WO2006049061A1 - Ｈ５型又はｈ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法 - Google Patents

Ｈ５型又はｈ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2006049061A1
WO2006049061A1 PCT/JP2005/019710 JP2005019710W WO2006049061A1 WO 2006049061 A1 WO2006049061 A1 WO 2006049061A1 JP 2005019710 W JP2005019710 W JP 2005019710W WO 2006049061 A1 WO2006049061 A1 WO 2006049061A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
base sequence
nucleic acid
region
target nucleic
oligonucleotide
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/019710
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Harumi Minekawa
Tsugunori Notomi
Toshihiro Yonekawa
Norihiro Tomita
Yoko Kuzuhara
Takahito Odagiri
Original Assignee
Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha
Japan As Represented By Director-General Of National Institute Of Infectious Diseases
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha, Japan As Represented By Director-General Of National Institute Of Infectious Diseases filed Critical Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha
Priority to ES05805278T priority Critical patent/ES2382446T3/es
Priority to JP2006543218A priority patent/JP4786548B2/ja
Priority to EP05805278A priority patent/EP1826269B1/en
Priority to US11/718,357 priority patent/US8043813B2/en
Priority to AT05805278T priority patent/ATE552353T1/de
Priority to CN2005800376057A priority patent/CN101052720B/zh
Publication of WO2006049061A1 publication Critical patent/WO2006049061A1/ja
Priority to HK08100681.6A priority patent/HK1110348A1/xx
Priority to US13/232,091 priority patent/US8389221B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting H5 or H7 avian influenza virus, and more specifically, an oligonucleotide primer for detecting H5 or H7 avian influenza virus, H5 or
  • the present invention relates to a method for detecting H7 avian influenza virus, a method for diagnosing influenza, and a kit for diagnosing influenza.
  • Influenza is an epidemic viral respiratory infection that affects a wide range of ages, from infants to the elderly, and is often fatal.
  • the H5 type avian influenza virus which is currently infecting birds, is not intended to infect humans.
  • human infection was confirmed in Hong Kong, and it became an epidemic until 6 out of 18 patients died. Fortunately, human infection since then has not been confirmed. Since 2004, human infections have been confirmed in Thailand and Vietnam, with 8 deaths in Thailand and 16 deaths in Vietnam. Comes out! /
  • H7 type in addition to H5 type, and H7 type is roughly divided into Eurasian type and American type by its sequence.
  • One death was reported during the 2003 epidemic in the Netherlands, and the H7 avian influenza virus epidemic was also reported in the United States from 2003 to 2004.
  • RT-PCR is considered to have higher detection sensitivity than other methods. ing.
  • the currently available RT-PCR method cannot detect viruses with higher sensitivity compared to the infectivity of the virus. Even if the RT-PCR method is negative, Infection with avian influenza virus is not denied.
  • Patent Document 1 European Patent Application Publication No. 1310565
  • Patent Document 2 Publication 2004-509648
  • Non-specific literature l Lau LT., Et al., Biocnem. Biophys. Res. Commun., Vol. 31 ⁇ , ⁇ .3 ⁇ 6 ⁇ ⁇ 42 (2004)
  • Non-Patent Document 2 Shang S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 302, p. 377-3 83 (2003)
  • Non-Patent Document 3 Collins RA., Et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 300, p.507 -515 (2003)
  • Non-Patent Document 4 Lee MS., Et al., J. Virol.Methods, vol. 97, p.13-22 (2001)
  • Non-Patent Document 5 Munch M., et al., Arch. Virol, vol. 146, p.87-97 (2001)
  • the present inventors have produced an oligonucleotide primer that hybridizes with a base sequence specific to H5 or H7 avian influenza virus.
  • H5 type or H7 type avian influenza virus can be detected with high sensitivity by amplifying a base sequence specific to H5 type or H7 type avian influenza virus by loop-mediated isothermal amplification) and completed the present invention. did.
  • the present invention provides the following (1) to (8).
  • oligonucleotide primer comprising an oligonucleotide selected from the following (a) to (c):
  • oligonucleotide having a primer function comprising a base sequence in which one to several bases are substituted, deleted, inserted or added among the oligonucleotides described in (a) or (b).
  • a method for detecting H5-type trifluenza virus comprising performing an amplification reaction of a target nucleic acid region of the virus.
  • H5 type avian influenza virus infection is diagnosed by detecting amplification of the target nucleic acid region of H5 type avian influenza virus using the oligonucleotide primers described in (1) to (4) Influenza diagnosis method.
  • a kit comprising the oligonucleotide primer according to (1) to (4) for diagnosing influenza.
  • the present invention also provides the following (9) to (16).
  • an oligonucleotide comprising at least 15 consecutive nucleotides selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 13 to 18 or a nucleotide sequence complementary thereto;
  • oligonucleotide having a primer function comprising a base sequence in which one to several bases are substituted, deleted, inserted or added among the oligonucleotides described in (a) or (b).
  • the F2 region of the target nucleic acid is on the 3 'end side and the Flc region of the target nucleic acid is on the 5' end side Base sequence.
  • a method for detecting an H5 type trifluenza virus comprising performing an amplification reaction of a target nucleic acid region of an H5 type trifluenza virus using the oligonucleotide primer according to (9) to (12).
  • H5 type avian influenza virus is diagnosed by detecting the amplification of the target nucleic acid region of H5 type trifluenza virus using the oligonucleotide primers described in (9) to (12) Influenza diagnosis method.
  • a kit comprising the oligonucleotide primer according to (9) to (12) for diagnosing influenza.
  • the present invention also provides the following (17) to (24).
  • oligonucleotide primer according to (17), comprising an oligonucleotide selected from the following (a) to (c): (a) an oligonucleotide comprising at least 15 consecutive bases, wherein the base sequence shown in SEQ ID NOs: 24-29 or a base sequence ability complementary thereto is also selected.
  • oligonucleotide having a primer function comprising a base sequence in which one to several bases are substituted, deleted, inserted or added among the oligonucleotides described in (a) or (b).
  • a method for detecting an H5 type triinfluenza virus comprising performing an amplification reaction of a target nucleic acid region of an H5 type trifluenza virus using the oligonucleotide primer according to (17) to (20).
  • the method for detecting an H5 type avian influenza virus according to (21), wherein the amplification reaction of the target nucleic acid region of the H5 type avian influenza virus is the LAMP method.
  • a kit comprising the oligonucleotide primer according to (17) to (20) for diagnosing influenza.
  • the present invention also provides the following (25) to (32).
  • oligonucleotide primer according to (25), comprising an oligonucleotide selected from the following (a) to (c):
  • an oligonucleotide comprising at least 15 consecutive nucleotides, wherein the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 35 to 40 or a nucleotide sequence complementary thereto is also selected.
  • oligonucleotide having a primer function comprising a base sequence in which one to several bases are substituted, deleted, inserted or added among the oligonucleotides described in (a) or (b).
  • a method for detecting an H5 type trifluenza virus comprising performing an amplification reaction of a target nucleic acid region of an H5 type trifluenza virus using the oligonucleotide primers according to (25) to (28).
  • (31) It is characterized by diagnosing the presence or absence of H5 type avian influenza virus by detecting amplification of a target nucleic acid region of H5 type trifluenza virus using the oligonucleotide primers described in (25) to (28). How to diagnose influenza.
  • a kit comprising the oligonucleotide primer according to (25) to (28) for diagnosing influenza.
  • the present invention further provides the following (33) to (40).
  • oligonucleotide primer according to (33), comprising an oligonucleotide selected from the following (a) to (c):
  • an oligonucleotide comprising at least 15 consecutive nucleotides selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 49 to 54 or a nucleotide sequence complementary thereto;
  • oligonucleotide having a primer function comprising a base sequence in which one to several bases are substituted, deleted, inserted or added among the oligonucleotides described in (a) or (b).
  • a base sequence specific to the H7 avian influenza virus can be amplified and consists of a base sequence selected from the following (a) to (b) from the 5 ′ end to the 3 ′ end.
  • a method for detecting an H7 type trifluenza virus comprising performing an amplification reaction of a target nucleic acid region of an H7 type trifluenza virus using the oligonucleotide primer according to (33) to (36).
  • the method for detecting an H7 avian influenza virus according to (37), wherein the amplification reaction of the target nucleic acid region of the H7 avian influenza virus is a LAMP method.
  • 39) It is characterized by diagnosing the presence or absence of H7 type avian influenza virus by detecting the amplification of the target nucleic acid region of H7 type trifluenza virus using the oligonucleotide primers described in (33) to (36). How to diagnose influenza.
  • kits comprising the oligonucleotide primer according to (33) to (36) for diagnosing influenza.
  • an oligonucleotide primer that selectively hybridizes with a base sequence specific to H5 or H7 avian influenza virus is prepared, and specific to H5 or H7 avian influenza virus by the LAMP method.
  • H5 or H7 avian influenza virus can be detected with high sensitivity and speed.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of a specificity test of a primer set for H5 avian influenza virus.
  • (A), (b), (c) and (d) show the results when using primer sets A, B, C and D, respectively.
  • NC represents negative control
  • HI represents New Caledonia
  • H3 represents Panama
  • PC represents positive control (H5 type plasmid DNA)
  • FIG. 2 is a graph showing the results of a sensitivity test of a primer set for H5 avian influenza virus.
  • (A), (b), (c) and (d) show the results when using primer sets A, B, C and D, respectively.
  • 10 3 ⁇ : L0 6 represents the dilution rate of the RNA extract
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of electrophoresis of products amplified with a primer set for H5 avian influenza virus.
  • Lane 1 is an lOObp ladder marker
  • lane 2 is a sample of LAMP product
  • lane 3 is a sample of LAMP product treated with Ddel.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of a cross test of a primer set for H5 avian influenza virus.
  • B—sd represents B / Shangdong / 07/97
  • B—sh represents B / Shanghai / 361/2002
  • AIV—H 1 etc. represent avian influenza virus HI etc.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of a reactivity confirmation test of a primer set for H7 type avian influenza virus. 250, 100 and 50 represent the amount of tRNA added (copy Z attachment), NC Represents a negative control.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of electrophoresis of products amplified with a primer set for H7 avian influenza virus.
  • Lane M is an lOObp ladder marker
  • lane 1 is a sample of LAMP product
  • lane 2 is a sample of LAMP product treated with Pstl.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of a crossover test of a primer set for H7 type avian influenza virus.
  • HI and H3 represent human influenza viruses HI and H3, B-sd represents B / Shangdong / 07/97, B-sh represents B / Shanghai / 361/2002, AIV-H1 etc. are avian influenza Virus represents HI etc.
  • PC represents positive control
  • NC represents negative control
  • FIG. 8 is a graph showing the results of reactivity of H7 avian influenza virus primer set against various strains.
  • (A) represents A / Netherlands / 219/2003, and
  • (b) represents A / Netherl ands / 33/2003.
  • 10 5 to 10 8 represent the dilution ratio of the RNA extract.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of reactivity of H7 avian influenza virus primer set against various strains.
  • A represents A / mallard / Netherlands / 12/00, and
  • (b) represents A / wig eon / Osaka / 1/2001.
  • 10 5 to 10 8 represent the dilution ratio of the RNA extract.
  • Samples used in the present invention include specimens derived from human or other animal organisms suspected of having influenza virus infection, such as sputum, bronchoalveolar lavage fluid, nasal discharge, nasal aspirate, nasal lavage fluid, Examples include nasal wipes, pharyngeal wipes, gargles, saliva, blood, serum, plasma, spinal fluid, urine, feces, and tissues.
  • cells used in infection experiments and culture media thereof, or biological specimens or specimens containing force-separated viruses such as cultured cells can also serve as samples. These samples may be subjected to pretreatment such as separation, extraction, concentration, and purification.
  • nucleic acid amplification Loop-mediated isothermal amplification called LAMP (International Publication No. 1) 0 0Z28082 pamphlet).
  • LAMP International Publication No. 1
  • a complementary nucleotide is annealed by combining the primer that anneals to the loop formed at this time by annealing the 3 ′ end of the nucleotide itself to the caged nucleotide and using it as a starting point for the complementary strand synthesis.
  • Synthetic reaction It is a nucleic acid amplification method that makes it possible.
