CN110551623A - 用于核酸检测的纸质微流体芯片、装置、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因检测技术领域，公开了一种用于核酸检测的纸质微流体芯片、装置、试剂盒及其应用，检测所需核酸序列为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：28；基于纸基微流控分析装置包括：样品垫、胶体金结合垫、检测线、控制线、NC膜、吸水垫、底板；底板上自左向右依次设置有样品垫、胶体金结合垫、NC膜、吸水垫，NC膜的表面划有检测线、控制线。本发明通过通用序列探针和单碱基突变探针与固相表面RCA反应产物的大量串联重复序列杂交，构建了一个等温扩增结合纸基显色传感技术的检测平台，建立了一种快速鉴定及检测多重结核杆菌耐药的实验方法，适用于多种抗结核一线药物耐药突变位点的快速可视化检测。

Description

用于核酸检测的纸质微流体芯片、装置、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种用于核酸检测的纸质微流体芯片、装置、试剂盒及其应用。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：世界卫生组织(WHO)发布的《全球结核病报告》表明，结核病是具有空气飞沫传播性质的全球前十死亡原因之一，是具有严重健康危害的慢性传染病，是我国乃至全球重点防控的传染病之一。结核病中，由于人口数量及流动性增加、延误治疗和抗结核药物的不规范使用，以及艾滋病等免疫缺陷病的流行导致结核分支杆菌耐药菌株出现，形成的耐多药结核(MDRTB)和广泛耐药结核(XDRTB)是目前世界防治结核病的难点。如对最有效抗结核药物异烟肼(INH)和利福平(RFP)产生耐药性的结核病。目前普通结核病人治愈率多在85％以上，而耐多药治愈率仅为50％左右。而耐多药结核感染病人中，只有大约7％得以确诊。对结核分枝杆菌及其耐药检测的传统方法，主要依靠痰涂片、培养、药敏、PCR等多项试验综合分析，检测缓慢而繁琐、阳性率低、特异性差；而目前基于耐药基因检测的分子生物学技术，如直接测序法、微阵列基因芯片法等，传统的检测方法通常需要昂贵的大型仪器和诊断试剂，也可能需要结合多种实验方法综合分析才能得出检测结果，并要配备具有相关专业知识的技术人员进行操作，对需要现场诊断无医护人员的紧急状况，或资源匮乏的偏远地区就无法进行精确的诊断。而普通的POCT(现场快速检测)方法，如结核(TB)抗体检测卡，为TB的定性检测卡，适用于全血标本检测。以胶体金标记抗人免疫球蛋白IgG单抗检测结核特异性抗原，普通人也可利用此检测卡进行自我的定期监测。但检测所需的样本需要新鲜的全血，陈旧，凝集或取自其它部位的标本检测效果不明。且特异性差，若全血中抗体浓度过低，则无法得出阴性结果。所以资源环境和检测方法过于复杂等的限制导致该病的确诊率低。而基于等温扩增的核酸检测可由于扩增的优势显著提高检测灵敏度，可准确检测出耐药结核菌，用于早期患者的用药指导，以提高病人的治愈率。因此，建立新型检测结核菌耐药基因型的方法，用于快速检测耐药结核菌，对结核病早期治疗和控制耐药菌的传播具有重要意义。
综上所述，现有技术存在的问题是：
目前基于耐药基因检测的分子生物学技术价格昂贵，操作要求高，传统检测方法耗时长。
解决上述技术问题的难度及意义：
扩增产物与纸基质微流控芯片结合，纸基质芯片即纸质检测卡制作简单，来源丰富，成本低廉，较容易进行大量重复实验研究和条件优化。而在诊断价值没有受到影响的情况下，建立新型的快速诊断方法对于疾病的控制传播和早期治疗有非常重要的意义。拟构建一种简单，灵敏，快速的鉴定结核杆菌耐药的新型POCT纸基微流控芯片，将等温核酸扩增，可视化显色整合到到微流控芯片上。实现待测样本在恒温条件下进行扩增、纸基显色等的检测过程在2-4个小时之内完成，不需要温度循环，且不需要复杂的仪器设备。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于核酸检测的纸质微流体芯片、装置、试剂盒及其应用。
本发明是这样实现的，一种基用于核酸检测的纸质微流体芯片，所述基用于核酸检测的纸质微流体芯片所涉及的序列为：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：28。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述基用于核酸检测的基于纸基微流控分析装置，所述基于纸基微流控分析装置包括：样品垫、胶体金结合垫、检测线(ControlLine，C线)、控制线(Test Line，T线)、NC膜、吸水垫、底板；
胶体金结合垫上点膜可结合扩增产物的纳米金探针，C线上固定亲和素，T线固定合捕获探针。
