CN104561375A - 一种新布尼亚病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新布尼亚病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包含RNA提取试剂、恒温PCR扩增反应液、阳性对照和阴性对照；本发明的检测试剂盒特异性好、灵敏度高；从病毒RNA逆转录到链置换扩增全部恒定同一温度，恒温扩增仅需35分钟，核酸试纸条检测结果需2分钟左右，全程从接受样品到获得结果整个检测过程仅需1小时左右，且整个反应过程只需一个恒温仪器，特别适合新布尼亚病毒感染或蜱虫等媒介监测的快速检测使用。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种针对新布尼亚病毒核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对新布尼亚病毒的定性检测。
(二)背景技术
新布尼亚病毒是发热伴血小板减少综合征的重要病原体，其主要通过蜱虫叮咬传播。电镜下病毒颗粒呈球形或椭圆形，直径约80nm～100nm，其基因组由大(L)、中(M)、小(S)3个单股负链RNA片段组成。病人感染新布尼亚病毒后引起发热伴血小板减少综合征，主要表现为急性起病、发热、恶心、腹泻、乏力、全身不适、呕吐、肌肉酸痛等，可因多器官功能衰竭死亡。新布尼亚病毒可以通过蜱虫叮咬传播，也可通过接触病人血液等传播。新布尼亚病毒感染需要实验室诊断技术加以确诊，因此建立快速、准确的诊断方法十分重要。目前新型布尼亚病毒的实验室检测技术主要基于针对病毒RNA的核酸检测技术(如荧光定量PCR等技术)，但由于需要昂贵的荧光定量PCR仪，使得难以广泛使用。恒温扩增技术是继PCR技术后近年发展起来的一种新的体外核酸扩增技术，本发明技术研制了恒温扩增新布尼亚病毒核酸，并结合核酸试纸条显色来判定检测结果，且整个反应过程不打开反应管盖子，试纸条流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性。本发明研发的新布尼亚病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法检测时间短、反应灵敏、方法特异，为新布尼亚病毒检测提供了一种可靠的快速检测方法。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测新布尼亚病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒组成包括：
(1)RNA提取液，优选德国QIAGEN RNA提取试剂盒(Qia-74104)；
(2)恒温PCR扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermol buffer、MgSO4、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶和无菌双蒸水；其中：
所述正向外围引物为：5′-TTGCTGCTTACAGGTTCCTG-3′；
反向外围引物为：5′-GAGGAGCCAGCAAGACAGA-3′；
所述两条探针的序列分别为：
正向5’端Biotin标记探针
5′-Biotin-GTCCCCAGCAGAGCTGCTGAG-3′；
反向3’端Fitc标记探针
5′-Fitc-GGGAAGAAGACAGAGTTCACAG-3′；
所述两条扩增交叉引物分别为：
扩增正向引物：
5′-AGGGAATCCTTGGCCCAGATGTAAGCAGCGGCAGCAAC-3′；扩增反向引物：
5′-TGGCCTTCAGCCACTTCACCTCAGGGATCCTCTCCATGC-3′；
(3)阳性对照：含有新布尼亚病毒的S基因片段的DNA质粒；
(4)阴性对照：无菌双蒸水。
进一步，本发明所述的1×Thermol buffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。
进一步，本发明所述阳性对照为含有长189bp的新布尼亚病毒S片段基因序列，序列如(SEQ ID NO.1)：
TTGCTGCTTACAGGTTTCTGTAAGCAGCAGCAGCAACCTCAGCAGCTCTGCTGGGGACCCCATCTGGGCCAAGGATCCCCTTGGCCTTCAGCCACTTCACCCGAACATCATTGGGAAAGAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAGAGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACCTCTGTCTTGCTGGCTCCTC。
进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备：
以包含扩增区域的新布尼亚病毒S基因片段(即SEQ ID NO.1所示)为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A280定量并稀释至10个拷贝/μl，获得阳性对照，-20℃保存。
进一步，本发明所述恒温PCR扩增反应液组成为：两条外围引物各自15pmol，两条探针各自20pmol，两条交叉引物各自30pmol，1×Thermol buffer，MgSO4为6mmol，dNTPs溶液各0.4mmol，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，无菌双蒸水组成补足至25μl。
本发明还提供一种所述新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒的应用，所述应用为：
a)用试剂盒中RNA提取试剂从待检测的标本中提取RNA；
