CN103320544B - 用于以rt-lamp法检测h7n9禽流感病毒的引物、试剂盒、检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的引物、试剂盒、检测方法。该引物包括H7引物组和N9引物组，可有效检测H7N9禽流感病毒。该试剂盒包括前述引物，可用于检测H7N9禽流感病毒。该检测方法采用前述试剂盒进行，可直观地根据反应液颜色判断结果，快速准确。本发明结果可靠，成本相对较低，具有简单、快速、灵敏的特点，尤其适用于现场检测，并适用于国内大多数缺乏实时荧光定量PCR仪的医院、防疫部门实验室使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的引物、试剂盒、检测方法及试剂盒检验方法，属于生物技术领域。
背景技术
禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜；其基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。禽甲型流感病毒除感染禽外，还可感染猪、马、水貂和海洋哺乳动物。自1959年以来，H5、H7和H9等亚型病毒已逾10次跨越物种障碍感染人类。现在已经确认能够感染人的禽流感病毒共有8种，包括H5N1、H5N2、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H10N7，以及2013年发现的H7N9。
自2013年2月起，中国爆发了人感染H7N9禽流感病毒的疫情，临床表现为流感样症状和重症肺炎，病死率高，导致至少131人发病，其中39人死亡（截止2013年5月31日）。这种全球首次发现的新型禽源性重组甲型流感病毒，在短期内造成了至少65亿美元的经济损失，并已对人类健康构成严重威胁，而且不能排除该病毒进一步进化成有效人传人，引发未来流感大流行的可能性。
加强对流感样病例尤其是重症肺炎，以及候鸟、家禽类的H7N9禽流感病毒的快速检测，对全球的H7N9疫情监测与防控意义重大。目前已有的免疫胶体金检测方法，敏感性较低，难以检出临床病例（Baas C,et al.Eurosurveillance,2013）。基于H7N9禽流感病毒HA基因和NA基因的逆转录实时荧光定量PCR（rRT-PCR,世界卫生组织、中国疾控中心推荐方法，参见http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/influenza_h7n9/en/），具有敏感、特异的优点，但需昂贵的设备、专业的技术、繁琐的操作，不适合现场检测或者条件较差的基层实验室。因此，目前迫切需要建立一种新的简单易行、快速敏感的H7N9禽流感病毒检测方法。
据申请人所知，环介导等温扩增（Loop-mediated isothermalamplification,LAMP）及逆转录环介导等温扩增（reverse transcriptionloop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP）是一类新型核酸扩增方法，扩增反应全过程均在同一温度下进行，不须像PCR反应那样需要经历几十个温度变化的循环过程，因此对扩增所需仪器的要求大大简化，整个扩增过程只需一台水浴锅或恒温金属浴即可，反应时间一般只需15min至60min，并且不需要通过繁琐的核酸电泳方法来检测结果，只需通过其副产物-白色的焦磷酸镁沉淀来观察结果（可用浊度仪实时扫描判定），或者预先加入HNB或钙黄绿素等金属离子螯合剂，通过反应前后的溶液颜色变化，直接目视观察以判断结果，无需其它任何设备。
其中，RT-LAMP方法具有简便、快速、敏感、高效的特点，非常适合在基层实验室甚至现场进行快速诊断，目前亟需建立一种能够灵敏、特异、高效检测H7N9禽流感病毒的RT-LAMP检测手段。
发明内容
本发明的第一目的是：针对现有技术存在的问题，提供一种用于以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的引物，可有效检测H7N9禽流感病毒。
本发明的第二目的是：提供含有上述引物的试剂盒，可用于检测H7N9禽流感病毒。
本发明的第三目的是：提供采用前述试剂盒的检测方法，可直观地根据反应液颜色判断结果，快速准确。
本发明的第四目的是：提供针对前述试剂盒的检验方法，确保使用正常的试剂盒来得到可靠的结果。
实现本发明第一目的的技术方案如下：一种用于以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的引物，其特征是，包括H7引物组和N9引物组；其中，
