CN102373273B

CN102373273B - 一种结核分枝杆菌核酸的检测试剂盒

Info

Publication number: CN102373273B
Application number: CN 201010263981
Authority: CN
Inventors: 胡林; 尤其敏; 徐高连; 王宏莹; 钟华燕
Original assignee: YOUSIDA BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd HANGZHOU
Current assignee: Hangzhou Yousida Biotechnology Co ltd
Priority date: 2010-08-26
Filing date: 2010-08-26
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2030-08-26
Also published as: CN102373273A

Abstract

本发明涉及一种利用核酸恒温扩增检测结核分枝杆菌的快速检测技术，以及定性检测的试剂盒。该试剂盒包含无仪器DNA提取试剂盒、结核分枝杆菌核酸恒温扩增反应液、防污染核酸扩增物检测装置、结核分枝杆菌阳性对照、结核分枝杆菌阴性对照。本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需1～1.5小时；可同时满足中通量和低通量的样品检测，特别适合现场检测以及基层医院使用，且整个反应过程只需一个恒温仪器。

Description

一种结核分枝杆菌核酸的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种结核分枝杆菌核酸的检测技术，具体将，涉及一种结核分枝杆菌核酸的快速检测试剂盒及其方法，适合对结核分枝杆菌的定性检测。

背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)是严重危害人类健康的传染病，是阻碍国家经济和社会发展的重大问题，是我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题。近年来，全球结核病疫情的回升，引起了国际社会的高度重视，世界卫生组织已将结核病作为重点控制的传染病之一，并宣布全球结核病处于紧急状态。世卫组织在结核防治报告中指出，改进检测工作，可以促进国际结核病控制努力，并应对巨大的市场需求，同时呼吁对以低收入和中等收入国家为目标的新的诊断工具进行工业投资。

目前应用于结核菌诊断的技术有很多种，这些常规检查方法在技术上虽然比较成熟，但目前尚存在一些问题：国际推荐的涂片和培养方法还分别存在特异性差、敏感性低和结果报出时间太长的不足，国际认可的结核菌快速培养系统虽大大提高了培养结果的报出时间，但由于仪器设备昂贵，检测成本太高而较难推广普及。PCR技术虽然具备快速、灵敏、特异等特点，但由于实验室扩增物污染极易造成假阳性结果而限制了其在临床上的广泛应用。进口诊断试剂则由于采购供货周期长，价格昂贵，基层单位难于常规应用。而结核病高发区主要集中于农村、边远地区及贫穷落后国家，世卫组织调查认为在全世界结核病患者或生活在结核病高危地区的人当中，大多数人都很难获得迅速而准确的检测。世卫组织控制结核司司长Mario Raviglione博士说“世界迫切需要新的、安全的和可负担得起的诊断方法，以简化病例发现过程”。因此，开发简便、快速、准确、经济，尤其适宜于基层单位推广使用的结核分枝杆菌快速诊断试剂成了各国企业研究的重点。

近年来的发展起来针对结核分枝杆菌的荧光定量PCR(Fluorescence QuantitativePCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高，速度快，特异性强等优点在结核分枝杆菌的基因检测水平上有着广泛的应用，是目前结核分枝杆菌检测的主要方法，目前国内市场上尚未有关于结核分枝杆菌定量检测试剂盒。

FQ-PCR虽然有着简便，快速，灵敏的优势，但是其检测需要昂贵的仪器，且容易造成假阳性等问题。

200810161998.8公开了一种结核分枝杆菌快速检测系统及其方法，包括结核菌液体培养基和结核分枝杆菌检测试剂条，结核分枝杆菌检测试剂条利用胶体金免疫层析技术对结核分枝杆菌特异性抗原MPB64进行特异性检测。但是该技术的缺陷为培养过程过长，需要培养7-14天，不适应临床使用的需要。

专利申请200810134583.1公开了一种交叉引物扩增靶核酸序列的方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计6种(3对：分别为1对交叉扩整引物、1对剥离引物、1对检测引物)特异引物，引物尾端交叉互换序列，利用链置换DNA聚合酶(如，但不限于，Bst DNA聚合酶)在恒温条件即可完成核酸扩增反应。不需要模板的变性、多次温度循环等过程。

