CN1858249A

CN1858249A - 一种基于液相芯片检测禽流感病毒h5n1亚型的方法

Info

Publication number: CN1858249A
Application number: CN 200610018603
Authority: CN
Inventors: 王华林; 夏骏; 袁丽; 邓菲; 胡志红
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2006-03-21
Filing date: 2006-03-21
Publication date: 2006-11-08
Anticipated expiration: 2026-03-21
Also published as: CN100494402C

Abstract

本发明是基于液相芯片检测禽流感病毒H5N1亚型的方法，其利用液相芯片技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对在核酸序列库中能够检索到的所有的H5、N1血清亚型核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对禽流感病毒H5和N1基因片断的简并引物和特异性探针，特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联制成特异性检测微球，即液相芯片；液相芯片能够特异性的识别禽流感病毒H5和N1基因片断，通过两轮PCR反应，并通过液相芯片检测仪读出检测结果。本发明能够对禽流感病毒H5N1亚型进行快速检测和进行早期诊断，并为开发出检测H5N1亚型和其它各种亚型流感病毒更为快速有效的方法提供了一条广阔的前景。

Description

一种基于液相芯片检测禽流感病毒H5N1亚型的方法

技术领域

本发明涉及一种基于液相芯片检测禽流感病毒H5N1亚型的方法。

背景技术

流行性感冒是常见急性呼吸道传染病之一，由于流感病毒极易变异，常常引起全国甚至世界性大流行。尤其近段时间国内外部分地区禽流感的流行及人禽流感病例的出现等突发公共卫生事件，都迫切要求对上述疾病做出早期快速的实验室诊断。

流行性感冒病毒属于正粘病毒科，可分为甲、乙、丙三型。根据甲型流感病毒表面抗原血凝素抗原(HA)和神经氨酸酶抗原(NA)的结构及基因特性的不同又可分为若干亚型，至今已经发现甲型流感的HA有16个亚型(H1-H16)，NA有9个亚型(N1-N9)。由于HA和NA的抗原性容易发生变异，所以造成了流感病毒的不断流行，因此在流感病毒的检测过程中对于其型别的鉴定是十分重要的。

流感病毒的检测主要有四大部分：病毒培养分离、血清学诊断、病毒抗原检测、病毒核酸检测。其中病毒培养分离、血清学检测和分型是常规的方法，但此类方法花费时间比较长，无法快速的对流感病毒进行检测和分型；而在病毒核酸的检测和分型中，出现了很多快速特异的方法。特别是PCR技术的应用，对于流感病毒鉴定和分型发挥着越来越大的作用。这些方法如：逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)、多重逆转录聚合酶链反应(multiplex reverse transcription-PCR，MRT-PCR)、酶免PCR(PCR-enzymeimmunoassay，PCR-EIA)、实时PCR(real-time PCR，RT-PCR)等提高了检测的速度和灵敏度，然而，尽管越来越多的方法用于检测流感病毒，但尚未有一种方法能够对流感病毒各种亚型进行快速准确的分型。因此建立一种对流感病毒各种型别进行快速鉴定的方法就十分重要了。

液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array，MASA)技术是一种新型基因芯片技术。该技术的核心是把荧光编码的乳胶颗粒分别与特异性的检测探针偶联，然后在悬液中加入微量标本与特异性检测微粒进行结合，结合的结果经激光判读后由电脑以数据形式记录下来。该技术具有高通量、灵敏度高、速度快的特点，且所需要的标本量少，已经在基因分型、组织分型、感染性疾病检测等方面广泛应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：运用液相芯片技术，提供一种用于检测禽流感病毒H5N1亚型的方法，以便对禽流感病毒H5N1亚型进行快速检测和进行早期诊断，为控制禽流感的流行及控制和消灭人禽流感互相感染做出贡献。

本发明所采用的技术方案是：利用液相芯片技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对在核酸序列库中能够检索到的所有的H5、N1血清亚型核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对禽流感病毒H5和N1基因片断的简并引物和特异性探针，简并引物包括特异性检测引物和生物素修饰的通用引物，特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联制成特异性检测微球，即液相芯片。液相芯片能够特异性的识别禽流感病毒H5和N1基因片断，通过两轮PCR反应，并通过液相芯片检测仪(Luminex)读出检测结果。

本发明的主要效果如下：

我们设计了针对禽流感病毒H5N1血清亚型的四对特异性引物和探针，其中H5和N1分别分为两个组别(H5-1和H5-2、N1-1和N1-2)；使用四种荧光编码微球，利用液相芯片技术对H5N1亚型和其它常见亚型(A1、A2、A3、H9N2)标本进行了检测分析。发现基于液相芯片技术研制的禽流感病毒H5N1亚型检测试剂盒具有较高特异性、灵敏度和快速的特点，在对禽流感病毒H5N1亚型进行快速检测和进行早期诊断方面具有重要的应用价值。

