CN103320532B - H7n9亚型禽流感病毒快速检测引物组及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一组用来检测H7N9亚型禽流感病毒的引物组及用此引物组来检测H7N9亚型禽流感病毒的方法。本发明的检测方法具有高特异性、快速、高效扩增、灵敏度高、鉴定简便等优点，可广泛用于临床常规检测及流行病学调查。

Description

H7N9亚型禽流感病毒快速检测引物组及其用途

技术领域

本发明属于分子诊断和基因诊断领域，为微生物检测试剂，试剂检测对象H7N9亚型禽流感病毒RNA。

背景技术

H7N9型禽流感是一种新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现。禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。禽甲型流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。可感染人的禽流感病毒亚型为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3。

此次报道的人感染H7N9禽流感病毒，是全球首次发现的新亚型流感病毒，尚未纳入我国法定报告传染病监测报告系统。被该病毒感染均在早期出现发热等症状，至2013年4月尚未证实此类病毒是否具有人传染人的特性。2013年4月经调查，H7N9禽流感病毒基因来自于东亚地区野鸟和中国上海、浙江、江苏鸡群的基因重配。

目前，H7N9禽流感病毒感染的诊断，主要根据流行病学接触史、临床表现及实验室检查结果，可以做出人感染H7N9禽流感的诊断。特别是从患者呼吸道分泌物标本中分离出H7N9禽流感病毒，或H7N9禽流感病毒核酸检测阳性，均可以作为诊断标准。然而，目前相关检测技术存在一定程度的弊端：虽然病毒分离属于诊断的金标准，但是该方法只能在BSL-3级实验室进行，且容易造成对操作人员直接接触感染的可能，不利于普及和推广。此外还有基于PCR技术的相关检测方法，该技术具有操作复杂、检测成本较高无形中加重了患者负担、对于操作人员要求较高、不利于在基层医院开展等缺点。此外，根据PCR技术的原理，需要有变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的反应温度和时间均不相同且有十分精确的要求，甚至需要进行20-40个循环来完成，因此需要依赖相对贵重的PCR温度循环仪进行控制，不利于现场诊断的要求。核酸序列扩增法(NASBA)，自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)虽然属于等温扩增法，它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要后续的实验操作手段来对于扩增产物进行检测，因此具有操作繁琐的缺点。在病原体集中爆发期间，由于单克隆抗体获得周期较长，不利于在疾病爆发期间进行检测。

为了改善目前H7N9检测操作复杂、依赖昂贵的仪器设备、检测成本高、对操作人员要求较高等缺点，开发一种能够不依赖于昂贵的仪器设备，能够在1小时内对患者样本进行检测，并且可以用肉眼直接观察结果的H7N9检测方法，具有特异性强、灵敏度高、检准率高特点，使其反应程序化，能够广泛应用于临床检验及流行病学调查。

DNA环介导恒温核酸扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification ofDNA，简称LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在恒温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性(见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediatedisothermal amplification ofDNA，Nucleic Acids Res.2000Jun15；28(12)：E63.)。该技术具有以下优点：(1)特异性强，PCR反应仅需要一对引物来识别靶DNA，达到分子检测的目的，而LAMP技术使用2对引物，一共识别靶DNA的6个不同区域，因此特异性较高；(2)灵敏度高，由于该技术使用了一种灵敏度、扩增效率高的DNA聚合酶，因此大大提高了灵敏度，并且缩短了检测时间；(3)操作简单，是用肉眼对结果就能进行判断，并且在等温条件下反应，操作简便不依赖贵重仪器设备。

