CN111004869B - 用于h1n1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的荧光定量pcr引物和参考标准品 - Google Patents

用于h1n1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的荧光定量pcr引物和参考标准品 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的方法，属于流感病毒鉴别技术领域，其特征在于：包括针对H1N1亚型流感病毒4个遗传进化谱系鉴别引物的设计与筛选，荧光定量PCR鉴别质粒标准品的制备，以及荧光定量PCR方法的建立等步骤。在所建立的荧光定量PCR鉴别方法中，本发明利用4对鉴别引物，以不同拷贝数标准品的对数值为横坐标，以检测到的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，构建荧光定量PCR的标准曲线，同时检测待鉴定H1N1亚型流感病毒cDNA的Ct值是否处于标准曲线上，从而达到快速鉴别H1N1亚型流感病毒4个遗传进化谱系的目的，以此为H1N1亚型流感病毒的检验检疫、流行病学监测、优势流行谱系的筛查、疫苗种毒的选择等方面提供技术支撑。其简便快速、特异性强、敏感性高。

Description

用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的荧光定量PCR引 物和参考标准品
技术领域
本发明涉及用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的荧光定量PCR引物和参考标准品，属于流感病毒鉴别技术领域。
背景技术
基于核蛋白和基质蛋白的抗原性差异，目前已经发现甲（A）型、乙（B）型、丙（C）型和丁（D）型等4个血清型的流感病毒，其中以A型流感病毒的流行史最为悠久、波及范围最广、传播能力最强、宿主感染谱最宽、引发的公共卫生威胁最为严重。根据A型流感病毒表面两个纤突蛋白—血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）蛋白的抗原性差异，进一步将A型流感病毒分为不同的血清亚型，迄今已经发现了18种HA亚型和11种NA亚型。其中，H1N1亚型流感病毒在流感流行史上扮演了重要角色，其不仅可以导致人类的季节性和大流行性流感，而且也是引发哺乳动物流感和禽流感的重要病毒亚型。
A型流感病毒编码的HA基因既是病毒抗原性的决定性蛋白，也是划分病毒遗传进化谱系的主要依据。对于H1N1亚型流感病毒而言，其HA基因已经演化出4个不同的遗传进化谱系，分别是古典猪流感病毒谱系（包括人类大流行性流感病毒）、季节性人流感病毒谱系、禽流感病毒谱系和欧亚类禽猪流感病毒谱系。查明H1N1亚型流感病毒的遗传进化谱系，有利于我们判断病毒的来源，明确各谱系病毒在人群和各动物群体中的感染和流行状况，分析各个群体中流行的优势流行谱系，选择与流行谱系抗原性相匹配的疫苗，以及筛选疫苗种毒等。
目前流感病毒的鉴别方法主要包括血清学方法和分子生物学方法。由于A型流感病毒各血清亚型之间存在一定的交叉反应，因此血清学方法不是流感病毒血清亚型鉴别的首选方法。而分子生物学方法，如PCR技术已经广泛应用于临床呼吸道标本、粪便标本和组织脏器标本等样品中流感病毒的检测。在各种PCR方法中，荧光定量PCR方法是美国AppliedBiosystems公司于1996年推出的一种实验技术。该方法利用荧光染料或荧光标记的特异性核酸探针，可以对PCR反应中每一个循环扩增产物的荧光信号进行实时收集，从而实现对起始模板的定性和/或定量分析。由于荧光定量PCR方法具有操作简便、特异性强、敏感性高、准确快速等特点，已经成为流感病毒血清型和血清亚型鉴别的首选方法。
荧光定量PCR方法包括绝对定量和相对定量。其中，绝对荧光定量是应用标准曲线来确定标本的实际拷贝数。其优点在于，可以测定目的基因在样本中的绝对分子数量。构建标准曲线是绝对荧光定量PCR的关键步骤。常用于构建标准曲线的方法是先将目的基因片段克隆到载体中以构建标准质粒，然后测定所构建标准质粒的浓度以计算其拷贝数，再以系列10倍倍比稀释的不同拷贝数的质粒作为模板进行荧光定量PCR，测定不同拷贝数质粒标准品的Ct值。以不同拷贝数标准品的对数值为横坐标，以检测到的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，构建荧光定量PCR的标准曲线。待鉴定流感毒株的cDNA在进行荧光定量PCR后，根据其Ct值在标准曲线上出现的位置可以计算出样品的浓度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的荧光定量PCR引物和参考标准品，实现了对H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系进行鉴别的目的，是一种快速、特异、敏感的荧光定量PCR方法，用于鉴别H1N1亚型流感病毒的遗传进化谱系。
