CN102634604A - 新布尼亚病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents
新布尼亚病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一用于检测新布尼亚病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，该试剂盒包括PCR反应酶、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品和DEPCH2O，PCR反应液中包含特异性引物和Taqman荧光探针，该引物和探针是针对布尼亚病毒的基因组相对应的S片段区域设计的，能够快速、简便、敏感、特异地检测新布尼亚病毒的存在。本试剂盒适用于发热伴血小板减少综合征病人急性期血清标本及病原细胞分离培养物等标本的检测，检测结果可作为新布尼亚病毒感染的诊断依据，同时适用于流行病学监控。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种在流行病学监控中用于新布尼亚病毒感染诊断依据的新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒。
背景技术
2007年，河南省信阳、南阳地区发现了多例不明原因发热、严重消化道出血症状，白细胞、血小板减少，并伴出血倾向的病人。河南省疾病预防控制中心对此开展了专项调查，根据临床特点建立疾病定义，扩大搜索范围，建立症状监测报告系统，命名为发热伴血小板减少综合征，多种已知病原体检测阴性，仅极少部分病例人嗜粒细胞无形体核酸、血清学检测阳性，随后湖北、山东、安徽、江苏、辽宁等省也发现了类似病例。
2010年河南省新发传染病创新科研团队在发热伴血小板减少综合征病例急性期血清标本中分离到一种未知病原体，完成了新病毒全基因组测序，结合电子显微镜形态学观察、流行病学和临床特征，确定为布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新病毒，并命名为新布尼亚病毒。新布尼亚病毒属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，呈球形，直径80～100 nm，有包膜，表面有棘突，基因组含三个单股负链RNA片段（L、M和S)。可以经接触血液、虫媒等途径传播，对人体致病严重，潜伏期为7～9天，主要临床表现为突然起病、发热、乏力、纳差、恶心、呕吐等；部分病例有头痛、肌肉酸痛、腹泻等症状；体格检查常有颈部及腹股沟等浅表淋巴结肿大伴压痛、上腹部压痛及相对缓脉；部分病例病情危重，出现意识障碍、皮肤瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭、弥漫性血管内凝血（DIC）等多脏器功能衰竭死亡，病死率较高。该病严重影响了人民群众身体健康，给民众造成了巨大的经济损失和精神负担。因此，针对感染新布尼亚病毒导致的发热伴血小板减少综合征病例提供一种简便、快速、灵敏、特异性高的检测试剂成为目前临床诊断该类病人的迫切需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒可以快速、简便、敏感、特异性的检测发热伴血小板减少综合征病人急性期血清中新布尼亚病毒的存在，为疾病的诊断和流行病学调查提供参考依据。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，包括PCR反应酶、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品和DEPC H2O，所述PCR反应液包括特异性引物和荧光探针，上游引物为：5’- GAARTCCTCAAGCTCAGTCAAATTG -3’，下游引物为：5’-GCAAAGGAGTGATCATGTCIGAGT -3’，荧光探针为：5’-CTGCTGCTCACCAAACTCCACIGCA -3’；阳性质控品模板的核苷酸序列为：TAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAGGGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACTTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGCATCTTCACATTGATAGTCTTGGTGAAGGCATCTTGCCATAAAGAGTAAGCCTCCATCAGGGTCTTGGTCGTGGCTTCAGATACCCCTGCAGTTGGAATCAGGGACCCGAAGGCCATGCACATCATCTCAGGGGGATAATTCTCGACCTTCAGGTTCATGACGGCTGGCCCCACAGGGAGATACTCCTTTAAGGCTGCTGCTGCAGCACATGTCCAAGTGGGGAGGCTCTGCGCTACCCTTACTGGGGTGATTGAGAGCCTGGTCTCTGCCCTCTCAACCAGCCCATATTTCTCCTGGAGTGCCATCAACCTCTTAGACCCTGAGTTTGACATCTTCCCTGATGCCTTGACGATCTTATTGCCTCGAGTCAGGGCAAAGACAATGATGAACTTAGTATCCTTCACCCAGTCATCTCCACCTGTCTCCTTCAGCTTCTTGATGATCAAAGCAGGATCAAGGCCTTCATAGGCTAGCTCTCTCGCGAAATCCTCAAGCTCAGTCAAATTGAGCTGCTGCTCACCAAACTCCACTGCAATTCTGGACCACTCTGACATGATCACTCCTTTGCGTCTTTCCTTTTTTGGGGGTTT。
所述阳性质控品模板是含有插入新布尼亚病毒特异性核酸序列的PUCM-T质粒载体，该载体可在大肠杆菌JM109中增殖。