H7引物组包括外引物对H7-F3和H7-B3，内引物对H7-FIP和H7-BIP，以及环引物H7-LB；H7-F3的序列如SEQ ID NO:1所示，H7-B3的序列如SEQ IDNO:2所示，H7-FIP的序列如SEQ ID NO:3所示，H7-BIP的序列如SEQ ID NO:4所示，H7-LB的序列如SEQ ID NO:5所示；
N9引物组包括外引物对N9-F3和N9-B3，内引物对N9-FIP和N9-BIP，以及环引物N9-LB；N9-F3的序列如SEQ ID NO:6所示，N9-B3的序列如SEQ IDNO:7所示，N9-FIP的序列如SEQ ID NO:8所示，N9-BIP的序列如SEQ ID NO:9所示，N9-LB的序列如SEQ ID NO:10所示。
采用该引物后，即可有效检测H7N9禽流感病毒。
实现本发明第二目的的技术方案如下：一种以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征是，包括前述用于以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的引物，其中由H7引物组构成的引物混合液放置于Ⅰ管中，由N9引物组构成的引物混合液放置于Ⅱ管中。
采用该试剂盒即可用于检测H7N9禽流感病毒。
优选地，所述Ⅰ管中，外引物对H7-F3和H7-B3、内引物对H7-FIP和H7-BIP、及环引物H7-LB的摩尔比为1:(5-10):(2-6)；所述Ⅱ管中，外引物对N9-F3和N9-B3、内引物对N9-FIP和N9-BIP、及环引物N9-LB的摩尔比为1:(5-10):(2-6)。
优选地，还包括2×反应液，酶液，及显色试剂；
所述酶液包括浓度为6-12U/μl的BstDNA聚合酶，以及浓度为8-16U/μl AMV逆转录酶；
所述2×反应液包括30-60mmol/L pH8.8的Tris-HCl，16-30mmol/L的KCl，10-30mmol/L的(NH4)2SO4，质量浓度为0.1-0.3%的Triton X-100，由浓度均为2.0-3.6mmol/L的dATP、dTTP、dCTP、dGTP组成的dNTPs，0.1-2.0mmol/L的甜菜碱C5H11NO2，以及12-20mmol/L的MgSO4；
所述显色试剂为浓度2-20mmol/L的金属离子指示剂HNB储存液。
优选地，还包括阳性对照品：包括HA阳性对照品和NA阳性对照品，浓度分别为20-100mg/L，且由以下方法获得：先分别构建含有H7N9禽流感病毒HA基因的质粒H7-PCRⅡ、以及含有H7N9禽流感病毒NA基因的质粒N9-PCRⅡ，再分别进行体外转录反应获得RNA片段，分别纯化后即得HA阳性对照品和NA阳性对照品。
此外，本发明还提供：前述引物制作以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的试剂盒的用途。
实现本发明第三目的的技术方案如下：一种非诊断目的以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的快速检测方法，其特征是，采用前述以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，该方法包括以下步骤：
第一步、向透明反应管A、B中分别加入体积相同的试剂盒2×反应液、Ⅰ管或Ⅱ管的引物混合液、酶液、显色液、超纯水，然后混合，得到体积相同的反应液A、B；其中反应管A中加入Ⅰ管的引物混合液，反应管B中加入Ⅱ管的引物混合液；试剂盒2×反应液、Ⅰ管或Ⅱ管的引物混合液、酶液、显色液、超纯水的体积分别为（8-12）：（1.5-3.5）：（0.5-1.5）：（0.3-0.9）：（3.1-4.7）；
第二步、向反应管A、B中分别加入体积相同的待测核酸样品，盖好反应管A、B后混匀；
第三步、将反应管A、B先分别在60℃-65℃恒温条件下放置25-60min进行RT-LAMP扩增，再于80℃-95℃下放置2-10min结束反应；
第四步、观察反应液A、B的颜色，若两者颜色均为天蓝色，则待测核酸样品的来源含有H7N9禽流感病毒；若两者颜色均为紫罗兰色，则待测核酸样品的来源不含H7N9禽流感病毒；若反应液A颜色为天蓝色，且反应液B颜色为紫罗兰色，则待测核酸样品的来源含有H7亚型禽流感病毒；若反应液A颜色为紫罗兰色，且反应液B颜色为天蓝色，则待测核酸样品的来源含有N9亚型禽流感病毒。
采用该检测方法后，可直观地根据反应液颜色判断结果，快速准确。
优选地，第二步中，加入待测核酸样品后，反应管A、B中的反应液体积均为25μl；第三步中，RT-LAMP扩增条件为：63℃恒温条件下放置30min；结束反应的条件为：80℃下放置2min。