进一步，所述样品垫(15mm)、胶体金结合垫(6mm)、NC膜(20mm)，吸水垫(13mm)。所述样品垫、胶体金结合垫、NC膜，吸水垫相互之间重叠2mm，整个宽4mm。
进一步，所述样品垫、胶体金结合垫、NC膜，吸水垫分别是聚酯纤维素膜或玻璃纤维素膜、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水纸和具有粘性的PVC的底板。
本发明的另一目的在于提供一种所述基用于核酸检测的纸质微流体芯片在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述基于RCA扩增反应的结核分枝杆菌耐药基因多重检测方法的试剂盒，所述试剂盒包括：5种纸基微流控分析装置即纸质核酸检测卡、SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：28、E.coli DNA ligase、10×E.coli DNA Ligase Buffer、BSA、exonuclease I、exonuclease III、exonuclease I 10×reaction buffer、dNTPs、5％DMSO、Phi29DNA polymerase、Phi29 DNA polymerase 10X Reaction Buffer、HhaI限制性内切酶、10X BufferTango；
所述纸质核酸检测卡包括4种单碱基突变检测卡和一个阴性对照。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：微流体芯片是指在一块以平方厘米为单位的小芯片上进行样品制备、生化反应、结果检测和分析的装置。重点在于提高检测效率，降低损耗，装置小型化并能进行高通量分析。由于纸质材料来源丰富、价格低廉、可循环、易处理、易化学修饰，将其作为基底替代硅、玻璃、高聚物等材料，再结合纳米金免疫层析技术可制备出具备快速诊断能力的纸基微流控分析装置(Paper-based microfluidicanalytical devices，μPADs)。与普通意义上的微流体芯片相比，成本低、制备简便、无需复杂外围设备，能够进行真正意义上一次性、价格低廉、便携式的分析，已经越来越受到关注，被普遍视为未来现场实时诊断发展趋势之一，符合现场快速检验(Point-of-Care Test，POCT)的要求。
滚环扩增技术(RCA)是一种简单、高效的恒温扩增技术，通过设计一个两端带有与靶DNA互补序列的锁式探针(padlock probes，PLPs)，特异性识别目标基因的单碱基突变，然后在E.coli.DNA连接酶的作用下线性PLP连接成环状，加入预先设计好的引物，即可在恒温状态下进行扩增，扩增产物是具有与PLP互补的成千上万重复序列的长链。所以该扩增方法不需要温度循环且扩增效率很高，并具有很好的特异性，若靶DNA序列与PLP不能完全互补则不能进行RCA反应。其中，所设计的PLP上有5个不同区域：识别目的基因的两端检测臂T1，T2；通用序列S(所有的PLP探针此序列均相同)；HhaI限制性内切酶酶切位点R；引物结合区G。扩增结束后，设计两种纳米金探针，一种与通用序列扩增片段互补，一种与连接后的检测臂扩增区域互补。胶体金(或纳米金溶液，AuNPs)对生物分子(核酸，蛋白等)具有很强的吸附作用，且在不同的状态，溶液会发生肉眼可见的颜色变化。将DNA探针巯基化修饰后，探针能够和纳米金颗粒共价结合从而固定在AuNPs表面。用此纳米金标记的探针与RCA产物(通用序列扩增片段，连接后的检测臂扩增片段)杂交，再通过能捕获扩增产物的物质将该探针聚集在纸基装置表面某处发生颜色变化即可进行可视化检测。
本发明通过纳米金颗粒修饰的通用序列探针和单碱基突变探针与固相表面RCA反应产物的大量串联重复序列杂交，产生颜色反应指示检测结果。构建了一个等温扩增结合纸基显色传感技术的检测平台，建立了一种快速鉴定及检测多重结核杆菌耐药的实验方法。RCA连接过程的高选择性使得该方法具有很高的特异性并能够实现对靶基因单碱基突变的识别。整个过程包括连接、扩增、纸基检测步骤能够在几个小时之内完成。所有检测步骤均在恒温下进行且不需要复杂的仪器设备，解决了PCR反应需要反复升温降温的问题。
本实验采用了等温扩增的方法代替传统PCR，并结合了胶体金层析技术用于检测单碱基突变的耐药结核杆菌。
为了评估此方法的可行性，本发明首先设计了与目标基因TB突变基因序列完全一致的DNA序列片段，来评价方法的可行性和特异性。有靶序列的时候，在检测卡上有很明显的T线产生，而空白对照在T线上则没有可识别的检测信号。此方法能很明显的将突变基因区分开来。为了进一步确定连接反应的特异性，使用一段与结核杆菌无同源性的李斯特菌hlyA DNA片段(Negative control)作为阴性对照。结核杆菌的4种RCA产物均不能与对照菌的捕获探针结合，使阴性对照检测卡的T线产生颜色反应。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于纸基微流控分析装置的结构示意图；