  • the LAMP method is a highly specific nucleic acid amplification method that uses four primers that recognize at least six regions.
  • Oligonucleotide primers used in the LAMP method consist of a total of 6 regions of the base sequence of the vertical nucleic acid, that is, the region of 3 'end side force F3c, F2c, Flc, and B3, B2, B1 These are at least four types of primers that recognize the base sequence of the region, called inner primer F and B and outer primer F and B, respectively.
  • the complementary sequences of Flc, F2c, and F3c are called Fl, F2, and F3, and the complementary strands of Bl, B2, and B3 are called Blc, B2c, and B3c, respectively.
  • the inner primer recognizes a “specific nucleotide sequence region” on the target base sequence, and has a base sequence that gives the origin of synthesis at the 3 ′ end, and at the same time generates a nucleic acid synthesis reaction starting from this primer.
  • a primer including “a base sequence selected from F2” and “a base sequence selected from Flc” is referred to as an inner primer F (hereinafter abbreviated as FIP), and “a base sequence selected from B2”.
  • a primer containing “a base sequence selected from Blc” is called inner primer B (hereinafter abbreviated as BIP).
  • the outer primer is an oligonucleotide having a base sequence that recognizes “a specific nucleotide sequence region existing 3 ′ from the region recognized by the inner primer” on the target base sequence and provides a starting point for synthesis.
  • a primer containing “a base sequence selected from F3” is an outer primer F (hereinafter abbreviated as F3)
  • a primer containing “a base sequence selected from B3” is an outer primer B (hereinafter abbreviated as B3).
  • F in each primer is a primer indication that complementarily binds to the sense strand of the target base sequence and provides a starting point for synthesis, while B is complementary to the antisense strand of the target base sequence.
  • the length of the oligonucleotide used as a primer is 10 bases or more, preferably 15 bases or more.
  • Either chemically synthesized or natural primers may be used as a single oligonucleotide. It can be a mixture of oligonucleotides! /.
  • a loop primer in addition to the inner primer and the outer primer, another primer, that is, a loop primer can be used.
  • the Loop Primer has a complementary sequence that occurs on the same strand of the amplified product by the LAMP method.
  • two types of primers one for each of the two strands
  • a base sequence complementary to the sequence in the loop at the 3 'end! #2 When this primer is used, the starting point of nucleic acid synthesis is increased, and the reaction time can be shortened and the detection sensitivity can be increased (WO 02Z24902 pamphlet).
  • Oligonucleotides can be produced by known methods, for example, can be chemically synthesized. Alternatively, a natural nucleic acid can be cleaved with a restriction enzyme or the like, modified so as to have a desired base sequence, or ligated. Specifically, it can be synthesized using an oligonucleotide synthesizer or the like. In addition, as a method for synthesizing an oligonucleotide having a base sequence in which one to several bases are substituted, deleted, inserted or added, a method known per se can be used. For example, it is possible to synthesize such oligonucleotides by combining site-directed mutagenesis, gene homologous recombination, primer extension, or PCR alone or in appropriate combination.
  • Stringent nobbreviation conditions include, for example, 50% formamide, 5 X SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (PH7.6), 5 X Denhart's solution, 10% dextran sulfate, and 20 / solution containing zg / ml of DNA, after hybrida I See Chillon 42 ° C De ⁇ , and primary lavage with 2 X SSC '0. 1 0/ 0 SDS at room temperature in, in the next! / ⁇ , approximately 65 ° C [antifreeze! / ⁇ Te 0. 1 X SSC-0. washing secondary in 1 0/0 SDS, conditions and the like that.
  • the influenza virus is an RNA virus.
  • the nucleic acid amplification reaction can be similarly promoted by adding reverse transcriptase to the reaction solution when the cocoon type is DNA (RT-LAMP method).
  • BIP5 5 -CAAACTCCAATGGGGGCATGGTGAGAGGGTGTAT-3
  • F3m6 5 '-GGAGTTCTTCTGGACAA-3' (SEQ ID NO: 4)
  • LF24 5 '-GAGTCCCCTTTCTTGACAAT-3' (SEQ ID NO: 11)
  • LB1 5 '-GATAAACTCTAGTATGCCA-3' (SEQ ID NO: 12) (Primer set B) Column number 19) SEQ ID NO: 20)
  • LF6 5 '-CCAGCTACACTACAATCTCT-3' (SEQ ID NO: 33)
  • LB6 5 '-TCCAGCCAATGACCTCTG-3' (SEQ ID NO: 34)
  • the following primer set E was selected from the base sequence of magglutinin (base sequence shown by SEQ ID NO: 1).
  • the enzyme used in the nucleic acid synthesis is not particularly limited as long as it is a cage-dependent nucleic acid synthase having strand displacement activity.
  • examples of such an enzyme include Bst DNA polymerase (large fragment), Bca (exo-) DNA polymerase, and Talenow fragment of E. coli DNA polymerase I, and preferably Bst DNA polymerase (large fragment).
  • the reverse transcriptase used in the RT-LAMP method is not particularly limited as long as it has an activity of synthesizing cDNA using RNA as a cage.
  • examples of such enzymes include AMV, Clone d AMV, MMLV reverse transcriptase, Superscripts ReverTraAce, Thermoscript, etc.
  • AMV or Cloned AMV reverse transcriptase is used.
  • RT-LAMP reaction can be performed with one enzyme using an enzyme that has both reverse transcriptase activity and DNA polymerase activity, such as Bca DNA polymerase.
  • the enzyme or reverse transcriptase used in the nucleic acid synthesis may be a force purified product such as a virus or a bacterium, or a gene produced by a genetic recombination technique. These enzymes may be modified by fragmentation or amino acid substitution.
  • a known technique can be applied to the detection of the nucleic acid amplification product after the LAMP reaction.
  • it can be detected using a labeled oligonucleotide that specifically recognizes the amplified base sequence or a fluorescent intercalator method (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-242169), and the reaction solution after completion of the reaction can be detected.
  • It can be easily detected by subjecting it to agarose gel electrophoresis as it is. In agarose gel electrophoresis, a large number of bands with different base lengths are detected as ladders in the LAMP amplification product.
  • Various reagents necessary for the detection of nucleic acid amplification using the primer of the present invention can be packaged and kited in advance.
  • various oligonucleotides necessary as a primer or loop primer of the present invention four types of dNTPs that serve as a base for nucleic acid synthesis, a DNA polymerase that performs nucleic acid synthesis, an enzyme having reverse transcription activity, and an enzyme reaction Buffers and salts that give conditions suitable for the reaction, protective agents that stabilize enzymes and cages, and reagents necessary for detection of reaction products, if necessary, are provided as kits.
  • Example 1 Confirmation of Reactivity of Primer Set for H5 Avian Influenza Virus Primer reactivity was confirmed by the following method.
  • the composition of the reaction solution for amplifying nucleic acid by the LAMP method is as follows. Primer synthesis was requested from QIAGEN and purified by OPC (reverse phase column cartridge).
  • H5 type plasmid DNA (HK / 213/03; donor from the National Institute of Infectious Diseases) was added 104 copies were subjected to 60 minutes RT- LAMP reaction at 62. 5 ° C. The reaction was detected in real time using LA-320C (Eiken Igaku). As a result, amplification was confirmed for four primer sets (primer sets A, B, C, and D).
  • Figure 1 is a graph showing the results of the specificity test. As shown in FIG. 1, no amplification of HI type or H3 type was confirmed with any of the primer sets. From the above results, This primer set also showed high specificity for the H5 type.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of the sensitivity test.
  • primer set A was used, amplification was confirmed even in a sample diluted 10 5 times, and it was revealed that the sensitivity was the highest.
  • Example 2 Confirmation of product amplified with primer set for H5 type avian influenza virus
  • the LAMP product amplified with primer set A was confirmed by electrophoresis and restriction enzyme Ddel.
  • FIG. 3 shows the results of electrophoresis. As can be seen from lane 2 in Fig. 3, a ladder pattern peculiar to LAMP products was confirmed. In addition, digestion was confirmed in the sample treated with Ddel (lane 3). From the above results, it became clear that the target sequence was specifically amplified.
  • Example 3 Evaluation of primer set for H5 avian influenza virus (cross test) A / New Caledonia / 20/99 (HlNl), A / Panama / 2007/99 (H3N2), B of human influenza virus A total of 18 samples of / Shangdong / 07/97 and B / Shanghai / 361/2002 and avian influenza viruses H1 to H15 (excluding H5) were used as samples.
  • RNA was extracted from the culture virus using QIAamp Viral RNA Kit (QIAGEN), and 5 ⁇ L of the extract was used for RT-LAMP reaction (primer set A was used as a primer).
  • the RT-LAMP method was powerful in that no amplification was observed in any sample. Therefore, the RT-LAMP method was found to be highly specific.
  • Example 4 Evaluation of primer set for H5 avian influenza virus (sensitivity test)
  • RNA extracted from cultured virus is serially diluted (10 4 to 10 8 ) with RNase-free sterilized water.
  • RT-PCR is 10 L, RT-LAMP (primer set A is used as a primer) 5 ⁇ L of diluted solution was used. [0039] The RT-PCR method was performed by correcting the conditions listed on the website of the Infectious Disease Information Center of the National Institute of Infectious Diseases.
  • reverse transcription reaction was performed at 50 ° C for 30 minutes, treated at 94 ° C for 2 minutes, then 94 ° C for 1 minute, 45 ° C1
  • the cycle of 1 minute at 72 ° C was repeated 30 times, and the extension reaction was further carried out at 72 ° C for 10 minutes and stored at 4 ° C.
  • compositions of the primers and reaction solution used in the RT-PCR method are as follows.
  • H5 515f 5-CATACCCAACAATAAAGAGG-3 '(SEQ ID NO: 46)
  • H5 1220r 5 '-GTGTTC ATTTTGTTAATGAT-3' (SEQ ID NO: 47)
  • RNase Free sterilized water is added as appropriate to adjust the reaction volume to 50 L.
  • Table 1 summarizes the results of amplification by the RT-PCR method and the RT-LAMP method.
  • RT amplification by the RT-PCR method and the RT-LAMP method.
  • the column of the LAMP method shows the proportion of samples in which amplification was confirmed.
  • the amplification in RT-PCR confirmed the result of electrophoresis visually (in Table 1, ⁇ indicates that amplification was detected, and X indicates that amplification could not be detected).
  • the RT-LAMP method was 10 to 10 times more sensitive than the LOO method in any strain.
  • primer set E The reactivity of primer set E was confirmed by the following method.
  • the composition of the reaction solution for performing nucleic acid amplification by the LAMP method is as follows.
  • primer synthesis is QIA
  • the product purified by OPC (reverse phase column cartridge) was used from GEN.
  • the base sequence of A / Netherlands / 219/2003 (H7N7) (the strain that was isolated when the death occurred in the Netherlands) (the fragment containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1) was incorporated into the cloning vector.
  • TRNA was prepared by transcription reaction. Prepared tRNA is added to the above reaction solution to 250, 100 or 50 copies / accessory, and amplification reaction is performed using LA-200 (Teramettas), a real-time turbidity measurement device at 62.5 ° C for 35 minutes. And detection.
  • FIG. 5 shows the results of real-time detection of the negative control when the amount of tRNA added was 250, 100, and 50 copies of Z assembly. From this result, it was found that 50 copies could be detected.
  • Example 6 Confirmation of product amplified with H7 avian influenza virus primer set
  • the LAMP product amplified with primer set E was confirmed by electrophoresis and restriction enzyme Pstl.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of electrophoresis. M stands for lOObp ladder, lane 1 is a sample of untreated LAMP product, and lane 2 is a sample of LAMP product digested with Pstl. As can be seen from lane 1 in Fig. 6, a ladder pattern specific to the LAMP product was confirmed. In addition, digestion was confirmed in the sample treated with Pstl (lane 2). From the above results, it was revealed that the target sequence was specifically amplified.
  • Example 7 Evaluation of primer set for H7 avian influenza virus (cross-ability test) A / New Caledonia / 20/99 (HlNl), A / Panama / 2007/99 (H3N2), B of human influenza virus Primers were examined for specificity using a total of 18 samples of / Shangdong / 07/97 and B / Shanghai / 361/2002 and avian influenza viruses H1 to H15 (excluding H7).
  • RNA was extracted from the cultured virus using QIAamp Viral RNA Kit (QIAGEN), and the extracted RNA diluted 100-fold was used for RT-LAMP reaction.
  • the tRNA prepared in Example 5 was used for the positive control (PC), and distilled water was used for the negative control.
  • Example 8 Evaluation of primer set for H7 avian influenza virus (for various strains) Reactivity)
  • RNA extracted from the cultured virus was serially diluted (10 5 to 10 8 ) with RNase-free sterilized water and 5 ⁇ L of the diluted solution was used.
  • H5 or H7 avian influenza virus can be detected with high sensitivity and speed.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Ｈ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの塩基配列から設計された任意の塩基配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、該プライマーを用いた核酸増幅法、核酸増幅の検出によるＨ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルス感染の診断方法、並びにインフルエンザ診断用キットを本発明は提供する。