因此本发明利用了该技术的上述优点，将其应用于H7N9禽流感病毒的检测，能够改善目前众多技术的不足。

发明内容

本发明为了克服上述现有技术的不足，通过以下技术方案实现了高效、特异性检测H7N9禽流感病毒的目的。

本发明的一个技术方案如下：

一组用于检测H7N9亚型禽流感病毒的引物组，其包含以下引物：

(1)针对H7亚型进行检测的各引物如下：

外引物1：GAAGAAGCTCTGAGGCAA

外引物2：CTTAGTCATCTGCGGGAA

内引物1：

TGCTCCATTAGTTCTTATTCCACTGATTCTCAGAGAATCAGGCG

内引物2：

TGCATGTAGGAGATCAGGATCTGCATTATCTGTGTTTGACAGG；

(2)针对N9亚型进行检测的各引物如下：

外引物1：CTGGCCACTATCATCACC

外引物2：TGTGTTCTTAGTATGTTTCGG

内引物1：GCCATCATGGCAACTAGTACTTGCCCACAGTGTACAACAGC

内引物2：

TCAGGACCAAACAACAATGCAGTGTTAATTTCTGCAACAGGC。

本发明的另一个技术方案是上述引物组在检测H7N9亚型禽流感病毒中的应用。

本发明的另一个技术方案是引物组在制备检测H7N9亚型禽流感病毒的试剂盒中的用途。

本发明引物组的使用方法如下：

1、对被检样品的RNA提取：用常规法快速提取样本RNA和反转录。

2、按照以下配方配制反应液：反应体系为25μL：1-10mM的内引物1和内引物2、0.1-10mM的外引物1和外引物2(其中内引物1、内引物2、外引物1和外引物2是四套引物中的一套)、1-10mM的dNTPs、1-10mM的MgSO4、1-10M的甜菜碱、1-5μL粗提DNA、1-8U Bst DNA聚合酶、加蒸馏水至25μL，温和混匀。

3、进行环介导恒温扩增反应：在60-65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应。

4、分析判断反应产物结果：在反应产物中加入SYBR Green I荧光染料，混匀，静置5min，反应产物显现绿色则为阳性，显橙色则为阴性。

本发明利用环介导恒温基因扩增技术，构建了H7N9禽流感病毒快速检测试剂盒，有以下创新点：

特殊引物的设计：原有环介导等温扩增的引物设计上条件非常苛刻，本发明运用生物信息平台进行大规模基因组分析，引入对于多态性位点引入简并碱基和基因组分型处理，使引物设计更加完善，在引物设计时，根据LAMP技术的特殊性，充分考虑了引物二聚体ΔG；3’和5’末端ΔG；错配概率，优化了引物间距和扩增效率，大大提高了扩增反应的特异性和灵敏度。分别根据H7N9中HA基因和NA基因所设计的六条引物是扩增进行的关键。

本发明的有益效果：①只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备；②高特异性：应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，假阳性率为0；③快速、高效扩增：扩增仅需1小时即可完成，且产率高；④灵敏度高：对H7N9病毒的最低检测极限达到10个拷贝以内，标本的检出率达高到99％；⑤鉴定简便：通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤。⑥.用途广，可广泛用于临床常规检测及流行病学调查。

附图说明

图1是本发明实施例各样本检测结果图。

其中A、C、E、G、I分别为样本1-5的H7亚型检测结果，B、D、F、H、J分别为样本1-5的N9亚型检测结果。

具体实施方式

下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明的技术应用不仅限于实施例。

实施例：等温扩增法快速检检测患者咽拭子中的H7N9病毒

本实验分为两部分，其中一部分为H7亚型流感病毒的检测，使用H7型红血球凝集素基因引物；另一部分为N9亚型流感病毒检测，使用亚型神经氨(糖)酸苷酶基因引物。两部分为相互独立的试验。

步骤一：被检样品预处理

对被检样品的RNA提取和反转录：用常规法快速提取样本RNA并反转录。

其中样本如下：

样本1：H7N9亚型禽流感病毒

样本2：H7N2亚型禽流感病毒

样本3：H3N9亚型禽流感病毒

样本4：H9N2亚型禽流感病毒

样本5：去除DNAase和RNAase的无菌双蒸水

步骤二：等温扩增反应体系配置

反应体系为25μL：其中包括1.6mM的内引物1和内引物2；0.2mM的外引物1和外引物2；1.6mM的dNTPs；6mM的MgSO4；1M的甜菜碱；8U Bst DNA聚合酶；通过步骤一获得的2μL样本DNA；加蒸馏水至25μL。其中针对H7亚型进行检测的各引物如下：

