CN105296674A - 发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105296674A
CN105296674A CN201510875067.4A CN201510875067A CN105296674A CN 105296674 A CN105296674 A CN 105296674A CN 201510875067 A CN201510875067 A CN 201510875067A CN 105296674 A CN105296674 A CN 105296674A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rpa
probe
primer
add
detecting kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510875067.4A
Other languages
English (en)
Inventor
祁贤
宋勇春
邢铮
焦永军
李志锋
汤奋扬
鲍倡俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Original Assignee
JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL filed Critical JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Priority to CN201510875067.4A priority Critical patent/CN105296674A/zh
Publication of CN105296674A publication Critical patent/CN105296674A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)反转录-重组酶多聚酶扩增(RT-RPA)检测试剂盒及其制备方法。本发明涉及的检测试剂盒由RT-RPA反应体系、RNA酶抑制剂、SFTS病毒L片段阳性质粒Puc-L、阴性质控品、L片段RPA引物和exo探针组成。用特异性引物和探针，通过配制RT-RPA反应体系，置入Twista实时荧光检测仪进行实时荧光检测，建立了一种快速、敏感、特异的发热伴血小板减少综合征病毒等温实时荧光核酸检测方法。本发明涉及特异性RPA引物和exo探针在发热伴血小板减少综合征病毒感染临床鉴别诊断和病毒分离株鉴定中的用途。

Description

发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒及制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种发热伴血小板减少综合症病毒反转录-重组酶多聚酶扩增(RT-RPA)检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
发热伴血小板减少综合征病毒(severefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus，SFTSV)属于布尼亚病毒科，是近年来在我国新发现一种可引起出血性疾病的病毒。该病毒基因组包括大(L)、中(M)、小(S)3个单股负链RNA片段。其中L片段编码RNA依赖的RNA聚合酶；M片段编码糖蛋白Gn和Gc；S片段以双向的方式编码病毒核蛋白N和非结构蛋白NSs。病毒主要分布山区和丘陵地带的农村，呈散发，人群普遍易感。感染患者临床表现为发热，伴乏力、恶心、呕吐等，部分病例有头痛、肌肉酸痛、腹泻等。绝大部分患者预后良好，但部分病例病情危重，出现意识障碍、皮肤瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭、弥漫性血管内凝血等多脏器功能衰竭死亡，重症死亡率高达15-30％。目前在我国的河南、湖北、山东、安徽、辽宁、江苏、浙江等地都发现了SFTS病例。近期在日本、韩国和美国都发现了由SFTS相关病毒引起的病例，表明病毒的分布范围较广，SFTS已成为威胁人类健康和公共卫生的重要新发传染病。
SFTSV感染引起临床症状很难与其它病原(如汉坦病毒、无形体、流感病毒等)感染相区别，因此实验室诊断具有重要意义。目前实验室诊断方法主要有病毒分离、血清学方法和核酸检测方法等。病毒分离耗时费力，且试验操作的生物安全要求高，一般实验室难以开展。检测特异性IgG抗体的血清学方法适合回顾性诊断和流行病学调查，不适合早期诊断。目前核酸检测方法主要包括普通PCR法、Real-timetimePCR法和环等温扩增(LAMP)法等。Real-timetimePCR法和LAMP法具有很好的特异性和敏感性，但前者依赖昂贵的仪器和试剂；而后者由于交叉污染很容易出现假阳性。因此，需要建立一种快速、敏感、特异、便于现场应用的核酸分子检测方法，以提高病毒监测和临床诊断水平。
发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种发热伴血小板减少综合症病毒反转录-重组酶多聚酶扩增(RT-RPA)检测试剂盒及其制备方法。
本发明提供的发热伴血小板减少综合症病毒RT-RPA检测试剂盒由RT-RPA反应体系、L片段阳性质粒Puc-L、阴性质控品、L片段RPA引物和exo探针组成。
L片段RPA引物和exo探针为：
L-F，5`-TCTATAAACATAAACTCATCCAATGATGCCAAG-3'；
L-S，5`-ATCAGATGACCTAGACTCAGATTTAGAACTGA-3`；
L-exo-probe,5`-TTGGTTCATGCCAGCCAAATTCCACAGAT[dT-FAM]CA[THF]T[dT-BHQ]GGGCTGCCATTTCCATG[3`-block]-3`。
本发明所述发热伴血小板减少综合征病毒RT-RPA检测试剂盒的制备方法：
(1)病毒核酸提取：采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：取临床血清标本或病毒培养物核酸100μL，加入含有200ul水饱和酚的1.5mlEP中，剧烈震荡混匀，静置3min，加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g室温离心15分钟；吸取上清液，加入两倍上清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积3M醋酸钠约40ul，充分混匀后-20℃静置2h；取出于4℃下，12000g，离心20min；弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，12000g，离心20min；弃上清，室温干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA，-70℃冰箱放置备用；