Description

明 細 書
H5型又は H7型トリインフルエンザウイルスの検出方法
技術分野
[0001] 本発明は、 H5型又は H7型トリインフルエンザウイルスの検出法方法に関し、さらに 詳しくは、 H5型又は H7型トリインフルエンザウイルスを検出するためのオリゴヌタレ ォチドプライマ一、当該プライマーを用いた H5型又は H7型トリインフルエンザウィル スの検出方法、インフルエンザの診断方法及びインフルエンザを診断するためのキッ トに関するものである。
背景技術
[0002] インフルエンザは流行性のウィルス性呼吸器感染症であり、乳幼児から高齢者まで 幅広い年齢層が罹患し、しばしば致命的である。現在、トリに感染して問題となって いる H5型トリインフルエンザウイルスは、本来ならばヒトに感染しないものである。しか し、 1997年に香港でヒトへの感染が確認され、 18名の患者のうち 6名が死亡するま での流行となった。それ以降のヒトへの感染は幸い確認されていなかった力 2004 年に入ってから、タイやベトナムでヒトへの感染が確認されており、タイでは 8名、べト ナムでは 16名の死亡者が出て!/、る。
[0003] 高病原性のトリインフルエンザウイルスは、 H5型のほかに H7型が存在し、 H7型は、 その配列によって、ユーラシア型とアメリカ型に大きく 2分される。 2003年にオランダ で流行した際には死亡者が 1名報告されており、アメリカでも 2003年から 2004年に かけて H7型トリインフルエンザウイルスの流行が報告されている。
[0004] 現在、トリインフルエンザウイルスの検出には、ヒトの A型インフルエンザウイルス迅速 診断キットが用いられている。し力し、どの亜型のウィルスに感染したかの同定には、 分離されたウィルスの抗原解析や遺伝子検査などのさらに詳しい解析を必要として いた。
[0005] 確実な結果が得られるウィルス分離培養による診断は、数日を要するために迅速な 診断を行うことができな 、。ウィルス分離と比較して迅速な診断が可能な方法が 、く つかあるが、その中でも RT— PCR法は、他の方法と比較して検出感度が高いとされ ている。しかし、現在公開されている RT— PCR法では、ウィルスの感染価と比較して 高い感度でウィルスを検出することができないとの報告があり、 RT— PCR法による検 查で陰性となってもトリインフルエンザウイルスへの感染が否定されるわけではない。
[0006] そこで、迅速かつ高感度に H5型及び H 7型トリインフルエンザウイルスを検出できる 検査法が望まれていた。
[0007] 特許文献 1:欧州特許出願公開第 1310565号明細書
特許文献 2：公表 2004 - 509648号公報
非特干文献 l:Lau LT., et al., Biocnem. Biophys. Res. Commun., vol. 31ό, ρ.3ό6~ό 42 (2004)
非特許文献 2:Shang S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 302, p.377- 3 83 (2003)
非特許文献 3: Collins RA., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 300, p.507 -515 (2003)
非特許文献 4: Lee MS., et al., J. Virol. Methods, vol. 97, p.13- 22 (2001) 非特許文献 5:Munch M., et al., Arch. Virol, vol. 146, p.87-97 (2001)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、 H5型又は H7 型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列とハイブリダィズするオリゴヌクレオ チドプライマ一を作製し、 LAMP (loop- mediated isothermal amplification)法により H 5型又は H7型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、 H5 型又は H7型トリインフルエンザウイルスを高感度に検出できることを見出し、本発明 を完成した。
課題を解決するための手段
[0009] すなわち、本発明は以下の（1)〜（8)を提供する。
(1) 配列番号 1で示される H5型トリインフルエンザウイルスのへマダルチュン塩基 配列の、 693番〜 959番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相 補的な塩基配列力 設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。 (2) 以下の（a)〜（c)より選ばれたオリゴヌクレオチドを含む、（1)記載のオリゴヌタレ ォチドプライマ一。
(a)配列番号 2〜7で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれ た、少なくとも連続する 15塩基を含むオリゴヌクレオチド。
(b)前記 (a)に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし うるオリゴヌクレオチド。
(c)前記 (a)又は (b)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、 1ないし数個の塩基が置換、 欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
(3) H5型トリインフルエンザウイルスのへマダルチュンの標的核酸上の 3，末端側 力 F3c、 F2c、 Flcという塩基配列領域を、 5'末端側から B3、 B2、 Blという塩基配 列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列を F3、 F2、 Fl、そして B3c、 B2c、 Bl cとしたときに、以下の（a)〜（d)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（1) 〜（2)記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)標的核酸の F2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Flc領域を有す る塩基配列。
(b)標的核酸の F3領域を有する塩基配列。
(c)標的核酸の B2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Blc領域を有す る塩基配列。
(d)標的核酸の B3領域を有する塩基配列。
(4) H5型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、 5'末端から 3 '末端に向か 、以下の（a)〜 (b)力も選ばれた塩基配列力も成ることを特徴とする（ 1)〜（3)記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a) 5' - (配列番号 2の塩基配列に相補的な塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の 塩基配列） （配列番号 3の塩基配列） 3'。
(b) 5' （配列番号 5の塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の塩基配列） （配列番 号 6の塩基配列に相補的な塩基配列） 3'。
(5) (1)〜（4)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、 H5型トリインフルェン ザウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする H5型トリインフルェン ザウィルスの検出方法。
(6) H5型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応が LAMP法であ ることを特徴とする（5)記載の H5型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
(7) (1)〜（4)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて H5型トリインフルエンザ ウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、 H5型トリインフルエンザウィル ス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
(8) インフルエンザを診断するための、（1)〜 (4)記載のオリゴヌクレオチドプライマ 一を含むことを特徴とするキット。
本発明は、また、以下の（9)〜（16)を提供する。
(9) 配列番号 1で示される H5型トリインフルエンザウイルスのへマダルチュン塩基 配列の、 19番〜 220番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相 補的な塩基配列力 設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
(10) 以下の（a)〜（c)より選ばれたオリゴヌクレオチドを含む、（9)記載のオリゴヌク レオチドプライマ一。
(a)配列番号 13〜18で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列力 選ば れた、少なくとも連続する 15塩基を含むオリゴヌクレオチド。
(b)前記 (a)に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし うるオリゴヌクレオチド。
(c)前記 (a)又は (b)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、 1ないし数個の塩基が置換、 欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
(11) H5型トリインフルエンザウイルスのへマダルチュンの標的核酸上の 3，末端側 力 F3c、 F2c、 Flcという塩基配列領域を、 5'末端側から B3、 B2、 Blという塩基配 列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列を F3、 F2、 Fl、そして B3c、 B2c、 Bl cとしたときに、以下の（a)〜（d)力も選ばれた塩基配列力も成ることを特徴とする（9) 〜（10)記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)標的核酸の F2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Flc領域を有す る塩基配列。
(b)標的核酸の F3領域を有する塩基配列。
(c)標的核酸の B2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Blc領域を有す る塩基配列。
(d)標的核酸の B3領域を有する塩基配列。
(12) H5型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、 5 '末端か ら 3 '末端に向か 、以下の（a)〜 (b)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする (9)〜（11)記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a) 5' - (配列番号 13の塩基配列に相補的な塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の 塩基配列） （配列番号 14の塩基配列） 3'。
(b) 5' （配列番号 16の塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の塩基配列） （配列 番号 17の塩基配列に相補的な塩基配列） 3 '。
(13) (9)〜（12)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、 H5型トリインフル ェンザウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする H5型トリインフル ェンザウィルスの検出方法。
(14) H5型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応が LAMP法で あることを特徴とする（13)記載の H5型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
(15) (9)〜（ 12)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用 、て H5型トリインフルェ ンザウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、 H5型トリインフルエンザゥ ィルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
(16) インフルエンザを診断するための、（9)〜（12)記載のオリゴヌクレオチドプライ マーを含むことを特徴とするキット。
本発明は、また、以下の（17)〜（24)を提供する。
(17) 配列番号 1で示される H5型トリインフルエンザウイルスのへマダルチュン塩基 配列の、 114番〜 333番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相 補的な塩基配列力 設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
(18) 以下の（a)〜（c)より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする（17) 記載のオリゴヌクレオチドプライマー。 (a)配列番号 24〜29で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列力も選ば れた、少なくとも連続する 15塩基を含むオリゴヌクレオチド。
(b)前記 (a)に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし うるオリゴヌクレオチド。
(c)前記 (a)又は (b)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、 1ないし数個の塩基が置換、 欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
(19) H5型トリインフルエンザウイルスのへマダルチュンの標的核酸上の 3，末端側 力 F3c、 F2c、 Flcという塩基配列領域を、 5'末端側から B3、 B2、 Blという塩基配 列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列を F3、 F2、 Fl、そして B3c、 B2c、 Bl cとしたときに、以下の（a)〜（d)力も選ばれた塩基配列力も成ることを特徴とする（17 ；)〜（18)記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)標的核酸の F2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Flc領域を有す る塩基配列。
(b)標的核酸の F3領域を有する塩基配列。
(c)標的核酸の B2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Blc領域を有す る塩基配列。
(d)標的核酸の B3領域を有する塩基配列。
(20) H5型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、 5 '末端か ら 3 '末端に向か 、以下の（a)〜 (b)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする ( 17)〜（ 19)記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a) 5' - (配列番号 24の塩基配列に相補的な塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の 塩基配列） （配列番号 25の塩基配列） 3'。
(b) 5' （配列番号 27の塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の塩基配列） （配列 番号 28の塩基配列に相補的な塩基配列） 3 '。
