CN111575406A - 基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法与试剂盒，具体涉及病毒检测领域，包括以下筛查方法：以金磁纳米颗粒为载体，利用固相滚环扩增技术，构建冠状病毒的核酸恒温扩增体系；扩增产物通过与纸质微流体芯片的检测探针特异性捕获，实现胶体金的凝集和特异性显色反应。本发明将恒温扩增的方法代替传统PCR，并结合纸质微流体免疫层析技术，构建2019‑nCov病毒的恒温扩增关键技术及配套试剂盒，系统地将纸质微流体芯片与核酸恒温扩增技术结合，实现靶标的快速可视化定性检测，实现新型冠状病毒的快速、高效，大规模人群筛查，一次性高效鉴别感染源，实现快速确诊感染病例、排除疑似病例，操作简便适用于疫情现场快速检验。
Description
技术领域
本发明实施例涉及病毒检测领域，具体涉及基于核酸恒温扩增的新型冠状 病毒快速筛查方法与试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒2019-nCov(新命名为SARS-CoV-2)，也称严重急性呼吸综 合征(SARS)冠状病毒-2。新型冠状病毒RNA序列约29883个碱基，与SARS 冠状病毒相似度较高，达80％多；与蝙蝠冠状病毒的核酸序列一致性最高，达 95％以上。不同区域和其它冠状病毒的相似性有所不同，有些区域相似度高达 90％以上。通过核酸引物的设计与探针合成特异性检测新型冠状病毒核酸的变 异区域，可以实现2019-nCoV病毒的特异性核酸检测。目前，核酸检测被作 为2019-nCoV感染确定诊断的实验室诊断金标准。国家卫健委发布的“新型冠 状病毒感染的肺炎诊疗方案--试行第五版修正版”中已将病毒基因测序与实时 荧光RT-PCR核酸检测列为实验室确诊方法。因此，及时对疑似患者进行病毒 核酸检测及易感人群的快速筛查，对于实现快速确诊感染病例、排除疑似病例， 促进疫情的防控与临床救治至关重要。
疫情暴发以来，作为核酸检测的成熟技术，实时荧光RT-PCR方法在常规 检验和科研实验中被广泛应用。目前，大多厂家针对2019-nCoV基因组的3 个区域，开放读码框1a/b(ORF1ab)、核壳蛋白N(N)或E结构蛋白(E)，设 计探针进行扩增，一般扩增序列包含两个位点(交叉验证)便于对结果复核。 普通实时定量荧光PCR核酸检测试剂的紧急研发和临床应用在患者临床诊断 和疑似患者排查中发挥了重要作用，但是，受操作繁琐、耗时长、需要集中送 检等限制，还不能满足当前快速增长的大量疑似患者、无症状感染者等排查诊 断的检测需求。
现有的技术从对标本的接收、灭活处理、病毒核酸提取、核酸扩增、数据 处理及报告，一般需要约4个小时或更长时间，如何改进核酸提取和扩增流程， 缩短整个检测时间是迫切需要解决的问题。与此同时，近期在临床救治过程中 发现核酸检测阳性率低、重复检测多次阴性后出现阳性结果、咽拭子标本多次 检测阴性但最后在呼吸道灌洗液标本中检测出阳性结果、CT影像筛查出现新 型冠状病毒肺炎特征但核酸检测阴性等“假阴性”问题。虽然诸多因素诸如样本 类型、样本质量、实验因素、患者感染周期等均可影响结果的判读，但近期我 们通过调研和对市场上不同企业生产的试剂盒的做了系统的性能评价，结果发现：6种2019-nCoV核酸检测试剂对弱阳性样品的检测能力有差异，部分试剂 的准确性、灵敏度及重复性欠佳，亟需进一步优化，提高其性能，以便更好地 适应大规模的筛查需求。
发明内容
为此，本发明实施例提供基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法 与试剂盒，旨在解决现有技术中由于新型冠状病毒不能够快速、高效，大规模 人群筛查导致的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：基于核酸恒温扩增 的新型冠状病毒快速筛查方法与试剂盒，包括以下筛查方法：
S1、首先，以金磁纳米颗粒为载体，利用固相滚环扩增技术，构建类SARS 冠状病毒(包括SARS、2019nCov)的核酸恒温扩增体系；
S2、扩增产物通过与纸质微流体芯片的检测探针特异性捕获，实现胶体金 的凝集和特异性显色反应。
进一步地，步骤S1中，包括：
S1.1、金磁纳米颗粒偶联捕获探针：利用金磁纳米颗粒和巯基(SH)修饰 的捕获探针进行混合偶联；