图中：1、样品垫；2、胶体金结合垫；3、检测线；4、控制线；5、NC膜；6、吸水垫；7、底板。
图2是本发明实施例提供的等温扩增的核酸快速检测方法流程图。
图3是本发明实施例提供的RCA扩增示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明构建了一种简单，灵敏，快速的鉴定结核杆菌耐药的新型POCT纸基微流控分析装置，将等温核酸扩增，可视化显色整合到纸基微流控分析装置上。实现待测样本在恒温条件下进行扩增、纸基显色等的检测过程在2-4个小时之内完成，且不需要复杂的仪器设备。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的基于纸基微流控分析装置包括：样品垫1、胶体金结合垫2、检测线(Control Line，C线)3、控制线(Test Line，T线)4、NC膜5、吸水垫6、底板7。
底板7上自左向右依次设置有样品垫1、胶体金结合垫2、NC膜5、吸水垫6，NC膜5的表面划有检测线3、控制线4。
胶体金结合垫2上点膜可结合扩增产物的纳米金探针，C线上固定亲和素，T线固定合捕获探针。
样品垫1(15mm)、胶体金结合垫2(6mm)、NC膜5(20mm)，吸水垫6(13mm)。所述样品垫1、胶体金结合垫2、NC膜5，吸水垫6相互之间重叠2mm，整个宽4mm。
样品垫1、胶体金结合垫2、NC膜5，吸水垫6分别是聚酯纤维素膜(或玻璃纤维素膜)、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水纸和具有粘性的PVC的底板7。
如图2所示，本发明实施例提供的等温扩增的核酸快速检测方法包括以下步骤：
S101：将100nM 5’端磷酸化的线性PLP(Muts)(SEQ ID NO：1～4)与2μL检测靶标混合于20μL 10×E.coli DNA Ligase Buffer(30mM Tris-HCl pH8.0，4mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，1.2mM EDTA，0.1mM NAD，0.005％BSA)连接体系中，95℃变性5min后冷却至4℃，然后在37℃孵育30min。在体系中加入5U E.coli DNAligase和0.05％BSA后，于37℃反应1h至环状模板连接形成；
S102：将上步反应的连接产物加于40μL外切反应体系exonuclease I 10×reaction buffer(67mM glycine-KOH pH 9.5，6.7mM MgCl2，1mM DTT)中，加入10U的exonuclease I和exonuclease III以去除未环化的线性PLP和多余的靶标DNA，37℃反应30min，后90℃反应5mim使酶失活；
S103：将1μL环化的PLPs和2μL扩增引物(SEQ ID NO：5～8)放入RCA反应体系中37℃温育30min，包含10X Reaction Buffer(330mM Tris-acetate pH 7.9，100mM Mg-acetate，660mM K-acetate，10mM DTT，1％(v/v)Tween 20)，1mM dNTPs，0.2μg/μL BSA，5％DMSO。然后加入0.5U/μL的Phi29DNA聚合酶，混合物在37℃扩增1h，然后置于90℃10min使酶灭活。多重检测时按比例加入4种反应体系；
S104：将扩增后的待测产物20μL和20μLPBS缓冲液滴加在检测装置样品垫上或将该检测条(卡)即纸基微流控分析装置浸入样品液中(不触碰胶体金结合垫)30s，平放检测卡。可以每隔3分钟滴加20μL PBS缓冲液，5-10min钟后该检测卡上出现颜色变化，C线和T线若同时出现红色条带则证明该靶标发生了突变，若只在T线上出现红色条带则未发生突变，若两条带均没有产生颜色变化，则该检测卡无效。
17世纪英国化学家罗伯特·波义耳发明的pH试纸是最早的关于μPADs的应用，利用石蕊遇酸变红色，遇碱变蓝色的特性制成。此后，利用免疫层析技术的验孕试纸开始出现，将μPADs的应用与发展推向了高峰。现代诊断医疗已大规模使用此类便携式检测方法，因此本实验采用了等温扩增的方法代替传统PCR，并结合了胶体金层析技术用于检测单碱基突变的耐药结核杆菌。
为了评估此方法的可行性，首先设计了与目标基因TB突变基因序列完全一致的DNA序列片段，来评价方法的可行性和特异性。有靶序列的时候，在检测卡上有很明显的T线产生，而空白对照在T线上则没有可识别的检测信号。此方法能很明显的将突变基因区分开来。为了进一步确定连接反应的特异性，使用一段与结核杆菌无同源性的李斯特菌hlyADNA片段(Negative control)作为阴性对照。结核杆菌的4种RCA产物均不能与对照菌的纳米金探针结合，不能使阴性对照检测卡的T线产生颜色反应。
