CN104388599B - 流感病毒h5n1亚型和h7n9亚型的液相芯片检测试剂盒 - Google Patents

流感病毒h5n1亚型和h7n9亚型的液相芯片检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及流感病毒H5N1和H7N9亚型的液相芯片检测试剂盒。本发明提供了检测流感病毒表面血凝素抗原H5和H7亚型的引物对和探针，用于检测流感病毒神经氨酸酶抗原N1和N9亚型的引物对和探针，以及包括它们的试剂盒及试剂盒的使用方法。本发明提供的试剂盒具有良好的灵敏度、准确性和特异性，且使用简便快捷，能够在4小时内完成对待测样品的检测。经试验证实，该试剂盒检测阴性样品未见假阳性；对仅含H7N9亚型或H5N1亚型病毒的样品检测呈现100％的检出率；对同时含有H5N1亚型和H7N9亚型病毒的样品进行检测，也能100％的检出其中含有的H7N9和H5N1病毒。且该试剂盒对含有10个拷贝以上的待测样品都能进行有效的检测。

Description

流感病毒H5N1亚型和H7N9亚型的液相芯片检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及流感病毒H5N1亚型和H7N9亚型的液相芯片检测试剂盒。
背景技术
流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其流行特点是传播迅速，波及范围广。迄今为止，流感病毒已引起四次世界流感大流行，给人类社会的经济及健康造成了巨大损失。
流感病毒属于正黏病毒科，其基因组为分节段负链RNA，根据病毒核衣壳蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同可分为甲、乙、丙三种型别，均可感染人。甲、乙型流感病毒是人群中主要的流行病毒，甲型流感病毒根据病毒表面血凝素抗原的不同分为16个HA亚型；根据神经氨酸酶抗原的不同分为9个NA亚型。
所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感，现在已经确认能够感染人的禽流感病毒共有8种，包括H5N1、H5N2、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H10N7、H7N9。其中H5为高致病性。H5N1为卫生部新传染病防治法中规定报告的法定传染病，又称人感染高致病性禽流感。H5N1病毒自1997年首次感染人类后，在全球60多个国家肆虐，死亡率高达60％。2013年2月底H7N9在中国长三角地区首次出现，2014年1月末重新来袭，席卷中国12个省市，整个流行期发现了347人感染，其中128人死亡，死亡率高达35％，而且还有随时发生大规模流行的可能。因此，对流感病毒H7N9亚型做出早期、快速的实验室诊断十分迫切。
流感病毒的实验室诊断方法包括病毒细胞培养、血清学诊断以及抗原检测。病毒通过感染敏感的组织细胞可以被分离鉴定出来，这可以作为流感病毒感染最直接，最可靠的依据。另外，急性期血清较恢复期血清抗体有4倍增加也是流感病毒感染的标准。但是两者耗时较长，一般来说细胞培养需要3d～4d，血清学检查需要半个月。因此，这些方法无法实现流感病毒的快速诊断。抗原的直接检测包括了对病毒结构蛋白以及核酸的检测。病毒结构蛋白的检测基于抗原抗体的反应、偶联酶或者化学生色原或者荧光染料，包括免疫荧光(1mmunofluorescence，IF)、酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbentassays，ELISA)。直接或间接免疫荧光试验的敏感度波动在40％～100％，特异性在86％～99％，但是由于需要荧光显微镜特殊仪器而限制了其在临床上的应用。在对病毒核酸的检测和分型中，出现了很多快速特异的方法。特别是PCR技术的应用，对于流感病毒鉴定和分型发挥着越来越大的作用。这些方法如：逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)、多重逆转录聚合酶链反应(multiplex reversetranscription-PCR,MRT-PCR)、酶免PCR(PCR-enzyme immunoassay，PCR-EIA)、实时PCR(real-time PCR，RT-PCR)等都大大的提高了检测的速度和灵敏度。
然而，尽管越来越多的方法用于检测流感病毒，但尚未有一种方法能够快速、简便、准确的对流感病毒的各亚型进行区分。因此建立一种对流感病毒各种型别进行快速鉴定的方法就十分重要了。