荧光探针为寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此特异性和敏感性高，目前已广泛应用于乙肝病毒、人乳头瘤病毒、结核杆菌等多种病原体的临床诊断中。本发明就是采用Taqman探针技术，设计了检测新布尼亚病毒核酸的试剂盒，应用于发热伴血小板减少综合征病例的临床诊断中，获得了很好的检测效果，能够快速、简便、敏感、特异地检测新布尼亚病毒的存在。
本发明的优点主要体现在：
1、敏感：实时荧光定量RT-PCR检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显像技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。
2、特异：使用特异性引物和探针双重对靶分子进行识别，特异性好、准确性高、假阳性低。
3、简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染。
4、快速：速度快，高通量，可在2小时内完成。
附图说明
图1是本发明所用荧光探针的工作原理，R表示报告荧光基团，Q表示淬灭荧光基团。
图2是实时荧光RT-PCR的特异性结果。
图3是实时荧光RT-PCR的敏感性结果。
具体实施方式
本发明所述的新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，包括PCR反应酶、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品和DEPC H2O，所述PCR反应液包括特异性引物和TaqMan荧光探针（荧光探针的荧光基团为FAM，如图1所示），上游引物为：5’-GAARTCCTCAAGCTCAGTCAAATTG -3’，下游引物为：5’-GCAAAGGAGTGATCATGTCIGAGT -3’，荧光探针为：5’-CTGCTGCTCACCAAACTCCACIGCA -3’；阳性质控品模板的核苷酸序列为：TAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAGGGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACTTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGCATCTTCACATTGATAGTCTTGGTGAAGGCATCTTGCCATAAAGAGTAAGCCTCCATCAGGGTCTTGGTCGTGGCTTCAGATACCCCTGCAGTTGGAATCAGGGACCCGAAGGCCATGCACATCATCTCAGGGGGATAATTCTCGACCTTCAGGTTCATGACGGCTGGCCCCACAGGGAGATACTCCTTTAAGGCTGCTGCTGCAGCACATGTCCAAGTGGGGAGGCTCTGCGCTACCCTTACTGGGGTGATTGAGAGCCTGGTCTCTGCCCTCTCAACCAGCCCATATTTCTCCTGGAGTGCCATCAACCTCTTAGACCCTGAGTTTGACATCTTCCCTGATGCCTTGACGATCTTATTGCCTCGAGTCAGGGCAAAGACAATGATGAACTTAGTATCCTTCACCCAGTCATCTCCACCTGTCTCCTTCAGCTTCTTGATGATCAAAGCAGGATCAAGGCCTTCATAGGCTAGCTCTCTCGCGAAATCCTCAAGCTCAGTCAAATTGAGCTGCTGCTCACCAAACTCCACTGCAATTCTGGACCACTCTGACATGATCACTCCTTTGCGTCTTTCCTTTTTTGGGGGTTT。
阳性质控品模板是含有插入新布尼亚病毒特异性核酸序列的PUCM-T质粒载体，该载体可在大肠杆菌JM109中增殖。
PCR反应液中还包括dNTPs、10×PCR Buffer、DEPC H2O。
PCR反应酶中包括热启动Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂。
阳性质控品为制备的新布尼亚病毒基因组目的核酸片段的cDNA重组载体。
阴性质控品为不含新布尼亚病毒基因组RNA的样品。
本发明试剂盒的主要组成成分如下表1：
表1：试剂盒主要成分
| 组分名称 | 规格 | 数量 | 主要成分 |
| PCR反应酶 | 20μl | 1管 | 热启动Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂 |
| PCR反应液 | 1mL | 2管 | dNTPs、10×PCR Buffer、上游引物、下游引物、 Taqman探针 |
| 阳性质控品 | 300μl | 1管 | 制备的新布尼亚病毒基因组目的核酸片段的cDNA重组载体 |
| 阴性质控品 | 300μl | 1管 | DEPC H2O |
| DEPC H2O | 1mL | 2管 |
一、本发明新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒的配置：
1、材料：
PUCM-T质粒载体及引物探针的合成购自上海生工公司， PCR反应液及PCR反应酶均购自德国QIAGEN公司，荧光PCR仪IQ5购自美国Bio-Rad公司。
2、引物的设计与合成：
以新布尼亚病毒序列(Genbank登录号HQ642768)为模板，使用Primer Premier5.0设计引物及探针。
上游引物：5’- GAARTCCTCAAGCTCAGTCAAATTG -3’，下游引物：5’- GCAAAGGAGTGATCATGTCIGAGT -3’，Taqman荧光探针：5’- CTGCTGCTCACCAAACTCCACIGCA -3’（5`6- FAM 3` BHQ-1），引物及探针均由上海生工公司合成。
3、阳性质控品的制备：