(21) (17)〜（20)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、 H5型トリインフル ェンザウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする H5型トリインフル ェンザウィルスの検出方法。 (22) H5型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応が LAMP法で あることを特徴とする（21)記載の H5型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
(23) (17)〜（20)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて H5型トリインフルェ ンザウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、 H5型トリインフルエンザゥ ィルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
(24) インフルエンザを診断するための、（17)〜（20)記載のオリゴヌクレオチドブラ イマ一を含むことを特徴とするキット。
本発明は、また、以下の（25)〜（32)を提供する。
(25) 配列番号 1で示される H5型トリインフルエンザウイルスのへマグルチニン塩基 配列の、 874番〜 1065番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと 相補的な塩基配列力 設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
(26) 以下の（a)〜（c)より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする（25) 記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)配列番号 35〜40で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列力も選ば れた、少なくとも連続する 15塩基を含むオリゴヌクレオチド。
(b)前記 (a)に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし うるオリゴヌクレオチド。
(c)前記 (a)又は (b)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、 1ないし数個の塩基が置換、 欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
(27) H5型トリインフルエンザウイルスのへマダルチュンの標的核酸上の 3，末端側 力 F3c、 F2c、 Flcという塩基配列領域を、 5'末端側から B3、 B2、 B1という塩基配 列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列を F3、 F2、 Fl、そして B3c、 B2c、 Bl cとしたときに、以下の（a)〜（d)力も選ばれた塩基配列力も成ることを特徴とする（25 )〜（26)記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)標的核酸の F2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Flc領域を有す る塩基配列。
(b)標的核酸の F3領域を有する塩基配列。 (c)標的核酸の B2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Blc領域を有す る塩基配列。
(d)標的核酸の B3領域を有する塩基配列。
(28) H5型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、 5 '末端か ら 3 '末端に向か 、以下の（a)〜 (b)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする (25)〜（27)記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a) 5' - (配列番号 35の塩基配列に相補的な塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の 塩基配列） （配列番号 36の塩基配列） 3'。
(b) 5' （配列番号 38の塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の塩基配列） （配列 番号 39の塩基配列に相補的な塩基配列） 3 '。
(29) (25)〜（28)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、 H5型トリインフル ェンザウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする H5型トリインフル ェンザウィルスの検出方法。
(30) H5型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応が LAMP法で あることを特徴とする（29)記載の H5型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
(31) (25)〜（28)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて H5型トリインフルェ ンザウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、 H5型トリインフルエンザゥ ィルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
(32) インフルエンザを診断するための、（25)〜（28)記載のオリゴヌクレオチドブラ イマ一を含むことを特徴とするキット。
本発明は、さらに以下の（33)〜 (40)を提供する。
(33) 配列番号 48で示される H7型トリインフルエンザウイルスのへマグルチュン塩 基配列の、 1016番〜 1225番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれ らと相補的な塩基配列力 設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
(34) 以下の（a)〜（c)より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする（33) 記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)配列番号 49〜54で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列力 選ば れた、少なくとも連続する 15塩基を含むオリゴヌクレオチド。 (b)前記 (a)に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし うるオリゴヌクレオチド。
(c)前記 (a)又は (b)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、 1ないし数個の塩基が置換、 欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
(35) H7型トリインフルエンザウイルスのへマダルチュンの標的核酸上の 3，末端側 力 F3c、 F2c、 Flcという塩基配列領域を、 5'末端側から B3、 B2、 Blという塩基配 列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列を F3、 F2、 Fl、そして B3c、 B2c、 Bl cとしたときに、以下の（a)〜（d)力も選ばれた塩基配列力も成ることを特徴とする（33 )〜（34)記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)標的核酸の F2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Flc領域を有す る塩基配列。
(b)標的核酸の F3領域を有する塩基配列。
(c)標的核酸の B2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Blc領域を有す る塩基配列。
(d)標的核酸の B3領域を有する塩基配列。
(36) H7型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、 5 '末端か ら 3 '末端に向か 、以下の（a)〜 (b)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする (33)〜（35)記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a) 5' - (配列番号 49の塩基配列に相補的な塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の 塩基配列） （配列番号 50の塩基配列） 3'。
(b) 5' （配列番号 52の塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の塩基配列） （配列 番号 53の塩基配列に相補的な塩基配列） 3 '。
(37) (33)〜（36)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、 H7型トリインフル ェンザウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする H7型トリインフル ェンザウィルスの検出方法。
(38) H7型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応が LAMP法で あることを特徴とする（37)記載の H7型トリインフルエンザウイルスの検出方法。 (39) (33)〜（36)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて H7型トリインフルェ ンザウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、 H7型トリインフルエンザゥ ィルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
(40) インフルエンザを診断するための、（33)〜（36)記載のオリゴヌクレオチドブラ イマ一を含むことを特徴とするキット。
発明の効果
[0014] 本発明によれば、 H5型又は H7型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列と 選択的にハイブリダィズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、 LAMP法により H5型又は H7型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、 H5型又は H7型トリインフルエンザウイルスを高感度かつ迅速に検出することができ る。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]H5型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの特異性試験の結果を表す グラフである。（a) , (b) , (c)及び (d)は、それぞれ、プライマーセット A, B, C及び D を用いた場合の結果を表している。 NCはネガティブコントロールを、 HIは New Caled oniaを、 H3は Panamaを、 PCはポジティブコントロール（H5型プラスミド DNA)を表す
[図 2]H5型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの感度試験の結果を表すグ ラフである。（a) , (b) , (c)及び (d)は、それぞれ、プライマーセット A, B, C及び Dを 用いた場合の結果を表している。 103〜： L06は、 RNA抽出物の希釈率を表す
[図 3]H5型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットで増幅した産物の電気泳動 の結果を表す図である。レーン 1は lOObp ladder markerであり、レーン 2は LAMP産 物のサンプルであり、レーン 3は LAMP産物を Ddelで処理したサンプルである。
[図 4]H5型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの交差試験の結果を表すグ ラフである。 B— sdは B/Shangdong/07/97を、 B— shは B/Shanghai/361/2002を、 AIV— H 1等はトリインフルエンザウイルス HI等を、それぞれ表す。
[図 5]H7型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性確認試験の結果を 表すグラフである。 250、 100、 50は tRNAの添カ卩量（コピー Zアツセィ）を表し、 NC は陰性対照を表す。
[図 6]H7型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットで増幅した産物の電気泳動 の結果を表す図である。レーン Mは lOObp ladder markerであり、レーン 1は LAMP産 物のサンプルであり、レーン 2は LAMP産物を Pstlで処理したサンプルである。
[図 7]H7型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの交差性試験の結果を表す グラフである。 HI及び H3はヒトインフルエンザウイルス HI型及び H3型を表し、 B-sd は B/Shangdong/07/97を表し、 B-shは B/Shanghai/361/2002を表し、 AIV-H1等はトリ インフルエンザウイルス HI等を表し、 PCは陽性対照を表し、 NCは陰性対照を表す
[図 8]様々な株に対する H7型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性 の結果を表すグラフである。（a)は A/Netherlands/219/2003を表し、（b)は A/Netherl ands/33/2003を表す。 105〜108は、 RNA抽出物の希釈率を表す。
[図 9]様々な株に対する H7型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性 の結果を表すグラフである。（a)は A/mallard/Netherlands/ 12/00を表し、 (b)は A/wig eon/Osaka/1/2001を表す。 105〜108は、 RNA抽出物の希釈率を表す。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明において使用される試料としては、インフルエンザウイルス感染が疑われる人 間又は他の動物の生体由来の検体、例えば、喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、鼻 腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、血液、血清、血 漿、髄液、尿、糞便、組織などが挙げられる。また、感染実験などに用いられた細胞 やその培養液、あるいは生体由来の検体や培養細胞など力 分離したウィルスを含 む検体なども試料となりうる。これらの試料は分離、抽出、濃縮、精製などの前処理を 行っても良い。
[0017] このような核酸の増幅は、納富らが開発した、 PCR法で不可欠とされる温度制御が不 要な新 U、核酸増幅法： LAMP法と呼ばれるループ媒介等温増幅法 (国際公開第 0 0Z28082号パンフレット）で達成される。この方法は、铸型となるヌクレオチドに自身 の 3'末端をァニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるル 一プにァニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応 を可能とした核酸増幅法である。また、 LAMP法は、最低 6つの領域を認識する 4つ のプライマーを使う特異性の高!、核酸増幅法である。