下面结合附图对本发明的应用原理作进一步的描述。
1、筛选了四种临床常见抗结核一线药物耐药突变位点：
异烟肼(INH)耐药KatG315(AGC→ACC)，inhA-15(ACG→ATG)；
利福平(RFP)耐药rpo531(TCG→TTG)；
链霉素(SM)耐药rpsL43(AAG→AGG)。
2、根据各突变类型设计所需的锁式探针(PLP)、捕获探针(capture probe)等
SEQ ID NO：1
TGGTGATCGCGTCCTGTATACGCTTCTTCGGTGCCCATGCGCTGCGACCTCAGCATCGACCTGTCTAGACCTCGATGCCGG
SEQ ID NO：2
TCTCGCCGCGGCCGGGTATACGCTTCTTCGGTGCCCATGCGCGACCACCTTGCGATCGGGTAGTCTACCGACAACCTATCA
SEQ ID NO：3
ACAGTCGGCGCTTGGTATACGCTTCTTCGGTGCCCATGCGCCAGCGGTAGACCACCTATCGGTCTACCCAGCGCCA
SEQ ID NO：4
TCGGAGTGGTGGTGTACGTATACGCTTCTTCGGTGCCCATGCGCGACCGGTATGCGACCTGGTAGTCTAGAGTTCGGCTTCC
SEQ ID NO：5
AGGTCGATGCTGAGGTCGCA
SEQ ID NO：6
TACCCGATCGCAAGGTGGTC
SEQ ID NO：7
CGATAGGTGGTCTACCGCTG
SEQ ID NO：8
TACCAGGTCGCATACCGGTC
SEQ ID NO：9
GGATAGGACATAATAAGCGA
SEQ ID NO：10
CGCTTCTTCGGTGCCCAT
SEQ ID NO：11
CGCTTCTTCGGTGCCCAT
SEQ ID NO：12
TCCTGCGCTAGTGGTGGACGTAGCTCCAG
SEQ ID NO：13
GGCCGGCGCCGCTCTACTATCCAACAGCC
SEQ ID NO：14
GTTCGCGGCTGACAACCGCGACCC
SEQ ID NO：15
CATGTGGTGGTGAGGCTCCTTCGGCTTGAG
SEQ ID NO：16
CGTAAGTCTCCGAGGTTGCCATCGATGATTTGAACTTCATC
SEQ ID NO：17
TGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCAGCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAA
SEQ ID NO：18
TGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCACCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAA
SEQ ID NO：19
TACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGATGATAGGTTGTCGGGGTGACTG
SEQ ID NO：20
TCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTTGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCT
SEQ ID NO：21
GCACCCGCGTGTACACCACCACTCCGAGGAAGCCGAACTCGGCGCTTCGG
SEQ ID NO：22
TGTGTAACAACATGAAGATTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAACTGTGAAGATCGCTTATTATGTCCTATCCTCAGC
SEQ ID NO：23
GCGAAGAAGCCACGGGTA
SEQ ID NO：24
AGGACGCGATCACCACCGGCATCGAGGTC
SEQ ID NO：25
CCGGCCGCGGCGAGATGATAGGTTGTCGG
SEQ ID NO：26
CAAGCGCCGACTGTTGGCGCTGGG
SEQ ID NO：27
GTACACCACCACTCCGAGGAAGCCGAACTC
SEQ ID NO：28
GCATTCAGAGGCTCCAACGGTAGCTACTAAACTTGAAGTAC
