CN102127594A - 新型甲型h1n1流感病毒荧光定量rt-pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型甲型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，该检测方法是采用荧光探针技术，设计一组仅在新型H1N1流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针，具体包括以下步骤：(1)参照新型H1N1流感病毒HA基因序列设计特异性引物；(2)取备检样品提取病毒RNA；(3)RT-PCR扩增；(4)质粒标准阳性模板的制备；(5)对收集的荧光曲线进行结果分析。该方法灵敏度高、特异性强，并具有良好的重复性，操作简单快速，能大大缩短检测周期，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。
Description
(一)技术领域
本发明涉及新型甲型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法。
(二)发明背景
2009年4月，在墨西哥爆发的新型H1N1流感是由A型流感病毒引起的猪呼吸道传染病，初步研究检测出这种病毒是A型流感病毒，携带有H1N1亚型猪流感病毒毒株，包含有禽流感、猪流感和人流感三种流感病毒的脱氧核糖核酸基因片断，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病毒特征。截止到2010年7月30日，全球214个国家有H1N1感染病例报告，造成18398人死亡。2010年6月3日，世界卫生组织应急委员会在对H1N1全球流行趋势进行评估之后指出，H1N1人类大流行并没有结束，并呼吁对于这一流感病毒继续进行全球性的监测。2010年8月10日，WHO宣布novel H1N1 influenza大流行疫情已告结束，全球进入了“后流感大流行时期”(post-pandemic period)。但同时强调，即使进入了后流行时期，并不意味着novel H1N1 influenzavirus(novel H1N1 IV)已经消失。根据其它传染病的流行经验WHO预期，novel H1N1 IV会像其它的季节性流感一样，将持续传播多年，各国仍应密切注意防范。目前在全球的一些国家或地区该疫病仍在流行，该病毒的感染和死亡仍在继续。2010年6月18日，中国香港研究人员发现，该病毒在过去的一年半的时间里在猪体内发生了重组。Cássio Pontes Octaviani(2010年8月)指出，甲型H1N1流感病毒具有易与H5N1型禽流感病毒杂交的特性，有可能诞生传染性更强的新病毒。这一发现更加令人担忧。所以必须继续加强该疫情的监视。
甲型H1N1流感传播快，危害大，因此早期快速诊断就成为预防和控制该病的重要条件。
基于分子生物学技术的荧光定量RT-PCR方法，能够快速准确的对该病毒进行实时定量监测，及时捕获病原流行信息，对疫情予以评估和预报非常必要。
(三)发明内容
本发明建立了灵敏度高、特异性强、重复性良好、操作简单、快速的新型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，该方法速度快、高通量，能大大缩短检测周期，为疾病的治疗和疫情的控制提供保障，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。
本发明的具体步骤是：
1、引物设计
参照GenBank中公开发表的新型H1N1流感病毒HA基因序列(CY045143.1)，应用PrimerPremier 5.0软件设计了特异性引物、H1-probe探针序列：
2、病毒RNA提取
①取新型H1N1流感病毒悬液250μL，加入750μL Trizol液，混匀；
②室温放置5min，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；
③取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min；
④弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，混匀，4℃下7500g离心5min；
⑤重复④中的操作；
⑥小心弃去上清液，然后室温干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；
⑦然后将RNA溶于无RNA酶水中，放置10min。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增，若需长期保存须放置-70℃冰箱。
3、RT-PCR扩增
①反转录合成cDNA：反转录反应体系包括：10×RT mix 2μl，2.5mM dNTPs 2μl，2μl Random，Quant Reverse Transcriptase 1μl，5μl已制备的RNA，DEPC水8μl。37℃作用1h，即反转录完成。
②PCR扩增：PCR总体系为25μl，其中10×Buffer 2.5μl，2.5mM Mg2+2μl，2.5mM dNTPs 2μl，上、下游引物(H1F-1和H1R-1)各0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，模板1μl，余下用灭菌ddH2O补足。反应条件为：95℃预变性5min，然后94℃30s，45℃30s，72℃30s，进行30个循环，最后72℃延伸6min。反应结束后，取5μl PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳。
4、质粒标准阳性模板的制备
①确定阳性质粒：PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取DNA，按照常规方法将目的片段与pMD18-T载体连接，并转化DH5α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基37℃培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，菌液PCR鉴定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Genebank上的标准毒株序列对比分析，确定阳性质粒。所述的荧光定量标准品为新型H1N1流感病毒HA基因(CY045143.1)上335～586之间、大小约为252bp的基因片段的质粒。
②阳性质粒浓度的测定：将质粒提取物用超纯水10×稀释后，在260nm与280nm波长下测定液体中质粒的含量，并根据公式计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数。
注：每个碱基的平均分子量为660