本发明的技术方案是这样实现的：用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的荧光定量PCR引物和参考标准品，其特征在于：
（1）H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别引物的设计
针对NCBI与GISAID网站中所注册的H1N1亚型流感病毒HA基因的核苷酸序列，利用MEGA7.0软件，采用最大似然法，运算1000次，制作遗传进化树，划分出H1N1亚型流感病毒的4个遗传进化谱系，即古典猪流感病毒谱系、季节性人流感病毒谱系、禽流感病毒谱系、欧亚类禽猪流感病毒谱系。针对某一遗传进化谱系，至少设计1对PCR鉴别引物。每条引物设计的原则是：引物所处区域分别位于某一遗传进化谱系HA基因核苷酸序列的相对保守区，且该区域的核苷酸序列与其他遗传进化谱系HA基因的核苷酸序列存在明显差异，同时保证绝大多数差异位点位于所设计引物的3’端，以降低非特异性PCR扩增出现的概率。最终筛选出可以用于遗传进化谱系鉴别，只具有谱系内特异性，而无谱系间交叉反应的4对PCR鉴别引物。各谱系鉴别引物的序列信息如附表1所示。
Figure 234489DEST_PATH_IMAGE001
（2）H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别荧光定量PCR方法标准品的构建
根据H1N1亚型流感病毒HA基因遗传进化树的分析结果，从4个遗传进化谱系中各选取一株病毒的HA全长基因序列，其GenBank注册号分别为：MK159413、V01088、CY077076、KM028031（序列信息见附表2），
Figure 748647DEST_PATH_IMAGE002
送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成，并与pEASY-T1 Simple载体连接。将古典猪流感病毒谱系、季节性人流感病毒谱系、禽流感病毒谱系、欧亚类禽猪流感病毒谱系等4个谱系HA基因的重组质粒分别命名为pEASY-T1-I、pEASY-T1-II、pEASY-T1-III、pEASY-T1-IV，作为荧光定量PCR的标准品。
（3）H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别荧光定量PCR方法的建立
①反应体系：在荧光定量PCR八联管中依次加入FastStart Universal SYBRGreen Master（ROX） 10μL，ddH2O 8.75μL，浓度为10μM的上/下游引物各0.5μL，待鉴定毒株的cDNA或5个不同拷贝数的标准品0.25μL，至终体积20μL。
②反应条件：将配制好的反应体系置于荧光定量PCR仪上进行反应。第一阶段，95℃，2min；第二阶段，95℃，15s；47℃，30s；40个循环。
③标准曲线构建：测定各遗传进化谱系所对应的标准品的质粒浓度，根据质粒浓度与拷贝数换算公式：拷贝数（copies/μL）=[质粒浓度（ng/μL）×6.02×1014]÷[660×（载体长度bp+目的片段长度bp）]，计算质粒的拷贝数。将质粒进行10倍倍比稀释，选择5个不同拷贝数（1010copies/μL、108copies/μL、106copies/μL、104copies/μL、102copies/μL）的标准品为模板，通过荧光定量PCR，以不同拷贝数标准品的对数值为横坐标，以检测到的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，构建荧光定量PCR的标准曲线。不同拷贝数标准品测得的Ct值呈现良好的线性关系，标准曲线相关系数R2≥0.90，且5个不同拷贝数质粒所对应的Ct值≤35。
④结果判定标准：
a. 阳性结果：当待鉴定毒株cDNA的Ct值≤35，Ct值位于4条标准曲线中的其中一条，且出现扩增曲线和峰型单一的熔解曲线，则可以判定该毒株属于扩增该毒株所用鉴别引物对应的遗传进化谱系；