Padlock probes(PLP):带有检测臂的线性单链DNA探针。从上至下分别为识别异烟肼(INH)耐药KatG 315、inhA-15，利福平(RFP)耐药rpo531，链霉素(SM)rpsL43突变的寡核苷酸序列。斜体区：两端检测臂×2，加框碱基为突变位点。连字符粗体区：引物结合区。划线区域：通用序列，与胶体金结合垫上探针结合。GCGC：酶切位点。
“p”：5‘端的磷酸盐，与连接酶作用。
Primer：启动RCA反应的引物，5‘端修饰有生物素，可与带有亲和素的引物连接。
AuNPs probes：5‘端修饰有巯基，可结合纳米金的寡核苷酸探针，负责与RCA扩增产物结合，位于胶体金结合垫上。katG315，inhA-15，rpoB531，rpsL43负责识别相应的单碱基突变。Universal primer与四种突变产物均能结合，可同时识别4种单碱基突变。Mismatchprobe作为阴性对照，不能上述四种突变位点互补结合。
Target sequences：目标靶序列。该序列从结核杆菌相关耐药基因序列中截取，划线区域为PLP检测臂互补结合区，中间为突变位点。katG315(W)代表正常、未突变的异烟肼药物作用序列部分基因片段。Negative control为阴性对照，不可被PLP探针识别。
Capture probes：位于控制线上的捕获探针，可与纳米金探针互补结合，捕获多余的AuNPs probes。
3.序列特异性验证
3.1为保证反应的特异性，将PLP中段的引物序列与待测靶序列全基因组(结核分枝杆菌H37RV)进行同源性比较和特异性分析。
3.2为保证杂交效率，应尽量使特异性杂交区域位于探针环状部位，避免可能产生内部二级结构的序列，根据在线分析软件http://sfold.wadsworth.org/和http://mfold.rna.albany.edu/获得环状模板(circular Padlock probes)的单链二级结构结果及杂交热动力学参数(Ironic conditions:[Na+]＝0.1M，[Mg2+]＝0.01M)。
(1)探针两端检测臂的适宜长度为14-25bp；
(2)排除两端检测臂的发夹结构和GC含量<60％；
(3)两端检测臂Tm值分别为：T1(49℃)，T2(37.3℃)。捕获探针Tm值为49.4℃。
(4)PLP的连接温度应介于两端Tm值之间；
(5)PLP中段的链接序列应与待测靶序列无关，且包含通用引物序列和HhaI酶切位点(GCG^C)；
(6)成环后的PLP二级结构与引物杂交序列位于环状部位。
4、RCA扩增，以katG315扩增体系为例(如图3)
4.1线性PLP的环化连接反应：
将100nM 5’端磷酸化的线性PLP(Muts)(SEQ ID NO：1)分别与100nM的两种靶序列(突变型和野生型)(SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：18)混合于20μL10×E.coli DNALigaseBuffer中，包括(30mM Tris-HCl pH8.0，4mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，1.2mM EDTA，0.1mMNAD，0.005％BSA)，95℃变性5min后冷却至4℃，然后在37℃孵育30min。在体系中加入5UE.coli DNA ligase和0.05％BSA后，于37℃反应1h至环状模板连接形成。
4.2消化反应：
将上步反应的连接产物加于40μL外切反应体系10X Reaction Buffer(67mMglycine-KOH pH 9.5，6.7mM MgCl2，1mM DTT)中，加入10U的exonuclease I和exonucleaseIII以去除未环化的线性PLP和多余的靶标DNA，37℃反应30min，后90℃反应5mim使酶失活。
4.3RCA扩增反应：
将1μL环化的PLPs和2μL扩增引物SEQ ID NO：5放入RCA反应体系中37℃温育30min，包含10X Reaction Buffer(330mM Tris-acetate pH 7.9，100mM Mg-acetate，660mM K-acetate，10mM DTT，1％(v/v)Tween 20)，1mM dNTPs，0.2μg/μLBSA，5％DMSO。然后加入0.5U/μL的Phi29DNA聚合酶，混合物在37℃扩增1h，然后置于90℃10min使酶灭活。多重检测时按比例加入4种反应体系。
4.4酶切反应：
取RCA产物5μL，混合于5μL酶切反应体系10X Buffer Tango(33mM Tris-acetate(pH 7.9)，10mM magnesium acetate，66mM potassium acetate，0.1mg/mL BSA)中，加入5UHhaI限制性内切酶于37℃下酶切24h，然后80℃处理20min使酶失活。