(2)RT-RPA反应：采用英国TwistDx公司的TwistAmpRTexos试剂盒，取29.5μL反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-RPAF(10mM)和L-RPAR(10mM)各2.1μL，2.6μLRPAexo探针(10mM),1μLRNA酶抑制剂(5U),7.2μL超纯水，5μL标本RNA模板，涡旋震荡，短暂离心，再加入2.5μL醋酸镁(280mM)。混合离心后，放入Twista实时荧光检测仪中，反应温度为40℃，时间为20min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
设计针对L片段RPA引物和exo探针，通过反转录-重组酶多聚酶扩增方法，反应温度为40℃等温条件下，20min即可对临床上发热伴血小板减少综合症病毒标本和病毒分离物进行核酸分子鉴定，无需昂贵仪器设备，便于操作，具有快速、敏感、特异等特点，为发热伴血小板减少综合症病毒监测和临床救治提供一种新的检测方法。
附图说明
图1检测SFTS病毒L片段RPA引物琼脂糖凝胶电泳筛选
具体实施方式
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。
实施例1：靶基因质粒构建
设计L片段的特异性引物(F2705:5'TGGAAGGCAGTTCTGGATGACGG3'；R3594：3'GTAAAGGTGTCCGTGAACCAATC5')，通过PCR法扩增获得890bp核苷酸片段，回收纯化后的与T载体连接，获得靶基因阳性质粒，命名为Puc-L。
实施例2：引物探针设计与筛选
通过序列分析软件分析，以SFTSV病毒较为保守的L片段2945-3154间序列为模板，共设计8条正向引物和9条反向引物，引物长度为30-35bp；同时设计1条exo探针(命名为L-exo-probe)，长度为52bp，其中30位碱基T标记荧光物质FAM，33位碱基T由四氢呋喃代替，35位碱基标记荧光物质BHQ，同时封闭3`末端碱基。
采用TwistAmpBasickit(TwistDx公司，英国)，以靶基因克隆质粒Puc-L为模板，以琼脂糖凝胶电泳为结果指示手段，对上述设计的引物进行筛选。引物优劣的评价指标包括特异性、敏感性、扩增效率和引物噪音等。取29.5μL反应缓冲液，分别加入下列组分：上下游引物(10mM)各2.4μL，12.2μL超纯水，1μL质粒Puc-L模板。再加入2.5μL醋酸镁(280mM)。混合离心后，放入40℃，温育5min。涡旋震荡8-10次，短暂离心，放入放入40℃，反应20min。取反应产物2ul放入18ul水中，用酚-氯仿法对DNA进行纯化。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测纯化DNA产物，结果筛选到一组引物，命名为L-F和L-R(图1)。
实施例3：RT-RPA的敏感性
将靶基因克隆质粒Puc-Ls稀释100倍，再按10倍梯度稀释成10-2-10-9共八个浓度，以此为模板，进行RT-RPA反应：采用TwistAmpRTexos试剂盒(TwistDx公司，英国)。取29.5μL反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-RPAF(10mM)和L-RPAR(10mM)各2.1μL，2.6μLRPAexo探针(10mM),1μLRNA酶抑制剂(5U),7.2μL超纯水，5μL标本RNA模板。涡旋震荡8-10次，短暂离心。再加入2.5μL醋酸镁(280mM)。混合离心后，放入Twista实时荧光检测仪中，反应温度为40℃，时间为20min。
本实验中所建立的RT-RPA方法可以检测下限是10copies/μL，具有较好的敏感性。
实施例4：RT-RPA的特异性
以汉坦病毒、登革热病毒、呼吸道冠状病毒、鼻病毒、呼吸道合胞体病毒、甲型流感病毒和乙型流感核酸为模板，用设计的RPA引物和exo探针进行RT-RPA实验。结果对上述毒核酸都没有荧光信号检出，表明建立的RT-RPA方法具有较好的特异性。。
实施例5：临床标本检测
收集94份发热伴血小板减少综合征病毒感染临床样本，所有标本都通过细胞培养进行病毒分离。
(1)病毒RNA提取
采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：1.取血清标本100μL，加入含有200ul水饱和酚的1.5mlEP中，剧烈震荡混匀，静置3min，加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g室温离心15分钟。2.吸取上清液，加入两倍上清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积3M醋酸钠约40ul，充分混匀后-20℃静置2h；取出于4℃下，12000g，离心20min。3.弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，12000g，离心20min。4.弃上清，室温干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA。
(2)RT-RPA反应：采用公司的TwistAmpRTexos试剂盒(TwistDx公司，英国)。取29.5μL反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-RPAF(10mM)和L-RPAR(10mM)各2.1μL，2.6μLRPAexo探针(10mM),1μLRNA酶抑制剂(5U),7.2μL超纯水，5μL标本RNA模板。涡旋震荡，短暂离心。再加入2.5μL醋酸镁(280mM)。混合离心后，放入Twista实时荧光检测仪中，反应温度为40℃，时间为20min。
结果94份临床样本，RT-RPA检测阳性的有76份，阴性18份，结果与病毒分离结果完全一致。

Claims (2)

1.一种基于反转录-重组酶多聚酶扩增的发热伴血小板减少综合征病毒检测试剂盒，其特征是试剂盒由RT-RPA反应体系、RNA酶抑制剂、L片段阳性质粒Puc-L、阴性质控品、L片段RPA引物和exo探针组成，L片段RPA引物和exo探针为：