b. 阴性结果：阴性结果检测不到Ct值，且无扩增曲线和熔解曲线生成。
本发明的积极效果是具有特异性强、敏感性高、检测时间短，不需要凝胶电泳和基因测序等实验内容，只需一台荧光定量PCR仪即可实现H1N1亚型流感病毒的谱系鉴别。
附图说明
图1. H1N1亚型流感病毒HA基因遗传进化树。
图2. H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别荧光定量PCR所用标准品凝胶电泳结果。
图3. 以标准品为模板，古典猪流感病毒谱系鉴定引物的特异性验证。
图4. 以标准品为模板，季节性人流感病毒谱系鉴定引物的特异性验证。
图5. 以标准品为模板，禽流感病毒谱系鉴定引物的特异性验证。
图6. 以标准品为模板，欧洲类禽猪流感病毒谱系鉴定引物的特异性验证。
图7. 古典猪流感病毒谱系鉴别引物所处HA基因核苷酸序列的区域。
图8. 季节性人流感病毒谱系鉴别引物所处HA基因核苷酸序列的区域。
图9. 禽流感病毒谱系鉴别引物所处HA基因核苷酸序列的区域。
图10. 欧亚类禽猪流感病毒谱系鉴别引物所处HA基因核苷酸序列的区域。
图11. 以标准品为模板，古典猪流感病毒谱系荧光定量PCR鉴定结果。
图12. 以标准品为模板，季节性人流感病毒谱系荧光定量鉴定PCR结果。
图13. 以标准品为模板，禽流感谱系病毒荧光定量鉴定PCR结果。
图14. 以标准品为模板，欧洲类禽猪流感病毒谱系荧光定量鉴定PCR结果。
图15. 古典猪流感病毒谱系荧光定量PCR方法的敏感性鉴定。
图16. 季节性人流感病毒谱系荧光定量PCR方法的敏感性鉴定。
图17. 季节性人流感病毒谱系荧光定量PCR方法的敏感性鉴定。
图18. 欧亚类禽猪流感病毒谱系荧光定量PCR方法的敏感性鉴定。
图19. H1N1亚型流感病毒实验室保存和临床分离株HA基因的遗传进化树。
图20. 以各谱系病毒cDNA为模板，古典猪流感病毒谱系鉴定引物谱系特异性普通PCR鉴定结果。
图21. 以各谱系病毒cDNA为模板，季节性人流感病毒谱系鉴定引物谱系特异性普通PCR鉴定结果。
图22. 以各谱系病毒cDNA为模板，禽流感病毒谱系鉴定引物谱系特异性普通PCR鉴定结果。
图23. 以各谱系病毒cDNA为模板，欧洲类禽猪流感病毒谱系鉴定引物谱系特异性普通PCR鉴定结果。
图24. 以各谱系病毒cDNA为模板，古典猪流感病毒谱系鉴定引物谱系特异性荧光定量PCR鉴定结果。
图25. 以各谱系病毒cDNA为模板，季节性人流感病毒谱系鉴定引物谱系特异性荧光定量PCR鉴定结果。
图26. 以各谱系病毒cDNA为模板，禽流感病毒谱系鉴定引物谱系特异性荧光定量PCR鉴定结果。
图27. 以各谱系病毒cDNA为模板，欧洲类禽猪流感病毒谱系鉴定引物谱系特异性荧光定量PCR鉴定结果。
图28. 以各谱系病毒cDNA为模板，古典猪流感病毒谱系鉴定引物亚型特异性荧光定量PCR鉴定结果。
图29. 以各谱系病毒cDNA为模板，季节性人流感病毒鉴定引物亚型特异性荧光定量PCR鉴定结果。
图30. 以各谱系病毒cDNA为模板，禽流感病毒谱系鉴定引物亚型特异性荧光定量PCR鉴定结果。
图31. 以各谱系病毒cDNA为模板，欧洲类禽猪流感病毒鉴定引物亚型特异性荧光定量PCR鉴定结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及的部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍说明如下：
生物材料：
待鉴定的A型流感病毒毒株，由本实验室保存或分离；
pEASY-T1 Simple载体，购自全式金生物技术（北京）有限公司。
实验试剂：
A型流感病毒反转录通用引物Uni12和HA基因扩增引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；
RNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司。
Reverse Transcriptase M-MLV，购自宝生物工程（大连）有限公司；
RNasin，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
2×Taq Master Mix（Dye），购自北京康为世纪生物科技有限公司；
FastStart Universal SYBR Green Master（ROX），购自上海罗氏制药有限公司；
Trans2K® DNA marker，购自全式金生物技术（北京）有限公司。
实验设备：