专利申请2006100034291公开了一种核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条及其用途。该专利申请公开了一种特异性核酸序列的检测方法，该方法将一种特异性抗体A吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被；将另一种特异性抗体-无色抗B抗体固定于膜上形成检测线；待测核酸进行扩增时，将所使用的探针或是引物用A抗原或B抗原标记，形成扩增物、探针、引物、抗原A、抗原B的复合物，将该复合物与吸附有色颗粒的抗体A结合，得到的该有色颗粒复合物在溶液中通过毛细血管现象眼纤维膜向上流动只抗体B检测条时，与线条上的抗体B结合，从而滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条。

专利申请2006101096204公开了一种全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置及方法，该专利申请使用了专利申请200610003429.1的试纸条，达到了全封闭检测的效果。

本发明利用专利申请200610003429.1和专利申请200610109620.4所公开的核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条、全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置及方法，提出了一种针对结核分枝杆菌核酸的快速检测方法，以及针对结核分枝杆菌的定性检测的试剂盒。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提出一种利用无仪器核酸提取方法、交叉引物核酸恒温扩增以及封闭式核酸扩增物快速检测结核分枝杆菌的试剂盒。

本发明的另一发明目的在于提出利用这种试剂盒检测结核分支杆菌的方法。

为了实现本发明之目的，采用如下技术方案。

本发明提出一种利用核酸恒温扩增检测结核分枝杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)DNA提取液和装置；

(2)结核分枝杆菌核酸恒温扩增反应液；

(3)阳性对照：为含有结核分枝杆菌IS6110基因的DNA片段；

(4)阴性对照：为无菌双蒸水；

其中，所述结核分枝杆菌核酸恒温扩增反应液的组成为：

正向外围引物	0.01～0.05μmol；
		反向外围引物	0.01～0.05μmol；
正向交叉引物	0.01～0.05μmol；
		反向交叉引物	0.01～0.05μmol；
正向探针	0.1～0.5μmol；
		反向探针	0.1～0.5μmol；
MgSO₄	3～6mmol；
		dNTPs溶液	0.2～0.4mmol；
Bst DNA聚合酶	6～10U；
		10×Thermol buffer	2μl；
无菌双蒸水	补足到16μl。

本发明的第一优选技术方案为，所述结核分枝杆菌核酸恒温扩增反应液的组成为：

正向外围引物	0.03～0.05μmol；
		反向外围引物	0.03～0.05μmol；
正向交叉引物	0.03～0.05μmol；
		反向交叉引物	0.03～0.05μmol；
正向探针	0.3～0.5μmol；
		反向探针	0.3～0.5μmol；
MgSO₄	5～6mmol；
		dNTPs溶液	0.3～0.4mmol；
Bst DNA聚合酶	8～10U；
		10×Thermol buffer	2μl；
无菌双蒸水	补足到16μl。

[0023] 本发明的第二优选技术方案为，所述结核分枝杆菌核酸恒温扩增反应液的组成优选为：

正向外围引物	0.05μmol；
		反向外围引物	0.05μmol；
正向交叉引物	0.05μmol；
		反向交叉引物	0.05μmol；
正向探针	0.5μmol；
		反向探针	0.5μmol；
MgSO₄	6mmol；
		dNTPs溶液	0.4mmol；
Bst DNA聚合酶	10U；
		10×Thermol buffer	2μl；
无菌双蒸水	补足到16μl。

本发明的第三优选技术方案为，所述的DNA提取液和装置选自无仪器核酸提取试剂盒。所述无仪器核酸提取装置包括管状主体(1)，管状主体一端设有用于与抽吸装置连接的接头(2)，另一端为插头(3)，用于与核酸结合的滤芯装置(4)安装于管状主体或插头内。微量核酸提取装置的管状主体与插头为一体或由管状主体与插头两个部件连接而成，其中，所述插头为锥状。

优选的，微量核酸提取装置的滤芯装置(4)包括一个与管状主体或插头内壁相适应的中空的套筒和设置在套筒内部的滤膜，套筒两端为设置有挡板(5)的网状结构。

再优选的，微量核酸提取装置的滤芯装置的挡板(5)位于底面的中心，挡板面积大于插头下孔的面积。

进一步优选的，无仪器微量核酸提取试剂盒中的裂解液选自异硫氰酸胍、盐酸胍或肌酸胍；清洗液为Tris缓冲液；洗脱液为Tris-HCl溶液。其中，所述的清洗液为pH为4～8的Tris缓冲液，洗脱液为pH为7～10的10mmol/L的Tris-HCl溶液。