外引物1：GAAGAAGCTCTGAGGCAA

外引物2：CTTAGTCATCTGCGGGAA

内引物1：

TGCTCCATTAGTTCTTATTCCACTGATTCTCAGAGAATCAGGCG

内引物2：

TGCATGTAGGAGATCAGGATCTGCATTATCTGTGTTTGACAGG

针对N9亚型进行检测的各引物如下：

外引物1：CTGGCCACTATCATCACC

外引物2：TGTGTTCTTAGTATGTTTCGG

内引物1：GCCATCATGGCAACTAGTACTTGCCCACAGTGTACAACAGC

内引物2：

TCAGGACCAAACAACAATGCAGTGTTAATTTCTGCAACAGGC

步骤三：等温扩增反应实施

将步骤二中配置的反应液在63℃下保温1h，随后85℃加热2min以终止反应。

步骤四：结果观察

在反应产物中加入1.0μL荧光染料(SYBR Green I)，混匀，静置5min。观察颜色变化，其中绿色为阳性、橙色为阴性。

步骤五：实验结果

样本1的结果见图1A和B，均为绿色，说明H7亚型检测和N9亚型检测均显阳性。

样本2的结果见图1C和D，C为绿色，D均为橙色，说明H7亚型检测为阳性，N9亚型检测为阴性。

样本3的结果见图1E和F，E为橙色，F为绿色，说明H7亚型检测为阴性，N9检测结果为阳性。

样本4的结果见图1G和H，均为橙色，说明H7亚型检测和N9亚型检测均显阴性。

样本5的结果见图1I和J，均为橙色，说明H7亚型检测和N9亚型检测均显阴性。

由以上的实验数据可以看出，实验检测结果与实际相符。通过对检测结果颜色的观察，可以直观、迅速的将H7N9亚型禽流感病毒样品鉴别出来，同时也可以将其与相近的亚型区分开来，实现准确检测、避免假阳性的目的。

Claims (3)

1.一组用于检测H7N9亚型禽流感病毒的引物组，其包含以下引物：

(1)针对H7亚型进行检测的各引物如下：

外引物1：GAAGAAGCTCTGAGGCAA

外引物2：CTTAGTCATCTGCGGGAA

内引物1：

TGCTCCATTAGTTCTTATTCCACTGATTCTCAGAGAATCAGGCG

内引物2：

TGCATGTAGGAGATCAGGATCTGCATTATCTGTGTTTGACAGG；

(2)针对N9亚型进行检测的各引物如下：

外引物1：CTGGCCACTATCATCACC

外引物2：TGTGTTCTTAGTATGTTTCGG

内引物1：GCCATCATGGCAACTAGTACTTGCCCACAGTGTACAACAGC

内引物2：

TCAGGACCAAACAACAATGCAGTGTTAATTTCTGCAACAGGC。

2.权利要求1所述的引物组在制备检测H7N9亚型禽流感病毒的试剂盒中的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：试剂盒的使用方法如下：

(1)对被检样品的RNA提取：用常规法快速提取样本RNA和反转录；

(2)按照以下配方配制反应液：反应体系为25μL：1-10mM的内引物1和内引物2、0.1-10mM的外引物1和外引物2、1-10mM的dNTPs、1-10mM的MgSO4、1-10M的甜菜碱、1-5μL粗提DNA、1-8U BstDNA聚合酶、加蒸馏水至25μL，温和混匀；

(3)进行环介导恒温扩增反应：在60-65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应；

(4)分析判断反应产物结果：在反应产物中加入SYBR Green I荧光染料，混匀，静置5min，反应产物显现绿色则为阳性，显橙色则为阴性。