CN114317837A - 一种用于检测18种病原体的多重pcr引物和探针组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测18种病原体的多重PCR引物和探针组合及其应用。本发明以甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人副流感病毒（区分I型，II型，III型）、肠道病毒、登革病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒为目标，研发设计得到了可用于同时检测上述18种病原体的多重PCR引物和探针组合，并在此基础上开发了相应的基因芯片和检测试剂盒。本发明设计获得的引物和探针方案的特异性强、检测范围广、结果准确性好，不仅有助于传染性病原体的防控，还可用于相应病原体的室间质评等。

Description

一种用于检测18种病原体的多重PCR引物和探针组合及其 应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域。更具体地，涉及一种用于检测18种病原体的多重PCR引物和探针组合及其应用。

背景技术

传染病是由各种病原体引起的能在人与人或人与动物之间相互传播的一类疾病。由于传染病的变异和更新周期逐渐缩短，患者的症状逐渐加重，给健康带来了极大的威胁，严重影响患者的生活质量和生命质量。因此，对传染病病原体展开及时准确的检测，有助于及时采取措施，阻止传染病的发生、传播和流行。

传染病病原体核酸检测是监测各传染病流行和早期确诊感染的重要手段，是预防传染病在我国爆发流行的必要措施。现有病原体的检测产品中，联检类产品具有筛查快递等优势。例如专利“15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合及试剂盒”中，利用开发的病原体联检引物探针组合实现了对呼吸道感染病原体的快速筛查。而针对需要长期监测的传染病病原体开发相关联检产品，有助于疾控部门或相关检测单位对未知病毒进行快速排查，便于新病毒的快速确认，预防传染病在我国爆发流行。

流行性感冒病毒（influenza virus），简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，属于正黏病毒，共有甲（A）、乙（B）、丙（C）三型。流行性感冒病毒会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速传播，严重时会造成大量死亡。

呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）属副黏病毒科肺炎属的RNA病毒，是引发病毒性肺炎最常见的病原，多见于三岁以下的婴幼儿。呼吸道合胞病毒感染的主要症状有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，后表现为细支气管炎及肺炎，少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。

人副流感病毒（Human Parainfluenza viruse，HPIVs）又名仙台病毒（SendaiVirus，SeV），属副粘病毒科，是单链的RNA病毒，也是常见的社区获得性呼吸道感染病原。根据遗传学和血清学特征，HPIV可分为人副流感病毒I型、人副流感病毒II型、人副流感病毒III型和人副流感病毒IV型。在临床上四个型别各自有不同的感染后症状，Ⅰ型可引起严重的喉炎（假膜性喉炎）、气管炎或支气管炎；Ⅱ型与Ⅰ型引起病症的临床表现相似，但不严重，只有在感染2～4岁儿童时才可发生严重的感染病例。感染Ⅰ型和Ⅱ型病毒的另一个表现就是起病较急，会出现鼻塞、流涕、咽痛等症状，严重的话还会发生喉梗阻。Ⅲ型是仅次于呼吸道合胞病毒的婴儿支气管炎和肺炎的病原体，常引起婴幼儿细支气管和肺炎，也可导致假膜性喉炎。Ⅳ型引起的病症较轻，多引起成人和儿童的上呼吸道感染，通常不引起肺炎。因此，区分这四种型别的人副流感病毒来辅助临床医生是很有必要的。

鼻病毒（rhinovirus，HRV）本身为无包膜的二十面体结构，基因组长7.2～8.5kb，为单链正向RNA基因组。HRV分类上属小RNA病毒科，全年均有感染发生，在春秋季高发，人群普遍易感。鼻病毒主要传播途径是通过带有鼻病毒的飞沫、气溶胶经呼吸道或人与人接触传播，是普通感冒的重要病原体。对于儿童和患有呼吸道基础疾病的易感群体，HRV感染后还可能会出现较为严重的后遗症。

人肠道病毒（enterovirus，EV）属小RNA病毒科，包括小儿麻痹病毒（血清型1-3），柯萨奇病毒A（血清型1-22，24），柯萨奇病毒B（血清型1-6），埃可病毒（血清型1-9，11-27，29-31）及新肠道病毒（血清型68-71）。肠道病毒感染的最普遍症状是非特异性发热，有时伴随出疹，引发的急性病毒综合症主要包括脑炎、心肌炎、出血性结膜炎、手足口综合症、流行性胸痛、不可逆性新生儿脓血症、脓毒血症等。EV可在肠道内高滴度复制，经血液传播到各器官，引发急性肠道病毒综合症，导致严重后果。