5、根据荧光定量PCR标准曲线进行结果分析，通过ABI7500 System SDS Software Version1.2(Applied Biosystems，USA)软件分析收集的荧光曲线判定结果。
提取上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，倍比稀释(107～101copies/μL)用于荧光定量PCR标准曲线绘制，扩增反应体系20μl，其中2.5×realMasterMix 8μl，上下游引物(H1F-2和H1R-2)各0.6μl，探针0.3μl，20×Probe Enhancer solution 1.0μl，模板2μl，超纯水7.5μl。反应条件为：95℃1min；95℃10s，60℃15s，68℃34s，40个循环。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)灵敏度高：通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测可知检测到最低浓度为1000copies/reaction。
(2)特异性强：除新型H1N1亚型的毒株能检测到阳性的荧光信号外，猪H1、人季节性H3、以及H5、H7等均为阴性。
(3)重复性好：选择不同浓度的5个质粒标准品进行荧光定量PCR检测，每个标准品在同一反应条件下重复3次作为同一批次内重复试验，然后在另一时间再重复一次作为不同批次间重复试验，通过计算得出，批次内变异系数的mean±S.D.为0.20±0.40％，批次间变异系数的mean±S.D.为1.15±0.17％。
说明书附图：
图1新型H1N1流感病毒荧光定量PCR标准品扩增曲线，图中自左侧到右侧的扩增曲线，代表2.03×107copies/reaction-2.03×103copies/reaction的标准品的扩增曲线。由图得知，建立的检测体系最低检测极限是2.03×103Qcopies/reaction(20fg病毒RNA)。
图2新型H1N1流感病毒荧光定量PCR标准曲线。由图得知，标准品的模板浓度与可检测到荧光信号的循环数呈显著的线性关系，其相关系数R2＝0.999，线性方程为y＝-3.22x+0.999。
具体实施方式：
参照GenBank中公开发表的新型H1N1流感病毒HA基因序列，设计了特异性引物序列：
实施例一：以已知新型H1N1流感病毒为检测材料，并以超纯水为阴性对照。
1、新型H1N1流感病毒RNA提取
①取甲型H1N1流感病毒悬液250μL，加入750μL Trizol液，混匀；
②室温放置5min，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；
③取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min；
④弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，混匀，4℃下7500g离心5min；
⑤重复④中的操作；
⑥小心弃去上清液，然后室温干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；
⑦然后将RNA溶于无RNA酶水中，放置10min。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增，若需长期保存须放置-70℃冰箱。
2、反转录合成cDNA
反转录反应体系包括：10×RT mix 2μl，2.5mM dNTPs 2μl，2μl Random，QuantReverse Transcriptase 1μl，5μl已制备的RNA，DEPC水8μl。37℃作用1h，即反转录完成。
3、荧光定量PCR检测
取上述反转录获得的cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测，同时制定标准曲线，反应体系20μl，其中2.5×realMasterMix 8μl，上下游引物(H1F-2和H1R-2)各0.6μl，探针0.3μl，20×Probe Enhancer solution 1.0μl，模板2μl，超纯水7.5μl。反应条件为：95℃1min；95℃10s，60℃15s，68℃34s，40个循环。最后使用ABI7500SystemSDS Software Version 1.2(Applied Biosystems，USA)软件对收集的荧光曲线分析被检材料中的病毒核酸量(copies)。
结果说明本方法能有效地检测新型H1N1流感病毒核酸量。
实施例二：待检病料(疑似病人咽喉拭子)中新型H1N1流感病毒的荧光定量PCR检测。
1、样品制备：
病人咽喉拭子在混合器上充分混合后，用灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转入无菌的1.5mL Eppendorf管中，编号备用。
2、病毒RNA提取
①取上述液体250μL，加入750μL Trizol液，混匀；
②室温放置5min，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；
③取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min；
④弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，混匀，4℃下7500g离心5min；
⑤重复④中的操作；
⑥小心弃去上清液，然后室温干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；
⑦然后将RNA溶于无RNA酶水中，放置10min。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增，若需长期保存须放置-70℃冰箱。
3、反转录合成cDNA
反转录反应体系包括：10×RT mix 2μl，2.5mM dNTPs 2μl，2μl Random，QuantReverse Transcriptase 1μl，5μl已制备的RNA，DEPC水8μl。37℃作用1h，即反转录完成。
4、荧光定量PCR检测
取上述反转录获得的cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测，同时制定标准曲线，反应体系20μl，其中2.5×realMasterMix 8μl，上下游引物(H1F-2和H1R-2)各0.6μl，探针0.3μl，20×Probe Enhancer solution 1.0μl，模板2μl，超纯水7.5μl。反应条件为：95℃1min；95℃10s，60℃15s，68℃34s，40个循环。最后根据标准曲线分析被检材料中的病毒核酸量(copies)。
结果说明本方法能敏感地检测出病料中新型H1N1流感病毒核酸量。
Claims (3)
1.一种新型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)参照新型H1N1流感病毒HA基因序列设计特异性引物；