液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array,MASA)作为一种新型低密度基因芯片技术通过悬浮阵列来实现多重检测。分子反应发生在经过颜色编码的微球体表面。针对试验的每一目标检测物都有数千的核酸(互补链)或蛋白(如包被抗体)共价结合在颜色编码的微球体表面。不同的颜色编码代表不同的检测物。在悬液中微球体与病人标本特异性地结合，并加上荧光标记。然后，使用多功能流式点阵仪进行检测，乳胶颗粒首先被微量液体传送系统排成单列通过两束激光，其中红色判定颗粒的颜色从而决定被测物的特异性(定性)；绿色测定微粒上的荧光标记强度从而给被测物定量。最后，系统软件会搜集数据并给出经分析处理后的结果。由于分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，而且可以在一个微量液态反应体系中同时检测多达100个指标，因此具有高通量、灵敏度高、速度快、操作简便的特点。
目前液相芯片技术已经涉及到了生命科学的各个领域的研究中，包括临床诊断、基础研究、新药开发、司法鉴定、食品卫生监督和生物武器防范等。但是液相芯片技术的灵敏度和准确性高度依赖于引物和探针的质量，必须保证引物和探针性质稳定、不产生发卡结构或二聚体、产物长度不应超过500bp，且要保证不发生非特异性结合。尽管这些原则对于一般引物设计而言并不复杂，但是由于流感病毒序列的过于复杂，目前尚无特异性和准确度能够达到临床应用要求的液相芯片技术的引物和探针的报道。因此，设计高特异性、准确度的引物和探针，将液相芯片技术应用于H5N1亚型和H7N9亚型流感病毒的检测具有十分重大的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供流感病毒H5N1亚型和H7N9亚型的液相芯片检测试剂盒，本发明提供的试剂盒操作简单，特异性、准确度皆较高。
本发明提供了一种检测流感病毒H5N1亚型和H7N9亚型的试剂盒，包括：引物对A、引物对B、引物对C和引物对D，以及探针组A、探针组B、探针C和探针D；
引物对A中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
引物对B中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
引物对C中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
引物对D中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
探针组A包括如SEQ ID NO:9～10所示核苷酸序列的2条探针；
探针组B包括如SEQ ID NO:11～12所示核苷酸序列的2条探针。
探针C的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
探针D的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
本发明提供的引物和探针根据H7N9和H5N1病毒设计，病毒序列主要来自NCBI和EBI的核酸数据库，并参考WHO，美国CDC和中国CDC等的相关资料，经实验证实，本发明提供的引物在58℃的退火温度下，经PCR扩增未产生非特异性条带或引物二聚体条带，证明本发明提供的引物对具有良好的特异性。本发明提供的探针在43℃的杂交温度下未产生非特异性杂交，证明本发明提供的探针具有良好的特异性。
在本发明的实施例中，本发明提供的试剂盒还包括：PCR扩增试剂、探针结合试剂或微球杂交试剂。
在一些实施例中，PCR扩增试剂包括：PCR预混液、DNA Ploymerase和ddH2O；探针结合试剂包括：乳胶微球；微球杂交试剂包括：1.5×TMAC杂交缓冲液。
在一些实施例中，本发明提供的试剂盒还包括藻红蛋白。
本发明提供的试剂盒具有良好的灵敏度、准确性和特异性。经试验证实，用本发明提供的试剂盒对不含病毒的阴性样品检测未见假阳性产生；对仅含H7N9亚型或H5N1亚型病毒的样品检测呈现100％的检出率；对同时含有H5N1亚型和H7N9亚型病毒的样品进行检测，检出率也能达到100％。可见，本发明提供的试剂盒对流感病毒H7N9亚型或H5N1亚型的检测具有良好的准确性和特异性，且不受其他亚型流感病毒存在的影响。另外，经试验证实，本发明提供的试剂盒对含有10个拷贝以上的待测样品都能进行有效的检测，说明该试剂盒具有较高的灵敏度。