登革热、黄热和西尼罗热三种疾病是威胁热带或亚热带国家人民健康的重要虫媒病毒性传染病，分别因感染登革热病毒（Dengue virus，DV）、黄热病毒（Yellow fevervirus，YFV）、西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）所引起。登革热、黄热、西尼罗热三种疾病都是通过带毒蚊子叮咬人而传播，三者发病初期症状极其相似，难以鉴别，并且具有传染快、易流行等特点。为有效防控上述虫媒病毒性疾病的发生与传播，在疾病发生早期实行快速诊断是一个重要的环节，而对于各出入境口岸来说，在不影响入境人员和货物快速通关前提下，如能在有效时间内，实现对人员以及船舱、货物中可能携带的蚊子进行快速筛查；同时，快速检测各口岸周边环境中蚊子携带病毒情况、建立有效防控网络，以防上述病毒的传入，将具有非常重大的意义。

圣路易斯脑炎病毒是有包膜的线性单股正链RNA病毒，具有高传染性，一经流行将引发巨大社会恐慌。因此，研制快速高效的诊断试剂对于防止圣路易斯脑炎感染具有重要意义。

东马脑炎病毒、西马脑炎病毒和委内瑞拉马脑炎病毒属典型的人兽共患病毒性疾病，临床表现与乙型脑炎很相似，病死率可达35%左右。目前被国际社会列为防生物恐怖的主要种类之一，国内属一类管理的病毒种类，备受关注。

蜱传脑炎是由森林脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus，TBEV）所致的一种的以侵袭中枢神经统为主的自然疫源性急性传染病，临床上以发热，神经症状为特征，有时出现瘫痪后遗症。

尼帕病毒（Nipah virus，NIV）属于副黏病毒科、亨尼帕病毒属，因其相对较新发现并且高致病性被列为生物安全四级病毒，能引起人类急性严重呼吸道疾病和脑炎，致死率为40%～70%。

亨德拉病毒（HendraVirus，HeV）是一种新的人畜共患病毒性疾病病毒，属于副黏液病毒科（Paramyxoviridae），人感染此病毒会因肾衰竭，呼吸系统会受到影响然后无法呼吸导致死亡。

上述流行、急性或烈性传染病原体的传染性强，部分病毒具有相似的临床症状和流行特征。然而，通过临床症状和常规的实验室检测很难鉴别确定所感染的病毒种类，而且病毒的培养条件较苛刻，造成培养阳性率低，甚至有些病毒在目前条件下尚不能培养，这给感染患者及临床医生带来很大困扰。因此，亟需一种简便、快速、特异性强的可同时检测多种传染病病原体的产品和方法，以便及早明确病原，及早诊断以及合理指导临床用药。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有尚未有可同时检测甲型流感病毒（Flu-A）、乙型流感病毒（Flu-B）、呼吸道合胞病毒（RSV）、鼻病毒（HRV）、人副流感病毒I型（HPIV I）、人副流感病毒II型（HPIV II）、人副流感病毒III型（HPIV III）、肠道病毒（EV）、登革病毒（DV）、东部马脑炎病毒（EEEV）、西部马脑炎病毒（WEEV）、委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）、森林脑炎病毒（TBEV）、圣路易斯脑炎病毒（SLEV）、西尼罗病毒（WNV）、黄热病毒（YFV）、尼帕病毒（NIV）或亨德拉病毒（HeV）的产品的不足，提供一种用于检测上述18种病原体的多重PCR引物和探针组合及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种用于检测18种病原体的多重PCR引物和探针组合。

本发明的第二个目的是提供上述多重PCR引物和探针组合在制备用于检测所述18种病原体的产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测所述18种病原体的基因芯片。

本发明的第四个目的是提供一种用于检测所述18种病原体的试剂盒。

本发明的第五个目的是提供一种以非疾病诊断为目的的检测所述18种病原体的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明以甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人副流感病毒（I型、II型、III型）、肠道病毒、登革病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒代表株，这18种病原体的核苷酸序列为目标，通过多序列对比与分析，设计了可用于检测上述病原体的多重PCR引物和探针。同时，还设计了内标引物、内标探针以及显色体系控制探针，用于监测样本的采集和提取过程，避免假阴性结果。

本发明提供了一种用于检测18种病原体的多重PCR引物和探针组合，包括如下组分：

（1）用于检测甲型流感病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，其探针序列如SEQ ID NO.29所示；

（2）用于检测乙型流感病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.3～4所示，其探针序列如SEQ ID NO.30所示；

（3）用于检测呼吸道合胞病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.5～6所示，其探针序列如SEQ ID NO.31所示；