S1.2、恒温扩增体系的构建与条件优化：设计两端带有与靶RNA互补序 列的PLP锁式探针(padlock probes，PLPs)，特异性识别目标基因的单碱基突变； 在E.coli.DNA连接酶的作用下线性PLP连接成环状，然后加入利用金磁纳米 颗粒偶联的捕获探针，即可在恒温状态下RCA反应体系中进行扩增，扩增产 物是具有与PLP互补的成千上万重复序列的长链；
S1.3、生物素化的检测探针合成及杂交反应：先将检测探针经过生物素化 修饰，使其可以与PLP锁式探针的通用序列扩增片段互补；扩增结束后，将 生物素化的检测探针与金磁微粒介导的RCA扩增产物进行杂交反应。
进一步地，所述金磁纳米颗粒是内核为磁性纳米颗粒且表面包覆材料为纳 米金的磁性纳米复合微粒，所述金磁纳米颗粒经地高辛修饰，粒径为100nm， 其中磁性纳米颗粒内核的粒径为80nm，纳米金包覆厚度为20nm。
进一步地，所述PLP锁式探针上有5个不同区域：识别目的基因的两端 检测臂T1、T2；通用序列S(所有的PLP探针此序列均相同)；HhaI限制性 内切酶酶切位点R；引物结合区G。
进一步地，步骤S1.2中，利用固相RCA构建冠状病毒基因组特异RNA 的恒温扩增反应体系，其中RCA反应体系包括：10 U Phi29聚合酶、200μM dNTPs、1×的Phi29聚合酶缓冲液和去离子水，反应终体积为30μL，反应条 件为40℃，15分钟。
进一步地，步骤S1.3中，生物素化的检测探针(通用序列片段)与金磁 微粒介导的RCA扩增产物进行杂交反应，反应产物通过纸质芯片上的亲和素 和地高辛抗体，将该金纳米颗粒聚集在纸基装置表面某处发生颜色变化，进行 可视化检测。
进一步地，步骤S1.3中，杂交反应的反应体系为：将RCA扩增产物和检 测探针加入50μL杂交液中进行杂交，反应条件为55℃，10分钟，4℃保存； 其中杂交液为10mM Tris、1mMEDTA以及50mM NaCl的混合液。
进一步地，步骤S2中，纸质微流体芯片包括：样品垫、检测线、控制线、 NC膜、吸水垫、底板；检测线T1固定亲和素，所述控制线固定地高辛。
进一步地，步骤S2中，恒温扩增获得的RCA扩增产物-地高辛-生物素- 金磁纳米微粒，通过以构建的通用型纸质微流体芯片，可实现快速颜色反应。
本发明还提供了一种基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法的 试剂盒，包括纸质微流体芯片、锁式探针、利用金磁纳米颗粒偶联的捕获探针、 检测探针、E.coli.DNA连接酶、RCA反应体系和杂交液。
本发明实施例具有如下优点：
1、本发明将恒温扩增的方法代替传统PCR，并结合纸质微流体免疫层析 技术，构建2019-nCov病毒的恒温扩增关键技术及配套试剂盒，系统地将纸质 微流体芯片与核酸恒温扩增技术结合，可实现靶标的快速可视化定性检测(恒 温扩增可在15分钟完成，整个检测流程在1.5小时内)，且恒温37度反应不 依赖于大型精密PCR仪，可以突破现有检测技术对人员/场所的限制，大大缩 短检测用时，提升便捷程度，可实现新型冠状病毒的快速、高效，大规模人群 筛查，一次性高效鉴别感染源，实现快速确诊感染病例、排除疑似病例，且操 作简便适用于疫情现场快速检验；
2、本发明所研发的适用于病原菌核酸检测的现场快速POCT检测产品， 突破现有核酸检测技术对人员/场所的限制，缩短检测用时，提升便捷程度， 实现疑似患者的快速诊断和密切接触人群的现场筛查；该技术可快速拓展为感 染性病原体的快速筛查技术，为我国应对公共突发卫生事件提供有力的技术储 备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对 实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下 面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创 造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内 容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条 件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调 整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明 所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明提供的固相RCA恒温扩增技术结构示意图；
