JP5666905B2 - ヘマグルチニンポリペプチド中に変化を有するインフルエンザbウイルス - Google Patents
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Description
本発明により包含されるいくつかの方法においては、インフルエンザBウイルスの8個の断片の各々に対応するウイルスゲノム断片を、インフルエンザウイルスの操作および製造のための複数のベクター中に挿入することができる。8個のベクターは、複数のベクターに含まれうるし、8個のベクターは、1種以上のインフルエンザBウイルスの8個のゲノム断片に対応する核酸配列を含みうる。複数のベクターは、より多くの、またはより少ないベクターを含んでもよい。例えば、11個のベクターは、複数のベクターに含まれうるし、11個のベクターは、11個のインフルエンザBウイルスタンパク質のコード配列に対応する核酸配列を含みうる。あるいは、1個のベクターも複数のベクターに含まれうるし、1個のベクターは、1種以上のインフルエンザBウイルスの8個のゲノム断片の各々を含みうる。2、3、4、5、6、7、9、または10個のベクターも、複数のベクターに含まれうる。
発現させようとするインフルエンザウイルスゲノム断片を、mRNA合成を指令する好適な転写制御配列(プロモーター)に機能し得る形で連結する。様々なプロモーターが、インフルエンザウイルスゲノム断片の転写を調節するための発現ベクターにおける使用にとって好適である。特定の実施形態においては、例えば、ベクターがプラスミドpAD3000である場合、サイトメガロウイルス(CMV) DNA依存的RNAポリメラーゼII(Pol II)プロモーターを用いる。必要に応じて、例えば、条件的発現を調節するために、特定の条件下で、または特定の組織もしくは細胞中で、RNA転写を誘導する他のプロモーターと置換することができる。多くのウイルスおよび哺乳動物プロモーター、例えば、ヒトプロモーターが利用可能であり、または意図される特定の用途に従って単離することができる。例えば、動物およびヒトウイルスのゲノムから得られた代替的なプロモーターとしては、アデノウイルス(アデノウイルス2など)、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、ポリオーマウイルス、およびサルウイルス40(SV40)などのプロモーター、および種々のレトロウイルスプロモーターが挙げられる。哺乳動物プロモーターとしては、特に、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどが挙げられる。さらに、バクテリオファージプロモーターを、同族RNAポリメラーゼ、例えば、T7プロモーターと共に用いることができる。
インフルエンザウイルスタンパク質をコードするゲノム断片は、該断片の発現にとって必要な任意の追加配列を含んでもよい。例えば、異種コード配列の効率的な翻訳を助ける特異的開始シグナルを含有させることができる。これらのシグナルは、例えば、ATG開始コドンおよび隣接配列を含んでもよい。ゲノム断片によりコードされるタンパク質全体の翻訳を確実にするために、ウイルスタンパク質と比較して正確な読み枠で開始コドンを挿入する。外因性転写エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の両方の様々な起源のものであってよい。発現の効率を、使用における細胞系にとって好適なエンハンサーの含有により増強することができる。
インフルエンザBウイルス株の内部ゲノム断片は、1種以上のマスターインフルエンザBウイルスの内部ゲノム断片であってよい。1種以上のマスターインフルエンザBウイルスを、ワクチン投与に関連する所望の特性に基づいて選択することができる。例えば、マスタードナーインフルエンザBウイルス株を、弱毒化表現型、低温適合性および/または温度感受性について選択することができる。この文脈においては、ca B/Ann Arbor/1/66、または表17に特定された1個以上のアミノ酸置換を含む人工的に操作されたインフルエンザB株が、マスタードナーインフルエンザB株であってよい。これらのアミノ酸置換としては、PB2630; PA431; PA497; NP55; NP114; NP410; NP509; M1159およびM1183の1個以上の置換が挙げられる。このアミノ酸置換は、以下の1個以上:PB2630 (S630R); PA431 (V431M); PA497 (Y497H); NP55 (T55A); NP114 (V114A); NP410 (P410H); NP509 (A509T); M1159 (H159Q)およびM1183 (M183V)を含んでもよい。アミノ酸置換は、PB2630; PA431; PA497; NP55; NP114; NP410; NP509; M1159およびM1183の全部の置換を含んでもよい。置換は、PB2630 (S630R); PA431 (V431M); PA497 (Y497H); NP55 (T55A); NP114 (V114A); NP410 (P410H); NP509 (A509T); M1159 (H159Q)およびM1183 (M183V)の全部であってよい。