（4）用于检测鼻病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.7～8所示，其探针序列如SEQ ID NO.32所示；

（5）用于检测人副流感病毒I型的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.9～10所示，其探针序列如SEQ ID NO.33所示；

（6）用于检测人副流感病毒II型的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.11～12所示，其探针序列如SEQ ID NO.34所示；

（7）用于检测人副流感病毒III型的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.13～14所示，其探针序列如SEQ ID NO.35所示；

（8）用于检测肠道病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.15～16所示，其探针序列如SEQ ID NO.36所示；

（9）用于检测登革病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.17～18所示，其探针序列如SEQ ID NO.37所示；

（10）用于检测东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒的引物和探针，其引物序列均如SEQ ID NO.19～20所示，用于检测东部马脑炎病毒的探针序列如SEQID NO.38所示，检测西部马脑炎病毒的探针序列如SEQ ID NO.39所示，检测委内瑞拉马脑炎病毒的探针序列如SEQ ID NO.40所示；

（11）用于检测森林脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒的引物和探针，其引物序列均如SEQ ID NO.21～22所示，用于检测森林脑炎病毒的探针序列如SEQ ID NO.41所示，检测圣路易斯脑炎病毒的探针序列如SEQ ID NO.42所示；

（12）用于检测西尼罗病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.23～24所示，其探针序列如SEQ ID NO.43所示；

（13）用于检测黄热病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.25～26所示，其探针序列如SEQ ID NO.44所示；

（14）用于检测尼帕病毒、亨德拉病毒的引物和探针，其引物序列均如SEQ IDNO.27～28所示，用于检测尼帕病毒的探针序列如SEQ ID NO.45所示，检测亨德拉病毒的探针序列如SEQ ID NO.46所示。

由于本发明所述多重PCR引物和探针组合具有相近的Tm值，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性显著增加。本发明所述多重PCR引物和探针组合能够一次性对多种流行、急性或烈性传染病病原体进行检测，检测病原体种类多且检测特异性强，检测结果准确。因此，本发明申请保护所述多重PCR引物和探针组合在制备用于检测上述18种病原体的产品中的应用。

具体地，所述病原体为甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人副流感病毒I型、人副流感病毒II型、人副流感病毒III型、肠道病毒、登革病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒中的一种或几种。

优选地，本发明所述多重PCR引物和探针组合还包括内标引物和内标探针，所述内标引物的序列如SEQ ID NO.47～48所示，所述内标探针的序列如SEQ ID NO.49所示。

此外，本发明设计的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肠道病毒、登革病毒多重PCR引物探针为相应病毒的通用型引物探针；其中，甲型流感病毒引物探针可检测H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2；乙型流感病毒引物探针可检测Yamagata和Victoria；呼吸道合胞病毒引物探针可检测呼吸道合胞病毒A型和B型；鼻病毒引物探针可检测鼻病毒A、B、C型；肠道病毒引物探针可检测柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型；登革热病毒引物探针可检测登革热病毒1、2、3、4型。

因此，本发明还申请保护所述多重PCR引物和探针组合在制备用于鉴定验证检测H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2、Yamagata、Victoria、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、鼻病毒A型、鼻病毒B型、鼻病毒C型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、登革病毒1型、登革病毒2型、登革病毒3型或登革病毒4型的产品中的应用。

本发明还提供了一种用于检测上述18种病原体的基因芯片，所述芯片的固定载体上包含本发明所述多重PCR引物和探针组合中的探针序列，其中用于检测病原体的探针序列依次如SEQ ID NO.29～46所示。

优选地，本申请所述基因芯片中还含有SEQ ID NO.49所示内标探针序列以及标记有生物素点的显色体系控制探针，用于监测样本的采集和提取过程，避免假阴性结果，所述显色体系控制探针的序列如SEQ ID NO.50所示。

具体地，所述基因芯片上的探针的5′或3′端均进行了氨基化处理。

具体地，所述固定载体为硝酸纤维素、醋酸纤维素、玻璃片、硅胶晶片、尼龙膜、聚丙烯膜或微缩磁珠。

优选地，所述固定载体为尼龙膜，见实施例2。

本发明还提供了一种用于检测上述18种病原体的试剂盒，所述试剂盒中含有SEQID NO.1～28所示多重PCR引物、SEQ ID NO.47～48所示内标引物以及本发明所述基因芯片，所述引物的5’端均结合有标记物。

具体地，所述标记物为生物素。

本发明所述试剂盒中还含有RT-PCR检测体系（RT-PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、酶混合液）和灭菌注射水。