图2为本发明提供的纸质微流体芯片结构示意图；
图3为本发明提供的恒温扩增产物的纸基显色结果图；
图4为本发明提供的2019n-Cov核酸多靶点同时检测的多重检测芯片设计 图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由 本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的 实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。
参照说明书附图1，该实施例的基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛 查方法与试剂盒，包括以下筛查方法：
S1、利用固相RCA构建2019-nCov基因组特异RNA的恒温扩增反应体 系和条件优化
以金磁纳米颗粒为载体(300nm)，利用固相RCA的特异性锁式探针(PLP) 设计和滚环放大作用的技术优势，获得适宜于2019-nCov特异RNA序列检测 的检测体系和条件，以提高检测灵敏度和特异性。具体包括以下步骤：
S1.1、金磁纳米颗粒偶联捕获探针：利用金磁纳米颗粒和巯基(SH)修饰 的捕获探针进行混合偶联；其中金磁纳米颗粒是内核为磁性纳米颗粒且表面包 覆材料为纳米金的磁性纳米复合微粒，所述金磁纳米颗粒经地高辛修饰，粒径 为100nm，其中磁性纳米颗粒内核的粒径为80nm，纳米金包覆厚度为20nm；
S1.2、恒温扩增体系的构建与条件优化：设计两端带有与靶RNA互补序 列的PLP锁式探针(padlockprobes，PLPs)，特异性识别目标基因的单碱基突变； 在E.coli.DNA连接酶的作用下线性PLP连接成环状，然后加入利用金磁纳米 颗粒偶联的捕获探针，即可在恒温状态下RCA反应体系中进行扩增，扩增产 物是具有与PLP互补的成千上万重复序列的长链；
其中PLP锁式探针上有5个不同区域：识别目的基因的两端检测臂T1、 T2；通用序列S(所有的PLP探针此序列均相同)；HhaI限制性内切酶酶切位 点R；引物结合区G；
其中RCA反应体系包括：10 U Phi29聚合酶、200μM dNTPs、1×的Phi29 聚合酶缓冲液和去离子水，反应终体积为30μL，反应条件为40℃，15分钟；
S1.3、生物素化的检测探针合成及杂交反应：先将检测探针经过生物素化 修饰，使其可以与PLP锁式探针的通用序列扩增片段互补；扩增结束后，将 生物素化的检测探针与金磁微粒介导的RCA扩增产物进行杂交反应；生物素 化的检测探针(通用序列片段)与金磁微粒介导的RCA扩增产物进行杂交反 应，反应产物通过纸质芯片上的亲和素和地高辛抗体，将该金纳米颗粒聚集在 纸基装置表面某处发生颜色变化，进行可视化检测；杂交反应的反应体系为： 将RCA扩增产物和检测探针加入50μL杂交液中进行杂交，反应条件为55℃，10分钟，4℃保存；其中杂交液为10mM Tris、1mM EDTA以及50mM NaCl 的混合液；具体见图1。
S2、纸质微流体芯片快速核酸检测平台的构建及应用研究
通过前期已成熟构建的金磁微粒免疫层析检测技术平台，所构建的纸基微 流控分析装置包括：样品垫、检测线、控制线、NC膜、吸水垫、底板；检测 线T1固定亲和素，控制线固定地高辛。恒温扩增获得的RCA扩增产物-地高 辛-生物素-金磁纳米微粒，通过以构建的通用型纸质微流体芯片，可实现快速 颜色反应。生物素化的检测探针(通用序列片段)与金磁微粒介导的RCA扩 增产物进行杂交反应。反应产物通过纸质芯片上的亲和素和地高辛抗体，将该 金纳米颗粒聚集在纸基装置表面某处发生颜色变化，进行可视化检测。具体见 图2。
S3、阴性质控和阳性质控的设计