[0018] LAMP法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、铸型核酸の塩基配列の計 6 領域、すなわち 3'末端側力 F3c、 F2c、 Flcという領域と、 5'末端側から B3、 B2、 B1という領域の塩基配列を認識する少なくとも 4種類のプライマーであって、各々ィ ンナープライマー F及び Bとアウタープライマー F及び Bと呼ぶ。また、 Flc、 F2c、 F3 cの相補配列をそれぞれ Fl、 F2、 F3、また Bl、 B2、 B3の相補鎖を Blc、 B2c、 B3c と呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領 域」を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を 3'末端に有し、同時にこのプライマ 一を起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を 5' 末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「F2より選ばれた塩基配列」及び「F lcより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマー F (以下、 FIPと略 す）、そして「B2より選ばれた塩基配列」と「Blcより選ばれた塩基配列」を含むプライ マーをインナープライマー B (以下、 BIPと略す）と呼ぶ。一方、アウタープライマーと は、標的塩基配列上の「インナープライマーが認識する領域よりも 3'末端側に存在 するある特定のヌクレオチド配列領域」を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有 するオリゴヌクレオチドである。ここで、「F3より選ばれた塩基配列」を含むプライマー をアウタープライマー F (以下、 F3と略す）、「B3より選ばれた塩基配列」を含むプライ マーをアウタープライマー B (以下、 B3と略す）と呼ぶ。ここで、各プライマーにおける Fとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー 表示であり、一方 Bとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起 点を提供するプライマー表示である。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌタレ ォチドの長さは、 10塩基以上、好ましくは 15塩基以上で、化学合成あるいは天然の どちらでも良ぐ各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよぐ複数のオリ ゴヌクレオチドの混合物であってもよ！/、。
[0019] LAMP法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、さらにこれと は別のプライマー、すなわちループプライマーを用いる事ができる。ループプライマ 一 (Loop Primer)は、 LAMP法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が 互いにァニールしてループを形成するとき、該ループ内の配列に相補的な塩基配列 をその 3 '末端に含むプライマー 2種（二本鎖を構成する各々につ 、て 1つずつ）を!ヽ う。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感 度の上昇が可能となる（国際公開第 02Z24902号パンフレット)。
[0020] オリゴヌクレオチドは、公知の方法により製造することができ、例えばィ匕学的に合成す ることができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、所望の塩基 配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、ォ リゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、 1ないし数個の塩 基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの合 成法も、 自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、 遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又は PCR法を単独又は適宜組合せて、か 力るオリゴヌクレオチドを合成することが可能である。
[0021] 本明細書における「ストリンジェントなノ、イブリダィゼーシヨン条件」としては、一般に知 られたものを選択することができる。ストリンジェントな条件として、例えば、 50%ホル ムアミド、 5 X SSC (150mM NaCl、 15mM クェン酸三ナトリウム）、 50mMリン酸 ナトリウム（PH7. 6)、 5 Xデンハーツ溶液、 10%デキストラン硫酸、及び 20 /z g/ml の DNAを含む溶液中、 42°Cでー晚ハイブリダィゼーシヨンした後、室温で 2 X SSC' 0. 10/0SDS中で一次洗净し、次!/ヽで、約 65°C【こお!/ヽて 0. 1 X SSC-0. 10/0SDSで 二次洗浄する、という条件があげられる。
[0022] インフルエンザウイルスは RNAウィルスである。 LAMP法は铸型が RNAの場合には 、铸型が DNAの場合の反応液に逆転写酵素を添加する事で、同様に核酸増幅反 応を進めることができる（RT—LAMP法)。
[0023] 本発明者らは H5型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を迅速に増幅で きる LAMP法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、 H5 型トリインフルエンザウイルスのへマダルチュンの塩基配列（配列番号 1で示される塩 基配列）から、プライマーセットとして次の A、 B、 C及び Dの 4組を選定した。なお、こ れらのプライマーの配列は、既に報告されている（例えば、特許文献 2)、 H5型トリイ ンフルェンザウィルスの検出のための NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Ampli fication)用のプライマーの配列とは全く異なる。
(プライマーセット A)
FIP19c : 5
TGC-3' (配列番号 8)
BIP5： 5 -CAAACTCCAATGGGGGCATGGTGAGAGGGTGTAT-3 F3m6： 5 '-GGAGTTCTTCTGGACAA-3 ' (配列番号 4)
B3m： 5'- GTCGCAAGGACTAATCT- 3' (配列番号 10)
LF24： 5 '-GAGTCCCCTTTCTTGACAAT-3' (配列番号 11) LB1： 5 '-GATAAACTCTAGTATGCCA-3' (配列番号 12) (プライマーセット B) 列番号 19) 配列番号 20)
F3： 5 '-CAGATTTGCATTGGTTACCA-3 ' (配列番号 15)
B3： 5'- CGTCACACATTGGGTTTC- 3' (配列番号 21)
LF： 5 '-TTCCATTATTGTGTCAACC-3' (配列番号 22)
LB8： 5 '-CGATCTAGATGGAGTGAAGC-3' (配列番号 23) (プライマーセット C) 番号 30) 番号 31)
F3： 5 '-GGAAAAGACACACAATGGG-3 ' (配列番号 26)
B3： 5 '-GCTCAATAGGTGTTTCAGTT-3 ' (配列番号 32)
LF6： 5 '-CCAGCTACACTACAATCTCT-3' (配列番号 33) LB6： 5 '-TCCAGCCAATGACCTCTG-3 ' (配列番号 34)
(プライマーセット D) 番号 41) 配列番号 42)
F3： 5 -TCTAGTATGCCATTCCACAA-3' (配列番号 37)
B3： 5'- ACCATCTACCATTCCCTG- 3' (配列番号 43)
LF8： 5 '-TC AC ATATTTGGGGC ATTCC-3 ' (配列番号 44)
LB8： 5 '-AGAGAGGACTATTTGGAGCT-3 ' (配列番号 45)
[0024] さらに、本発明者らは H7型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を迅速に 増幅できる LAMP法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結 果、 H7型トリインフルエンザウイルスのへマグルチニン塩基配列（配列番号 1で示さ れる塩基配列）から、以下のプライマーセット Eを選定した。
(プライマーセット E) 配列番号 55)
3' (配列番号 56)
22F3m： 5 -TTCCCGAAATCCCAAA-3' (配列番号 51)
22B3： 5 '-GGTTAGTTTTTTCTATAAGCCG-3 ' (配列番号 57)
22 - 9LF： 5 -CCCATCCATTTTCAATGAAAC-3' (配列番号 58)
22- 9LB： 5 '-ACTGCTGCAGATTACAAAAG-3 ' (配列番号 59)
[0025] 核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する铸型依存性核酸合成酵素であれ ば特に限定されない。このような酵素としては、 Bst DNAポリメラーゼ (ラージフラグメ ント)、 Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、大腸菌 DNAポリメラーゼ Iのタレノウフラグメント等 が挙げられ、好ましくは Bst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント)が挙げられる。
[0026] RT— LAMP法に用いる逆転写酵素としては、 RNAを铸型として cDNAを合成する 活性を有する酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、 AMV、 Clone d AMV、 MMLVの逆転写酵素、 Superscripts ReverTraAce、 Thermoscript等が挙げ られ、好ましくは、 AMV又は Cloned AMV逆転写酵素が挙げられる。また Bca DNAポ リメラーゼのように、逆転写酵素活性と DNAポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素 を用いると、 RT— LAMP反応を 1つの酵素で行うことができる。
[0027] 核酸合成で使用する酵素や逆転写酵素は、ウィルスや細菌など力 精製されたもの でも良ぐ遺伝子組み換え技術によって作製されたものでも良い。またこれらの酵素 はフラグメント化やアミノ酸の置換などの改変をされたものでも良い。
[0028] LAMP反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、増幅 された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレー ター法 (特開 2001— 242169号公報）を用いて検出することができ、また、反応終了 後の反応液をそのままァガロースゲル電気泳動にかけても容易に検出できる。ァガロ ースゲル電気泳動では、 LAMP増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー (はしご)状に検出される。また、 LAMP法では核酸の合成により基質が大量に消費 され、副産物であるピロリン酸イオン力 共存するマグネシウムイオンと反応してピロリ ン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。したがって、こ の白濁を、反応終了後ある 、は反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる 測定機器、例えば 400nmの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認すること で、核酸増幅反応を検出することも可能である（国際公開第 01Z83817号パンフレ ット)。
[0029] 本発明のプライマーを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あ らカじめパッケージングしてキットィ匕する事ができる。具体的には、本発明のプライマ 一あるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、核酸合成の基 質となる 4種類の dNTPs、核酸合成を行う DNAポリメラーゼ、逆転写活性を持つ酵 素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類、酵素や铸型を安定化する保護 剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される 実施例
[0030] 以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限 定されるものではない。 [0031] 実施例 1 : H5型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性の確認 プライマーの反応性の確認を以下の方法で行った。 LAMP法により核酸の増幅を行 うための反応溶液の組成は以下の通りである。なお、プライマーの合成は QIAGEN 社に依頼し、 OPC (逆相カラムカートリッジ)精製したものを使用した。
20mM Tris -HCl pH8. 8
10mM KC1
8mM MgSO
4
1. 4mM dNTPs
lOmM (NH ) SO
4 2 4
0. 8M Betaine (SIGMA)
0. 1 % Tween20
1. 6 ^ Μ FIP
1. 6 ^ Μ BIP
0. 2 μ Μ F3
0. 2 μ Μ B3
0. 8 M LF
0. 8 ^ Μ LB
AMV Reverse Transcriptase 2U (Finnzyme)
Bst DNA polymerase 16U (NEB)
[0032] 上記反応溶液に、 H5型プラスミド DNA (HK/213/03；国立感染症研究所から供与） を 104コピー加えて、 62. 5°Cで 60分間 RT— LAMP反応を行った。リアルタイム濁 度測定装置 LA— 320C (栄研ィ匕学)を用いて、リアルタイムに反応を検出した。その 結果、 4つのプライマーセット（プライマーセット A、 B、 C及び D)について増幅が確認 された。
[0033] さらに、その 4セットについて、培養ウィルスである New Caledonia (H1N1)及び Pana ma (H3N2)カゝら抽出した RNAを铸型に使って特異性試験を行った。図 1は、特異性 試験の結果を表すグラフである。図 1に示したように、いずれのプライマーセットを用 いた場合も、 HI型及び H3型の増幅は確認されなかった。以上の結果から、いずれ のプライマーセットも、 H5型に対する特異性が高いことが明ら力となった。
[0034] 次に、培養ウィルスである Vetnam/JP1203/04 (H5Nl)力ら抽出した RNAを使って、 感度試験を行った。抽出 RNAは铸型量が不明であるため、 RNase freeの滅菌水で 1 03〜： L06倍希釈したものを铸型サンプルとして用いた。図 2は、感度試験の結果を表 すグラフである。プライマーセット Aを用いた場合、 105倍希釈したサンプルでも増幅 が確認されており、最も高感度であることが明らかとなった。
[0035] 実施例 2 : H5型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットで増幅した産物の確認 プライマーセット Aで増幅した LAMP産物につ!、て、電気泳動及び制限酵素 Ddelで の確認を行った。図 3は、電気泳動の結果を表す図である。図 3のレーン 2から明らか なように、 LAMP産物特有のラダーパターンが確認された。また、 Ddelで処理したサ ンプル (レーン 3)では、消化が確認された。以上の結果から、標的配列が特異的に 増幅されていることが明ら力となった。
[0036] 実施例 3： H5型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの評価（交差性試験） ヒトインフルエンザウイルスの A/New Caledonia/20/99 (HlNl)、 A/Panama/2007/99 (H3N2)、 B/Shangdong/07/97及び B/Shanghai/361/2002並びにトリインフルエンザ ウィルス H1〜H15 (H5を除く）の合計 18種類をサンプルとした。それぞれ、培養ウイ ルスから QIAamp Viral RNA Kit (QIAGEN社）を用いて RNAの抽出を行い、 5 μ L· の抽出液を RT— LAMP反応（プライマーセット Aをプライマーとして用 、た）に用い た。