上述RT-PCR检测体系包含UNG酶和dUTP，作为防污染措施，将可能存在的PCR产物污染充分降解，避免引起的假阳性结果。

本发明所述基因芯片或试剂盒的检测原理为：将探针结合于固相载体上用于和靶序列核酸杂交而捕捉样品；样品（经引物对扩展后的样品）流经置放于导流杂交装置的固相载体，其中的靶序列和探针杂交成结合体；通过检测与探针形成的复合物，若为阳性结果则提示样品中含有待测靶核酸序列。

具体地，可以采用导流杂交仪对扩增产物进行导流杂交（flow-throughhybridization），然后通过化学显色对结果进行判读，以此对传染病病原体进行诊断。

本发明还提供了一种以非疾病诊断为目的的检测上述18种病原体的方法，其包含以下步骤：

S1.释放待测样本的核酸；

S2.以S1所得核酸为模板，使用SEQ ID NO.1～28所示多重PCR引物和SEQ IDNO.47～48所示内标引物进行RT-PCR；

S3.利用基因芯片对RT-PCR扩增产物进行杂交，通过化学显色对结果进行判读。

显色结束后，若基因芯片上内标探针（IC）和探针均呈现深蓝色斑点且无非特异结果出现，则表明探针已检出提取样本中所含有的特异性序列，表示其对应病原体的检测结果为阳性。

所述样本可以为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液或血液。

具体地，PCR扩增程序为：50℃逆转录15 min，95℃热启动2 min，95℃变性30 sec、55℃退火30 sec、72℃延伸30 sec，共35个循环，最后一步72℃延伸5 min。

具体地，步骤S3中所述杂交为导流杂交。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种特异性强的多重PCR引物和探针组合，可用于同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人副流感病毒（区分检测I型，II型，III型）、肠道病毒、登革病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、尼帕病毒或亨德拉病毒，便于病原体的快速筛查，且操作简单，耗时短。同时，本发明所述引物和探针组合中各探针的Tm值相近，故将其制成基因芯片进行检测时，病原体核酸PCR扩增产物与相应探针杂交时最适温度条件基本一致，不会因为温度问题影响杂交结果；同时设置了内控系统来监测样本的采集和提取过程，避免了假阴性结果，检测准确性好。在所述多重PCR引物和基因芯片的基础上，本发明还提供了相应的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包含UNG酶和dUTP防污染措施，能将可能存在的PCR产物污染充分降解，避免引起的假阳性结果。

本发明所述多重PCR引物和探针组合，所述基因芯片以及对应检测试剂盒不仅有助于传染性病原体的防控，还可用于相应病原体的室间质评等。

附图说明

图1为本发明所述基因芯片中各病原体检测探针的排列顺序图。

图2为利用所述引物和探针对Flu-A、Flu-B、RSV和HRV假病毒的灵敏度检测结果。

图3为利用所述引物和探针对EV、HPIVI、HPIVII和HPIVIII假病毒的灵敏度检测结果。

图4为利用所述引物和探针对DV、EEEV、WEEV、VEEV和TBEV假病毒的灵敏度检测结果。

图5为利用所述引物和探针对SLEV、WNV、YFV、NIV和HeV假病毒的灵敏度检测结果。

图6为利用所述引物和探针对未稀释核酸的假病毒的检测结果。

图7为利用本发明所述试剂盒对不同未稀释核酸的假病毒混合样本的检测结果；其中，第一行第一幅图为甲流病毒/乙流病毒混合样本的检测结果，第一行第二幅图为鼻病毒/肠道病毒混合样本的检测结果，第一行第三幅图为登革热病毒/森林脑炎病毒混合样本的检测结果，第二行第一幅图为东部马脑炎/西部马脑炎/委内瑞拉马脑炎病毒混合样本的检测结果，第二行第二幅图为尼帕病毒/亨德拉病毒混合样本的检测结果。

图8为利用本发明所述试剂盒对H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2的检测结果。

图9为利用本发明所述试剂盒对Yamagata和Victoria的检测结果。

图10为利用本发明所述试剂盒对呼吸道合胞病毒A型和B型的检测结果。

图11为利用本发明所述试剂盒对鼻病毒A、B和C型的检测结果。

图12为利用本发明所述试剂盒对柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型的检测结果。

图13为利用本发明所述试剂盒对登革热病毒1、2、3和4型的检测结果。

注：图2～5中，从上至下的检测浓度依次为1000、500和250 copies/反应。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 多重PCR引物和探针组合