为了评估此方法的可行性，本发明首先设计了与目标基因ORF1ab和N 基因序列完全一致的DNA序列片段，来评价方法的可行性和特异性。有靶序 列的时候，在检测卡上有很明显的T线产生，而空白对照在T线上则没有可 识别的检测信号。因此，C线和T线同时显色代表阳性反应，即在检测范围内 阳性核酸片段的检出。C线单独显色则为阴性反应，无突变产生。为了进一步 确定连接反应的特异性，使用一段与冠状病毒核酸无同源性的RNA片段(Negative control)作为阴性对照。2019n-Cov的3种靶标的RCA产物均不能 与阴性对照的纳米金探针结合，不能使阴性对照检测卡的T线产生颜色反应。 我们探索了靶标浓度分别为100pg/ul,1ng/ul,10ng/ul,100ng/ul,1ug/ul的金磁微 粒恒温扩增产物的纸基显色结果，如图3所示。图3中，C为空白对照，1-5 的靶标浓度分别为100pg/ul,1ng/ul,10ng/ul,100ng/ul,1ug/ul.CL为质控线，TL 为检测线；
S4、构建2019n-Cov核酸多靶点同时检测的多重检测技术
由于所设计的PLP探针可达到识别单碱基突变的灵敏度，基于此探索单 管反应多重检测集中在一张检测卡上具备可行性。构建3种PLP探针分别特 异性识别开放读码框1a/b(ORF1ab)、核壳蛋白N(N)和E结构蛋白(E)，进 行固相RCA扩增。3种PLP探针的颈环部分均有一段相同的通用序列，所以 其扩增产物也具有一段相同的DNA，根据此段基因序列设计通用detector探 针能够指示在可检测范围内RdRp基因、E基因和N基因序列来检测新冠病毒 是否存在。其中不同类型标记物用于修饰通用探针，可捕获检测范围内所有的 扩增产物。识别RdRp基因的PLP序列的detector probe端修饰生物素，通过 颜色变化指示是否有RdRp基因的检出；可将检测E基因的detector探针5’ 端修饰地高辛，第二条检测线T2上固定抗地高辛抗体即可通过抗原抗体反应 捕获相关扩增产物产生颜色变化，从而指示E基因的定性检出。根据引物上修 饰的物质不同在T线固定不同的捕获物质即可实现多靶标位点的多重检测。 2019n-Cov核酸多靶点多重检测设计如图4所示。
本发明以金磁纳米颗粒为载体，利用固相滚环扩增技术，构建类SARS冠 状病毒(包括SARS、2019nCov)的核酸恒温扩增体系；扩增产物通过与纸质 微流体芯片的检测探针特异性捕获，实现胶体金的凝集和特异性显色反应。所 构建的核酸检测纸芯片，系统地将纸质微流体芯片与恒温扩增技术结合，构建 多靶标并行检测肺炎相关呼吸道病毒的集成式微流控芯片和快速可视化定性 检测，可在1.5小时内一次性检测多种病原体，实现新型冠状病毒的快速、高 效，大规模人群筛查，一次性高效鉴别感染源，实现快速确诊感染病例、排除 疑似病例，且操作简便适用于疫情现场快速检验。
本发明还提供了一种基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法的 试剂盒，包括纸质微流体芯片、锁式探针、利用金磁纳米颗粒偶联的捕获探针、 检测探针、E.coli.DNA连接酶、RCA反应体系和杂交液。
采用该试剂盒即可进行冠状病毒快速筛查。
本发明将恒温扩增的方法代替传统PCR，并结合纸质微流体免疫层析技 术，旨在研发新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸的现场快速检测产品。
基于恒温扩增的核酸快速检测技术是适用于疫情现场快速检验的新型诊 断试剂的重要研究方向。RCA是模仿噬菌体感染细菌后进行自我复制形式的 一种扩增方法，这种复制形式可在恒温下对环状单链DNA进行相对无限扩增。 利用RCA的锁式探针(PLP)设计和滚环放大作用，既保证DNA检测的特异性， 又提高灵敏度，且具有反应时间短、无需特殊仪器、操作简单等优势。纸基质 芯片即纸质检测卡制作简单，来源丰富，成本低廉，较容易进行大量重复实验 研究和条件优化。与普通意义上的微流体芯片相比，成本低、制备简便、无需 复杂外围设备，能够进行真正意义上一次性、价格低廉、便携式的分析，已经 越来越受到关注，被普遍视为未来现场实时诊断发展趋势之一，符合现场快速 检验(Point-of-CareTest，POCT)的要求。
因此，研发简便快速、直接定性检测重症肺炎相关性病毒RNA的高灵敏、 高通量的恒温扩增型微流体芯片和核酸检测试剂盒，可以突破现有检测技术对 人员/场所的限制，大大缩短检测用时，提升便捷程度，可实现新型冠状病毒 的快速、高效，大规模人群筛查，可以为病毒感染性肺炎的早期广泛筛查、疫 情防控提供技术支持。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是 显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均 属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法，其特征在于，包括以下筛查方法：