本発明の方法はまた、HAの位置141にアミノ酸置換をもたらす突然変異を導入することを包含する。この突然変異は、HA非置換インフルエンザウイルスと比較した場合、孵化鶏卵中で複製するインフルエンザBウイルスの能力を増加させることができる。HAの位置141での置換により、インフルエンザウイルスはHAのアミノ酸残基196/197に糖鎖をさらに保持することができる。HAの位置141での置換はさらに、HAの抗原性を有意に変化させなくてもよい。HAの位置141での置換は、アルギニン、ヒスチジン、またはシステインに対するものであってよい。
本発明により包含されるいくつかの方法においては、複数のベクターを宿主細胞中に導入する。これらの宿主細胞としては、例えば、Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞およびCOS細胞、例えば、293T細胞、COS7細胞が挙げられる。あるいは、上記細胞系のうちの2種、例えば、MDCK細胞と293TもしくはCOS細胞とを含む同時培養物を、例えば、1:1の比率で用いることができる。この細胞を、中性の緩衝化pH(例えば、7.0〜7.2のpH)を維持するのに好適な制御された湿度およびCO2濃度下で、血清(例えば、10%ウシ胎仔血清)を補給したDulbeccoの改変イーグル培地などの好適な市販の培養培地中、または無血清培地中で維持することができる。必要に応じて、培地は細菌の増殖を防止するための抗生物質、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど、および/またはL-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、好ましい増殖特性を促進するための追加補給物質、例えば、トリプシン、β-メルカプトエタノールなどの追加栄養素を含む。
インフルエンザゲノム断片に対応するヌクレオチド配列を含むベクターを、例えば、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、およびポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクションなどの当業界でよく知られた方法に従って宿主細胞中に導入する(例えば、トランスフェクトする)ことができる。例えば、ベクター、例えば、プラスミドを、製造業者の説明書に従ってポリアミントランスフェクション試薬TransIT-LT1 (Mirus)を用いて、COS細胞、293T細胞またはCOSもしくは293T細胞とMDCK細胞の組合せなどの宿主細胞中にトランスフェクトすることができる。約1μgの各ベクターを、200μlの全量中、160μlの培地に希釈した約2μlのTransIT-LT1と共に、宿主細胞の集団中に導入することができる。DNA:トランスフェクション試薬混合物を、室温で45分間インキュベートした後、800μlの培地を添加する。トランスフェクション混合物を宿主細胞に添加し、細胞を上記のように培養する。
複数のベクターを導入した細胞の培養培地から、ウイルスを回収することができる。粗培地を、取得し、清澄化した後、清澄化された培地中のインフルエンザウイルスを濃縮することができる。一般的な濃縮方法としては、濾過、限外濾過、硫酸バリウム上での吸着および溶出、ならびに遠心分離が挙げられる。例えば、感染した培養物に由来する粗培地を、最初に、例えば、1000〜2000 x gで、細胞破片および他の大きい粒子状物質を除去するのに十分な時間、例えば、10〜30分間遠心分離することにより清澄化することができる。あるいは、培地を0.8μmの酢酸セルロースフィルターを通して濾過して、無傷の細胞および他の大きい粒子状物質を除去することができる。次いで、必要に応じて、清澄化された培地上清を遠心分離して、例えば、15,000 x gで約3〜5時間、インフルエンザウイルスを沈降化させることができる。STE (0.01 M Tris-HCl;0.15 M NaCl;0.0001 M EDTA)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4などの好適なバッファー中にウイルス沈降物を再懸濁した後、スクロース(60%〜12%)または酒石酸カリウム(50%〜10%)上での密度勾配遠心分離によりウイルスを濃縮することができる。連続的または段階的勾配、例えば、12%の4段階での12%〜60%のスクロース勾配が好適である。