利用一种新型的基因芯片技术——液相芯片技术，建立一种对禽流感病毒H5N1亚型进行快速诊断的新方法，并制成检测试剂盒等生物用品。由于该生物用品具有快速和较高特异性的特点，能够快速检测出禽流感H5N1亚型，因而能够为控制禽流感的流行，以及为控制和消灭人禽流感互相感染做出贡献。

鉴于目前用于禽流感检测的方法无法快速简便的对流感病毒各种亚型进行区分，基于上述效用，本发明为开发出检测H5N1亚型和其它各种亚型流感病毒更为快速有效的方法提供了一条更为广阔的前景。

附图说明

图1是一例H5N1亚型的RT-PCR和PCR产物的示意图。图中：DL2000为Marker，各个电泳条带代表了各自的PCR产物。

图2至图5是采用Luminex 100系统对混合引物扩增产物杂交检测结果的示意图，其中：

图2为gate value的确定，使检测荧光的峰值位于确定的gate值之间；

图3标明了四种混合微球所对应的位置；

图4为检测的一例H5N1亚型标本；

图5为A1亚型标本。

图4和图5两图中横坐标表示杂交产物的平均荧光强度，纵坐标表示所使用的探针偶联的微球，其中有一个内源性Control。

具体实施方式

本发明基于液相芯片技术，建立了一种对H5N1亚型禽流感病毒进行快速检测的新方法。在对各种标本的检测中，我们发现基于液相芯片技术研制的禽流感病毒H5N1亚型检测试剂盒具有较高特异性、灵敏度和快速的特点。

本发明利用液相芯片技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对在核酸序列库中能够检索到的所有的H5、N1血清亚型核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对禽流感病毒H5和N1基因片断的简并引物和特异性探针，简并引物包括特异性检测引物和生物素修饰的通用引物，特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联制成特异性检测微球，即液相芯片。液相芯片能够特异性的识别禽流感病毒H5和N1基因片断，通过两轮PCR反应，并通过液相芯片检测仪读出检测结果。液相芯片能够制成试剂盒等生物用品。

下面结合实例及附图对本发明作进一步说明。

一.序列分析、引物探针的设计合成

从NCBI的Genbank上下载所有A型流行性感冒病毒H5和N1片断核酸序列，筛选出需要的完整的核酸序列。对序列进行比对分析，对于每个片断根据核酸同源性将检索的核酸序列分成不同组别。

本发明中我们将H5和N1亚型分别分成两个组：H5-1和H5-2、N1-1和N1-2。对于每个组，分析并找出保守序列，然后根据保守序列设计引物和探针。由于单个核酸变异比较多，我们使用简并引物。设计的探针要和芯片中使用的微球进行偶联，5′端需要氨基化处理。

设计引物时，在所有正向引物和反向引物的5′端各加入一段序列(经分析该序列与流行性感冒病毒序列不同源)，即通用引物(Uni-forward)5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tc和(Uni-reverse)5′-ctg gtc cgt act tcc gag cg，以便第二轮扩增反应。

第二轮扩增反应使用上面加入的这两段序列(Uni-Primers)，其中反向通用引物Uni-reverse的5′端用生物素(biotin)进行标记。

最终设计合成如下引物和探针：

特异性检测引物如下：

H5-1For：5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tcg gac aat ttt raa rcc raa tg-3′

H5-1Rev：5′-ctg gtc cgt act tcc gag cgt tat cgc mcc cay tgg ag-3′

H5-2For：5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tca atg gac aaa gtg gaa gaa t-3′

H5-2Rev：5′-ctg gtc cgt act tcc gag cga agg cata ctr gaa ttt ata g-3′

N1-1For：5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tcg caa ttc atc tct ttg ycc-3′

N1-1Rev：5′-ctg gtc cgt act tcc gag cgc acc cac agg aca act c-3′

N1-2For：5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tcc tcy cac ttg gar tgc ag-3′