本发明提供的试剂盒用于流感病毒H5N1亚型和H7N9亚型的液相芯片法检测。具体使用方法包括以下步骤：
步骤1：以待测样品cDNA为模板，以混合引物，经PCR获得扩增产物；
步骤2：将核苷酸序列如SEQ ID NO:9～14所示的6条探针分别与乳胶微球结合，制得包被微球；
步骤3：将扩增产物与包被微球杂交，染色、检测荧光信号；
混合引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4所示的4条引物，或包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5～8所示的4条引物。
在本发明的实施例中，待测样品为病毒培养物、动物组织或鼻咽部分泌物。
在本发明的实施例中，PCR的反应体系为：
其中，引物对A和引物对B的混合引物中，核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4
引物对C和引物对D的混合引物中，核苷酸序列如SEQ ID NO:5～8
所示的混合引物中单一引物的浓度为2μmol/L；PCR反应体系中，核苷酸序列如SEQID NO:1～4或SEQ ID NO:5～8所示的任一引物的浓度为0.2μmol/L。
作为优选，PCR的退火温度58℃。
在本发明实施例中，PCR的反应条件为：
在本发明的实施例中，杂交的体系为：
1.5×TMAC杂交缓冲液 21.9μL；
包被探针的微球 0.1μL；
扩增产物 各3μL。
作为优选，1.5×TMAC杂交缓冲液包括：
在本发明的实施例中，杂交的条件为：
95℃ 5min；
43℃ 60min。
在本发明的实施例中，染色的荧光染料为藻红蛋白(SA-PE)。
作为优选，SA-PE工作液中包括：
SA-PE原液 32μL；
1×TE(pH8.0) 4mL。
作为优选，SA-PE工作液的量为杂交产物体积的3倍。
作为优选，染色的温度为43℃，时间为15min。
在本发明的实施例中，检测荧光信号采用Luminex流式分析仪。
在本发明的实施例中，检测荧光信号的结果分析方法为：
信号值小于150，判定为阴性；
信号值在150～200之间，判定为可疑，继续实验证实；
信号值大于200，判定为阳性。
探针组A中任一条探针的检测结果判定为阳性，则流感病毒表面血凝素抗原H5亚型为阳性；
探针组B中任一条探针的检测结果判定为阳性，则流感病毒神经氨酸酶抗原N1亚型为阳性；
同一待测样品，流感病毒表面血凝素抗原H5亚型和流感病毒神经氨酸酶抗原N1亚型同时被判定为阳性，则含有流感病毒H5N1亚型；
同一待测样品，仅流感病毒表面血凝素抗原H5亚型或仅流感病毒神经氨酸酶抗原N1亚型被判定为阳性，则非含有流感病毒H5N1亚型。
探针C检测结果判定为阳性，则流感病毒表面血凝素抗原H7亚型为阳性；
探针D检测结果判定为阳性，则流感病毒神经氨酸酶抗原N9亚型为阳性；
同一待测样品，流感病毒表面血凝素抗原H7亚型和流感病毒神经氨酸酶抗原N9亚型同时被判定为阳性，则含有流感病毒H7N9亚型；
同一待测样品，仅流感病毒表面血凝素抗原H7亚型或仅流感病毒神经氨酸酶抗原N9亚型被判定为阳性，则非含有流感病毒H7N9亚型。
同一待测样品，若流感病毒表面血凝素抗原H5亚型和流感病毒神经氨酸酶抗原N1亚型同时被判定为阳性，且流感病毒表面血凝素抗原H7亚型和流感病毒神经氨酸酶抗原N9亚型同时被判定为阳性，则含有流感病毒H5N1亚型和H7N9亚型。
本发明提供的试剂盒，使用简便快捷，可在4小时内对待测样品完成检测，检测准确度可达100％，不产生假阳性，特异性良好，可对含有10个拷贝以上的样品进行有效检测，灵敏度高。
本发明提供了一种检测流感病毒H5N1亚型和H7N9亚型的试剂盒，包括：引物对A、引物对B、引物对C和引物对D，以及探针组A、探针组B、探针C和探针D。本发明提供的试剂盒具有良好的灵敏度、准确性和特异性，且使用简便快捷，能够在4小时内完成对待测样品的检测，且能够精确分辨待测样品中是否含有H5N1亚型和/或H7N9亚型流感病毒。经试验证实，用本发明提供的试剂盒对不含病毒的阴性样品检测未见假阳性产生；对仅含H7N9亚型病毒或仅含H5N1亚型病毒的样品检测呈现100％的检出率；对同时含有H5N1亚型和H7N9亚型病毒的样品进行检测，检出率也能达到100％。可见，本发明提供的试剂盒对流感病毒H7N9亚型和H5N1亚型的检测具有良好的准确性和特异性，且不受其他亚型流感病毒存在的影响。另外，经试验证实，本发明提供的试剂盒对含有10个拷贝以上的待测样品都能进行有效的检测，说明该试剂盒具有较高的灵敏度。
附图说明
图1为不同退火温度下本发明提供的引物的扩增效果。