本发明的第四优选技术方案为，所述的正向外围引物选自SEQ ID NO：1所示序列的至少5个核苷酸序列，优选SEQ ID NO：1所示序列的至少8个核苷酸序列，更优选SEQ IDNO：1所示序列的至少12个核苷酸序列；所述的反向外围引物选自SEQ ID NO：2所示序列的核苷酸序列所示的至少5个核苷酸序列，优选SEQ ID NO：2所示序列的至少8个核苷酸序列，更优选SEQ IDNO：2所示序列的至少12个核苷酸序列。

本发明的第五优选技术方案为，所述的正向探针选自5’端标记有Biotin的SEQ IDNO：3所示序列的至少5个核苷酸序列；优选5’端标记有Biotin的SEQ ID NO：3所示序列的至少8个核苷酸序列，更优选5’端标记有Biotin的SEQ ID NO：3所示序列的至少12个核苷酸序列；所述的反向探针选自3’端标记有FitC的SEQ ID NO：4所示序列的至少5个核苷酸序列；优选3’端标记有FitC的SEQ ID NO：4所示序列的至少8个核苷酸序列，更优选3’端标记有FitC的SEQ ID NO：4所示序列的至少12个核苷酸序列。

本发明的第六优选技术方案为，所述正向交叉引物选自选自SEQ ID NO：5所示序列的至少5个核苷酸序列，优选SEQ ID NO：5所示序列的至少8个核苷酸序列，更优选SEQ IDNO：5所示序列的至少12个核苷酸序列；所述反向交叉引物选自SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列所示序列的至少5个核苷酸序列，优选SEQ ID NO：6所示序列的至少8个核苷酸序列，更优选SEQ IDNO：6所示序列的至少12个核苷酸序列。

本发明的第七优选技术方案为，所述的10×Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。

本发明的第八优选技术方案为，所述的结核分枝杆菌阳性对照含有如SEQ ID NO：7所示的长198bp的结核分枝杆菌TS6110基因序列。

本发明还公开了试剂盒中结核分枝杆菌阳性对照中的结核分枝杆菌DNA制备方法，包括下列步骤：

(1)利用两条外围引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2进行PCR扩增获得目的基因；

(2)对步骤(1)得到的PCR扩增产物进行纯化；

(3)将步骤(2)得到的纯化后的扩增产物通过质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因SEQ ID NO：7所示的质粒序列；

(4)将所抽提的质粒定量并稀释至10⁶拷贝/μl，-20℃保存。

其中，在步骤(2)中，采用Promega的PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；在步骤(3)中采用Promega的T-easy质粒转染试剂盒。

本发明还公开了利用本发明的试剂盒的检测结核分枝杆菌的方法，是利用核酸恒温扩增，具体步骤为：

a)用DNA提取试剂盒从待检测的标本中提取DNA；

b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在60～65℃下扩增反应60～65分钟，优选63℃下扩增反应60分钟；对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板；

c)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15分钟以后判读结果。

其中，其中的核酸防污染检测装置采用了专利申请200610109620.4所公开的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置，其中的试纸条采用了专利申请200610003429.1所公开的核酸薄膜层析快速检测的试纸条。

下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。

本发明提出一种利用核酸恒温扩增检测结核分枝杆菌的试剂盒，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg²⁺浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了结核分枝杆菌核酸恒温扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速检测结核分枝杆菌的要求。

所述试剂盒包括：

(1)DNA提取液；

(2)结核分枝杆菌核酸恒温扩增反应液；

(3)阳性对照：为含有结核分枝杆菌IS6110基因的DNA片段；

(4)阴性对照：为无菌双蒸水；

其中，所述结核分枝杆菌核酸恒温扩增反应液的组成为：

正向外围引物	0.05μmol；
		反向外围引物	0.05μmol；
正向交叉引物	0.05μmol；
		反向交叉引物	0.05μmol；
正向探针	0.5μmol；
		反向探针	0.5μmol；
MgSO₄	6mmol；
		dNTPs溶液	0.4mmol；
Bst DNA聚合酶	10U；
		10×Thermol buffer	2μl
无菌双蒸水	补足到16μl。