勾配を、回収のための可視的バンドにウイルスを濃縮するのに十分な速度、および時間、この勾配を遠心分離することができる。あるいは、および大規模商業用途のために、連続的な様式で操作するゾーン遠心分離ローターを用いて密度勾配からウイルスを浄化することができる。組織培養からのインフルエンザウイルスの調製を介して当業者を案内するのに十分なさらなる詳細は、例えば、Furminger. Vaccine Production, Nicholsonら(編) Textbook of Influenza pp. 324-332; Mertenら(1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation、Cohen & Shafferman (編) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151、および米国特許第5,690,937号に提供されている。必要に応じて、回収されたウイルスを、安定剤としてのスクロース-リン酸-グルタミン酸(SPG)の存在下で-80℃で保存することができる。
好適な担体または賦形剤中の本発明の組換えウイルスおよび再集合体ウイルスを、予防的に投与して、1種以上の株のインフルエンザウイルスに特異的な免疫応答を刺激することができる。担体または賦形剤は、滅菌水、水性塩水溶液、水性緩衝塩水溶液、水性デキストロース溶液、水性グリセロール溶液、エタノール、未感染の鶏卵から得た尿膜腔液(すなわち、正常な尿膜腔液、「NAF」)またはその組合せなどの製薬上許容し得る担体または賦形剤であってよい。無菌性、pH、等張性、および安定性を確保するそのような溶液の調製を、当業界で確立されたプロトコルに従って行う。一般的には、アレルギー作用および他の望ましくない作用を最小化し、特定の投与経路、例えば、皮下、筋肉内、鼻内などに適合するように、担体または賦形剤を選択する。
本発明により包含されるベクターおよびインフルエンザウイルスの使用を容易にするために、実験目的または治療目的のためのインフルエンザウイルスのパッケージングおよび感染にとって有用な、任意のこれらの、およびさらなる成分、例えば、バッファー、細胞、培養培地を、キットの形態で包装することができる。キットは、上記成分に加えて、追加の材料、例えば、本発明の方法を実施するための器具、包装材料、および容器を含んでもよい。
本発明の文脈においては、インフルエンザウイルス核酸および/またはタンパク質を、よく知られる分子生物学技術に従って操作する。増幅、クローニング、突然変異誘発、形質転換などの多くのそのような手順に関する詳細なプロトコルは、例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology (supplemented through 2000) John Wiley & Sons, New York (「Ausubel」); Sambrookら、Molecular Cloning - A Laboratory Manual (第2版), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (「Sambrook」)ならびにBergerおよびKimmel、Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (「Berger」)に記載されている。
1.卵中で増加した複製を示すHA糖鎖付加されたインフルエンザBウイルスを調製する方法であって、
(a)インフルエンザBウイルスゲノム中に、HA位置141でのアルギニンへのアミノ酸置換をもたらす突然変異を導入すること;および
(b)インフルエンザBウイルスが産生される条件下で、突然変異させたインフルエンザウイルスゲノムを複製すること、
を含む前記方法。
(a)宿主細胞集団中に、
(i)第1のインフルエンザB株の少なくとも6個の内部ゲノム断片;および
(ii)少なくとも第2のインフルエンザB株のHAおよびNAポリペプチドをコードする1個以上のゲノム断片であって、HAポリペプチドがアミノ酸残基141にアルギニンを含む前記断片、
に対応するヌクレオチド配列を含む、複数のベクターを導入すること;
(b)35℃を超えない温度で宿主細胞集団を培養すること;ならびに
(c)インフルエンザウイルスを回収すること、
を含む前記方法。
プラスミドpHW2000(Hoffmannら(2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids., Proc Natl Acad Sci USA, 97:6108-6113)を改変して、ウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナルをサルウイルス40(SV40)から得られたポリアデニル化シグナル配列で置換した。