实现本发明第四目的的技术方案如下：一种针对前述以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒试剂盒的检验方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、制备两套含反应液A的反应管A、含反应液B的反应管B：取透明反应管A，向其中加入试剂盒中的2×反应液、Ⅰ管的引物混合液、酶液、显色液，然后加入超纯水并混合，得到预定体积的反应液A；取透明反应管B，向其中加入试剂盒中的2×反应液、Ⅱ管的引物混合液、酶液、显色液，然后加入超纯水并混合，得到预定体积的反应液B；反应液A和反应液B的体积相同；
第二步、向第一套反应管A、B中分别加入相同体积的蒸馏水，盖好反应管A、B后混匀，作为阴性对照；向第二套反应管A、B中分别加入相同体积的HA阳性对照品和NA阳性对照品，盖好反应管A、B后混匀，作为阳性对照；蒸馏水和阳性对照品的加入体积相同；
第三步、将反应管A、B先分别在60℃-65℃恒温条件下放置25-60min进行RT-LAMP扩增，再于80℃-95℃下放置2-10min结束反应；
第四步、观察阴性对照反应液A、B和阳性对照反应液A、B的颜色，若阴性对照反应液A、B颜色均为紫罗兰色，且阳性对照反应液A、B颜色均为天蓝色，则第一步所用试剂盒是合格的；若各反应液颜色与前述情况不完全相符或完全不相符，则第一步所用试剂盒不合格。
采用该验证方法后，可确保使用正常的试剂盒来得到可靠的结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明的试剂盒使用简单，一步即可完成实验操作；不需要大型复杂的仪器；结果鉴定方便直观；快速高效，半个多小时内即可完成扩增及结果判定全过程；检测敏感性高，经实验对比测试，本发明检测H7N9禽流感病毒HA基因的敏感性最低可检测到10拷贝，这与WHO推荐的实时荧光定量PCR方法（H7-rRT-PCR）相同，而本发明检测H7N9禽流感病毒NA基因的敏感性最低可检测到5拷贝，比WHO推荐的实时荧光定量PCR方法（N9-rRT-PCR，经实验测试的检出限为500拷贝）高10-100倍。
本发明结果可靠，成本相对较低，具有简单、快速、灵敏的特点，尤其适用于现场检测，并适用于国内大多数缺乏实时荧光定量PCR仪的医院、防疫部门实验室使用。
附图说明
图1为本发明实施例2的重组质粒H7-PCRⅡ结构示意图，其中Spe I为酶切位点（用于体外转录前的线性化，以产生固定长度的RNA片段，便于准确定量拷贝数），H7为H7N9病毒的HA基因序列，T7promoter为质粒PCR Ⅱ上自带的体外转录启动子，箭头所指为体外转录的方向。
图2为本发明实施例2的重组质粒N9-PCRⅡ结构示意图，其中BamH I为酶切位点（用于体外转录前的线性化，以产生固定长度的RNA片段，便于准确定量拷贝数），N9为H7N9病毒的NA基因序列，T7 promoter为质粒PCR Ⅱ上自带的体外转录启动子，箭头所指为体外转录的方向。
图3为本发明实施例2的PCR Ⅱ质粒图谱。
图4为本发明实施例6中，采用逆转录实时荧光定量定量PCR（H7-rRT-PCR）检测梯度稀释的HA阳性对照品的结果；Ct值＜38判定为阳性。其中Neg表示为检测结果阴性，NTC为阴性对照（使用超纯水代替模板）。
图5为本发明实施例6中，采用实施例2试剂盒并结合浊度法检测梯度稀释的HA阳性对照品的结果；浊度值＞0.1判定为阳性。
图6为本发明实施例6中，采用实施例2试剂盒并结合显色法检测梯度稀释的HA阳性对照品，天蓝色判定为阳性，紫罗兰色为阴性。垂直虚线标记为区分示阳性、阴性结果。
图7为本发明实施例6中，采用逆转录实时荧光定量定量PCR（N9-rRT-PCR）检测梯度稀释的NA阳性对照品的结果，Ct值＜38判定为阳性。其中Neg表示为检测结果阴性，NTC为阴性对照（使用超纯水代替模板）。
图8为本发明实施例6中，采用实施例2试剂盒并结合浊度法检测梯度稀释的NA阳性对照品的结果，浊度值＞0.1判定为阳性。
图9为本发明实施例6中，采用实施例2试剂盒并结合显色法检测梯度稀释的NA阳性对照品，天蓝色判定为阳性，紫罗兰色为阴性。垂直虚线标记为区分示阳性、阴性结果。
图10是本发明实施例7中，采用实施例2试剂盒（限定使用H7引物组）结合浊度法的特异性试验结果图。
图11是本发明实施例7中，采用实施例2试剂盒（限定使用N9引物组）结合浊度法的特异性试验结果图。
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
以下内容中涉及的实验操作，如未注明具体实验条件，则按照常规条件进行，例如，可参照SAMBROOK.J等编著的《分子克隆实验指南》第3版（Molecular Cloning:A Laboratory Manual;NEW York:Cold Spring HarborLaboratory Press,2001）中述及的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