合成新型布尼亚病毒核酸检测引物S9-F2：5’ - aacccccaaaaaaggaaagacg -3’、 S650-R2：5’- aagacagagttcacagcagc -3’。 将新布尼亚病毒HN01株病毒反复冻融3次以上，12000rpm离心20min，各取140uL用QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN Catalog #52904）按说明书要求提取RNA，作为荧光PCR反应的模板，应用一步法荧光PCR试剂盒（德国QIAGEN公司）进行扩增，反应条件50℃ 30min 1 cycle；95℃15min 1 cycle；95℃ 30sec，50℃ 45sec，72℃ 45sec 40 cycles，72℃ 10min。
PCR产物电泳检测后，切胶回收，送上海生工插入PUCM-T载体克隆测序，结果为：
TAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAGGGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACTTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGCATCTTCACATTGATAGTCTTGGTGAAGGCATCTTGCCATAAAGAGTAAGCCTCCATCAGGGTCTTGGTCGTGGCTTCAGATACCCCTGCAGTTGGAATCAGGGACCCGAAGGCCATGCACATCATCTCAGGGGGATAATTCTCGACCTTCAGGTTCATGACGGCTGGCCCCACAGGGAGATACTCCTTTAAGGCTGCTGCTGCAGCACATGTCCAAGTGGGGAGGCTCTGCGCTACCCTTACTGGGGTGATTGAGAGCCTGGTCTCTGCCCTCTCAACCAGCCCATATTTCTCCTGGAGTGCCATCAACCTCTTAGACCCTGAGTTTGACATCTTCCCTGATGCCTTGACGATCTTATTGCCTCGAGTCAGGGCAAAGACAATGATGAACTTAGTATCCTTCACCCAGTCATCTCCACCTGTCTCCTTCAGCTTCTTGATGATCAAAGCAGGATCAAGGCCTTCATAGGCTAGCTCTCTCGCGAAATCCTCAAGCTCAGTCAAATTGAGCTGCTGCTCACCAAACTCCACTGCAATTCTGGACCACTCTGACATGATCACTCCTTTGCGTCTTTCCTTTTTTGGGGGTTT。
测序结果与插入序列完全一致，阳性质控品制备成功。
二、本发明新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒的使用方法：
1、标本采集、保存和运送：
血清：采取病人急性期静脉血于未加抗凝剂（若收集血浆则加入抗凝剂）的容器内，静置使血凝固，分离血清备检测，可于-70℃冰箱内保存，冰排运输。
病原细胞分离培养物：将冻存的细胞培养管反复冻融三次，4℃，12,000rpm，离心15分钟后取上清液备检测，可于-70℃冰箱内保存，冰排运输。
2、核酸分离：
取140μl血清或病原细胞分离培养物进行核酸提取。采用RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit（德国Qiagen公司catalog NO.52904），按试剂盒说明书要求操作，提取RNA以备检测用。该试剂盒适用于血液、体液标本及细胞分离物中病毒RNA的提取。
3、实时荧光RT-PCR扩增
取1个RNase Free的1.5mL离心管，计算待测样品数量（n），按n+2份配置荧光RT-PCR扩增反应体系（如下表2），反应液配制请在冰上进行，分装20uL/管到n+2个PCR扩增管，模板依次加入阴性质控品、阳性质控品、待测标本各RNA 5ul。
表2：荧光RT-PCR扩增反应体系配置表
| 序号 | 成分名称 | ×1 |
| 1 | PCR反应酶 | 0.5 μl |
| 2 | PCR反应液 | 12.5 μl |
| 3 | 模板 | 5ul |
| 4 | DEPC H2O | 补足25μl |
荧光定量RT-PCR扩增程序：50 ℃逆转录30 min；95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min，进行5个循环的预扩增；接下来进行40个循环：95 ℃变性10 s，55 ℃退火40 s，并采集荧光(设置仪器收集FAM荧光信号)。
4、结果分析
基线范围根据仪器要求设定，目的为校正背景荧光干扰，终止循环一般设置为最强样本出现扩增信号的前3-4个循环。阈值线用于判断样品是否扩增，应调整使阈值线高于荧光背景和阴性对照的荧光信号，或点击自动获得。每次试验应设阳性和阴性对照，且阴性对照无Ct值，阳性对照Ct值小于30.0，否则试验结果不成立。
检测结果Ct值≤35为阳性；无Ct值为阴性；Ct值在35～40为可疑样品，需重新检测。
三、本发明新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒的性能评价
1、实时荧光RT-PCR的特异性
取新型布尼亚病毒原始毒株wz69株的培养物为阳性扩增底物,以双蒸水、健康人标本为阴性对照, EV71肠道病毒HN201033株、CA16肠道病毒HN201002株和乙型脑炎病毒作为参考病毒, 应用本试剂盒进行实时荧光RT-PCR扩增，检测结果表明,该方法与其他病毒间无交叉反应，具有良好的特异性。具体结果见图2。
2、实时荧光RT-PCR的敏感性
取原始毒株wz69进行10倍倍比稀释至10-8，分别提取RNA，应用本试剂盒进行实时荧光RT-PCR扩增，结果表明本发明方法可检测到的最低稀释的为10-5，浓度为1.6×106copy/L，具体结果见图3。
3、实时荧光RT-PCR的准确性