インフルエンザB/Ann Arbor/1/66の低温適合変異体(ca/Master Ann Arbor/1/66 P1 Aviron 10/2/97)である例示的なインフルエンザBマスタードナー株(MDV-B)に由来するウイルスRNAを、RNeasy Kit (Qiagen, Valencia, CA)を用いて、感染した孵化卵に由来する100μlの尿膜腔液から抽出し、RNAを40μlのH2O中に溶出させた。提供されたプロトコルに従ってOne Step RT-PCRキット(Qiagen, Valencia, CA)を用いて、各反応につき1μlの抽出されたRNAを用いて、ゲノム断片のRT-PCRを行った。RT反応を50℃で50分間行った後、94℃で15分間行った。PCRは、94℃で1分間、54℃で1分間、および72℃で3分間を25サイクルで行った。P遺伝子を、2個の断片の生成をもたらすBsmB1部位を含む断片特異的プライマーを用いて増幅した(表1)。
PCR断片を単離し、BsmBI(またはNPについてはBsaI)で消化し、上記のようにBsmBI部位でpAD3000(マイナス鎖vRNAおよびプラス鎖mRNAの転写を可能にするpHW2000の誘導体)中に挿入した。得られたプラスミドのそれぞれについて2〜4個を配列決定し、RT-PCR断片の直接配列決定に基づいてMDV-Bの共通配列と比較した。共通配列とは異なるアミノ酸変化をもたらすヌクレオチド置換を有したプラスミドを、プラスミドのクローニングにより、またはQuikchangeキット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いることにより、「修復」した。得られたB/Ann Arbor/1/66プラスミドを、pAB121-PB1、pAB122-PB2、pAB123-PA、pAB124-HA、pAB125-NP、pAB126-NA、pAB127-M、およびpAB128-NSと命名した。この二方向転写系を用いて、全てのウイルスRNAおよびタンパク質を細胞内生産させ、感染性インフルエンザBウイルスの生成をもたらした(図2)。
293TまたはCOS-7細胞(高いトランスフェクション効率およびpolI活性を有する霊長類細胞)と、MDCK細胞(インフルエンザウイルスに対して許容性)との同時培養により、感染性組換えインフルエンザBウイルスを産生させた。293T細胞を、5%FBS細胞を含むOptiMEM I-AB培地中で維持し、COS-7細胞を、10%FBSを含むDMEM I-AB培地中で維持した。MDCK細胞を、抗生物質および抗真菌剤を添加した1 x MEM、10%FBS中で維持した。ウイルスゲノムベクターを用いるトランスフェクションの前に、細胞を5 mlのPBSまたはFBSを含まない培地で1回洗浄した。10 mlのトリプシン-EDTAを、75 cm2のフラスコ中の集密状態(confluent)の細胞に添加した(MDCK細胞を、20〜45分間インキュベートし、293T細胞を1分間インキュベートした)。細胞を遠心分離し、10 mlのOptiMEM I-AB中に再懸濁した。次いで、1 mlの各懸濁化細胞系を、18 mlのOptiMEM I-AB中に希釈し、混合した。次いで、細胞を3 ml/ウェルで6個のウェルに分注した。6〜24時間後、1μgの各プラスミドを、OptiMEM I-ABを含む1.5 mlのエッペンドルフチューブ中で、プラスミド(xμlのプラスミド + xμlのOptiMEM I-AB + xμlのTransIT-LT1=200μl)と混合した。すなわちプラスミドDNA 1μgあたり2μlのTransIT-LT1。混合物を室温で45分間インキュベートした。次いで、800μlのOptiMEM I-ABを添加した。培地を細胞から除去し、トランスフェクション混合物を33℃で6〜15時間、細胞に添加した(t = 0)。トランスフェクション混合物を細胞からゆっくりと除去し、1 mlのOptiMEM I-ABを添加し、細胞を33℃で24時間インキュベートした。トランスフェクションの48時間後、1μg/mlのTPCK-トリプシンを含有する1 mlのOptiMEM I-ABを細胞に添加した。トランスフェクションの96時間後、1μg/mlのTPCK-トリプシンを含む1 mlのOptiMEM I-ABを細胞に添加した。
その後、MDCK細胞で継代した後、感染細胞の上清のRT-PCRを用いて、生成されたウイルスの真正性を確認した。RT-PCRを、全部で8個の断片に対する断片特異的プライマーを用いて行った(表1)。図3Aに示されるように、PCR産物は全ての断片について生成された。PB1、HAおよびNS断片のPCR産物の直接配列決定により、分析された4個のヌクレオチドが、プラスミドpAB121-PB1、pAB124-HA、およびpAB128-NS中に認められるものと同じであることが示された。これらの結果により、生成されたウイルスが、設計されたプラスミドから生成されたこと、そして親ウイルスの実験室夾雑物の可能性が排除されたこと(陰性対照に加えて)が確認された(図3B)。