-80℃超低温冰箱，青岛Haier特种电器有限公司产品；
低温台式高速离心机，美国Thermo公司产品；
普通PCR仪、荧光定量PCR仪，美国ABI公司产品；
水平核酸电泳仪，北京市六一仪器厂产品；
紫外凝胶成像仪，美国Alpha Innotech Corporation公司产品。
还需说明的是，文本简要期间，下述实施例中未具体描述的操作，参考现有技术及相关产品说明书进行操作即可，不再赘述。
实施例1
本实施例仅就H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别引物的设计过程简要介绍如下：
利用MEGA7.0软件，针对NCBI与GISAID网站中所注册的H1N1亚型流感病毒HA基因的核苷酸序列，采用最大似然法，运算1000次，制作HA全长基因（1710bp）的遗传进化树。结果如图1所示，
H1N1亚型流感病毒已经演化出4个不同的遗传进化谱系，即古典猪流感病毒谱系、季节性人流感病毒谱系、禽流感病毒谱系、欧亚类禽猪流感病毒谱系。
针对H1N1亚型流感病毒4个不同的遗传进化谱系，各设计了至少1对PCR鉴别引物。每条引物设计的原则是：引物所处区域分别位于某一遗传进化谱系HA基因核苷酸序列的相对保守区，且该区域的核苷酸序列与其他遗传进化谱系HA基因的核苷酸序列存在明显差异，同时保证绝大多数差异位点位于所设计引物的3’端，以降低非特异性PCR扩增出现的概率。
实施例2
本实施例仅就H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别荧光定量PCR方法中所使用的质粒标准品的构建过程简要介绍如下：
根据H1N1亚型流感病毒HA基因遗传进化树的分析结果，从4个遗传进化谱系中各选取一株病毒的HA全长基因序列，其GenBank注册号分别为：MK159413、V01088、CY077076、KM028031（序列信息见附表2），
Figure 612698DEST_PATH_IMAGE002
送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成，并与pEASY-T1 Simple载体连接。将4个谱系HA基因的重组质粒分别命名为pEASY-T1-I、pEASY-T1-II、pEASY-T1-III、pEASY-T1-IV，作为荧光定量PCR的标准品。所合成的4个谱系的重组质粒的凝胶电泳结果如图2所示，泳道1~4分别为古典猪流感病毒谱系（pEASY-T1-I）、季节性人流感病毒谱系（pEASY-T1-II）、禽流感病毒谱系（pEASY-T1-III）、欧亚类禽猪流感病毒谱系（pEASY-T1-IV）。
实施例3
在实施例1和实施例2的基础上，本实施例以所构建的质粒标准品为模板，主要介绍H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别PCR反应条件的优化与引物的筛选。
（1）以标准品为模板，H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别普通PCR反应条件的优化与引物的筛选
①普通PCR反应反应体系：在普通PCR反应管中依次加入2×Taq Master Mix（Dye）10μL，随后依次加入不同体积的ddH2O、浓度为10μM的上/下游引物、拷贝数为1010copies/μL的标准品，至终体积20μL。
其中，1010copies/μL的标准品的计算依据是：测定各遗传进化谱系所对应的标准品的质粒浓度，根据质粒浓度与拷贝数换算公式：拷贝数（copies/μL）=[质粒浓度（ng/μL）×6.02×1014]÷[660×（载体长度bp+目的片段长度bp）]，计算质粒的拷贝数。
②普通PCR反应反应条件：将配制好的反应体系置于普通PCR仪内进行反应。第一阶段，95℃，2min；第二阶段，不同Tm值，30s，共30个循环；第三阶段，72℃，2min。
③普通PCR反应体系与反应条件的确立：将PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，确定最终的PCR反应体系与反应条件。由图3~6的凝胶电泳结果显示，各谱系HA基因的扩增条带单一，无非特异性条带和引物二聚体出现，说明所优化的PCR反应体系和反应条件较好。最终优化的普通PCR反应体系和反应条件如下：
a. 反应体系：2×Taq Master Mix（Dye） 10μL，ddH2O 8.75μL，浓度为10μM的上/下游引物各0.5μL，拷贝数为1010copies/μL的标准品0.25μL，至终体积20μL。
