孔平底培养板(10⁵个/孔)中培养过夜，并加入0.01MOI鳜鱼弹状病毒。使病毒在28℃下吸附1小时。随后用PBS洗涤细胞两次以除去病毒接种物。加入含有3％FBS的L15培养基，将细胞在28℃培养。分别在感染1、2、4、6、8、10、12和24小时后收集细胞，一次三个复孔。用试剂盒提取细胞中的总病毒RNA。首先用链特异性引物逆转录样品，然后用每种类型病毒RNA的标记引物对定量得到的cDNA产物。未感染的CPB细胞的总RNA用作阴性对照。使用标准曲线分析从RT-qPCR测定获得的Δt值，并且在SCRV感染的CPB细胞中产生vRNA，cRNA和mRNA的动力学曲线。为了在感染期间理解SCRV病毒复制位点，通过测量病毒感染细胞中三种类型SCRV病毒RNA的细胞内动力学来验证该RT-qPCR方法的效用。虽然结果表明vRNA，cRNA和mRNA的细胞内动力学不同(如图3所示)，但拷贝数趋势相似。在SCRV感染的最早阶段，vRNA增长非常缓慢；在最初的感染2小时中，vRNA拷贝数略有增加(从0.12拷贝/细胞到0.19拷贝/细胞)，而mRNA拷贝数从不可检测到增加到几乎与vRNA(0.16拷贝/细胞)相同的水平；在感染4小时内中几乎检测不到cRNA；从感染4小时到6小时，vRNA，mRNA和cRNA以指数速率累积，并且拷贝数增加了两个数量级(分别为625,172和510拷贝/细胞)，所有三种类型的病毒RNA的合成在感染12小时候达到峰值然后降低。这些结果表明，本发明已能成功区分和绝对量化鳜鱼弹状病毒vRNA，mRNA和cRNA。

以上所述实施方式仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 用于区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的引物组合及试剂盒

<130> 1.23

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggccgtcatg gtggcgaatc tgaatctcca agaatggaaa acc 43

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gctagcttca gctaggcatc aaagtttttt tcatatccca tc 42

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ccagatcgtt cgagtcgttt tttttttttt ttcatatccc atcacc 46

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ggccgtcatg gtggcgaat 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ggataagtgg cctgagcttc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gctagcttca gctaggcatc 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

agcaatcctc gagtcagag 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ccagatcgtt cgagtcgt 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

agcaatcctc gagtcagag 19

Claims

1.用于区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的引物组，其特征在于，所述引物组包括反转录引物和荧光定量扩增引物，所述荧光定量扩增引物的序列如SEQ ID NO:4～9所示；

反转录引物的序列如SEQ ID NO:1～3所示。

2.一种区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物组。

3.一种非疾病诊断目的区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的方法，其特征在于，采用以下步骤：首先用如权利要求1中所述如SEQ ID NO:1～3所示的特异性引物分步进行反转录，分别获得鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的cDNA；然后用如权利要求1中所述如SEQ IDNO:4～9所示的特异性引物进行荧光定量扩增的引物进行PCR，最后区分vRNA、cRNA和mRNA；

所述PCR的反应体系为：

cDNA模板2μl

10μM正、反向引物各0.5μl

50×ROX 0.5μl

2×PCR Master Mix 10μl

无菌去离子水补足至20μl；

所述PCR的反应程序为：95℃预变性10s，然后经95℃，5s和60℃，30s，40个循环，于60℃采集荧光信号。