MDV-Bウイルスは、2つの特徴的な表現型を示す:温度感受性(ts)および低温適合性(ca)。定義により、33℃と比較して37℃でのウイルス力価における2 log(またはそれ以上)の差異がtsを定義し、caは33℃と比較して25℃でのウイルス増殖における2 log未満の差異により定義される。一次ニワトリ腎臓(PCK)細胞に、親ウイルスMDV-Bおよびプラスミドに由来するトランスフェクトされたウイルスを感染させて、3つの温度でのウイルス増殖を決定した。
インフルエンザBの主要な系列であるいくつかの異なる株のHAおよびNA断片を、本質的には上記のようにして増幅し、pAD3000中にクローニングした。HAおよびNA断片の同時的RT-PCR増幅のためにプライマーを最適化した。断片4(HA)および断片6(NB/NA)の非コード領域であるvRNAの末端領域の比較により、5'末端の20個の末端ヌクレオチドおよび3'末端の15ヌクレオチドが、インフルエンザBウイルスのHAおよびNA遺伝子の間で同一であることが示された。RT-PCRのためのプライマー対(イタリック体の配列はインフルエンザBウイルス特異的である):
を合成し、これを用いて様々なインフルエンザB株に由来するHAおよびNA遺伝子を同時に増幅した(図6)。B/Victoria/504/2000、B/Hawaii/10/2001、およびB/Hong Kong/330/2001のHAおよびNA PCR断片を単離し、BsmBIで消化し、pAD3000中に挿入した。これらの結果は、インフルエンザBの主要な系列であるいくつかの異なる野生型ウイルスに由来するインフルエンザB HAおよびNA遺伝子を含むプラスミドの効率的生成のためのこれらのプライマーの適用性を証明していた。このRT-PCR産物を、発現プラスミド中での配列決定および/またはクローニングに用いることができる。
フェレットにおいて弱毒化表現型を示し、細胞培養物において低温適合性および温度感受性表現型を示す、MDV-Bウイルス(ca B/Ann Arbor/1/66)を、ヒトにおいて弱毒化する。MDV-Bの内部遺伝子の推定アミノ酸配列を、BLAST検索アルゴリズムを用いて、Los Alamosインフルエンザデータベース(ワールドワイドウェブ上のflu.lanl.gov)中の配列と比較した。MDV-Bにとってユニークであり、任意の他の株に存在しない8個のアミノ酸を同定した(表6)。PB1、BM2、NS1、およびNS2をコードするゲノム断片は、ユニークな置換された残基を示さない。PAおよびM1タンパク質は各々2個、NPタンパク質は4個のユニークな置換アミノ酸(表6)を有する。1個の置換アミノ酸は、PB2中の位置630に認められる(さらなる株B/Harbin/7/94 (AF170572)も位置630にアルギニン残基を有する)。
低温適合性(ca)B/Ann Arbor/1/66は、生弱毒化インフルエンザB Flumist(登録商標)ワクチンのためのマスタードナーウイルス(MDV-B)である。ca B/Ann Arbor/1/66に由来する6個の内部遺伝子ならびに血中循環する野生型株に由来するHAおよびNA表面糖タンパク質を担持する6:2インフルエンザBワクチンは、低温適合性(ca)、温度感受性(ts)および弱毒化(att)表現型を特徴とする。配列分析により、MDV-Bが野生型インフルエンザB株には認められないPB2、PA、NPおよびM1タンパク質中の9個のアミノ酸を含むことが示された。本発明者らは、PA(M431V)およびNP(A114V、H410P)中の3個のアミノ酸がts表現型を決定し、これらの3個のts遺伝子座に加えて、M1中の2個のアミノ酸(Q159H、V183M)がatt表現型を付与することを決定した。
組換えインフルエンザウイルスをエレクトロポレーションを用いてVero細胞からレスキューすることもできる。これらの方法は、インフルエンザAおよびインフルエンザB株ウイルスの両方の製造にとって好適であり、例えば、鼻内ワクチン製剤中での投与にとって好適な生弱毒化ワクチンの調製を容易にする無血清条件下で増殖させたVero細胞からの、例えば、低温適合性、温度感受性、弱毒化ウイルスの回収を可能にする。ウイルス株間でのその広い適用性に加えて、エレクトロポレーションは細胞基質のための増殖培地以外の追加試薬を必要とせず、かくして、望ましくない夾雑物の可能性が低い。特に、この方法は、病原体を含まないと見なされ、かつワクチン製造にとって好適なVero細胞単離物などの、無血清条件下で増殖するように適合させたVero細胞を用いて組換えおよび再集合体ウイルスを作成するのに有効である。この特徴は、細胞基質へのDNAの商業的導入のための好適な方法としてのエレクトロポレーションの選択を支持する。