以下内容中涉及的实验材料和试剂，如未特别说明则为市售品。
实施例1：H7、N9引物组
首先，在GISAID（全球流感禽流感共享数据库，http://www.gisaid.org/)的EpiFlu数据中心检索获得H7N9禽流感病毒的HA基因序列和NA基因序列，并通过ClustalX软件进行序列比对（分别与H1、H3、H5、H7、H9亚型流感病毒，以及N1、N2、N7、N9亚型流感病毒序列进行比对），得到两种基因的特异性保守序列；然后，通过LAMP引物设计软件（Primer Explorer software，version4.0），针对上述特异性保守序列分别进行LAMP引物设计，根据专业经验进行了人工选择和校正，再根据多轮实验测试，在合成的10套引物组合中筛选出可应用于同一反应体系的H7、N9引物组。
H7引物组包括外引物对H7-F3和H7-B3，内引物对H7-FIP和H7-BIP，以及环引物H7-LB；H7-F3的序列如SEQ ID NO:1所示，H7-B3的序列如SEQ IDNO:2所示，H7-FIP的序列如SEQ ID NO:3所示，H7-BIP的序列如SEQ ID NO:4所示，H7-LB的序列如SEQ ID NO:5所示；
N9引物组包括外引物对N9-F3和N9-B3，内引物对N9-FIP和N9-BIP，以及环引物N9-LB；N9-F3的序列如SEQ ID NO:6所示，N9-B3的序列如SEQ IDNO:7所示，N9-FIP的序列如SEQ ID NO:8所示，N9-BIP的序列如SEQ ID NO:9所示，N9-LB的序列如SEQ ID NO:10所示。
实施例2：以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的试剂盒
本实施例的试剂盒包括实施例1的H7引物组和N9引物组。其中，由H7引物组构成的引物混合液放置于Ⅰ管中，外引物对H7-F3和H7-B3、内引物对H7-FIP和H7-BIP、及环引物环引物H7-LB的摩尔比为1:(5-10):(2-6)，优选1:8:4。由N9引物组构成的引物混合液放置于Ⅱ管中，外引物对N9-F3和N9-B3、内引物对N9-FIP和N9-BIP、及环引物N9-LB的摩尔比为1:(5-10):(2-6)，优选1:8:4。
例如：I管中，每2.5μl引物混合液含有4pmol H7-F3、4pmol H7-B3、32pmol H7-FIP、32pmol H7-BIP、及16pmol H7-LB；Ⅱ管中，每2.5μl引物混合液含有4pmol N9-F3、4pmol N9-B3、32pmol N9-FIP、32pmol N9-BIP、及16pmol N9-LB。
本实施例试剂盒还包括：
（1）阳性对照品：包括HA阳性对照品和NA阳性对照品（如图1、图2所示），浓度分别为20-100mg/L，优选分别为50mg/L。
获得方法如下：抽提H7N9禽流感病毒（A/Nanjing/1/2013）毒株的RNA，进行RT-PCR扩增出HA、NA基因的全长片段（分别如SEQ ID NO:11、12所示），分别TA克隆至PCR Ⅱ质粒(美国Invitrogen公司，如图3所示)并测序，命名为H7-PCR Ⅱ和N9-PCR Ⅱ。将H7-PCR Ⅱ质粒用SpeI限制性内切酶（日本Takara公司），N9-PCR Ⅱ用BamH I限制性内切酶（Takara）进行酶切线性化，分别割胶纯化后作为模板，使用RiboMax T7In Vitro Transcription System（美国Promega公司）分别进行体外转录，用Dnase酶试剂将DNA模板分别完全降解，获得的RNA产物分别使用RNA纯化试剂盒（北京天根公司）纯化，使用分光光度计测定浓度，所得RNA片段即为HA阳性对照品和NA阳性对照品。
（2）2×反应液：该反应缓冲液含有30-60mmol/L（优选40mmol/L）pH8.8的Tris-HCl，16-30mmol/L（优选20mmol/L）的KCl，10-30mmol/L（优选20mmol/L）的(NH4)2SO4，质量浓度为0.1-0.3%（优选0.2%）的Triton X-100，由浓度均为2.0-3.6mmol/L（优选2.8mmol/L）的dATP、dTTP、dCTP、dGTP组成的dNTPs，0.1-2.0mmol/L（优选1.6mmol/L）的甜菜碱(C5H11NO2)，以及12-20mmol/L（优选16mmol/L）的MgSO4。
（3）酶液：包括浓度为6-12U/μl（优选8U/μl）的BstDNA聚合酶（大片段，美国NEB公司），以及浓度为8-16U/μl（优选10U/μl）AMV逆转录酶（美国NEB公司）。
