CN101392298B

CN101392298B - 一种用于检测流感和h5n1亚型禽流感病毒的液相芯片和特异性检测引物及其制备方法

Info

Publication number: CN101392298B
Application number: CN2008100224897A
Authority: CN
Inventors: 崔仑标; 葛以跃; 史智扬; 曾晓燕; 焦永军; 潘浩; 汪华
Original assignee: JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Current assignee: JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Priority date: 2008-07-15
Filing date: 2008-07-15
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2028-07-15
Also published as: CN101392298A

Abstract

本发明涉及一种检测流感病毒的方法，尤其是一种借助液相芯片检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的方法，属于医学监测技术领域。本发明是一种可以同时对甲(FluA)、乙(FluB)型流感病毒，包括H5N1亚型禽流感病毒进行分型鉴定的快速高效的检测方法。利用了液相芯片技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，制作能够特异性识别H5、N1基因片段、甲型流感病毒的NP基因以及乙型流感病毒的HA基因片段的液相芯片。其优点是：能够对甲、乙型流感病毒，包括H5N1亚型高致病性禽流感病毒进行快速检测和早期诊断；并为开发其它各种亚型流感病毒的快速高效检测方法提供依据。其检测病毒种类多，反应时间短且灵敏度高的特性决定了本发明必将具有广阔的应用前景。

Description

一种用于检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的液相芯片和特异性检测引物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测病毒的液相芯片和特异性检测引物及制备方法，尤其是一种用于检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的液相芯片和特异性检测引物及其制备方法，属于医学检测技术领域。

背景技术

迄今发现能直接感染人的禽流感病毒有H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7和H9N2等亚型毒株，其中以H5N1亚型对人类的威胁最大。此外，对人类造成威胁的主要流感病毒还有H1N1、H3N2等甲型流感病毒和乙型流感病毒。

目前，禽流感病毒的主要检测方法包括病毒分离、病毒抗原和基因检测以及血清学检查三个方面。其中，病毒分离耗时长，技术要求高，不利于快速诊断；血清学检查只能用于回顾性诊断；病毒抗原检测耗时、费力，也无法做到高通量；在病毒基因检测方面，由美国疾病预防控制中心推荐的禽流感A/H5(亚洲谱系)实时荧光定量PCR检测体系，于2006年2月3日通过美国食品与药品管理局的认证，作为H5N1禽流感爆发的主要监测方法。采用实时荧光定量PCR的方法检测禽流感可以做到高通量、快速准确，但是不利于多重检测，因为各组引物的不兼容性、扩增背景高以及实验重复性差等诸多因素直接影响了多重荧光定量PCR检测的敏感性和特异性。液相芯片(xMAP)技术是20世纪90年代中期发展起的一种集流式技术、荧光微球、激光、数字信号处理和传统化学技术为一体的新型生物分子高通量多重检测技术。xMAP技术自问世以来，已广泛应用于各个领域，极大的推动了科学研究和临床检测技术的快速发展。与现有检测方法相比，液相芯片技术主要拥有以下几方面优点：1)高通量；2)反应速度快，因为杂交或免疫反应在悬浮的液相中进行，有利于生物分子间的相互作用，所以反应时间可缩短至十几分钟；3)可以多重检测，一次最多可以检测100种指标；4)敏感性高，液相芯片的灵敏度是常规的酶联免疫吸附试验(简称ELISA)方法灵敏度的10～100倍；5)重复性好。液相芯片技术是一个灵活的、开放的技术平台，可以根据需要进行相应的构建，从而同时对多种不同待检生物分子进行快速、廉价、准确的检测。迄今为止，全球已有数百套基于此项技术的检测平台，诊断试剂的开发方面也发展相当迅速。公开号为CN1560597、公开日为2005.1.5的中国专利申请公开了一种禽流感病毒多重PCR快速检测方法，该发明提供了可以快速鉴定禽流感病毒H5、H9亚型病毒的检测方法，不能同时对H5N1、H1N1、H3N2等甲型流感病毒和乙型流感病毒同时进行检测。公开号为CN1858249、公开日为2006.11.08 的中国专利申请公开了一种基于液相芯片检测禽流感病毒H5N1亚型的方法，该方法利用液相芯片技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对在核酸序列库中能够检索到的所有的H5、N1血清亚型核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对禽流感病毒H5和N1基因片断的简并引物和特异性探针，特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联制成特异性检测微球，即液相芯片；液相芯片能够特异性的识别禽流感病毒H5和N1基因片断，通过两轮PCR反应，并通过液相芯片检测仪读出检测结果。但该方法只能对H5N1亚型进行快速检测，不能同时对H1N1、H3N2等甲型流感病毒和乙型流感病毒同时进行检测，而且需通过两轮PCR反应，检测时间较长。