4.5酶切产物电泳：
配制3％的琼脂糖凝胶电泳，加入10μL SYBR Green II染色的RCA产物(酶切产物)，1×loading buffer，进行电泳，电压120V，30min，凝胶成像观察并记录。
5、纳米金探针的标记及纸基微流控分析装置的组装(组装后为可直接使用的成品检测卡)：
5.1纳米金探针的标记：
①离心管中先加入10μL 100μmol/L巯基标记的DNA(1μmol/L)SEQ ID NO：12，再向其中加入0.33μL 500μmol/L醋酸缓冲液(pH5.2)和0.5μL 10mmol/LTCEP以活化巯基，室温，避光孵育1小时。②另取一离心管加入1mL 10nmol/L的纳米金(20nm-40nm)，低速震荡。加入活化后的DNA，室温避光放置16h以上。低速震荡状态下分3次逐渐加入各10μL的500mmol/L的Tris醋酸缓冲液(pH8.2)和1mol/L的NaCl至终浓度分别为5mmol/L，0.1mol/L。混匀后避光室温孵育48h。③4℃，12000r/min离心30min后，用500μL 10mmol/LPBS缓冲液(pH 7.0)清洗，14000r/min三次。去上清，胶体金重悬液(20mmol/L的Na3PO4、10％PEG、5％BSA、0.25％Tween、10％蔗糖)500μL重悬，4℃贮存。
5.2单条纸基微流控分析装置的组装及样品检测：
①如图1所示，将处理后的样品垫(15mm)、纳米金结合区(6mm)、NC膜(20mm)，吸水垫(13mm)和底板依次组装，相互之间重叠约2mm，整个宽4mm。各部位材料分别是聚酯纤维素膜(或玻璃纤维素膜)、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水纸和具有粘性的PVC底板。②使用XYZ三维划膜喷金仪分别将控制线、检测线(距离2mm)划至NC膜上，并将上步标记好的纳米金探针溶液点膜至纳米金结合区，亲和素点膜至C线(Control Line)即控制线，合成的捕获探针SEQ ID NO：24溶液点膜至T线(Test Line)检测线。点膜完成后37℃干燥1h后置于室温干燥环境下备用。③将扩增后的待测产物20μL和20μL杂交buffer滴加在检测装置样品垫上或将该检测条(卡)即纸基微流控分析装置浸入样品液中(不触碰胶体金结合垫)30s，平放检测卡。可以每隔3分钟滴加20μL杂交buffer，5-10min钟后该检测卡上出现颜色变化，C线和T线若同时出现红色条带则证明该靶标发生了突变，若只在T线上出现红色条带则未发生突变，若两条带均没有产生颜色变化，则该检测卡无效。
检测原理为：PLP可特异性识别发生了单碱基突变的目标靶序列，只有与靶标完全互补，线性PLP才能在连接酶的作用下成环进而在聚合酶的作用下发生RCA反应，其产物具有与PLP互补的大量重复序列：与通用探针互补结合的序列、修饰有生物素的引物序列、与带有突变位点的完整检测臂互补的序列。检测卡的胶体金结合垫上具有纳米金探针，可与扩增产物互补结合。C线固定有亲和素，当靶基因发生相关突变产生RCA反应后，结合了纳米金探针的产物由于具有生物素(修饰在引物5’端)而被捕获在该线上，因为一个亲和素可结合四个生物素，二者的复合物具有极高的亲和力和稳定性，所以结合了产物的纳米金探针在此处聚集显色。多余的纳米金探针由T线上固定的互补探针捕获。因此，C线和T线同时显色代表阳性反应，即在检测范围内发生了耐药突变。C线单独显色则为阴性反应，无突变产生。
5.3试剂盒中所述5种成品检测卡，结构如图1所示：
检测卡①：KatG 315突变位点检测卡。相关DNA序列：SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：18即人工合成检测靶标识别连接成环，SEQ ID NO：5为该扩增体系的引物，SEQ ID NO：12位于胶体金结合垫，SEQ ID NO：24固定在检测线上。
检测卡②：inhA-15突变位点检测卡。相关DNA序列：SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：19连接成环，SEQ ID NO：6为该扩增体系的引物，SEQ ID NO：13位于胶体金结合垫，SEQ IDNO：25固定在检测线上。
检测卡③：rpoB531突变位点检测卡。相关DNA序列：SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：20连接成环，SEQ ID NO：7为该扩增体系的引物，SEQ ID NO：14位于胶体金结合垫，SEQ IDNO：26固定在检测线上。
检测卡④：rpsL43突变位点检测卡。相关DNA序列：SEQ ID NO：4与SEQ ID NO：21连接成环，SEQ ID NO：8为该扩增体系的引物，SEQ ID NO：15位于胶体金结合垫，SEQ ID NO：27固定在检测线上。