[0037] 図 4 (a)及び（b)から分かるように、 RT— LAMP法ではいずれのサンプルにおいても 増幅が認められな力つた。したがって、 RT— LAMP法は特異性が高いことが明らか となった。
[0038] 実施例 4： H5型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの評価 (感度試験）
2004年に山口県で感染が確認されたトリインフルエンザ H5型株（CH/Yamaguchi 7 /04)及び 2004年にベトナムで感染が確認された H5型株 (VN/JP1203/04)を铸型サ ンプルとして用いた。それぞれ、培養ウィルスから抽出した RN Aを RNase freeの滅菌 水で段階希釈（104〜108)を行い、 RT— PCR法には 10 L、 RT— LAMP法（プラ イマ一セット Aをプライマーとして用いた）には 5 μ Lの希釈液を使用した。 [0039] RT— PCR法は、国立感染症研究所の感染症情報センターのウェブサイトに掲載さ れている条件を修正して行った。すなわち、市販のキット（TaKaRa One Step RNA PC R Kit (AMV))を使用し、 50°C30分で逆転写反応を行い、 94°Cで 2分間処理した後 、 94°C1分、 45°C1分、 72°C1分のサイクルを 30回繰り返し、さらに 72°Cで 10分間 伸長反応を行い、 4°Cで保存した。
[0040] RT—PCR法に用いたプライマー及び反応溶液の組成は以下の通りである。
プライマー（PCR産物の長さ： 708bp)
H5 515f: 5-CATACCCAACAATAAAGAGG-3' (配列番号 46)
H5 1220r: 5 '-GTGTTC ATTTTGTTAATGAT-3 ' (配列番号 47)
反応溶液
RNA抽出液 10/zL
10 X One Step RNA PCR Buffer 5μL·
lOmM dNTPs 5μL·
25mM MgCl lO^L
2
RNase Inhibitor 1 μL·
AMV RTase lμL·
AMV— Optimized Taq lμL·
H5 515ί(10^Μ) 2μL·
H5 1220Γ(10^ Μ) 2μΙ^
RNase Free滅菌水 適宜添加して反応液を 50 Lに調整
[0041] RT—PCR法及び RT—LAMP法による増幅の結果を表 1にまとめた。表 1中、 RT—
LAMP法の欄には増幅が確認されたサンプルの割合を示した。また、 RT— PCRに おける増幅は電気泳動の結果を目視により確認した (表 1中、〇は増幅が検出できた ことを表し、 Xは増幅が検出できな力つたことを表す)。
[0042] [表 1] 希釈率
サンプル 測定法
104 105 107 108
RT-LAMP 2/2 2/2 2/2 2/2 0/2
CH/Yamaguchi 7/04
RT-PCR 〇 〇 X X X
RT-LAMP 2/2 2/2 2/2 2/2 1/2
VN/JP1203/04
RT-PCR 〇 〇 〇 X X
[0043] RT— LAMP法と RT— PCR法とを比較した場合、いずれの株でも、 RT— LAMP法 の方が 10〜： LOO倍感度が高かった。
[0044] 実施例 5： H7型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性の確認
プライマーセット Eの反応性の確認を以下の方法で行った。 LAMP法により核酸の増 幅を行うための反応溶液の組成は以下の通りである。なお、プライマーの合成は QIA
GEN社に依頼し、 OPC (逆相カラムカートリッジ)精製したものを使用した。
20mM Tris-HCl pH8. 8
10mM KC1
8mM MgSO
4
1. 4mM dNTPs
lOmM (NH ) SO
4 2 4
O. 8M Betaine (SIGMA)
O. 1% Tween20
1. 6^Μ FIP
1. 6^Μ BIP
O. 2μΜ F3
O. 2μΜ B3
O. 8 M LF
O. 8^Μ LB
AMV Reverse Transcriptase 2U (Finnzyme) Bst DNA polymerase 16U (NEB)
[0045] A/Netherlands/219/2003 (H7N7) (オランダで死亡例が出た際に分離された株）の 塩基配列（配列番号 1に示す塩基配列を含む断片）をクローニングベクターに組み込 み、転写反応により tRNAを調製した。調製した tRNAを 250、 100又は 50コピー/ アツセィとなるように上記反応溶液にカ卩え、 62. 5°Cで 35分間、リアルタイム濁度測定 装置 LA- 200 (テラメッタス）を用いて、増幅反応及び検出を行った。
[0046] tRNAの添カ卩量が 250、 100及び 50コピー Zアツセィの場合並びに陰性対照のリア ルタイム検出の結果を図 5に示した。この結果より 50コピー Zアツセィまで検出される ことが分力つた。
[0047] 実施例 6： H7型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットで増幅した産物の確認 プライマーセット Eで増幅した LAMP産物につ!、て、電気泳動及び制限酵素 Pstlで の確認を行った。図 6は、電気泳動の結果を表す図である。 Mは lOObpのラダーマ 一力一を表し、レーン 1は未処理の LAMP産物のサンプルであり、レーン 2は LAMP 産物を Pstlで消化したサンプルである。図 6のレーン 1から明らかなように、 LAMP産 物特有のラダーパターンが確認された。また、 Pstlで処理したサンプル（レーン 2)で は、消化が確認された。以上の結果から、標的配列が特異的に増幅されていることが 明らかとなった。
[0048] 実施例 7： H7型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの評価（交差性試験） ヒトインフルエンザウイルスの A/New Caledonia/20/99 (HlNl)、 A/Panama/2007/99 (H3N2)、 B/Shangdong/07/97及び B/Shanghai/361/2002並びにトリインフルエンザ ウィルス H1〜H15 (H7を除く）の合計 18種類をサンプルとし、プライマーの特異性 を調べた。それぞれ、培養ウィルスから QIAamp Viral RNA Kit (QIAGEN社）を用い て RNAの抽出を行い、 100倍希釈した抽出 RNAを RT— LAMP反応に用いた。な お、陽性対照 (PC)には実施例 5で調製した tRNAを用い、陰性対照には蒸留水を 用いた。
[0049] 図 7から分力るように、いずれのサンプルにおいても増幅が認められなかった。したが つて、本発明のプライマーセットは特異性が高いことが明ら力となった。
[0050] 実施例 8 :H7型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの評価 (様々な株に対 する反応性）
4種類の H7型トリインフルエンザウイルスゲノムを铸型サンプルとして用いて、各ウイ ルスに対する感度を調べた。それぞれ、培養ウィルスカゝら抽出した RNAを RNase free の滅菌水で段階希釈（105〜108)を行 5 μ Lの希釈液を使用した。
[0051] 各ウィルスゲノムを铸型サンプルとした場合のリアルタイム検出の結果を図 8及び 9に ついては、 107希釈まで検出でき（図 8を参照）、 A/mallard/Netherlands/12/2003 (H 7N3)及び A/wigeon/Osaka/1/2001 (H7N7)については、 106希釈まで検出できた (図 9を参照)。以上より本発明のプライマーセットは、上記 4種類の株に反応すること が分かった。
産業上の利用可能性
[0052] 本発明によれば、 H5型又は H7型トリインフルエンザウイルスを高感度かつ迅速に検 出することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 1で示される H5型トリインフルエンザウイルスのへマグルチニン塩基配列の 、 693番〜 959番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な 塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
[2] 以下の（a)〜（c)より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項 1記 載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)配列番号 2〜7で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれ た、少なくとも連続する 15塩基を含むオリゴヌクレオチド。
(b)前記 (a)に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし うるオリゴヌクレオチド。
(c)前記 (a)又は (b)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、 1ないし数個の塩基が置換、 欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
[3] H5型トリインフルエンザウイルスのへマグルチニンの標的核酸上の 3，末端側から F3 c、 F2c、 Flcという塩基配列領域を、 5'末端側から B3、 B2、 Blという塩基配列領域 を選択し、それぞれの相補的塩基配列を F3、 F2、 Fl、そして B3c、 B2c、 Blcとした ときに、以下の (a)〜 (d)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項 1〜 2記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)標的核酸の F2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Flc領域を有す る塩基配列。
(b)標的核酸の F3領域を有する塩基配列。
(c)標的核酸の B2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Blc領域を有す る塩基配列。
(d)標的核酸の B3領域を有する塩基配列。
[4] H5型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、 5，末端から 3 '末 端に向か!/、以下の (a)〜 (b)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項 1〜3記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a) 5' - (配列番号 2の塩基配列に相補的な塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の 塩基配列） （配列番号 3の塩基配列） 3'。
(b) 5' （配列番号 5の塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の塩基配列） （配列番 号 6の塩基配列に相補的な塩基配列） 3'。
[5] 請求項 1〜4記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、 H5型トリインフルエンザ ウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする H5型トリインフルエンザ ウィルスの検出方法。
[6] H5型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応が LAMP法であること を特徴とする請求項 5記載の H5型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
[7] 請求項 1〜4記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて H5型トリインフルエンザゥ ィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、 H5型トリインフルエンザウイルス 感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
[8] インフルエンザを診断するための、請求項 1〜4記載のオリゴヌクレオチドプライマー を含むことを特徴とするキット。
[9] 配列番号 1で示される H5型トリインフルエンザウイルスのへマグルチニン塩基配列の
、 19番〜 220番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な 塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
[10] 以下の（a)〜（c)より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項 9記 載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)配列番号 13〜18で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列力 選ば れた、少なくとも連続する 15塩基を含むオリゴヌクレオチド。
(b)前記 (a)に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし うるオリゴヌクレオチド。
(c)前記 (a)又は (b)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、 1ないし数個の塩基が置換、 欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
[11] H5型トリインフルエンザウイルスのへマグルチニンの標的核酸上の 3，末端側から F3 c、 F2c、 Flcという塩基配列領域を、 5'末端側から B3、 B2、 B1という塩基配列領域 を選択し、それぞれの相補的塩基配列を F3、 F2、 Fl、そして B3c、 B2c、 Blcとした ときに、以下の（a)〜（d)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項 9〜 10記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)標的核酸の F2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Flc領域を有す る塩基配列。
(b)標的核酸の F3領域を有する塩基配列。
(c)標的核酸の B2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Blc領域を有す る塩基配列。
(d)標的核酸の B3領域を有する塩基配列。
[12] H5型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、 5'末端から 3'末 端に向か!/、以下の (a)〜 (b)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項 9〜： L 1記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a) 5' - (配列番号 13の塩基配列に相補的な塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の 塩基配列） （配列番号 14の塩基配列） 3'。
(b) 5' （配列番号 16の塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の塩基配列） （配列 番号 17の塩基配列に相補的な塩基配列） 3 '。
[13] 請求項 9〜12記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、 H5型トリインフルエンザ ウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする H5型トリインフルエンザ ウィルスの検出方法。
[14] H5型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応が LAMP法であること を特徴とする請求項 13記載の H5型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