（4）显色液：浓度为2-20mmol/L（优选4mmol/L）的金属离子指示剂HNB（hydroxy naphthol blue，羟基萘酚蓝）储存液，在反应前加入反应体系内，从而实现不开盖可视化检测。具体地，指示剂HNB购自美国Sigma-Alorich公司，货号CAS63451-35-4，规格33936-10G；该指示剂加入反应体系后的终浓度为120-160μmol/L。
实施例3：非诊断目的以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的快速检测方法
本实施例检测方法采用实施例2试剂盒进行检测。
本实施例检测方法包括以下步骤：
第一步、向透明反应管A、B中分别加入体积相同的试剂盒2×反应液、Ⅰ管或Ⅱ管的引物混合液、酶液、显色液、超纯水，然后混合，得到体积相同的反应液A、B；其中反应管A中加入Ⅰ管的引物混合液，反应管B中加入Ⅱ管的引物混合液；试剂盒2×反应液、Ⅰ管或Ⅱ管的引物混合液、酶液、显色液、超纯水的体积比为（8-12）：（1.5-3.5）：（0.5-1.5）：（0.3-0.9）：（3.1-4.7）；
例如，反应液A可以按下表得到：
| 试剂 | 使用量（μl） |
| 2×反应液 | 12.5 |
| Ⅰ管的引物混合液 | 2.5 |
| 酶液 | 1 |
| 显色液（4mmol/L） | 1 |
| 超纯水 | 5 |
| 合计 | 22μl |
反应液B可以按下表得到：
| 试剂 | 使用量（μl） |
| 2×反应液 | 12.5 |
| Ⅱ管的引物混合液 | 2.5 |
| 酶液 | 1 |
| 显色液（4mmol/L） | 1 |
| 超纯水 | 5 |
| 合计 | 22μl |
第二步、向反应管A、B中分别加入体积相同的待测核酸样品，盖好反应管A、B后混匀；
例如，向两反应管中分别加入3μl待测核酸样品，使两反应液的终体积均为25μl；此外，混匀后可短暂离心。
至于待测核酸样品可使用现有商品化的通用试剂盒（如德国QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit；日本Takara的miniBEST viral DNA/RNAEXtraction kit ver4.0；北京天根的TIANamp病毒RNA提取试剂盒）来提取获得，参照厂家的试剂盒说明书进行，时间由30分钟至45分钟不等。提取过程应在严格生物安全防护条件下进行。
第三步、将反应管A、B先分别在60℃-65℃（优选63℃）恒温条件下放置25-60min（优选30min）进行RT-LAMP扩增，再于80℃-95℃（优选80℃）下放置2-10min（优选2min）使酶灭活，结束反应；
具体地，恒温条件可以由水浴箱、恒温金属浴、或浊度仪等装置来提供。
第四步、观察反应液A、B的颜色，若两者颜色均为天蓝色，则待测核酸样品的来源含有H7N9禽流感病毒；若两者颜色均为紫罗兰色，则待测核酸样品的来源不含H7N9禽流感病毒；若反应液A颜色为天蓝色，且反应液B颜色为紫罗兰色，则待测核酸样品的来源含有H7亚型（例如H7N2、H7N3、H7N7等）禽流感病毒；若反应液A颜色为紫罗兰色，且反应液B颜色为天蓝色，则待测核酸样品的来源含有N9亚型禽流感病毒（此种情况需要进一步将待测核酸样品进行基因测序确证）。
此可视化结果观察步骤亦可使用浊度仪实时扫描浊度代替。例如使用LA-320C浊度仪（日本Eiken Chemical公司），对反应进程中的浊度进行实时扫描（波长650mm，每6秒测定1次），浊度值超过0.1则为阳性判定。如反应液A、B浊度值均大于0.1，则待测核酸样品的来源含有H7N9禽流感病毒；若两者均小于0.1，则待测核酸样品的来源不含H7N9禽流感病毒；若反应液A浊度值大于0.1，且反应液B浊度值小于0.1，则待测核酸样品的来源含有H7亚型（包括H7N2、H7N3、H7N7等）禽流感病毒；若反应液A浊度值小于0.1，且反应液B浊度值大于0.1，则待测核酸样品的来源含有N9亚型禽流感病毒（此种情况需要进一步将待测核酸样品进行基因测序确证）。
实施例4：试剂盒检验方法
本实施例方法可以检验实施例2试剂盒是否合格。
本实施例方法包括以下步骤：
第一步、制备两套含反应液A的反应管A、含反应液B的反应管B：取透明反应管A，向其中加入试剂盒中的2×反应液、Ⅰ管的引物混合液、酶液、显色液，然后加入超纯水并混合，得到预定体积的反应液A；取透明反应管B，向其中加入试剂盒中的2×反应液、Ⅱ管的引物混合液、酶液、显色液，然后加入超纯水并混合，得到预定体积的反应液B；反应液A和反应液B的体积相同；
具体配制体积可参照实施例3。
第二步、向第一套反应管A、B中分别加入相同体积的蒸馏水，盖好反应管A、B后混匀，作为阴性对照；向第二套反应管A、B中分别加入相同体积的HA阳性对照品和NA阳性对照品，盖好反应管A、B后混匀，作为阳性对照；蒸馏水和阳性对照品的加入体积相同；
例如，向反应管中加入3μl蒸馏水或阳性对照品，使反应液终体积均为25μl；