检测卡⑤：阴性对照检测卡。相关DNA序列：SEQ ID NO：22是与结核杆菌完全无关序列，无法形成环状PLP。在RCA扩增体系中，可加入任意PLP与其反应。SEQ ID NO：10为扩增引物，SEQ ID NO：16位于胶体金结合垫，SEQ ID NO：28固定在检测线上。SEQ ID NO：16与SEQ ID NO：28可互补结合，所以只在检测卡的控制线有颜色聚集，检测线没有颜色反应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 张阳
<120> 用于核酸检测的纸质微流体芯片、装置、试剂盒及其应用
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggtgatcgc gtcctgtata cgcttcttcg gtgcccatgc gctgcgacct cagcatcgac 60
ctgtctagac ctcgatgccg g 81
<210> 2
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctcgccgcg gccgggtata cgcttcttcg gtgcccatgc gcgaccacct tgcgatcggg 60
tagtctaccg acaacctatc a 81
<210> 3
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acagtcggcg cttggtatac gcttcttcgg tgcccatgcg ccagcggtag accacctatc 60
ggtctaccca gcgcca 76
<210> 4
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcggagtggt ggtgtacgta tacgcttctt cggtgcccat gcgcgaccgg tatgcgacct 60
ggtagtctag agttcggctt cc 82
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggtcgatgc tgaggtcgca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tacccgatcg caaggtggtc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgataggtgg tctaccgctg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taccaggtcg cataccggtc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggataggaca taataagcga 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgcttcttcg gtgcccat 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgcttcttcg gtgcccat 18
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcctgcgcta gtggtggacg tagctccag 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggccggcgcc gctctactat ccaacagcc 29
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gttcgcggct gacaaccgcg accc 24
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
catgtggtgg tgaggctcct tcggcttgag 30
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgtaagtctc cgaggttgcc atcgatgatt tgaacttcat c 41
<210> 17
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tggcaccgga accggtaagg acgcgatcac cagcggcatc gaggtcgtat ggacgaa 57
<210> 18