具体实施方式
本发明提供了流感病毒H5N1亚型和H7N9亚型的液相芯片检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明实施例中，引物和探针的合成由英潍捷基(中国)贸易有限公司合成，纯化方式为DHPL。
本发明实施例中采用的其他试材或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：本发明提供引物的退火温度、探针杂交温度、染色温度筛选
一、以流感病毒H5N1亚型或H7N9亚型的cDNA为模板，温度梯度PCR扩增，退火温度设置50℃～66℃，4℃一个梯度。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。从电泳结果看，54℃到58℃都能有效扩增，考虑到不同病毒亚型之间序列相似，避免非特异性扩增，所以选取较高的退火温度。
二、将探针包被在微球上，将退火温度为58℃条件下扩增得到的产物与包被探针的微球进行结合，以40℃、43℃、46℃为杂交温度进行杂交。然后进行染色。结果如表1所示：
表1探针杂交温度、染色温度筛选
从杂交结果看，40℃和43℃杂交结果都不错，但为了防止非特异性杂交。我们会选择高一点的温度，即43℃。从染色情况来看，43℃孵育的结果最佳。
实施例2本发明提供试剂盒的特异性、重复性检测
使用本发明提供的试剂盒，对不同亚型流感病毒样本进行检测，以证明本发明的特异性。并对其中一个H5N1亚型的样品，和一个H7N9亚型的样品重复三次检测，鉴定重复性。
检测方法具体步骤如下：
a、病毒cDNA获得：取病毒样本，按照RNeasy Mini Kit(Qiagen公司，货号74104)说明书提取病毒RNA。按照SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis System(Invitrogen公司，货号18080-051)说明书合成病毒第一链cDNA。
b、以步骤a中获得的cDNA为模板进行PCR，在PCR管中加入20μL下列物质：
引物为如SEQ ID NO:1～4所示的4条引物的混合物，或如SEQ ID NO:5～8所示的4条引物的混合物。
混合引物中单一引物的浓度为2μmol/L，PCR反应液中某单一引物的终浓度是0.2μmol/L。
c、将PCR管放入PCR仪，条件如下：
d、SEQ ID NO:9～14所示核苷酸序列的探针分别结合到给定颜色的微球(微小的乳胶颗粒)上，获得包被微球。
e、微球杂交：
微球杂交体系的组分及组成：
1.5×TMAC 21.9μL；
每种包被探针的微球 各0.1μL；
PCR产物 各3μL。
①先将微球混合液22ul加入杂交板上的well中，然后取每个样本的2组PCR扩增产物各3μl加入同一个well中。
②剪取相应大小的封板纸，将微孔杂交板覆盖封口。请用指压封口数次，确保封严，以防在高温变性和杂交时溶液蒸发。
③将杂交板置于金属恒温浴(可以用PCR仪代替)，把仪器的盖子压紧已封口的杂交板，以防封板膜在加热后张开，导致液体蒸发。
④杂交过程运行如下程序：
95℃ 5分钟 变性
43℃ 60分钟 杂交
⑤小心将封板纸撕下，每孔加入荧光染料藻红蛋白(SA-PE)75μL。加完后将封板纸重新粘好，继续在43℃下孵育15分钟；
整个程序为：
95℃ 5分钟 变性
43℃ 60分钟 杂交
43℃ 15分钟 SA-PE孵育
f、将微孔杂交板快速转移至预热好的Luminex流式分析仪上进行阅读。
g、结果判定：
在本发明的实施例中，检测荧光信号的结果分析方法为：
信号值小于150，判定为阴性；
信号值在150～200之间，判定为可疑，继续实验证实；
信号值大于200，判定为阳性。
探针组A中任一条探针的检测结果判定为阳性，则流感病毒表面血凝素抗原H5亚型为阳性；
探针组B中任一条探针的检测结果判定为阳性，则流感病毒神经氨酸酶抗原N1亚型为阳性；
同一待测样品，流感病毒表面血凝素抗原H5亚型和流感病毒神经氨酸酶抗原N1亚型同时被判定为阳性，则含有流感病毒H5N1亚型；
同一待测样品，仅流感病毒表面血凝素抗原H5亚型或仅流感病毒神经氨酸酶抗原N1亚型被判定为阳性，则非含有流感病毒H5N1亚型。
探针C检测结果判定为阳性，则流感病毒表面血凝素抗原H7亚型为阳性；
探针D检测结果判定为阳性，则流感病毒神经氨酸酶抗原N9亚型为阳性；
同一待测样品，流感病毒表面血凝素抗原H7亚型和流感病毒神经氨酸酶抗原N9亚型同时被判定为阳性，则含有流感病毒H7N9亚型；
同一待测样品，仅流感病毒表面血凝素抗原H7亚型或仅流感病毒神经氨酸酶抗原N9亚型被判定为阳性，则非含有流感病毒H7N9亚型。