第三步、将反应管A、B先分别在60℃-65℃（优选63℃）恒温条件下放置25-60min（优选30min）进行RT-LAMP扩增，再于80℃-95℃（优选80℃）下放置2-10min（优选2min）使酶灭活，结束反应；
第四步、观察阴性对照反应液A、B和阳性对照反应液A、B的颜色，若阴性对照反应液A、B颜色均为紫罗兰色，且阳性对照反应液A、B颜色均为天蓝色，则第一步所用试剂盒是合格的；若各反应液颜色与前述情况不完全相符或完全不相符，则第一步所用试剂盒不合格，需要更换试剂盒。
实施例5：检测实例
1.待测样本
共135份待测标本。
其中，阳性样本：6份咽拭子及4份下呼吸道灌洗液标本分别采集自2013年4月的10位人感染H7N9禽流感确诊病例（标本已编码并完全匿名处理，已获伦理委员会批准）。
非诊断目的的未知样本1：90份未知混合物样本，包括58份未知样本A、20份未知样本B、12份未知样本C。
非诊断目的的未知样本2：25份未知液体样本。
阴性样本：10份作为控制对照的泄殖腔拭子采自SPF鸡（21日龄）。
2.试剂
（1）逆转录实时荧光定量PCR试剂，为WHO推荐试剂，具体详见http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/influenza_h7n9/en/。
（2）采用实施例2试剂盒。
3.实验方法
（1）实时荧光定量PCR：参见WHO推荐的H7N9禽流感病毒实时荧光逆转录PCR检测方法，即由上海Invitrogen公司合成其中分别针对H7和N9基因的引物探针，使用ABI7500Fast实时荧光定量PCR仪(美国lifetechnologies公司)，严格按该方法规定的试剂、反应体系和反应程序进行操作，简称为H7-rRT-PCR和N9-rRT-PCR。
（2）RT-LAMP：按实施例3方法进行检测。简述如下：
第一步，提取各检测样本的总RNA：采取Takara的miniBEST viralDNA/RNA EXtraction kit ver4.0试剂盒提取。
第二步，反应体系的配置：按照实施例3的第一步举例的列表，对于每一份具体样品，配制两套分别含22μl对应反应液的反应管A、B；向反应管A、B中各加入上述样品的第一步抽提的核酸3μl。
同时，按照实施例4第一步和第二步配制阴性对照反应管A、B（以超纯水代替样品）和阳性对照反应管A、B（分别加HA阳性对照品和NA阳性对照品）各一套。
第三步，恒温扩增反应：将上步所得各反应管在63℃恒温条件下（水浴箱或恒温金属浴装置等）放置30min进行恒温扩增，再于80℃放置2min结束反应。
第四步，结果观察：按实施例3的第四步判定结果。
4.实验结果
为评价本发明实施例2试剂盒用于临床实际检测的敏感性，本实施例分别采用实施例3方法（即H7-RT-LAMP、N9-RT-LAMP）和WHO推荐方法（即H7-rRT-PCR、NA-rRT-PCR）对以上样本进行检测，结果如下表所示。
结果显示，H7-RT-LAMP的敏感性与H7-rRT-PCR一致，在135份样本中均检出了相同的34份为H7核酸阳性（经测序复核确认），其余均为阴性。
N9-RT-LAMP的敏感性明显高于NA-rRT-PCR，前者在上述H7核酸阳性的34份样本中，检出了32份N9核酸阳性，H7与N9的诊断符合率为94.12%，而后者只检出了14份，符合率为41.18%。
以上结果表明，本发明实施例3检测方法对N9亚型基因的检出率显著高于目前WHO推荐的逆转录实时荧光PCR。这种对于N9基因片段的高辨别力，除了能更好地检测出H7N9禽流感病毒外，也有助于更好地将H7N9病毒从亦可感染人的H7N2、H7N3、H7N7等其它H7亚型禽流感病毒中区分出来。
实施例6：试剂盒检测敏感性分析
取实施例2试剂盒中的HA阳性对照品和NA阳性对照品，用分光光度仪分别测定两阳性对照品的OD260nm值，将数值带入公式(6.02×1023)×(ng/μl×10-9)/(DNA length×660)=copies/μl计算阳性对照品浓度。
然后将两阳性对照品分别做10倍梯度稀释，HA阳性对照品稀释后的各浓度为1.0×100copies/μl、1×101copies/μl、1.0×102copies/μl、1.0×103copies/μl、1.0×104copies/μl、1.0×105copies/μl、1.0×105copies/μl；NA阳性对照品稀释后的各浓度为5.0×10-1copies/μl、5.0×100copies/μl、5.0×101copies/μl、5.0×102copies/μl、5.0×103copies/μl、5.0×104copies/μl、5.0×105copies/μl。
将上述浓度的系列稀释液分别作为待测核酸样品，采用实施例2试剂盒按实施例3方法进行检测，并观察反应液颜色。