S1、首先，以金磁纳米颗粒为载体，利用固相滚环扩增技术，构建类SARS冠状病毒的核酸恒温扩增体系；
S2、扩增产物通过与纸质微流体芯片的检测探针特异性捕获，实现胶体金的凝集和特异性显色反应。
2.根据权利要求1所述的基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法，其特征在于：步骤S1中，包括：
S1.1、金磁纳米颗粒偶联捕获探针：利用金磁纳米颗粒和巯基修饰的捕获探针进行混合偶联；
S1.2、恒温扩增体系的构建与条件优化：设计两端带有与靶RNA互补序列的PLP锁式探针，特异性识别目标基因的单碱基突变；在E.coli.DNA连接酶的作用下线性PLP连接成环状，然后加入利用金磁纳米颗粒偶联的捕获探针，即可在恒温状态下RCA反应体系中进行扩增，扩增产物是具有与PLP互补的成千上万重复序列的长链；
S1.3、生物素化的检测探针合成及杂交反应：先将检测探针经过生物素化修饰，使其可以与PLP锁式探针的通用序列扩增片段互补；扩增结束后，将生物素化的检测探针与金磁微粒介导的RCA扩增产物进行杂交反应。
3.根据权利要求2所述的基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法，其特征在于：所述金磁纳米颗粒是内核为磁性纳米颗粒且表面包覆材料为纳米金的磁性纳米复合微粒，所述金磁纳米颗粒经地高辛修饰，粒径为100nm，其中磁性纳米颗粒内核的粒径为80nm，纳米金包覆厚度为20nm。
4.根据权利要求2所述的基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法，其特征在于：所述PLP锁式探针上有5个不同区域：识别目的基因的两端检测臂T1、T2；通用序列S；HhaI限制性内切酶酶切位点R；引物结合区G。
5.根据权利要求2所述的基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法，其特征在于：步骤S1.2中，利用固相RCA构建冠状病毒基因组特异RNA的恒温扩增反应体系，其中RCA反应体系包括：10U Phi29聚合酶、200μM dNTPs、1×的Phi29聚合酶缓冲液和去离子水，反应终体积为30μL，反应条件为40℃，15分钟。
6.根据权利要求5所述的基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法，其特征在于：步骤S1.3中，生物素化的检测探针与金磁微粒介导的RCA扩增产物进行杂交反应，反应产物通过纸质芯片上的亲和素和地高辛抗体，将该金纳米颗粒聚集在纸基装置表面某处发生颜色变化，进行可视化检测。
7.根据权利要求6所述的基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法，其特征在于：步骤S1.3中，杂交反应的反应体系为：将RCA扩增产物和检测探针加入50μL杂交液中进行杂交，反应条件为55℃，10分钟，4℃保存；其中杂交液为10mM Tris、1mM EDTA以及50mMNaCl的混合液。
8.根据权利要求2所述的基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法，其特征在于：步骤S2中，纸质微流体芯片包括：样品垫、检测线、控制线、NC膜、吸水垫、底板；检测线T1固定亲和素，所述控制线固定地高辛。
9.根据权利要求8所述的基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法，其特征在于：步骤S2中，恒温扩增获得的RCA扩增产物-地高辛-生物素-金磁纳米微粒，通过以构建的通用型纸质微流体芯片，可实现快速颜色反应。
10.一种实现权利要求1-9任意一项所述的基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法的试剂盒，其特征在于：包括纸质微流体芯片、锁式探针、利用金磁纳米颗粒偶联的捕获探针、检测探针、E.coli.DNA连接酶、RCA反应体系和杂交液。
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