同一待测样品，若流感病毒表面血凝素抗原H5亚型和流感病毒神经氨酸酶抗原N1亚型同时被判定为阳性，且流感病毒表面血凝素抗原H7亚型和流感病毒神经氨酸酶抗原N9亚型同时被判定为阳性，则含有流感病毒H5N1亚型和H7N9亚型。
结果如表2所示。
表2本发明提供试剂盒的特异性、重复性检测
结果显示，对H7N9亚型和H5N1亚型的检出率可达100％，对其他亚型的流感病毒则显示阴性。说明本发明提供的试剂盒具有良好的特异性，检测结果不受其他亚型流感病毒的干扰。并且，在对同时含有H5N1和H7N9的样本检测中，本方法表现出高准确性。对其中一个H5N1亚型的样品，和一个H7N9亚型的样品重复三次检测，获得的信号值差异不大，具有良好的重复性。
实施例3本发明提供试剂盒的灵敏性检测
将H5N1亚型病毒液、H7N9亚型病毒液和感染H7N9的雪貂模型的肺组织cDNA分别10倍梯度稀释，获得10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍稀释的样本。然后用real-time PCR方法进行定量。同时使用本发明提供的试剂盒，将梯度稀释的cDNA进行PCR，分子杂交及上机检测，以鉴定本发明提供试剂盒的灵敏性。试剂盒的使用方法同实施例2。结果如表3所示：
表3本发明提供的试剂盒的灵敏性检测
注：括号内为对应的real-time PCR的拷贝数
结果显示，以本发明提供的试剂盒对稀释后的样本进行检测，可以对含有10个拷贝以上的样本进行有效的检测。
实施例4实验样本的检测
利用本发明提供的试剂盒对实验室存留的大量感染雪貂模型的鼻拭子，咽拭子及解剖时各组织的cDNA样品进行检测。试剂盒的使用方法同实施例2。结果如表4所示：
表4利用本发明提供的试剂盒检测实验样本
在检测的85份样品中检到36份样品中含有H7N9亚型流感病毒，一份样本中含有H5N1亚型流感病毒，与预期完全一致，准确率可达100％。其中一份样本中H5亚型的探针之一信号值呈现阳性，但同时N1亚型的探针的信号值则呈阴性，经测序发现该样本中含有H5N2亚型流感病毒。另外，其中两份样本中N1亚型的探针之一信号值呈现阳性，但同时H5亚型的探针的信号值则呈阴性，经测序发现该样本中含有H1N1亚型流感病毒。说明本发明提供的试剂盒具有良好的准确性和特异性，检测结果不受其他亚型流感病毒的干扰。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.检测流感病毒H5N1亚型和H7N9亚型的试剂盒，其特征在于，包括：引物对A、引物对B、引物对C和引物对D，以及探针组A、探针组B、探针C和探针D；
所述引物对A中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述引物对B中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述引物对C中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述引物对D中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
所述探针组A包括如SEQ ID NO:9～10所示核苷酸序列的2条探针；
所述探针组B包括如SEQ ID NO:11～12所示核苷酸序列的2条探针；
所述探针C的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
所述探针D的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括：PCR扩增试剂、探针结合试剂或微球杂交试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括：PCR预混液、DNAPloymerase和ddH2O。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针结合试剂包括：乳胶微球。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述微球杂交试剂包括：1.5×TMAC杂交缓冲液；
所述1.5×TMAC杂交缓冲液包括：
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括藻红蛋白。
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