[0054] 其中，所述的DNA提取选自本公司的无仪器核酸提取试剂盒；

所述的正向外围引物选自SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述的反向外围引物选自SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列所示的核苷酸序列；

所述的正向探针选自5’端标记Biotin的SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述的反向探针选自3’端标记FitC的SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；

所述正向交叉引物选自选自SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，所述反向交叉引物选自选自SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；

所述的10×Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8；

所述的结核分枝杆菌阳性对照含有如SEQ ID NO：7所示的长198bp的结核分枝杆菌IS6110基因序列。

本发明还公开了利用本发明的试剂盒的检测结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

a)用DNA提取试剂盒从待检测的标本中提取DNA；

其中，所述样品选自临床样品或培养样品；其中临床样品选自痰液、支气管肺泡灌洗液、胸膜液、腹膜液、脑脊髓液、脓渣物质、尿、羊膜水、月经血、外周血或其他体液、淋巴结、脓或其它抽出物，和组织活检；

所述的DNA提取液选自德国QIAGEN DNA提取试剂盒；

其中的核酸防污染检测装置采用了专利申请200610109620.4所公开的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置；

试纸条采用了专利申请200610003429.1所公开的核酸薄膜层析快速检测的试纸条：该试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序有样品垫、有色颗粒结合物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上还设有检测线和质控线，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗FitC抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗FitC抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。

本试剂盒的核酸扩增的工作原理如图5所示：

在本发明提供本试剂盒中，有两条外围引物、两条交叉引物引物和两条检测探针。本试剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA合成不断的自我扩增循环。

交叉引物的核酸恒温扩增反应中包含以下几个步骤：

1.交叉正向引物CPF中的PFs与模板DNA中PFa互补，启动DNA合成，使得PRa被引入到所扩增的产物中。

2.外围引物DPls与PFa前端DPla序列互补，通过链置换型DNA聚合酶向前延伸，一边置换CPF合成的能与CPR和DP2a结合的单链产物(结构3)，一边与模板DNA形成双链产物(结构2)。

3.在结构3中，DP2a通过链置换型DNA聚合酶向前延伸，置换出由CPR所延伸的单链产物(结构5)，同时合成与步骤2中由CPF延伸所产生单链DNA形成双链产物(结构4)。而结构5相对起始的DNA模板，多了PRs和PFs两个片段序列。

4.单链结构5中的3’端的PFa和PRs可分别与CPF中的PFs和CPR中的PRa互补结合，可在链置换型DNA聚合酶的作用下延伸和置换出相应的单链产物。延伸产物相对结构5来说又增加了一个PFs区域(结构8)。

5.因此，扩增引物CPF和CPR的不断杂交和延伸，不仅使得结构5的长度不断的加长从而引入更多CPF和CPR 3’端互补区域，同时也置换出了各种可与CPF和CPR 3’端互补的单链产物。

6.通过CPF和CPR的不断杂交延伸和DNA聚合酶的链置换作用，使得DNA拷贝数不断的增加，从而达到基因扩增的效果。

7.在不同的扩增产物中存在能同时与两条分别带生物素(Biotin)和FitC标记的探针杂交的扩增产物(结构13，结构14)。这样的杂交产物可在核酸试纸条呈阳性。

其中在本发明的说明书中，所使用的技术术语具有如下含义：

“交叉扩增引物”是指用于交叉扩整的主要引物，其中正向引物的5’末端序列与反向引物的杂交序列相同，而反向引物的5’末端序列与正向引物的杂交序列相同，因此在扩增过程中这两条引物互相引入对方的杂交序列，增加引物的杂交位点，促进扩增反应。

“剥离引物”是指位于交叉扩增引物后方的短链引物，其作用是在链置换DNA聚合酶的作用下，将扩增产物的延伸链从模板上剥离。

“检测引物”是指用生物素或者半抗原标记的短链引物，其作用是使扩增产物带有标记，以用于检测。

“半抗原”是指用于检测引物的化学物质，它们与相应的抗体特异性的结合，用于检测扩增产物。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.特异性好：由于在检测过程中加入了2根特异性探针，确保结果的准确性；