b. 反应条件：将配制好的反应体系置于普通PCR仪内进行反应。第一阶段，95℃，2min；第二阶段，47℃，30s，共30个循环；第三阶段，72℃，2min。
④谱系鉴别引物的特异性鉴定：图3~6的凝胶电泳结果进一步显示，所设计的4个谱系的鉴别引物无谱系间的交叉反应，具有较好的谱系内特异性。这4对鉴别引物的序列信息如表1所示，
Figure 643714DEST_PATH_IMAGE003
它们处于HA基因核苷酸序列中的起始位置如图7~10所示的标注区域。
（2）以标准品为模板，H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别荧光定量PCR反应条件的优化与引物的特异性验证
根据实施例3（1）中普通PCR反应条件的优化结果，对鉴别荧光定量PCR的反应条件进行优化，同时对已经经过普通PCR验证的4对引物的特异性再次通过荧光定量PCR进行验证，具体步骤如下：
①荧光定量PCR反应体系：在荧光定量PCR八联管中依次加入FastStartUniversal SYBR Green Master（ROX） 10μL，ddH2O 8.75μL，浓度为10μM的上/下游引物各0.5μL，5个不同拷贝数的标准品0.25μL，至终体积20μL。
②荧光定量PCR反应条件：将配制好的反应体系置于荧光定量PCR仪上进行反应。第一阶段，95℃，2min；第二阶段，95℃，15s；Tm，30s；40个循环。
③荧光定量PCR标准曲线构建：测定各遗传进化谱系所对应的标准品的质粒浓度，根据质粒浓度与拷贝数换算公式：拷贝数（copies/μL）=[质粒浓度（ng/μL）×6.02×1014]÷[660×（载体长度bp+目的片段长度bp）]，计算质粒的拷贝数。将质粒进行10倍倍比稀释，选择5个不同拷贝数的标准品为模板，通过荧光定量PCR，以不同拷贝数标准品的对数值为横坐标，以检测到的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，构建荧光定量PCR的标准曲线。不同拷贝数标准品测得的Ct值呈现良好的线性关系，标准曲线相关系数R2≥0.90，且5个不同拷贝数质粒所对应的Ct值≤35。
④荧光定量PCR反应条件的确立：由图11~14的鉴定结果可知，本实施例中的荧光定量PCR的反应体系和反应条件较好，具体体现在：选取的1010copies/μL、108copies/μL、106copies/μL、104copies/μL、102copies/μL等不同拷贝数标准品测得的Ct值呈现良好的线性关系，标准曲线相关系数R2≥0.94，且5个不同拷贝数质粒所对应的Ct值≤35。此外，各谱系的熔解曲线峰型单一，无非特异性杂峰。
最终优化的荧光定量PCR反应体系和反应条件如下：
a. 反应体系：在荧光定量PCR八联管中依次加入FastStart Universal SYBRGreen Master（ROX） 10μL，ddH2O 8.75μL，浓度为10μM的上/下游引物各0.5μL，5个不同拷贝数的标准品（1010copies/μL、108copies/μL、106copies/μL、104copies/μL、102copies/μL）0.25μL，至终体积20μL。
b. 反应条件：将配制好的反应体系置于荧光定量PCR仪上进行反应。第一阶段，95℃，2min；第二阶段，95℃，15s；47℃，30s；40个循环。
⑤谱系鉴别引物的特异性鉴定：如图11~14所示，利用各谱系的鉴别引物所得到的Ct值均位于各自的标准曲线上。由此也可以进一步证实，所筛选出的4对鉴别引物具有较好的谱系特异性，可以用于荧光定量PCR以鉴别H1N1亚型流感病毒的遗传进化谱系。
⑥荧光定量PCR结果判定标准：
a. 阳性结果：当待鉴定毒株cDNA的Ct值≤35，Ct值位于4条标准曲线中的其中一条，且出现扩增曲线和峰型单一的熔解曲线，则可以判定该毒株属于扩增该毒株所用鉴别引物对应的遗传进化谱系；
b. 阴性结果：阴性结果检测不到Ct值，且无扩增曲线和熔解曲线生成。
实施例4
在实施例3（2）的基础上，本实施例仅就H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别荧光定量PCR的敏感性验证过程简要介绍如下：