为了比较本发明实施例2试剂盒的性能，同时使用实施例5中的逆转录实时荧光定量PCR的试剂及方法检测上述梯度稀释的阳性对照品模板。
以上实验结果表明，只要HA阳性对照品浓度大于或等于1.0×101copies/μl，反应液A颜色为天蓝色；只要NA阳性对照品浓度大于或等于5.0×100copies/μl，反应液B颜色为天蓝色。也就是说实施例2试剂盒对H7基因亚型的检出限（检测灵敏度）可以达到1.0×101copies/μl，这与WHO推荐的逆转录实时荧光定量PCR检测H7亚型的敏感性（亦为1.0×101copies/μl）相同；实施例2试剂盒对N9基因亚型的检出限可以达到5.0×100copies/μl，较WHO推荐的逆转录实时荧光定量PCR检测N9亚型的检出限（5.0×102copies/μl）灵敏100倍，与实施例5的临床样本验证结果相符合。
为验证上述目测可视化结果，还同时使用了LA-320C浊度仪，采用实施例2试剂盒按实施例3方法进行检测，实时扫描浊度，浊度值超过0.1则为阳性判定，浊度法的结果与目测可视化结果一致。
以上逆转录实时荧光定量PCR、本实施例的RT-LAMP的灵敏度测试比较结果见图4至图9。
图4结果表明，H7-rRT-PCR方法对H7基因亚型的检出限为1.0×101copies/μl。
图5中，随HA阳性对照品浓度的降低，吸光度-时间曲线逐渐右移，当浓度降至1.0×100copies/μl时呈阴性，该结果表明采用实施例2试剂盒对H7基因亚型的检出限为1.0×101copies/μl。
图6中，虚线以左均显天蓝色，虚线以右均显紫罗兰色；该结果表明，采用实施例2试剂盒对H7基因亚型的检出限为1.0×101copies/μl。
图7结果表明，N9-rRT-PCR方法对N9基因亚型的检出限为5.0×102copies/μl。
图8中，随NA阳性对照品浓度的降低，吸光度-时间曲线逐渐右移，当浓度降至5.0×10-1copies/μl时呈阴性，该结果表明采用实施例2试剂盒对N9基因亚型的检出限为5.0×100copies/μl。
图9中，虚线以左均显天蓝色，虚线以右均显紫罗兰色；该结果表明，采用实施例2试剂盒对N9基因亚型的检出限为5.0×100copies/μl。
实施例7：试剂盒检测特异性分析
为验证实施例2试剂盒的特异性，选取可能有潜在交叉反应、可引起相似流感样症状的病毒，并提取其核酸，然后采用实施例2试剂盒按实施例3方法进行检测。
具体地，选用H5N1禽流感病毒、H9N2禽流感病毒、H1N1病毒（2009）、H3N2病毒、腺病毒4型、乙型流感病毒、副流感病毒3型（均由军事医学科学院全军微生物检验研究中心提供）。
本实施例使用了LA-320C浊度仪验观察验结果。结果见图10至图11，显示除对照的H7N9禽流感病毒外，其它各病毒均为阴性结果，这表明本发明试剂盒特异性良好。
Claims (9)
1.一种用于以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的引物，其特征是，包括H7引物组和N9引物组；其中，
H7引物组包括外引物对H7-F3和H7-B3，内引物对H7-FIP和H7-BIP，以及环引物H7-LB；H7-F3的序列如SEQ ID NO:1所示，H7-B3的序列如SEQ IDNO:2所示，H7-FIP的序列如SEQ ID NO:3所示，H7-BIP的序列如SEQ ID NO:4所示，H7-LB的序列如SEQ ID NO:5所示；
N9引物组包括外引物对N9-F3和N9-B3，内引物对N9-FIP和N9-BIP，以及环引物N9-LB；N9-F3的序列如SEQ ID NO:6所示，N9-B3的序列如SEQ IDNO:7所示，N9-FIP的序列如SEQ ID NO:8所示，N9-BIP的序列如SEQ ID NO:9所示，N9-LB的序列如SEQ ID NO:10所示。
2.一种以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征是，包括权利要求1所述用于以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的引物，其中由H7引物组构成的引物混合液放置于Ⅰ管中，由N9引物组构成的引物混合液放置于Ⅱ管中。
3.根据权利要求2所述以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征是，所述Ⅰ管中，外引物对H7-F3和H7-B3、内引物对H7-FIP和H7-BIP、及环引物H7-LB的摩尔比为1:(5-10):(2-6)；所述Ⅱ管中，外引物对N9-F3和N9-B3、内引物对N9-FIP和N9-BIP、及环引物N9-LB的摩尔比为1:(5-10):(2-6)。
4.根据权利要求3所述以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征是，还包括2×反应液，酶液，及显色试剂；