发明内容

本发明的目的在于：针对以上现有技术存在的不足之处，提出一种用于检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的液相芯片和特异性检测引物及其制备方法，该液相芯片和特异性检测引物可以快速准确检测包括H5N1亚型高致病性禽流感病毒在内的多种甲、乙型流感病毒，从而为快速检测和早期诊断提供依据。

为了达到以上目的，本发明用于检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的液相芯片和特异性检测引物，所述液相芯片是由特异性检测探针与荧光微球偶联形成的特异性检测微球，所述特异性检测探针是在5’端加上C₁₂分子臂和氨基修饰的特异性探针，所述特异性探针为：

FluA-probe TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA

H5-probe CCGCAGTATTCAGAAGAAGC

N1-probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC

FluB-probe GCCATAGGAAATTGCCCAAT

所述特异性检测引物是对所有反向引物进行生物素标记的简并引物，所述简并引物为：

FluA-Forward GAGGTCGAAACGTAYGTTCTCTCTAT

FluA-Reverse GGTCTTGTCTTTAGCCAYTCCAT

H5-Forward GGTAACGGTTGTTTCGARTTCTATCA

H5-Reverse ATAGACCAGCYACCATGATTGCCAG

N1-Forward GGACYAGTGGGAGCAGCATA

N1-Reverse TGTCAATGGTRAAYGGCAACTC

FluB-Forward AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA

FluB-Reverse CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA。

所述液相芯片和特异性检测引物的制备方法包括以下步骤：步骤一设计引物：依据现有核酸数据库中甲型流感病毒H5、N1和NP的基因节段序列以及乙型流感病毒中的HA基因节段序列进行同源性比对，根据保守序列，设计针对各基因的简并引物和特异性探针；所述简并引物和特异性探针如前所述；

步骤二合成及修饰引物和探针，在设计完成的特异性探针的5’端加上C₁₂分子臂和氨基修饰，得到特异性检测探针；对设计完成的简并引物中的所有反向引物进行生物素标记，得到特异性检测引物；

步骤三制备液相芯片，将所述特异性检测探针与荧光微球偶联形成特异性检测微球，即液相芯片。

本发明的目的通过以下技术方案进一步实现：所述步骤三中特异性检测探针与荧光微球偶联形成液相芯片的步骤是将特异性检测探针稀释至1mM，重悬微球，取80μl数目为1×10⁶个的羧基微球，离心后弃上清，加入0.1M、pH＝4.5的MES 10μl，混匀，在反应体系中加入0.04～0.1nmol的特异性检测探针，混匀，然后加入10mg/ml EDC1.25～2.5μl，混匀，室温避光孵育30min后，用0.5ml体积分数为0.02％的Tween-20和0.5ml质量浓度为0.1％的SDS各洗涤一次，最后用80μl TE缓冲液重悬微球，血细胞计数器计数后混合4种微球，用TE缓冲液稀释后4℃避光保存，备用。其中，在反应体系中重复加入EDC，室温避光孵育30min。

本发明可以同时对甲、乙型流感病毒，包括H5N1亚型禽流感病毒进行快速高效分型鉴定。本发明利用了液相芯片技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，设计并合成针对高致病性禽流感病毒血凝素(H5)和神经氨酸酶(N1)基因的亚型特异性以及针对甲型流感病毒核心蛋白(NP)、乙型流感病毒血凝素(HA)基因的型特异性PCR引物和寡核苷酸探针，特异性寡核苷酸探针通过与荧光编码微球进行偶联制成特异性检测微球，即液相芯片，液相芯片能够特异性识别H5、N1基因片段、甲型流感病毒的NP基因以及乙型流感病毒的HA基因片段；通过对待检标本进行多重PCR反应，产物与液相芯片进行杂交，并通过液相芯片检测系统读出检测结果。优点是：能够对甲、乙型流感病毒，包括H5N1亚型高致病性禽流感病毒进行快速检测和早期诊断；并为开发其它各种亚型流感病毒的快速高效检测方法提供依据。其检测病毒种类多，反应时间短且灵敏度高的特性决定了本发明必将具有广阔的应用前景。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为未偶联特异性探针的微球数值图；

图2为图1的Bead map；

图3为一例H5N1亚型标本PCR产物电泳图；

图4为一例乙型流感样本PCR产物电泳图；

图5为一例H5N1亚型标本检测图；

图6为一例H1N1亚型标本检测图；

图7为一例H3N2亚型标本检测图；

图8为一例乙型流感样本检测图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明

实施例一

第一步：设计引物和探针运用生物信息学知识和生物信息软件对核酸数据库中所有甲型流感病毒H5、N1和NP的基因节段序列以及乙型流感病毒中的HA基因节段序列通过计算机进行同源性比对，根据保守序列，设计针对各基因的简并引物和特异性探针；所得到的简并引物如下：