b)将步骤a)提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在60℃下扩增反应35分钟；将标准阳性模板(即阳性对照)加入阳性对照PCR管中，将标准阴性模板(即阴性对照)加入阴性对照PCR管中，所述阳性对照模板为含有新布尼亚病毒的S基因片段的质粒，所述阴性对照模板为无菌双蒸水；
c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置(杭州优思达生物技术公司3号装置)中进行检测(也可以采用其它核酸试纸条进行检测)，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有新布尼亚病毒核酸。本发明所述核酸试纸条防污染检测装置中试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序设有样品垫(即图1中玻纤)、有色颗粒结合物垫(即图1中乳胶)、纤维膜和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线和质控线，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗Fitc抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗Fitc抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有新布尼亚病毒核酸。
在本发明提供的试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物和两条检测探针。RNA由逆转录酶逆转录成cDNA后，本试剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA合成不断的自我扩增循环。在本发明提供的新布尼亚病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒中，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg2+浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了新布尼亚病毒核酸恒温扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出100个拷贝，可以满足快速检测新布尼亚病毒的要求。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
(1)本发明所述新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒的特异性好，灵敏度高，步骤简单，可重复性高；
(2)反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需1小时左右；
(3)整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；整个反应过程不需要复杂的仪器。
(四)附图说明
图1为核酸检测试纸条原理示意图。
图2为本发明试剂盒用于检测新布尼亚病毒的特异性，1-4依次为登革热病毒；基孔肯雅热病毒；西尼罗热病毒；阳性对照(103拷贝/反应)。
图3为本发明试剂盒用于检测新布尼亚病毒的灵敏度，1-5依次为空白对照、101拷贝/微升、102拷贝/微升、103拷贝/微升、104拷贝/微升。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1本发明试剂盒的组成与配制
a)RNA提取试剂：德国QIAGEN RNA提取试剂盒(Qia-74104)；
b)新布尼亚病毒核酸恒温PCR扩增反应液：两条外围引物(15pmol)，两条探针(20pmol)和两条交叉引物(30pmol)，1×Thermolbuffer，MgSO4(6mmol)，dNTPs溶液(各0.4mmol)，Bst DNA聚合酶(8U)，AMV逆转录酶(5U)和无菌双蒸水组成，总反应液体积为25μl；正向外围引物为：5′-TTGCTGCTTACAGGTTCCTG-3′；
反向外围引物为：5′-GAGGAGCCAGCAAGACAGA-3′；
两条探针的序列分别为：
正向5’端Biotin标记探针
5′-Biotin-GTCCCCAGCAGAGCTGCTGAG-3′；
反向3’端Fitc标记探针
5′-Fitc-GGGAAGAAGACAGAGTTCACAG-3′；
两条扩增交叉引物分别为：
扩增正向引物：
5′-AGGGAATCCTTGGCCCAGATGTAAGCAGCGGCAGCAAC-3′；扩增反向引物：
5′-TGGCCTTCAGCCACTTCACCTCAGGGATCCTCTCCATGC-3′；
所述的1×Thermol buffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。
所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。
c)阳性对照：含有长189bp的新布尼亚病毒S片段基因序列，序列如下：
TTGCTGCTTACAGGTTTCTGTAAGCAGCAGCAGCAACCTCAGCAGCTCTGCTGGGGACCCCATCTGGGCCAAGGATCCCCTTGGCCTTCAGCCACTTCACCCGAACATCATTGGGAAAGAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAGAGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACCTCTGTCTTGCTGGCTCCTC。
阳性对照按如下步骤制备：
以包含扩增区域的新布尼亚病毒S基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A280定量并稀释至10个拷贝/μl，-20℃保存。