多くのインフルエンザBウイルス臨床単離物は、潜在的なHA N結合糖鎖付加部位を含む。このHA N結合糖鎖付加部位は、B/Yamagata株についてはアミノ酸残基196〜199の周辺に、B/Victoria株についてはアミノ酸残基197〜199の周辺に存在する。B/Malaysia/2506/04およびB/Ohio/1/05などの最近血中循環が見られるB/Victoria株、ならびにB/Florida/7/04などの最近血中循環が見られるB/Yamagata株は、この潜在的なHA N結合糖鎖付加部位を含む。
インフルエンザB株B/Ohio/1/05、B/Malaysia/2506/04、およびB/Florida/7/04の抗原性に対するHA 196-197糖鎖付加部位の効果を次に試験した。糖鎖付加されたウイルスと糖鎖付加されていないウイルスの抗原性を比較するために、インフルエンザB株B/Ohio/1/05、B/Malaysia/2506/04、およびB/Florida/7/04の各々に対応するウイルス対を、逆遺伝学を用いて作製した(実施例3を参照)。各対の2個のメンバーは、第1のメンバーが野生型アミノ酸配列を有するHAポリペプチド、すなわち、CDCから得られた株中に存在するN結合糖鎖付加部位を含むHAアミノ酸配列を含み、第2のメンバーがN結合糖鎖付加部位を欠くHAポリペプチド、すなわち、卵中での継代後にウイルスから得られたHAアミノ酸配列を含む以外は同一であった。
実施例12の対になったインフルエンザ株のそれぞれのメンバーが卵中で複製することができるかどうかを決定するために、孵化鶏卵に102PFU/卵または104〜105PFU/卵のウイルスを接種し、33℃で3日間インキュベートした。次いで、ウイルスピーク力価を、MDCK細胞中でのプラークアッセイにより決定した。卵でのウイルス対の複製(ウイルス力価)およびそれぞれのウイルスのHAアミノ酸残基196〜199の配列を表11に示す。
196/197糖鎖付加部位を含む任意のインフルエンザB株が卵中で複製することができたかどうかを決定するために、卵に様々な野生型インフルエンザBウイルス株を接種した。次いで、複製しているウイルスのHA配列を決定した。卵で複製することができたインフルエンザBウイルスの多くは、残基197〜199(または196〜198)にNXT糖鎖付加部位を含まなかった。卵中で継代されたウイルスがNXT糖鎖付加部位を含んでいた場合、それらはそれを喪失しつつあった。すなわちNXT配列は、HAタンパク質の197〜199/196〜198残基における配列集団の1つであった。
表12の検討により、B/JSおよびB/JLインフルエンザ株が共にHAアミノ酸残基196〜199にアミノ酸配列NKTQを有したが、B/JSのみが卵で良好に複製し、NKTQ糖鎖付加部位を保持することができることが示された。B/JSおよびB/JLウイルスのHAアミノ酸配列の比較により、3個の異なるアミノ酸残基が同定された。これらの3個の残基の中で、141Rおよび237EはB/JSにとってユニークであった(他のインフルエンザBウイルスと比較して)。アミノ酸残基位置141および237には、多くのインフルエンザB株がグリシンを含む。141Rおよび/または237Eアミノ酸残基の一方または両方が、B/JS HA 196糖鎖付加部位の安定化に寄与したかどうかを試験するために、B/JS HAを突然変異させて、141Rおよび/または237Eをグリシンに変化させた。次いで、卵での種々のB/JSウイルスの複製を決定した。
インフルエンザB株の抗原性に対するHAアミノ酸位置141のアルギニン残基を置換する効果を試験した。141R残基がウイルスの抗原性に影響するかどうかを決定するために、様々な糖鎖付加された、および糖鎖付加されていないウイルスに対するフェレット血清を作製した。このフェレット血清を、141および196/197残基中に異なる修飾を含むウイルスに対する反応性について試験した。
HA 196/197部位が糖鎖付加されたインフルエンザBウイルスはMDCK細胞中で良好に増殖するが、卵中では増殖しないため、HA 196/197での糖鎖はウイルス受容体結合特異性に影響し得る。Sia(α-2,3)GalおよびSia(α-2,6)Galは様々な宿主細胞中に示差的に分布する2つの主要な受容体部分である。MDCK細胞はSia(α-2,3)GalおよびSia(α-2,6)Gal部分の両方を発現する。ニワトリ胚絨毛尿膜細胞はSia(α-2,3)Gal部分のみを発現する。ウイルス受容体結合特異性を、Sia(α-2,3)GalおよびSia(α-2,6)Gal部分を示差的に発現する異なる動物種に由来する赤血球(RBC)を用いる血球凝集アッセイにより試験することができる。ウマRBCは主にSia(α-2,3)Gal受容体を発現するが、モルモットRBCは主にSia(α-2,6)Gal受容体を発現する。七面鳥およびニワトリRBCはSia(α-2,3)GalおよびSia(α-2,6)Gal部分の両方の発現に富む(Itoら、Virol. 156(1997): 493-499)。