FluA-Reverse GGTCTTGTCTTTAGCCAYTCCAT

H5-Forward GGTAACGGTTGTTTCGARTTCTATCA

H5-Reverse ATAGACCAGCYACCATGATTGCCAG

N1-Forward GGACYAGTGGGAGCAGCATA

N1-Reverse TGTCAATGGTRAAYGGCAACTC

FluB-Forward AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA

FluB-Reverse CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA；

得到的特异性探针如下：

FluA-probe TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA

H5-probe CCGCAGTATTCAGAAGAAGC

N1-probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC

FluB-probe GCCATAGGAAATTGCCCAAT；

第二步：合成及修饰探针对上述设计完成的简并引物中所有反向引物FluA-Reverse、H5HA-Reverse、H5NA-Reverse和FluB-Reverse进行生物素标记，得到特异性检测引物；并在上述设计完成的特异性探针的5′端加上C₁₂分子臂和氨基修饰，得到特异性检测探针；

第三步：制备液相芯片将上述特异性检测探针与荧光微球偶联形成特异性检测微球，即液相芯片；具体步骤是，将特异性检测探针稀释至1mM，重悬微球，取80μl(1×10⁶个)羧基微球，10000g离心2min后弃上清，加入MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)(0.1M，pH＝4.5)10μl，混匀，在反应体系中加入1nM的特异性检测探针，混匀后再加入新鲜配置的10mg/ml EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐)1.25μl，混匀后室温避光孵育30min，重复加入新鲜配置的EDC一次，再次室温避光孵育30min后，用0.5mlTween-20(吐温-20)(0.02％V/V)和0.5ml SDS(十二烷基磺酸钠)(0.1％W/V)各洗涤一次，最后用80μlTE(三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液重悬微球，血细胞计数器计数后混合4种微球，用TE缓冲液稀释使每种微球的浓度至416个/μl，4℃避光保存，备用；

第四步：RT-PCR反应对甲型流感病毒H5、N1和NP以及乙型流感病毒中的HA进行4重PCR反应，得到PCR扩增产物；其中，RT-PCR的反应为引物浓度不对称的4重反应，反应体系为50μl∶5×RT-PCRBuffer(缓冲液)10μl，dNTP(脱氧核糖核苷酸)2μl，Enzymemix(酶混合物)2μl，特异性检测引物各1μl，正向引物的浓度为：0.04μM，反向引物的浓度为：0.2μM，RNA模板5μl，加水补足体积50μl，PCR扩增条件为：逆转录50℃ 30min，预变性95℃15min，94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 30sec，共45循环，最后72℃延伸5min，得到PCR扩增产物；

第五步：PCR扩增产物与液相芯片杂交将上述所得PCR扩增产物与第三步中得到的液相芯片进行杂交，通过液相芯片检测系统检测芯片；PCR扩增产物与液相芯片的杂交反应体系为50μl∶1.5×TMAC(氯化四甲铵)33μl，混合微球12μl，PCR扩增产物5μl，空白孔以5μl TE取代PCR扩增产物；杂交反应的条件为：95℃变性5min，45℃杂交15min，10000g离心2min后弃上清，加入1×TMAC新鲜稀释的SA-PE(链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白)(4ug/ml)75μl，45℃杂交5min后上机检测；其中，通过芯片检测仪(Bio-PlexSystem)直接读取以上实验中未偶联探针的微球，重复3次，确定Gate value的值为5280-16040后，芯片检测仪的参数设置如下：

Events：50

Min Events：0

Gate value：5280-16040

Gate value的值如图1所示，对应的Bead map如图2所示。

以上标本检测步骤如下：

1.PCR扩增效果检测检测方法采用常规的琼脂糖凝胶电泳法，用2％琼脂糖凝胶电泳检测所得的PCR扩增产物，如图3、图4所示。

2.特异性试验结果采用常规方法检测H5N1、H1N1、H3N2血清亚型流感标本和乙型流感标本。在H5N1亚型标本检测图中，偶联FluA、H5和N1的三种微球都得到了较高的荧光值，呈阳性，而偶联FluB微球的荧光值低于100，呈阴性，见图5；在H1N1亚型标本检测图中，偶联FluA和N1的两种微球都得到了较高的荧光值，呈阳性，而偶联H5和FluB微球的荧光值均低于100，呈阴性，见图6；在H3N2亚型标本检测图中，除了偶联FluA的微球得到较高的荧光值呈阳性之外，其余3种微球荧光值都很低，呈阴性，见图7；在乙型流感标本检测图中，只有偶联FluB的微球得到了阳性结果，见图8；表明本发明的方法具有较高的特异性。