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tggcaccgga accggtaagg acgcgatcac caccggcatc gaggtcgtat ggacgaa 57
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
taccgatttc ggcccggccg cggcgagatg ataggttgtc ggggtgactg 50
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcggggttga cccacaagcg ccgactgttg gcgctggggc ccggcggtct 50
<210> 21
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcacccgcgt gtacaccacc actccgagga agccgaactc ggcgcttcgg 50
<210> 22
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgtgtaacaa catgaagatt gtaggtcaga actcacctgt tagaaactgt gaagatcgct 60
tattatgtcc tatcctcagc 80
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcgaagaagc cacgggta 18
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aggacgcgat caccaccggc atcgaggtc 29
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccggccgcgg cgagatgata ggttgtcgg 29
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caagcgccga ctgttggcgc tggg 24
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtacaccacc actccgagga agccgaactc 30
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gcattcagag gctccaacgg tagctactaa acttgaagta c 41

Claims (6)

1.一种基用于核酸检测的纸质微流体芯片，其特征在于，所述用于核酸检测的纸质微流体芯片所涉及的核酸序列为：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：28。
2.一种包含权利要求1所述用于核酸检测的基于纸基微流控分析装置，其特征在于，所述基于纸基微流控分析装置包括：样品垫、胶体金结合垫、检测线、控制线、NC膜、吸水垫、底板；
胶体金结合垫上点膜可结合扩增产物的纳米金探针，C线上固定亲和素，T线固定合捕获探针。
3.如权利要求2所述的基于纸基微流控分析装置，其特征在于，样品垫、胶体金结合垫、NC膜，吸水垫；所述样品垫、胶体金结合垫、NC膜，吸水垫相互之间重叠2mm，整个宽4mm。
4.如权利要求2所述的基于纸基微流控分析装置，其特征在于，所述样品垫、胶体金结合垫、NC膜，吸水垫分别是聚酯纤维素膜或玻璃纤维素膜、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水纸和具有粘性的PVC的底板。
5.一种如权利要求1所述基用于核酸检测的纸质微流体芯片在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用。
6.一种利用权利要求2所述基于RCA扩增反应的结核分枝杆菌耐药基因多重检测方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：5种纸基微流控分析装置即纸质核酸检测卡、SEQID NO：1～SEQ ID NO：28溶液、E.coli DNAligase、10×E.coli DNALigase Buffer、BSA、exonuclease I、exonuclease III、exonuclease I 10×reactionbuffer、dNTPs、5％DMSO、Phi29 DNApolymerase、Phi29 DNA polymerase 10X Reaction Buffer、HhaI限制性内切酶、10X BufferTango；
所述纸质核酸检测卡包括4种单碱基突变检测卡和一个阴性对照。
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