2.灵敏度高：与琼脂糖凝胶电泳比较，检测灵敏度提高近100～200倍；

3.步骤简单，可重复性高：只需要按照试剂盒的说明书经过简单的操作处理即可；

4.快速：单个样本从样本处理到完成检测，仅需2小时；

5.全封闭检测：整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；

6.适用性好：可同时满足高通量和低通量的样品检测；

7.整个反应过程不需要复杂的仪器。

附图说明：

图1是无仪器微量核酸提取装置的示意图，其中1为管状主体，2为接头，3为插头，4为滤芯装置；

图2是无仪器微量核酸提取装置的示意图，其中1为管状主体，2为接头，3为插头，4为滤芯装置；

图3是无仪器微量核酸提取装置的滤芯装置4的示意图；

图4是无仪器微量核酸提取装置的滤芯装置4的俯视图；

图5为交叉引物恒温扩增的反应原理图；

图6为利用本发明试剂盒检测结核分枝杆菌的特异性的实验结果；1-14依次为海分枝杆菌、革登分枝杆菌、猿分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、蛙分枝杆菌、胞内分枝杆菌、草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、母牛分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、TB阳性对照品(10⁴拷贝/ml)、空白对照；

图7为利用本发明试剂盒检测结核分枝杆菌的灵敏度的实验结果；1-7依次为10⁴个菌/ul、10³个菌/ul、10²个菌/ul、10¹个菌/ul、10⁰个菌/ul的菌液、TB阳性对照品(10⁴拷贝/ml)；空白对照。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。

实施例1本发明试剂盒的组成与配制

a)DNA提取试剂：本公司的无仪器核酸提取试剂盒；

b)反应液：两条外围引物(0.05μmol)，两条探针(0.5μmol)，和两条交叉引物(0.5μmol)，10×Thermol buffer，MgSO₄(6mmol)，dNTPs溶液(0.4mmol)，Bst DNA聚合酶(10U)和无菌双蒸水组成，总反应液体积为16μl。其中：

正向外围引物序列为5’-AGGACCACGATCGCTGATC-3’；

反向外围引物序列为5’-TGGCCATCGTGGAAGCGA-3’；

所述的两条探针的序列分别为：

正向5’端Biotin标记探针 5-biotin-TAGCAGACCTCACCTATGTGTC

反向3’端异硫氰酸荧光素(FitC)标记探针5-CTGGGCAGGGTTCGCCT-FitC；

所述的扩增交叉引物分别为：

扩增反向引物5-CTCGTCCAGCGCCGCTTCGGTTCGGTGACAAAGGCCACG

扩增正向引物5-GCGTCGGTGACAAAGGCCACGTTCTCGTCCAGCGCCGCTTC

10×Thermol buffer的组成：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mMMgSO₄，0.1％Triton X-100。

所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。

c)阳性对照：含有结核分枝杆菌IS6110基因[[NCBI gene bank number：FJ653663.1(39-83)]的DNA片段。

阳性对照的制备步骤：利用两条外围引物和以结核分枝杆菌的基因组DNA模板进行PCR扩增获得目的基因；用Promega的PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过Promega的T-easy质粒试剂盒，构建含有目的基因片段的质粒；用分光光度计测A₂₈₀定量并稀释至10⁶拷贝/μl，-20℃保存。

d)阴性对照：无菌双蒸水。

实施例2用本发明试剂盒检测结核分枝杆菌核酸的具体方法

a)用DNA提取试剂盒从待检测的标本中提取DNA。其具体方案参见DNA提取试剂盒。

b)取标本DNA作为模板加入到装有反应液的PCR管中，在60℃进行扩增反应90分钟，其中标本DNA 4μl，反应液16μl；对照PCR管中分别加入阳性对照模板和阴性对照模板。

c)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15分钟以后判读结果。当样本中含有结核分枝杆菌核酸时，试纸条的检测线上呈阳性。

反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要1.5个小时就能完成，大大缩短检测时间。同时本试剂盒只需要1个人就可以完成所有的操作过程，可一次性检测一个到数百个样本，这样也减少了人力的浪费。

实施例3用本发明试剂盒检测结核分枝杆菌的专一性

按照实施例2的方法检测海分枝杆菌；革登分枝杆菌；猿分枝杆菌；瘰疬分枝杆菌；蛙分枝杆菌；胞内分枝杆菌；草分枝杆菌；耻垢分枝杆菌；母牛分枝杆菌；偶然分枝杆菌；龟脓肿分枝杆菌；龟分枝杆菌；TB阳性对照品，其结果如图6。