N1-2Rev：5′-ctg gtc cgt act tcc gag cgc crt tgt att tca ata cag c-3′

生物素修饰的通用引物如下：

Uni-For：5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tc-3′

Uni-Rev：5′-biotin-ctg gtc cgt act tcc gag cg-3′

特异性检测探针如下：

H5-1Probe：5′-NH2-tat gca tac aaa att gtc aag aar gg-3′

H5-2Probe：5′-NH2-ccw gaa tat gca tac aag ata gtt aa-3′

N1-1Probe：5′-NH2-aaa tcc aag ggg gat gtg ttt gtt rt-3′

N1-2Probe：5′-NH2-gtt ggt tga caa ttg gwa ttt cyg g-3′。

二.RT-PCR和PCR

我们设计了两轮PCR反应。其中第一轮反应即RT-PCR，利用特异性引物进行一步法RT-PCR。反应体系为25uL，其中5×buffer 5uL、dNTP 1uL、Enzyme 1uL、每个反应中加入RNA酶抑制剂5U、正向和反向引物各(每条引物终浓度为0.6uM)、RNA模板1uL，加水补足25uL体系。使用PTC-200PCR仪，条件设定为逆转录50℃30min，变性95℃15min，94℃30sec，50℃30sec，72℃30sec，进行35个循环，最后72℃延伸5min。第二轮反应是利用Uni-Primers以第一轮反应产物为模板进行的PCR反应。反应体系为50uL，其中10×buffer5uL，dNTP 1uL，TaqDNA聚合酶1U，Uni-forward 1uL，Uni-reverse 1.5uL，加入前一步RT-PCR反应产物1uL，加水补足50uL体系。反应条件设定为变性95℃10min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，进行35个循环，最后72℃延伸5min。反应产物置4℃待杂交检测。

三.液相芯片的制备

1、探针与微球偶联

取出50uL(1×10⁶个)需要的微球，12000rpm离心1min30sec后弃去上清，加入MES(0.1M，pH 4.5)8uL，混匀。将所用的探针用MES稀释到20uM，在偶联体系中加入2uL，加入EDC(10mg/mL)1.25uL第一次，混匀后避光放置30min。重复加入EDC一次。用500uLTween20(0.02％V/V)和SDS(0.1％W/V)各洗涤一次，最后将微球重新悬浮于20uL TE(PH8.0)溶液中，混匀后使用血细胞计数器计数微球数量(计数四角4个大方格的数目后换算为每uL微球个数)。4℃避光保存。混合偶联好探针的微球，使用1.5×TMAC稀释至每种微球的浓度是150个/uL。

2、扩增产物的液相杂交

将产物与混合微球进行杂交，杂交体系为50uL，其中混合微球33uL，PCR产物5uL，加入TE补充体积至50uL。96℃变性5min后，52℃杂交15min。加入SA-PE 52℃杂交5min，等待上机检测。

3、多功能流式点阵仪(Luminex 100^TM)的设置

设置仪器参数为Events：100；Min event：20。

Gate value的确定：使用Luminex 100^TM直接读取本实验中所使用未偶联探针的微球，根据仪器读取的峰值确定gate value大小。

四.标本的检测

1、RT-PCR和PCR对引物的验证

利用1.5％琼脂糖凝胶电泳，我们分别检测了两轮扩增反应的产物。

图1为一例H5N1亚型标本的RT-PCR产物结果，其中H5-2组中没有出现扩增产物。其它组中扩增出了与预计片断大小一致的产物。在应用混合引物进行的RT-PCR结果中，除H5-2组外，其它预计大小片断产物都出现，同时亦扩增出了一条较大和一条较小的非特异性片断。

在对利用Uni-Primers进行的第二轮PCR产物检测中亦得到同样结果。H5-2组并未得到PCR产物，分析其原因是H5-2组主要为H5N2亚型序列，而我们所用的是H5N1标本。

这次实验所使用的其它亚型标本经电泳检测，没有发现明显的相应大小扩增产物。证明我们设计的引物具有较好的特异性和可应用性。

2、Gate value的确定

使用Luminex 100^TM直接读取本实验中所使用未偶联探针的微球，重复三次，从而确定本实验中需要将gate value设定为9294～18441。仪器检测结果见图2。

3、特异性试验结果

如图3-5，检测了H5N1标本和其它几种常见血清亚型标本。在H5N1亚型标本检测中，四种微球都得到了较高的荧光强度，为阳性结果；在A1亚型标本检测中，N1-2微球得到了较高的荧光强度(平均荧光强度值为185.07)；在其它亚型标本中，各种微球荧光强度都较低，为阴性结果。

4、灵敏度试验结果

经测定，该方法对H5N1亚型RNA的最低检出量为10pg。结果见表2，随着RNA检测量的递减，检测的荧光强度值也逐渐递减。在10pg时，只有H5-1和N1-2组有较高的荧光强度值(大于100)，为阳性结果。

五.附表

灵敏度试验结果

H5N1亚型RNA检测量	偶联了相应探针微球的荧光强度值
	偶联了相应探针微球的荧光强度值					Control	H5-1	H5-2	N1-1	N1-2
	Blank100ng10ng1ng100pg10pg1pg100fg10fg	67.1860.5953.4269.9165.7076.7570.1577.0170.83	59.65858.61778.23663.32380.42144.2563.0156.8068.84	41.38303.36302.30233.78124.1356.0842.2949.5049.90	56.00227.69249.49224.44176.8670.4471.9965.3995.34	Control	H5-1	H5-2	N1-1	N1-2	42.211174.371042.11859.01609.69127.0059.3341.0744.86