所述酶液包括浓度为6-12U/μl的BstDNA聚合酶，以及浓度为8-16U/μl AMV逆转录酶；
所述2×反应液包括30-60mmol/L pH8.8的Tris-HCl，16-30mmol/L的KCl，10-30mmol/L的(NH4)2SO4，质量浓度为0.1-0.3%的Triton X-100，由浓度均为2.0-3.6mmol/L的dATP、dTTP、dCTP、dGTP组成的dNTPs，0.1-2.0mmol/L的甜菜碱C5H11NO2，以及12-20mmol/L的MgSO4；
所述显色试剂为浓度2-20mmol/L的金属离子指示剂HNB储存液。
5.根据权利要求4所述以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征是，还包括阳性对照品：包括HA阳性对照品和NA阳性对照品，浓度分别为20-100mg/L，且由以下方法获得：先分别构建含有H7N9禽流感病毒HA基因的质粒H7-PCRⅡ、以及含有H7N9禽流感病毒NA基因的质粒N9-PCRⅡ，再分别进行体外转录反应获得RNA片段，分别纯化后即得HA阳性对照品和NA阳性对照品。
6.权利要求1所述引物制作以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的试剂盒的用途。
7.一种非诊断目的以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的快速检测方法，其特征是，采用权利要求5所述以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，该方法包括以下步骤：
第一步、向透明反应管A、B中分别加入体积相同的试剂盒2×反应液、Ⅰ管或Ⅱ管的引物混合液、酶液、显色液、超纯水，然后混合，得到体积相同的反应液A、B；其中反应管A中加入Ⅰ管的引物混合液，反应管B中加入Ⅱ管的引物混合液；试剂盒2×反应液、Ⅰ管或Ⅱ管的引物混合液、酶液、显色液、超纯水的体积分别为（8-12）：（1.5-3.5）：（0.5-1.5）：（0.3-0.9）：（3.1-4.7）；
第二步、向反应管A、B中分别加入体积相同的待测核酸样品，盖好反应管A、B后混匀；
第三步、将反应管A、B先分别在60℃-65℃恒温条件下放置25-60min进行RT-LAMP扩增，再于80℃-95℃下放置2-10min结束反应；
第四步、观察反应液A、B的颜色，若两者颜色均为天蓝色，则待测核酸样品的来源含有H7N9禽流感病毒；若两者颜色均为紫罗兰色，则待测核酸样品的来源不含H7N9禽流感病毒；若反应液A颜色为天蓝色，且反应液B颜色为紫罗兰色，则待测核酸样品的来源含有H7亚型禽流感病毒；若反应液A颜色为紫罗兰色，且反应液B颜色为天蓝色，则待测核酸样品的来源含有N9亚型禽流感病毒。
8.根据权利要求7所述非诊断目的以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的快速检测方法，其特征是，第二步中，加入待测核酸样品后，反应管A、B中的反应液体积均为25μl；第三步中，RT-LAMP扩增条件为：63℃恒温条件下放置30min；结束反应的条件为：80℃下放置2min。
9.一种针对权利要求5所述以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒试剂盒的检验方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、制备两套含反应液A的反应管A、含反应液B的反应管B：取透明反应管A，向其中加入试剂盒中的2×反应液、Ⅰ管的引物混合液、酶液、显色液，然后加入超纯水并混合，得到预定体积的反应液A；取透明反应管B，向其中加入试剂盒中的2×反应液、Ⅱ管的引物混合液、酶液、显色液，然后加入超纯水并混合，得到预定体积的反应液B；反应液A和反应液B的体积相同；
第二步、向第一套反应管A、B中分别加入相同体积的蒸馏水，盖好反应管A、B后混匀，作为阴性对照；向第二套反应管A、B中分别加入相同体积的HA阳性对照品和NA阳性对照品，盖好反应管A、B后混匀，作为阳性对照；蒸馏水和阳性对照品的加入体积相同；
第三步、将反应管A、B先分别在60℃-65℃恒温条件下放置25-60min进行RT-LAMP扩增，再于80℃-95℃下放置2-10min结束反应；
第四步、观察阴性对照反应液A、B和阳性对照反应液A、B的颜色，若阴性对照反应液A、B颜色均为紫罗兰色，且阳性对照反应液A、B颜色均为天蓝色，则第一步所用试剂盒是合格的；若各反应液颜色与前述情况不完全相符或完全不相符，则第一步所用试剂盒不合格。
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