取85份新型布尼亚病毒巢式RT-PCR检测阳性标本，提取RNA，进行实时荧光RT-PCR，反应产物送上海生工技术有限公司测序。测序结果经NCBI数据库比对，85份标本中扩增的基因序列与数据库中新型布尼亚病毒基因同源性均达到99%以上，说明本方法可扩增新型布尼亚病毒的特定基因序列。
4、标本检测统计：
对2007-2010年发热伴血小板减少综合征监测采集的495份标本，应用本试剂盒进行新型布尼亚病毒核酸检测，阳性340例，阳性率为68.69%。2007年-2011年阳性率依次为53.13%（17/32），57.14（4/7）,57.97%（40/69），79.02%（162/205）和62.90%（117/186）。
Application Project
-------------------
<120> Title : 新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒
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--------
<213> OrganismName : 新布尼亚病毒
<400> PreSequenceString :
taagacagagttcacagcagcatggaggggatccctgaaggagttgtaaacttctgtcttgctggctccgcgcatcttcacattgatagtcttggtgaaggcatcttgccataaagagtaagcctccatcagggtcttggtcgtggcttcagatacccctgcagttggaatcagggacccgaaggccatgcacatcatctcagggggataattctcgaccttcaggttcatgacggctggccccacagggagatactcctttaaggctgctgctgcagcacatgtccaagtggggaggctctgcgctacccttactggggtgattgagagcctggtctctgccctctcaaccagcccatatttctcctggagtgccatcaacctcttagaccctgagtttgacatcttccctgatgccttgacgatcttattgcctcgagtcagggcaaagacaatgatgaacttagtatccttcacccagtcatctccacctgtctccttcagcttcttgatgatcaaagcaggatcaaggccttcataggctagctctctcgcgaaatcctcaagctcagtcaaattgagctgctgctcaccaaactccactgcaattctggaccactctgacatgatcactcctttgcgtctttccttttttgggggttt
<212> Type : RNA
<211> Length : 663
SequenceName : 新布尼亚病毒S片段的核苷酸
SequenceDescription :
Claims (2)
1.一种新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，包括PCR反应酶、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品和DEPC H2O，其特征在于：所述PCR反应液包括特异性引物和荧光探针，上游引物为：5’- GAARTCCTCAAGCTCAGTCAAATTG -3’，下游引物为：5’- GCAAAGGAGTGATCATGTCIGAGT -3’，荧光探针为：5’- CTGCTGCTCACCAAACTCCACIGCA -3’；阳性质控品模板的核苷酸序列为：TAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAGGGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACTTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGCATCTTCACATTGATAGTCTTGGTGAAGGCATCTTGCCATAAAGAGTAAGCCTCCATCAGGGTCTTGGTCGTGGCTTCAGATACCCCTGCAGTTGGAATCAGGGACCCGAAGGCCATGCACATCATCTCAGGGGGATAATTCTCGACCTTCAGGTTCATGACGGCTGGCCCCACAGGGAGATACTCCTTTAAGGCTGCTGCTGCAGCACATGTCCAAGTGGGGAGGCTCTGCGCTACCCTTACTGGGGTGATTGAGAGCCTGGTCTCTGCCCTCTCAACCAGCCCATATTTCTCCTGGAGTGCCATCAACCTCTTAGACCCTGAGTTTGACATCTTCCCTGATGCCTTGACGATCTTATTGCCTCGAGTCAGGGCAAAGACAATGATGAACTTAGTATCCTTCACCCAGTCATCTCCACCTGTCTCCTTCAGCTTCTTGATGATCAAAGCAGGATCAAGGCCTTCATAGGCTAGCTCTCTCGCGAAATCCTCAAGCTCAGTCAAATTGAGCTGCTGCTCACCAAACTCCACTGCAATTCTGGACCACTCTGACATGATCACTCCTTTGCGTCTTTCCTTTTTTGGGGGTTT。
2.根据权利要求1所述的新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品模板是含有插入新布尼亚病毒特异性核酸序列的PUCM-T质粒载体，该载体可在大肠杆菌JM109中增殖。
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Granted publication date: 20130814 Termination date: 20210206 |