[15] 請求項 9〜12記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて H5型トリインフルエンザ ウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、 H5型トリインフルエンザウィル ス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
[16] インフルエンザを診断するための、請求項 9〜 12記載のオリゴヌクレオチドプライマ 一を含むことを特徴とするキット。
[17] 配列番号 1で示される H5型トリインフルエンザウイルスのへマグルチニン塩基配列の 、 114番〜 333番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な 塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
[18] 以下の（a)〜（c)より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項 17記 載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)配列番号 24〜29で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列力も選ば れた、少なくとも連続する 15塩基を含むオリゴヌクレオチド。
(b)前記 (a)に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし うるオリゴヌクレオチド。
(c)前記 (a)又は (b)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、 1ないし数個の塩基が置換、 欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
[19] H5型トリインフルエンザウイルスのへマグルチニンの標的核酸上の 3，末端側から F3 c、 F2c、 Flcという塩基配列領域を、 5'末端側から B3、 B2、 Blという塩基配列領域 を選択し、それぞれの相補的塩基配列を F3、 F2、 Fl、そして B3c、 B2c、 Blcとした ときに、以下の (a)〜 (d)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項 17 〜18記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)標的核酸の F2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Flc領域を有す る塩基配列。
(b)標的核酸の F3領域を有する塩基配列。
(c)標的核酸の B2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Blc領域を有す る塩基配列。
(d)標的核酸の B3領域を有する塩基配列。
[20] H5型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、 5'末端から 3'末 端に向か!/、以下の (a)〜 (b)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項 17〜 19記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a) 5' - (配列番号 24の塩基配列に相補的な塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の 塩基配列） （配列番号 25の塩基配列） 3'。
(b) 5' （配列番号 27の塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の塩基配列） （配列 番号 28の塩基配列に相補的な塩基配列） 3 '。
[21] 請求項 17〜20記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、 H5型トリインフルェン ザウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする H5型トリインフルェン ザウィルスの検出方法。
[22] H5型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応が LAMP法であること を特徴とする請求項 21記載の H5型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
[23] 請求項 17〜20記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて H5型トリインフルエンザ ウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、 H5型トリインフルエンザウィル ス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
[24] インフルエンザを診断するための、請求項 17〜20記載のオリゴヌクレオチドプライマ 一を含むことを特徴とするキット。
[25] 配列番号 1で示される H5型トリインフルエンザウイルスのへマグルチニン塩基配列の
、 874番〜 1065番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的 な塩基配列力 設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
[26] 以下の（a)〜（c)より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項 25記 載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)配列番号 35〜40で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列力も選ば れた、少なくとも連続する 15塩基を含むオリゴヌクレオチド。
(b)前記 (a)に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし うるオリゴヌクレオチド。
(c)前記 (a)又は (b)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、 1ないし数個の塩基が置換、 欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
[27] H5型トリインフルエンザウイルスのへマグルチニンの標的核酸上の 3'末端側から F3 c、 F2c、 Flcという塩基配列領域を、 5'末端側から B3、 B2、 Blという塩基配列領域 を選択し、それぞれの相補的塩基配列を F3、 F2、 Fl、そして B3c、 B2c、 Blcとした ときに、以下の (a)〜 (d)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項 25 〜26記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)標的核酸の F2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Flc領域を有す る塩基配列。 (b)標的核酸の F3領域を有する塩基配列。
(c)標的核酸の B2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Blc領域を有す る塩基配列。
(d)標的核酸の B3領域を有する塩基配列。
[28] H5型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、 5'末端から 3'末 端に向か!/、以下の (a)〜 (b)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項 25〜27記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a) 5' - (配列番号 35の塩基配列に相補的な塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の 塩基配列） （配列番号 36の塩基配列） 3'。
(b) 5' （配列番号 38の塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の塩基配列） （配列 番号 39の塩基配列に相補的な塩基配列） 3 '。
[29] 請求項 25〜28記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、 H5型トリインフルェン ザウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする H5型トリインフルェン ザウィルスの検出方法。
[30] H5型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応が LAMP法であること を特徴とする請求項 29記載の H5型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
[31] 請求項 25〜28記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて H5型トリインフルエンザ ウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、 H5型トリインフルエンザウィル ス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
[32] インフルエンザを診断するための、請求項 25〜28記載のオリゴヌクレオチドプライマ 一を含むことを特徴とするキット。
[33] 配列番号 48で示される H7型トリインフルエンザウイルスのへマグルチニン塩基配列 の、 1016番〜 1225番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相 補的な塩基配列力 設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
[34] 以下の（a)〜（c)より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項 33記 載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)配列番号 49〜54で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列力 選ば れた、少なくとも連続する 15塩基を含むオリゴヌクレオチド。 (b)前記 (a)に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし うるオリゴヌクレオチド。
(c)前記 (a)又は (b)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、 1ないし数個の塩基が置換、 欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
[35] H7型トリインフルエンザウイルスのへマグルチニンの標的核酸上の 3，末端側から F3 c、 F2c、 Flcという塩基配列領域を、 5'末端側から B3、 B2、 Blという塩基配列領域 を選択し、それぞれの相補的塩基配列を F3、 F2、 Fl、そして B3c、 B2c、 Blcとした ときに、以下の (a)〜 (d)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項 33 〜 34記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)標的核酸の F2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Flc領域を有す る塩基配列。
(b)標的核酸の F3領域を有する塩基配列。
(c)標的核酸の B2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Blc領域を有す る塩基配列。
(d)標的核酸の B3領域を有する塩基配列。
[36] H7型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、 5'末端から 3'末 端に向か!/、以下の (a)〜 (b)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項 33〜35記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a) 5' - (配列番号 49の塩基配列に相補的な塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の 塩基配列） （配列番号 50の塩基配列） 3'。
(b) 5' （配列番号 52の塩基配列） （塩基数 0〜50の任意の塩基配列） （配列 番号 53の塩基配列に相補的な塩基配列） 3 '。
[37] 請求項 33〜36記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、 H7型トリインフルェン ザウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする H7型トリインフルェン ザウィルスの検出方法。
[38] H7型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応が LAMP法であること を特徴とする請求項 37記載の H7型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
[39] 請求項 33〜36記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて H7型トリインフルエンザ ウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、 H7型トリインフルエンザウィル ス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
[40] インフルエンザを診断するための、請求項 33〜36記載のオリゴヌクレオチドプライマ 一を含むことを特徴とするキット。
PCT/JP2005/019710 2004-11-01 2005-10-26 Ｈ５型又はｈ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法 WO2006049061A1 (ja)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES05805278T ES2382446T3 (es) 2004-11-01 2005-10-26 Método de detección del virus de la gripe aviar H5
JP2006543218A JP4786548B2 (ja) 2004-11-01 2005-10-26 Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法
EP05805278A EP1826269B1 (en) 2004-11-01 2005-10-26 Method of detecting h5 avian influenza virus
US11/718,357 US8043813B2 (en) 2004-11-01 2005-10-26 Method of detecting H5 or H7 avian influenza virus
AT05805278T ATE552353T1 (de) 2004-11-01 2005-10-26 Verfahren zum nachweis des h5-vogelgrippevirus
CN2005800376057A CN101052720B (zh) 2004-11-01 2005-10-26 H5型或h7型禽流感病毒的检测方法
HK08100681.6A HK1110348A1 (en) 2004-11-01 2008-01-18 Method of detecting h5 or h7 avian influenza virus h5
US13/232,091 US8389221B2 (en) 2004-11-01 2011-09-14 Method of detecting H5 or H7 avian influenza virus