测定实施例2中各遗传进化谱系所对应的标准品的质粒浓度，根据质粒浓度与拷贝数换算公式：拷贝数（copies/μL）=[质粒浓度（ng/μL）×6.02×1014]÷[660×（载体长度bp+目的片段长度bp）]，计算质粒的拷贝数。将质粒进行10倍倍比稀释，依次稀释为1010copies/μL、109copies/μL、108copies/μL、107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL。利用H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系的鉴别引物，以不同浓度拷贝数的质粒作为模板进行荧光定量PCR，验证该方法的敏感性，荧光定量PCR的反应体系与反应条件同实施例3（2）。结果如图15~18所示，当质粒拷贝数为1.0×102copies/μL时，仍有扩增曲线生成，表明所建立的荧光定量PCR方法具有较好的敏感性。
实施例5
本实施例主要对A型流感病毒cDNA的制备和亚型鉴定过程简要介绍如下：
（1）A型流感病毒cDNA的制备
按照RNA提取试剂盒说明书提取待鉴定的A型流感病毒的RNA，然后通过反转录获取其cDNA。反转录通用引物为Uni12：5’-AgCAAAAgCAgg-3’。使用时，将Uni12稀释至工作浓度为10μM。RNA反转录的反应体系和反应条件如下：
①反应体系：在普通PCR反应管中依次加入5×M-MLV Buffer 4µL，ddH2O 8µL，Unit12（10μM） 2µL，dNTPs（各2.5mM） 2µL，Rnasin（40U/µL） 1µL，M-MLV（5U/µL） 1µL，vRNA2µL，至终体积20μL。
②反应条件：将配制好的反应体系置于普通PCR仪内进行反应。37℃ 1h；94℃5min灭活反转录酶。将反转录后的cDNA产物作5×稀释，作为PCR反应的模板。
（2）A型流感病毒的亚型鉴定
根据A型流感病毒HA基因5’端和3’端的保守区，设计并合成HA基因的全长扩增引物，引物序列如附表3所示。
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HA基因扩增的反应体系和反应条件如下：
①反应体系：在普通PCR反应管中依次加入2×Taq Master Mix（Dye） 10μL，ddH2O8.75μL，浓度为10μM的上/下游引物各0.5μL，待鉴定毒株的cDNA 0.25μL，至终体积20μL。
②反应条件：将配制好的反应体系置于普通PCR仪内进行反应。第一阶段，95℃，2min；第二阶段，61℃，30s，共30个循环；第三阶段，72℃，8min。
③基因测序：取经DNA凝胶回收试剂盒回收的PCR产物4.5μL，与0.5μL的pEASY-T1Simple载体混匀后，25℃连接15min。将连接产物与100μL的DH5α感受态细胞混合后，冰浴30min，随后42℃热激30s，冰浴2min，加入800μL无抗LB液体培养基，37℃，200rpm摇菌1h。3000rpm离心5min，弃去750μL上清，剩余上清与菌体沉淀混匀。取20μL菌液涂布于LB固体培养基上，37℃静置培养过夜后挑取单菌落，对经菌落PCR鉴定为阳性的重组菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因测序。
④亚型鉴定：将HA基因的测序结果在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站中进行序列比对，确定待鉴定毒株的血清亚型。
实施例6
本实施例仅就H1N1亚型流感病毒分离株所属遗传进化谱系的鉴定过程简要介绍如下：
在实施例2和实施例5（2）的基础上，随机选择在NCBI与GISAID网站中注册的部分H1N1亚型流感病毒HA基因的核苷酸序列，以及H1N1亚型流感病毒实验室保存或分离毒株的HA基因序列，利用MEGA7.0软件，采用最大似然法，运算1000次，制作HA全长基因（1710bp）的遗传进化树。如图19所示，本实验室保存或分离的H1N1亚型流感毒株JL10、JL16、JS15、FJ18的HA基因分别隶属于古典猪流感病毒谱系、季节性人流感病毒谱系、禽流感病毒谱系、欧亚类禽猪流感病毒谱系。
实施例7
在实施例3、实施例5和实施例6的基础上，本实施例以实验室保存或分离的H1N1亚型流感毒株的cDNA为模板，进一步验证H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别引物的特异性和荧光定量PCR方法的特异性。此外，实施例6中对本实验室保存或分离的H1N1亚型流感毒株的谱系分析结果也可以佐证本实施例。
（1）以待鉴定毒株的cDNA为模板，通过普通PCR方法验证H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别引物的特异性