(2)取备检样品提取病毒RNA；
(3)RT-PCR扩增
①反转录合成cDNA：反转录反应体系包括：10×RT mix 2μl，2.5mM dNTPs 2μl，2μl Random，Quant Reverse Transcriptase 1μl，5μl已制备的RNA，DEPC水8μl；37℃作用1h，即反转录完成；
②PCR扩增：PCR总体系为25μl，其中10×Buffer 2.5μl，2.5mM Mg2+2μl，2.5mM dNTPs 2μl，上游引物H1F-1和下游引物H1R-1各0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，模板1μl，余下用灭菌ddH2O补足；反应条件为：95℃预变性5min，然后94℃30s，45℃30s，72℃30s，进行30个循环，最后72℃延伸6min；反应结束后，取5μl PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳；
(4)质粒标准阳性模板的制备
①确定阳性质粒：PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取DNA，按照常规方法将目的片段与pMD18-T载体连接，并转化DH5α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基37℃培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，菌液PCR鉴定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Genebank上的标准毒株序列对比分析，确定阳性质粒；
②阳性质粒浓度的测定：将质粒提取物用超纯水10×稀释后，在260nm与280nm波长下测定液体中质粒的含量，并计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数；
(5)结果分析，通过ABI7500System SDS Software Version 1.2软件分析收集的荧光曲线判定结果：
提取上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，倍比稀释(107～101copies/μL)用于荧光定量PCR标准曲线绘制，扩增反应体系20μl，其中2.5×realMasterMix 8μl，上下游引物(H1F-2和H1R-2)各0.6μl，探针0.3μl，20×Probe Enhancer solution 1.0μl，模板2μl，超纯水7.5μl；反应条件为：95℃1min；95℃10s，60℃15s，68℃34s，40个循环；通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测可知检测到最低浓度为1000copies/reaction。
2.根据权利要求1所述的新型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：所述的特异性引物、H1-probe探针序列如下：
H1F-1：TACCCAGGAGATTTCATCGA
H1R-1：GAGGACTTCTTTCCCTTTAT
H1F-2：5’-AGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGG-3’
H1R-2：5’-TGAGGACATGCTGCCGTTAC-3’
H1-probe：5’-FAM-TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA-Eclipse-3’。
3.根据权利要求1所述的新型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：所述的荧光定量标准品为新型H1N1流感病毒HA基因CY045143.1上335～586之间、大小为252bp的基因片段的质粒。
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| CN 201010579326 CN102127594A (zh) | 2010-11-26 | 2010-11-26 | 新型甲型h1n1流感病毒荧光定量rt-pcr检测方法 |
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| CN 201010579326 CN102127594A (zh) | 2010-11-26 | 2010-11-26 | 新型甲型h1n1流感病毒荧光定量rt-pcr检测方法 |
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN102286639A (zh) * | 2011-08-05 | 2011-12-21 | 江苏硕世生物科技有限公司 | 甲型h1n1/甲型流感病毒核酸双重荧光pcr检测试剂盒 |
| CN111004869A (zh) * | 2020-02-08 | 2020-04-14 | 吉林大学 | 一种用于h1n1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的方法 |
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Non-Patent Citations (1)
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| 《Journal of Virological Methods》 20091204 Wu Weili et al Detection of pandemic influrenza A/H1N1/2009 virus by real-time reverse transcription polymerase chain reaction, 294-296 , * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN111004869A (zh) * | 2020-02-08 | 2020-04-14 | 吉林大学 | 一种用于h1n1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的方法 |
| CN111004869B (zh) * | 2020-02-08 | 2023-05-23 | 吉林大学 | 用于h1n1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的荧光定量pcr引物和参考标准品 |
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Application publication date: 20110720 |