3.灵敏度试验结果将RNA模板进行梯度稀释后用本发明的方法检测，结果如表1，以荧光强度大于100为阳性判断标准，随着RNA 浓度的降低，检测的荧光强度减弱，本发明对甲乙型流感及H5N1亚型RNA最低检出量均为1pg，灵敏度高。

表1

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

序列表

<110>江苏省疾病预防控制中心

<120>一种用于检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的液相芯片和特异性检测引物及其制备方法

<140>200810022489.7

<141>2008年7月15日

<160>12

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(26)

<223>FluA-Forward

<400>1

GAG GTC GAA ACG TAY GTT CTC TCTAT 26

1 5

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(23)

<223>FluA-Reverse

<400>2

GGT CTT GTC TTT AGC CAY TCC AT 23

1 5

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(26)

<223>H5-Forward

<400>3

GGT AAC GGT TGT TTC GAR TTC TAT CA 26

1 5

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(25)

<223>H5-Reverse

<400>4

ATA GAC CAG CYA CCA TGA TTG CCA G 25

1 5

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(20)

<223>N1-Forward

<400>5

GGA CYA GTG GGA GCA GCA TA 20

1 5

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(22)

<223>N1-Reverse

<400>6

TGT CAA TGG TRA AYG GCA ACT C 22

1 5

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(26)

<223>FluB-Forward

<400>7

AAA TAC GGT GGA TTA AAT AAA AGC AA 26

1 5

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(21)

<223>FluB-Reverse

<400>8

CCA GCA ATA GCT CCG AAG AAA 21

1 5

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(20)

<223>FluA-probe

<400>9

TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA 20

1 5

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(20)

<223>H5-probe

<400>10

CCG CAG TAT TCA GAA GAA GC 20

1 5

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(20)

<223>N1-probe

<400>11

TGG TCT TGG CCA GAC GGT GC 20

1 5

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(20)

<223>FluB-probe

<400>12

1 5

Claims

1.一种用于检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的液相芯片和特异性检测引物，其特征是：所述液相芯片是由特异性检测探针与荧光微球偶联形成的特异性检测微球，所述特异性检测探针是在5’端加上C₁₂分子臂和氨基修饰的特异性探针，所述特异性探针为：

FluA-probe TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA

H5-probe CCGCAGTATTCAGAAGAAGC

N1-probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC

FluB-probe GCCATAGGAAATTGCCCAAT；

FluA-Forward GAGGTCGAAACGTAYGTTCTCTCTAT

FluA-Reverse GGTCTTGTCTTTAGCCAYTCCAT

H5-Forward GGTAACGGTTGTTTCGARTTCTATCA

H5-Reverse ATAGACCAGCYACCATGATTGCCAG

N1-Forward GGACYAGTGGGAGCAGCATA

N1-Reverse TGTCAATGGTRAAYGGCAACTC

FluB-Forward AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA

FluB-Reverse CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA。

2.根据权利要求1所述的用于检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的液相芯片和特异性检测引物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、设计引物和探针，依据现有核酸数据库中甲型流感病毒H5、N1和NP的基因节段序列以及乙型流感病毒中的HA基因节段序列进行同源性比对，根据保守序列，设计针对各基因的简并引物和特异性探针；所述简并引物和特异性探针如权利要求1所述；

步骤二、合成及修饰引物和探针，在设计完成的特异性探针的5’端加上C₁₂分子臂和氨基修饰，得到特异性检测探针；对设计完成的简并引物中的所有反向引物进行生物素标记，得到特异性检测引物；

步骤三、制备液相芯片，将所述特异性检测探针与荧光微球偶联形成特异性检测微球，即液相芯片。

3.根据权利要求2所述的用于检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的液相芯片和特异性检测引物的制备方法，其特征在于：所述步骤三中特异性检测探针与荧光微球偶联形成液相芯片的步骤是将特异性检测探针稀释至1mM，重悬微球，取80μl数目为1×10⁶个的羧基微球，离心后弃上清，加入0.1M、pH＝4.5的MES 10μl，混匀，在反应体系中加入0.04～0.1nmol的特异性检测探针，混匀，然后加入10mg/ml EDC1.25～2.5μl，混匀，室温避光孵育30min后，用0.5ml体积分数为0.02％的Tween-20和0.5ml质量浓度为0.1％的SDS各洗涤一次，最后用80μl TE缓冲液重悬微球，血细胞计数器计数后混合4种微球，用TE缓冲液稀释后4℃避光保存，备用。

4.根据权利要求3所述的用于检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的液相芯片和特异性检测引物的制备方法，其特征在于：在反应体系中重复加入EDC，室温避光孵育30min。