根据实施例3（1）、实施例5（1）和实施例6，以分别隶属于4个遗传进化谱系的实验室保存或分离的H1N1亚型流感毒株JL10、JL16、JS15、FJ18的cDNA为模板，利用实施例3（1）中所优化的普通PCR方法，进一步对各谱系鉴别引物的特异性进行验证。
①反应体系：在普通PCR反应管中依次加入2×Taq Master Mix（Dye） 10μL，ddH2O8.75μL，浓度为10μM的上/下游引物各0.5μL，本实验室保存或分离的H1N1亚型流感毒株的cDNA样品0.25μL，至终体积20μL。
②反应条件：将配制好的反应体系置于普通PCR仪内进行反应。第一阶段，95℃，2min；第二阶段，47℃，30s，共30个循环；第三阶段，72℃，2min。
③凝胶电泳鉴定：将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，验证各谱系鉴别引物的特异性，结果如图20~23所示。由凝胶电泳结果可知，某一谱系的鉴别引物只有在扩增其所对应谱系病毒的cDNA时，才会出现与预期大小相符的目的条带，而在扩增其他谱系病毒的cDNA时，不会出现非特异性扩增，由此进一步证实所设计的4对谱系鉴别引物具有较好的谱系内特异性。
（2）以待鉴定毒株的cDNA为模板，通过荧光定量PCR方法验证H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别引物的特异性，同时验证荧光定量PCR的特异性
根据实施例3（2）、实施例5（2）和实施例6，以分别隶属于4个遗传进化谱系的实验室保存或分离的H1N1亚型流感毒株JL10、JL16、JS15、FJ18的cDNA为模板，利用实施例3（2）中所优化的荧光定量PCR方法，进一步对各谱系鉴别引物的特异性进行验证，同时验证所建立的荧光定量PCR方法的特异性。
①反应体系：在荧光定量PCR八联管中依次加入FastStart Universal SYBRGreen Master（ROX） 10μL，ddH2O 8.75μL，浓度为10μM的上/下游引物各0.5μL，本实验室保存或分离的H1N1亚型流感毒株的cDNA或不同拷贝数的标准品0.25μL，至终体积20μL。
②反应条件：将配制好的反应体系置于荧光定量PCR仪上进行反应。第一阶段，95℃，3min；第二阶段，95℃，15s；47℃，30s；40个循环。
③标准曲线构建：以不同拷贝数标准品的对数值为横坐标，以检测到的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，构建荧光定量PCR的标准曲线。
④结果判定：引物特异性的荧光定量PCR验证结果如图24~27所示。结果显示，各谱系的鉴别引物只有在检测对应谱系的H1N1亚型流感病毒时，有扩增曲线生成，Ct值位于所生成的标准曲线上，且熔解曲线峰型单一，无非特异性杂峰；而在检测其他谱系H1N1亚型流感病毒时，无扩增曲线生成。由此表明，各谱系的鉴定引物只能够与其对应谱系病毒的模板结合，而与其他谱系病毒的模板无交叉反应。
总之，通过实施例7，不仅证实所设计的4对谱系鉴别引物具有较好的谱系内特异性，而且本实施例也可以与实施例6进行相互佐证，即本实施例中的鉴定结果与实施例6对4株谱系待鉴定的H1N1亚型流感毒株的鉴定结果完全一致。
实施例8
在实施例3（2）、实施例5（2）和实施例6的基础上，本实施例利用所建立的荧光定量PCR方法，分别以实验室保存或分离的H1N1亚型和H3N2、H9N2等其他亚型流感毒株的cDNA为模板，对H1N1亚型流感病毒谱系鉴别引物的特异性和荧光定量PCR方法的特异性进行再次验证。
①反应体系：在荧光定量PCR八联管中依次加入FastStart Universal SYBRGreen Master（ROX） 10μL，ddH2O 8.75μL，浓度为10μM的上/下游引物各0.5μL，本实验室保存或分离的H1N1、H3N2或H9N2亚型流感毒株的cDNA或不同拷贝数的标准品0.25μL，至终体积20μL。
②反应条件：将配制好的反应体系置于荧光定量PCR仪上进行反应。第一阶段，95℃，2min；第二阶段，95℃，15s；47℃，30s；40个循环。
③标准曲线构建：以不同拷贝数标准品的对数值为横坐标，以检测到的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，构建荧光定量PCR的标准曲线。