d)阴性对照：无菌双蒸水。
实施例2用本发明试剂盒检测新布尼亚病毒核酸的具体方法
a)用新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒中RNA提取液从待检测的标本中提取RNA(疑似病例或蜱虫标本提取核酸需在生物安全实验室进行)作为标本RNA。
b)取标本RNA作为模板，加入到装有新布尼亚病毒恒温扩增反应液的PCR管中，其中标本RNA 5μl，反应液20μl，60℃扩增反应35分钟；阳性和阴性对照PCR管中分别加入阳性模板和阴性模板。
c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置(杭州优思达生物技术公司3号装置)中进行检测，2分钟以后判读结果。当样本中含有新布尼亚病毒核酸时，试纸条的检测线上呈阳性。
反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要1个小时左右就能完成，大大缩短检测时间。
实施例3用本发明试剂盒检测新布尼亚病毒的特异性
按照实施例2的方法检测西尼罗病毒核酸RNA、基孔肯雅热病毒RNA、登革热病毒核酸RNA，其结果如图2。从图2测试结果可见，用本发明试剂盒检测新布尼亚病毒核酸具有很强的特异性。
实施例4用本发明试剂盒检测新布尼亚病毒核酸的灵敏度
对新布尼亚病毒的S基因质粒DNA进行定量，分别稀释至浓度为104拷贝/微升、103拷贝/微升、102拷贝/微升、101拷贝/微升，采用实施例2中所述方法来确定本发明试剂盒用于检测新布尼亚病毒核酸的灵敏度。结果如图3所示，图2中1-4分别表示空白对照、101拷贝/微升、102拷贝/微升、103拷贝/微升、104拷贝/微升，可以发现该试剂盒可在每个反应体系中检出100个拷贝，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测新布尼亚病毒核酸的要求。
Claims (6)
1.一种新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒组成包括：
(1)RNA提取试剂；
(2)恒温PCR扩增反应液：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条扩增交叉引物、1×Thermol Buffer，MgSO4，dNTPs溶液，Bst DNA聚合酶，AMV逆转录酶和无菌双蒸水；
所述正向外围引物为：5′-TTGCTGCTTACAGGTTCCTG-3′；
反向外围引物为：5′-GAGGAGCCAGCAAGACAGA-3′；
所述两条探针的序列分别为：
正向5’端Biotin标记探针5′-Biotin-GTCCCCAGCAGAGCTGCTGAG-3′；
反向3’端Fitc标记探针5′-Fitc-GGGAAGAAGACAGAGTTCACAG-3′；
所述两条扩增交叉引物分别为：
扩增正向引物：
5′-AGGGAATCCTTGGCCCAGATGTAAGCAGCGGCAGCAAC-3′；
扩增反向引物：
5′-TGGCCTTCAGCCACTTCACCTCAGGGATCCTCTCCATGC-3′；
(3)阳性对照：含有新布尼亚病毒的S基因片段的DNA质粒；
(4)阴性对照：无菌双蒸水。
2.如权利要求1所述新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述1×Thermol Buffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。
3.如权利要求1所述新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照为含有长189bp的新布尼亚病毒S片段的基因序列，所述基因序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1所述新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照按如下步骤制备：
以包含扩增区域的新布尼亚病毒S基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A280定量并稀释至10个拷贝/μl，获得阳性对照，-20℃保存。
5.如权利要求1所述新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述恒温PCR扩增反应液组成为：两条外围引物各自15pmol，两条探针各自20pmol，两条交叉引物各自30pmol，1×Thermol buffer，MgSO4为6mmol，dNTPs溶液各0.4mmol，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，无菌双蒸水组成补足至25μl。
6.一种权利要求1所述新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述检测方法为：
a)用试剂盒中RNA提取试剂从待检测的标本中提取RNA；
b)将步骤a)提取得到的RNA作为模板，加入到装有恒温PCR扩增反应液的PCR管中，在60℃下扩增反应35分钟；将阳性对照加入到阳性对照PCR管中，将阴性对照加入阴性对照PCR管中，所述阳性对照为含有新布尼亚病毒的S基因片段的质粒，所述阴性对照为无菌双蒸水；
c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置中进行检测，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有新布尼亚病毒核酸。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150429 |