Claims (14)
- 再集合体インフルエンザBウイルスを調製する方法であって、
(a)宿主細胞集団中に、
(i)第1のインフルエンザB株のPB1、PB2、PA、NP、NB、M1、BM2、NS1およびNS2ポリペプチドをコードする少なくとも6個の内部ゲノム断片;
(ii)第2のインフルエンザB株のHAポリペプチドをコードするゲノム断片であって、HAポリペプチドが該HAポリペプチドのアミノ酸残基141にアルギニンをもたらす導入された突然変異を含む前記断片;および
(iii)第1のインフルエンザB株、第2のインフルエンザB株または第3のインフルエンザB株のNAポリペプチドをコードするゲノム断片、
に対応するヌクレオチド配列を含む、複数のベクターを導入すること、ここで(i)、(ii)および(iii)のゲノム断片が完全なインフルエンザBゲノムを形成する;
(b)35℃を超えない温度で(a)の宿主細胞集団を培養すること;ならびに
(c)卵中で複製した場合に、(i)HAのアミノ酸残基位置196/197の糖鎖付加部位に糖鎖付加を保持し、且つ(ii)卵中で増加した複製を示す、該再集合体インフルエンザBウイルスを回収すること、
を含む前記方法。 - 第1のインフルエンザBウイルスが1個以上の下記性質:温度感受性、弱毒性、および/または低温適合性を有する、請求項1に記載の方法。
- 複数のベクターのうち少なくとも1つのベクター中に突然変異を導入する工程をさらに含み、該複数のベクターが第1のインフルエンザB株の6個の内部ゲノム断片に対応するヌクレオチド配列を含み、該導入された突然変異がアミノ酸残基:PB2630 (630R); PA431 (431M); PA497(497H); NP55 (55A); NP114 (114A); NP4l0(410H); NP5l0 (510T); M1159 (159Q)およびM1183 (183V)の存在をもたらす、請求項1または2に記載の方法。
- 第1のインフルエンザBウイルスがB/Ann Arbor/1/66株である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、PCK細胞、MDCK細胞、MDBK細胞、293細胞、またはCOS細胞のうちの1つである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のベクターが複数のプラスミドである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のプラスミドが、8つのプラスミドのセットを含み、8つのプラスミドのそれぞれが、第1または第2または第3(存在する場合)のインフルエンザB株の異なるゲノム断片に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項6に記載の方法。
- 複数のプラスミドの各々が、第1のインフルエンザB株の少なくとも6個の内部ゲノム断片、第2のインフルエンザB株のHAポリペプチドをコードするゲノム断片、及びNAポリペプチドをコードするゲノム断片に対応する全てのヌクレオチド配列を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記(a)における導入がヘルパーウイルスを用いることを含まない、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- (a)における導入を脂質媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより実施する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記温度が30〜35℃である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記温度が32〜35℃である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 回収された再集合体インフルエンザBウイルスを卵で複製させることをさらに含み、該再集合体インフルエンザBウイルスが卵で少なくとも7.0 log10 PFU/mlのピーク力価まで複製する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 回収されたウイルスを殺傷することをさらに含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
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