Claims

1.一种检测禽流感病毒H5N1亚型的方法，其特征是一种基于液相芯片检测禽流感病毒H5N1亚型的方法，具体是：利用液相芯片技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对在核酸序列库中能够检索到的所有的H5、N1血清亚型核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对禽流感病毒H5和N1基因片断的简并引物和特异性探针，简并引物包括特异性检测引物和生物素修饰的通用引物，特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联制成特异性检测微球，即液相芯片；液相芯片能够特异性的识别禽流感病毒H5和N1基因片断，通过两轮PCR反应，并通过液相芯片检测仪读出检测结果，

特异性检测引物为：

H5-1For：5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tcg gac aat ttt raa rcc raa tg-3′

H5-1Rev：5′-ctg gtc cgt act tcc gag cgt tat cgc mcc cay tgg ag-3′

H5-2For：5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tca atg gac aaa gtg gaa gaa t-3′

H5-2Rev：5′-ctg gtc cgt act tcc gag cga agg cata ctr gaa ttt ata g-3′

N1-1For：5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tcg caa ttc atc tct ttg ycc-3′

N1-1Rev：5′-ctg gtc cgt act tcc gag cgc acc cac agg aca act c-3′

N1-2For：5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tcc tcy cac ttg gar tgc ag-3′

N1-2Rev：5′-ctg gtc cgt act tcc gag cgc crt tgt att tca ata cag c-3′，

生物素修饰的通用引物为：

Uni-For：5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tc-3′

Uni-Rev：5′-biotin-ctg gtc cgt act tcc gag cg-3′，

特异性检测探针为：

H5-1Probe：5′-NH2-tat gca tac aaa att gtc aag aar gg-3′

H5-2Probe：5′-NH2-ccw gaa tat gca tac aag ata gtt aa-3′

N1-1Probe：5′-NH2-aaa tcc aag ggg gat gtg ttt gtt rt-3′

N1-2Probe：5′-NH2-gtt ggt tga caa ttg gwa ttt cyg g-3′。

2.根据权利要求1所述的检测禽流感病毒H5N1亚型的方法，其特征在于所述的两轮PCR反应，其中：第一轮反应是利用合成的特异性检测引物进行一步法RT-PCR，反应体系为25uL，其中5×buffer 5uL、dNTP 1uL、Enzyme 1uL、每个反应中加入RNA酶抑制剂5U、RNA模板1uL、正向和反向引物，每条引物终浓度为0.6uM，加水补足25uL体系，再使用PTC-200PCR仪，反应条件设定为逆转录50℃ 30min，变性95℃ 15min，94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 30sec，进行35个循环，最后72℃延伸5min；第二轮反应是利用生物素标记的通用引物以第一轮反应产物为模板进行的PCR反应，反应体系为50uL，其中10×buffer 5uL，dNTP1uL，TaqDNA聚合酶1U，Uni-forward 1uL，Uni-reverse 1.5uL，加入前一步RT-PCR反应产物1uL，加水补足50uL体系，再使用PTC-200PCR仪，反应条件设定为变性95℃ 10min，94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec，进行35个循环，最后72℃延伸5min，反应产物置4℃待杂交检测。

3.根据权利要求1所述的检测禽流感病毒H5N1亚型的方法，其特征在于将特异性检测探针偶联到具有荧光编码号的微球上去，制成液相芯片，具体是：取出50uL荧光编码微球，12000rpm离心1min30sec后弃去上清，加入MES(0.1M，pH4.5)8uL，混匀；将所用的探针用MES稀释到20uM，在偶联体系中加入2uL，加入10mg/mL的EDC 1.25uL第一次，混匀后避光保存30min；重复加入EDC一次；再用500uL的浓度为0.02％V/V的Tween20和0.1％W/V的SDS各洗涤一次，然后将微球重新悬浮于pH为8.0的20uLTE溶液中，混匀后使用血细胞计数器计数微球数量；最后，4℃避光保存，

混合四种偶联有特异性检测探针的荧光微球，使用1.5×TMAC稀释到每种微球的数量是150个/uL。

4.根据权利要求1所述的检测禽流感病毒H5N1亚型的方法，其特征在于：该方法用于检测禽流感病毒H5N1亚型。

5.根据权利要求1所述的检测禽流感病毒H5N1亚型的方法，其特征在于：将液相芯片制成试剂盒。