L-F，5`-TCTATAAACATAAACTCATCCAATGATGCCAAG-3'；
L-S，5`-ATCAGATGACCTAGACTCAGATTTAGAACTGA-3`；
L-exo-probe,5`-TTGGTTCATGCCAGCCAAATTCCACAGAT[dT-FAM]CA[THF]T[dT-BHQ]GGGCTGCCATTTCCATG[3`-block]。
2.根据权利要求1所述一种基于反转录-重组酶多聚酶扩增的发热伴血小板减少综合征病毒检测试剂盒的制备方法，其特征是由以下步骤构成：
(1)病毒核酸提取：采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：取临床血清标本或病毒培养物核酸100μL，加入含有200ul水饱和酚的1.5mlEP中，剧烈震荡混匀，静置3min，加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g室温离心15分钟；吸取上清液，加入两倍上清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积3M醋酸钠35-45ul，充分混匀后-20℃静置2h；取出于4℃下，12000g，离心20min；弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，12000g，离心20min；弃上清，室温干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA，-70℃冰箱放置备用；
(2)RT-RPA反应：采用TwistAmpRTexos试剂盒，取29.5μL反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-RPAF10mM和L-RPAR10mM各2.1μL，2.6μLRPAexo探针10mM,1μLRNA酶抑制剂5U,7.2μL超纯水，5μL标本RNA模板；涡旋震荡，短暂离心，再加入2.5μL醋酸镁280mM。混合离心后，放入Twista实时荧光检测仪中，反应温度为40℃，时间为20min。
CN201510875067.4A 2015-12-03 2015-12-03 发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒及制备方法 Pending CN105296674A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510875067.4A CN105296674A (zh) 2015-12-03 2015-12-03 发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510875067.4A CN105296674A (zh) 2015-12-03 2015-12-03 发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒及制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105296674A true CN105296674A (zh) 2016-02-03

Family

ID=55194493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510875067.4A Pending CN105296674A (zh) 2015-12-03 2015-12-03 发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105296674A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200047384A (ko) 2018-10-24 2020-05-07 국립감염증연구소장이 대표하는 일본국 중증열성혈소판감소증후군(sfts) 바이러스 검출용 프라이머 세트
KR20200048076A (ko) * 2018-10-29 2020-05-08 주식회사 스콜피오진 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트
CN111197110A (zh) * 2020-01-16 2020-05-26 浙江农林大学 用于检测猫泛白细胞减少症病毒的rpa-fld方法
CN111424117A (zh) * 2020-04-23 2020-07-17 舟山医院 一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光rt-raa检测试剂盒
WO2021034143A1 (ko) * 2019-08-22 2021-02-25 연세대학교 원주산학협력단 중증 열성 혈소판 감소증후군 바이러스 유래 면역원성 폴리펩타이드 단편 및 이의 용도
WO2021040245A1 (ko) * 2019-08-29 2021-03-04 조선대학교산학협력단 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 이를 이용한 중증열성혈소판감소증후군의 진단방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102634604A (zh) * 2012-02-06 2012-08-15 河南省疾病预防控制中心 新布尼亚病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒
CN104673933A (zh) * 2015-01-14 2015-06-03 浙江省疾病预防控制中心 新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法及试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102634604A (zh) * 2012-02-06 2012-08-15 河南省疾病预防控制中心 新布尼亚病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒
CN104673933A (zh) * 2015-01-14 2015-06-03 浙江省疾病预防控制中心 新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法及试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙魁等: "重组酶聚合酶扩增技术的研究进展", 《军事医学》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200047384A (ko) 2018-10-24 2020-05-07 국립감염증연구소장이 대표하는 일본국 중증열성혈소판감소증후군(sfts) 바이러스 검출용 프라이머 세트
KR20200048076A (ko) * 2018-10-29 2020-05-08 주식회사 스콜피오진 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트
KR102238561B1 (ko) * 2018-10-29 2021-04-12 주식회사 스콜피오진 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트
WO2021034143A1 (ko) * 2019-08-22 2021-02-25 연세대학교 원주산학협력단 중증 열성 혈소판 감소증후군 바이러스 유래 면역원성 폴리펩타이드 단편 및 이의 용도
WO2021040245A1 (ko) * 2019-08-29 2021-03-04 조선대학교산학협력단 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 이를 이용한 중증열성혈소판감소증후군의 진단방법
CN111197110A (zh) * 2020-01-16 2020-05-26 浙江农林大学 用于检测猫泛白细胞减少症病毒的rpa-fld方法
CN111424117A (zh) * 2020-04-23 2020-07-17 舟山医院 一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光rt-raa检测试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105296674A (zh) 发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒及制备方法
Zhao et al. Development of a multiplex TaqMan probe-based real-time PCR for discrimination of variant and classical porcine epidemic diarrhea virus
CN108676920B (zh) 一种快速检测小鼠诺如病毒引物、试剂盒及其rt-rpa方法
CN105296673A (zh) 一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法
CN110699489B (zh) 非洲猪瘟病毒cd2v基因的实时荧光pcr检测引物探针组、试剂盒及方法
CN103397105B (zh) 一种检测gii型诺如病毒的试剂盒及其用途
CN105018485A (zh) 一种应用rpa技术检测小反刍兽疫病毒的引物和探针
CN106884012A (zh) 用于检测6种呼吸道病毒的lamp引物组合及其应用
Zhu et al. Multiplex and visual detection of African Swine Fever Virus (ASFV) based on Hive-Chip and direct loop-mediated isothermal amplification
CN104862425A (zh) 鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式rt-pcr检测试剂盒
CN103993101A (zh) 一种同时检测人的冠状病毒229e、oc43、nl63的方法及试剂盒
Tao et al. Detection of enteroviruses in urban sewage by next generation sequencing and its application in environmental surveillance
CN110669870A (zh) 一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量rt-pcr检测引物、探针及检测试剂盒
CN104032035A (zh) 一种同时检测人的ⅰ型、ⅱ型及ⅲ型副流感病毒的方法及试剂盒
CN110714098A (zh) 一种用于检测猫杯状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的组合物、试剂盒及其应用
CN105002298B (zh) 一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量pcr检测方法
CN103993105B (zh) 鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重pcr检测试剂盒
CN102251061A (zh) 甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光pcr检测试剂盒
EP2268800B1 (en) A newly identified human rhinovirus of hrv-c and methods and kits for detecting hrv-cs
CN114317837A (zh) 一种用于检测18种病原体的多重pcr引物和探针组合及其应用
CN102286639A (zh) 甲型h1n1/甲型流感病毒核酸双重荧光pcr检测试剂盒
CN103525950B (zh) 一种用于鉴别cva6和非cva6肠道病毒的rt-pcr引物对及其应用
CN105296675A (zh) 一种乙型流感病毒核酸检测试剂盒及其制备方法
CN103993102A (zh) 一种同时检测人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的方法及试剂盒
CN110643740A (zh) 帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量rt-pcr检测引物、探针及检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160203