从图6测试结果可见，用本发明试剂盒检测结核分枝杆菌核酸具有很强的专一性。

实施例4用本发明试剂盒检测结核分枝杆菌核酸的灵敏度

提取培养的结核分枝杆菌的DNA，对其进行定量，分别稀释至浓度为10⁴拷贝/微升、10³拷贝/微升、10²拷贝/微升、10¹拷贝/微升，采用实施例2中所述方法来确定本发明试剂盒用于检测结核分枝杆菌核酸的灵敏度。

结果如图7所示，图中1～4分别表示10⁴拷贝/微升、10³拷贝/微升、10²拷贝/微升、10拷贝/微升，5是阴性对照，可以发现该试剂盒可在每个反应体系中检出10个拷贝，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测结核分枝杆菌的要求。

Claims

1.一种利用核酸恒温扩增检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)无仪器DNA提取试剂盒；所述的无仪器DNA提取试剂盒包括：微量核酸提取装置、抽吸装置、细胞裂解液、清洗液及洗脱液；

(2)结核分枝杆菌核酸恒温扩增反应液；

(3)阳性对照：为含有结核分枝杆菌IS6110基因的DNA片段；

(4)阴性对照：为无菌双蒸水；

其中，所述结核分枝杆菌核酸恒温扩增反应液的组成为：

正向外围引物 0.01～0.05μmol；反向外围引物 0.01～0.05μmol；正向交叉引物 0.01～0.05μmol；反向交叉引物 0.01～0.05μmol；正向探针 0.1～0.5μmol；反向探针 0.1～0.5μmol； MgSO₄ 3～6mmol； dNTPs溶液 0.2～0.4mmol； Bst DNA聚合酶 6～10U； 10×Thermol buffer 2μl；无菌双蒸水补足到16μl；

其中，所述的正向外围引物为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

所述的反向外围引物为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

所述的正向探针为5’端标记有Biotin的SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

所述的反向探针选自3’端标记有FitC的SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

所述正向交叉引物选自SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

所述反向交叉引物选自SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，结核分枝杆菌核酸恒温扩增反应液的组成为：

正向外围引物 0.03～0.05μmol；反向外围引物 0.03～0.05μmol；

正向交叉引物 0.03～0.05μmol；反向交叉引物 0.03～0.05μmol；正向探针 0.3～0.5μmol；反向探针 0.3～0.5μmol； MgSO₄ 5～6mmol； dNTPs溶液 0.3～0.4mmol； Bst DNA聚合酶 8～10U； 10×Thermol buffer 2μl；无菌双蒸水补足到16μl。

3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述结核分枝杆菌核酸恒温扩增反应液的组成为：

正向外围引物 0.05μmol；反向外围引物 0.05μmol；正向交叉引物 0.05μmol；反向交叉引物 0.05μmol；正向探针 0.5μmol；反向探针 0.5μmol； MgSO₄ 6mmol； dNTPs溶液 0.4mmol； Bst DNA聚合酶 10U； 10×Thermol buffer 2μl；无菌双蒸水补足到16μl。

4.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述的微量核酸提取装置包括管状主体（1），管状主体一端设有用于与抽吸装置连接的接头（2），另一端为插头（3），用于与核酸结合的滤芯装置（4）安装于管状主体或插头内；微量核酸提取装置的管状主体与插头为一体或由管状主体与插头两个部件连接而成，其中，所述插头为锥状。

5.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述的10×Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1%的Triton X-100，pH8.8。

6.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于：所述的结核分枝杆菌阳性对照含有如SEQ ID NO:7所示的、长198bp的结核分枝杆菌IS6110基因序列。

7.根据权利要求1～6任一所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于：所述的结核分枝杆菌阳性对照中的结核分枝杆菌DNA，制备方法包括下列步骤：

（1）利用两条外围引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行PCR扩增获得目的基因；

（2）对步骤（1）得到的PCR扩增产物进行纯化；

（3）将步骤（2）得到的纯化后的扩增产物通过质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因SEQ ID NO:7所示的质粒序列；

（4）将所抽提的质粒定量并稀释至10⁶拷贝/μl，-20℃保存。