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-318214 2004-11-01
JP2004318214 2004-11-01
JP2005-148487 2005-05-20
JP2005148487 2005-05-20

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/718,357 A-371-Of-International US8043813B2 (en) 2004-11-01 2005-10-26 Method of detecting H5 or H7 avian influenza virus
US13/232,091 Division US8389221B2 (en) 2004-11-01 2011-09-14 Method of detecting H5 or H7 avian influenza virus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006049061A1 true WO2006049061A1 (ja) 2006-05-11

Family

ID=36319073

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/019710 WO2006049061A1 (ja) 2004-11-01 2005-10-26 Ｈ５型又はｈ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US8043813B2 (ja)
EP (2) EP1826269B1 (ja)
JP (2) JP4786548B2 (ja)
AT (1) ATE552353T1 (ja)
ES (1) ES2382446T3 (ja)
HK (1) HK1110348A1 (ja)
WO (1) WO2006049061A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007058629A3 (en) * 2005-11-16 2007-08-16 Agency Science Tech & Res Influenza a virus detection method and kit therefor
CN101016570B (zh) * 2007-02-13 2011-08-31 厦门大学 H5亚型禽流感病毒核酸检测方法及其试剂盒
CN102337353A (zh) * 2011-08-31 2012-02-01 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 用于h5亚型禽流感病毒检测的rt-lamp引物组、检测方法及应用
CN103320544A (zh) * 2013-07-12 2013-09-25 中国人民解放军南京军区军事医学研究所 用于以rt-lamp法检测h7n9禽流感病毒的引物、试剂盒、检测方法

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003091401A2 (en) 2002-04-26 2003-11-06 Medimmune Vaccines, Inc. Multi plasmid system for the production of influenza virus
US7465456B2 (en) 2002-04-26 2008-12-16 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
WO2005018539A2 (en) 2003-06-16 2005-03-03 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
ES2345492T3 (es) 2003-12-23 2010-09-24 Medimmune, Llc Sistema multiplasmido para la produccion del virus de la gripe.
WO2005116260A2 (en) 2004-05-25 2005-12-08 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
EP2441471B1 (en) 2005-03-08 2014-10-08 MedImmune, LLC Reassortant influenza viruses
CA2659267C (en) 2006-08-09 2016-12-13 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
JP5666905B2 (ja) 2007-06-18 2015-02-12 メディミューン，エルエルシー ヘマグルチニンポリペプチド中に変化を有するインフルエンザｂウイルス
WO2009091501A1 (en) 2008-01-18 2009-07-23 Response Biomedical Corporation Heated assays for influenza
SG192501A1 (en) 2008-07-11 2013-08-30 Medimmune Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
WO2010093537A2 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
WO2011058580A1 (en) * 2009-11-12 2011-05-19 Defence Research & Development Organisation Oligonucleotides and process for detection of swine flu virus
CN101864498B (zh) * 2010-04-13 2012-10-03 上海国际旅行卫生保健中心 一种禽流感h5n1病毒的恒温扩增检测试剂盒
CN103320532B (zh) * 2013-06-09 2015-03-25 中国人民解放军第四军医大学 H7n9亚型禽流感病毒快速检测引物组及其用途
US10006097B2 (en) 2013-10-22 2018-06-26 The United States of America, as represented by the Secretry, Department of Health and Human Services Compositions and methods for detection and discrimination of influenza viruses
CN103614490B (zh) * 2013-10-22 2016-03-30 山东省农业科学院家禽研究所 一种基于rt-lamp检测h4亚型禽流感病毒的试剂盒
CN104694554A (zh) * 2015-02-16 2015-06-10 武汉思齐源生物科技有限公司 一种分离的禽流感病毒h7基因核酸序列
KR101652806B1 (ko) 2015-08-21 2016-09-01 주식회사 엠모니터 Lamp를 이용한 인플루엔자 검출용 프라이머 및 그 용도
JP2019156747A (ja) * 2018-03-12 2019-09-19 住友ゴム工業株式会社 ヘテロ原子含有芳香族ビニル化合物の製造方法
CN110551850A (zh) * 2019-09-02 2019-12-10 拱北海关技术中心 用于检测高致病性h7n9禽流感病毒的rt-lamp引物及方法
EP4146833A1 (en) 2020-05-05 2023-03-15 Genomtec SA Diagnostic primers, kits and methods for viral detection

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6420304A (en) 1987-07-15 1989-01-24 Kuraray Co Glove for sports
JP2001242169A (ja) 2000-02-29 2001-09-07 Eiken Chem Co Ltd 同一鎖内に相補性領域を有する核酸の検出方法
WO2001083817A1 (fr) 2000-05-01 2001-11-08 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede de detection de produit de reaction de synthese d'acide nucleique
WO2002024902A1 (fr) 2000-09-19 2002-03-28 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede permettant de synthetiser un polynucleotide
JP2004509648A (ja) * 2000-10-05 2004-04-02 ホンコン　ディーエヌエー　チップス　リミティド 非病原性又は病原性インフルエンザａサブタイプｈ５ウイルス検出キット

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3313358B2 (ja) 1998-11-09 2002-08-12 栄研化学株式会社 核酸の合成方法
ATE383441T1 (de) 2001-11-09 2008-01-15 Hong Kong Dna Chips Ltd Verfahren zur detektion von nukleinsäure- zielmolekülen bei dem enzym verbundenen sonde einfangtest sowie geeignetes testsystem
WO2005116260A2 (en) * 2004-05-25 2005-12-08 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6420304A (en) 1987-07-15 1989-01-24 Kuraray Co Glove for sports
JP2001242169A (ja) 2000-02-29 2001-09-07 Eiken Chem Co Ltd 同一鎖内に相補性領域を有する核酸の検出方法
WO2001083817A1 (fr) 2000-05-01 2001-11-08 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede de detection de produit de reaction de synthese d'acide nucleique
WO2002024902A1 (fr) 2000-09-19 2002-03-28 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede permettant de synthetiser un polynucleotide
JP2004509648A (ja) * 2000-10-05 2004-04-02 ホンコン　ディーエヌエー　チップス　リミティド 非病原性又は病原性インフルエンザａサブタイプｈ５ウイルス検出キット

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MUNCH M. ET AL: "Detection and subtyping (H5 and H7) of avian type A influenza virus by reverse transcription-PCR and PCR-ELISA", ARCH VIROL., vol. 146, no. 1, 2001, pages 87 - 97, XP002995220 *
POON L.L. ET AL: "Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification", J CLIN MICROBIOL, vol. 43, no. 1, January 2005 (2005-01-01), pages 427 - 430, XP002995222 *
WBSTER R.G. ET AL: "Characterization of H5N1 influenza viruses that continue to circulate in geese in southeastern China", J VIROL, vol. 76, no. 1, January 2002 (2002-01-01), pages 118 - 126, XP002995221 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007058629A3 (en) * 2005-11-16 2007-08-16 Agency Science Tech & Res Influenza a virus detection method and kit therefor
CN101016570B (zh) * 2007-02-13 2011-08-31 厦门大学 H5亚型禽流感病毒核酸检测方法及其试剂盒
CN102337353A (zh) * 2011-08-31 2012-02-01 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 用于h5亚型禽流感病毒检测的rt-lamp引物组、检测方法及应用
CN103320544A (zh) * 2013-07-12 2013-09-25 中国人民解放军南京军区军事医学研究所 用于以rt-lamp法检测h7n9禽流感病毒的引物、试剂盒、检测方法
CN103320544B (zh) * 2013-07-12 2015-01-14 中国人民解放军南京军区军事医学研究所 用于以rt-lamp法检测h7n9禽流感病毒的引物、试剂盒、检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
ATE552353T1 (de) 2012-04-15
ES2382446T3 (es) 2012-06-08
JP4786548B2 (ja) 2011-10-05
EP2388340A1 (en) 2011-11-23
HK1110348A1 (en) 2008-07-11
JP2011167207A (ja) 2011-09-01
US20120100527A1 (en) 2012-04-26
JPWO2006049061A1 (ja) 2008-05-29
US20090317795A1 (en) 2009-12-24
EP1826269B1 (en) 2012-04-04
EP2388340B1 (en) 2013-04-03
EP1826269A1 (en) 2007-08-29
US8389221B2 (en) 2013-03-05
JP5337944B2 (ja) 2013-11-06
US8043813B2 (en) 2011-10-25
EP1826269A4 (en) 2009-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006049061A1 (ja) Ｈ５型又はｈ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法
JP4773513B2 (ja) Ａ型及びｂ型インフルエンザウイルスの核酸を検出するための組成物及びアッセイ
AU2021250940B2 (en) Compositions and method for detecting human parvovirus nucleic acid and for detecting hepatitis A virus nucleic acids in single-plex or multiplex assays
EP2021516B1 (en) Nucleic acid primers and probes for detecting human and avian influenza viruses
US11879161B2 (en) Compositions and assays to detect swine H1N1 influenza a virus nucleic acids
JP2023516472A (ja) 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２）、インフルエンザａ及びインフルエンザｂを検出するための組成物及び方法
Teng et al. Specific detection of reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification amplicons for Taura syndrome virus by colorimetric dot–blot hybridization
WO2013165551A1 (en) Methods of detecting influenza virus
JP4603979B2 (ja) Ｓａｒｓコロナウイルスの検出法
EP2454386A1 (en) Influenza detection method and kit therefor
JP2007000040A (ja) Ｂ型肝炎ウイルスの検出方法
WO2007069331A1 (ja) ヒト免疫不全ウイルス１型の検出方法
Kabir Evaluation and adaptation of molecular approaches for detection and characterization of viruses of the respiratory tract

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV LY MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006543218

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200580037605.7

Country of ref document: CN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005805278

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11718357

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005805278

Country of ref document: EP