④结果判定：引物亚型间特异性的荧光定量PCR验证结果如图28~31所示。结果显示，各谱系的鉴别引物只有在检测对应谱系的H1N1亚型流感病毒时，才有扩增曲线生成，Ct值位于各谱系所生成的标准曲线上，且熔解曲线峰型单一，无非特异性杂峰；而在检测H3N2、H9N2等亚型流感病毒时，未检测到它们HA基因的扩增曲线和熔解曲线。由此表明，各谱系的鉴定引物只能够与其对应谱系的H1N1亚型流感病毒的模板结合，而与其他亚型病毒的模板无亚型间交叉反应，进一步表明证实4对谱系鉴别引物具有良好的亚型与谱系内特异性。

Claims (1)

1.一种用于非疾病诊断与治疗为目的的H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系的鉴别方法，其特征在于：
(1)针对H1N1亚型流感病毒的4个遗传进化谱系，即古典猪流感病毒谱系、季节性人流感病毒谱系、禽流感病毒谱系、欧亚类禽猪流感病毒谱系，分别筛选出可以用于遗传进化谱系鉴别、只具有谱系内特异性，而无谱系间交叉反应的4对PCR鉴别引物；各谱系鉴别引物的序列如下；
1)古典猪流感病毒谱系
上游引物：5′-CARCAMATCCTAYATTAATG-3′，下游引物：5′-ATTTTCCAATTGTGATCGG-3′
2)季节性人流感病毒谱系
上游引物：5′-YACTGATTTCYAAGGAR-3′，下游引物：5′-GGTACRARCCATTC-3′
3)禽流感病毒谱系
上游引物：5′-AGTTGGGTCATCGAAG-3′，下游引物：5′-CTAGATTGAATRGAAGGA-3′
4)欧亚类禽猪流感病毒谱系
上游引物：5′-GCCTGAATGGAAAGAK-3′，下游引物：5′-GWAGATTGCYTTTCAAG-3′
各引物所处区域分别位于某一遗传进化谱系HA基因核苷酸序列的相对保守区，且该区域的核苷酸序列与其他遗传进化谱系HA基因的核苷酸序列存在明显差异，同时保证绝大多数差异位点位于所设计引物的3’端，以降低非特异性PCR扩增出现的概率；
(2)该4对引物可以利用荧光定量PCR方法对H1N1亚型流感病毒的4个遗传进化谱系进行特异性鉴别，具体如下：
1)根据H1N1亚型流感病毒HA基因遗传进化树的分析结果，从4个遗传进化谱系中各选取一株病毒的HA全长基因序列，其GenBank注册号分别为：MK159413、V01088、CY077076、KM028031，送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成，并与pEASY-T1 Simple载体连接；将4个遗传进化谱系HA基因的重组质粒分别命名为pEASY-T1-I、pEASY-T1-II、pEASY-T1-III、pEASY-T1-IV，以此作为荧光定量PCR方法的标准品；
2)所述的荧光定量PCR方法包括如下步骤：
①荧光定量PCR方法的反应体系：
在荧光定量PCR八联管中依次加入FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10μL，ddH2O 8.75μL，浓度为10μM的上/下游引物各0.5μL，待鉴定毒株的cDNA 0.25μL，至终体积20μL；
②荧光定量PCR方法的反应条件：
将步骤①的反应体系置于荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件：第一阶段，95℃，2min；第二阶段，95℃，15s；47℃，30s；40个循环；
③荧光定量PCR标准曲线的构建：
将步骤1)中所构建的标准品稀释成5个不同的拷贝数，分别为1010copies/μL、108copies/μL、106copies/μL、104copies/μL、102copies/μL；将步骤2)①反应体系中的“待鉴定毒株的cDNA”分别替换为5个不同拷贝数的标准品，反应条件同步骤2)②；以不同拷贝数标准品的对数值为横坐标，以检测到的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，构建荧光定量PCR的标准曲线；不同拷贝数标准品测得的Ct值呈现良好的线性关系，标准曲线相关系数R2≥0.90，且5个不同拷贝数质粒所对应的Ct值≤35；
④结果判定标准：
a.阳性结果：当待鉴定毒株cDNA的Ct值≤35，Ct值位于4条标准曲线中的其中一条，且出现扩增曲线和峰型单一的熔解曲线，则可以判定该毒株属于扩增该毒株所用鉴别引物对应的遗传进化谱系；
b.阴性结果：阴性结果检测不到Ct值，且无扩增曲线和熔解曲线生成。
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