本发明以甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人副流感病毒（I型、II型、III型）、肠道病毒、登革病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒代表株，这18种病原体的核苷酸序列为目标，在NCBI数据库中下载了上述传染病病原体代表株的核苷酸序列，通过多序列对比与分析，设计了可用于检测上述病原体的多重PCR引物和探针，同时还设计了内标引物、内标探针以及显色体系控制探针，用于监测样本的采集和提取过程，避免假阴性结果。

本发明共设计了32对引物，53条探针；经过特异性、灵敏性等检测效果的考察，最终得到表1所示的多重PCR引物及内标引物，以及表2所示的特异性探针、内标探针及显色体系控制探针，其相关实验与数据如下文实施例2～5。

表1 引物核苷酸序列

表2 探针核苷酸序列

注：Bio为显色体系控制探针。

实施例2 基因芯片及检测试剂盒

在实施例1所述多重PCR引物及探针的基础上，本发明开发了用于检测上述18种病原体的基因芯片及检测试剂盒。所述基因芯片包括固定载体和固定在固定载体上的病原体特异性探针，即SEQ ID No.29～46所示探针序列，此外还含有SEQ ID No.49所示内标探针序列和SEQ ID No.50所示显色体系控制探针序列，探针交由引物合成厂家（上海捷瑞生物工程有限公司）合成并修饰，所述探针的5′和3′端均进行了氨基化处理（氨基基团Amino），所述显色体系控制探针上标记有生物素点。

1、基因芯片的制备

（1）探针的排列

此实施例中，本发明制备基因芯片所用固定载体为尼龙膜，将其划分为20个小格，各病原体特异性探针在基因芯片上的具体分布位置如图1所示，基因芯片的20个格子中，每个位点每个格子对应一条探针。

（2）尼龙膜的处理

对尼龙膜进行处理，首先将其放入0.1M 的HCl溶液中浸泡30秒钟，然后把已除去残余溶液的膜放入20%的EDAC溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200 mL纯化水冲洗10秒钟，重复此步骤3次，放到吸水纸上除去多余的残液；将膜转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时；将已烘干的尼龙膜用Kimwipes纸隔开，转入封口薄膜袋中，贮藏在4℃的温度下，备用。

（3）点样

将合成所得的DNA探针（表2所示探针）用探针稀释液（pH8.4的0.5M Na₂CO₃和0.5MNaHCO₃的溶液）溶解混合后进行点样；启动点样装置，在芯片制作程序的控制下，进行DNA探针的打印；通过DNA打印针每次取一个DNA探针，通过三维定点传递装置将DNA探针传递到指定的点样位置；完成一次打印后，荷样打印针清洗、干燥，进行下一轮探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。

本发明通过微量移液设备将上述制备好的探针分别点在上述的尼龙膜上，每滴0.4 μL；点膜结束后，将膜放置于室温15分钟进行反应；然后将膜转入0.1M NaOH溶液中浸泡10分钟，停止反应；将洗好的膜转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时，即制得基因芯片。

2、检测试剂盒

本发明还提供了一种用于检测上述18种病原体的试剂盒，所述试剂盒中含有表1所示引物对1～15、制备所得基因芯片、RT-PCR检测体系（RT-PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、酶混合液）和灭菌注射水；试剂盒中所有引物对的5’端均标记有生物素。

本发明所述试剂盒中设置了内控系统，用于监测样本采集、提取过程，避免假阴性结果。

上述PCR检测体系包含UNG酶和dUTP防污染措施，可以将可能存在的PCR产物污染充分降解，避免引起的假阳性结果。

实施例3 传染病病原体的检测方法

本发明以实施例2所述试剂盒为例，简述利用所述试剂盒进行的以非疾病诊断为目的的检测所述18种病原体的方法。

具体如下：

（1）释放待测样本的核酸；

（2）RT-PCR扩增；

利用试剂盒中所述引物对1～15对待测样品进行RT-PCR扩增，PCR反应液体积为45μL，DNA加样量为5 μL，总反应体积为50 μL。PCR扩增的反应体系如表3所示：

表3 多重PCR反应体系

注：Q-solution为基因扩增的辅助试剂，引物的5’端均标记有荧光素，酶混合液包含Taq酶、逆转录酶、UNG酶和RNA酶抑制剂。

PCR扩增程序为：50℃逆转录15 min，95℃热启动2 min，95℃变性30 sec、55℃退火30 sec、72℃延伸30 sec，共35个循环，最后一步72℃延伸5 min。

本发明可以在同一个条件下扩增多种传染病病原体，减少了PCR试剂的用量以及PCR仪的需求量，减少了操作步骤，降低了成本。

（3）利用基因芯片进行检测；

将获得的扩增产物在95℃下变性5～10分钟，然后迅速转移到冰水混合物中放置2分钟，加入预先温浴到45℃的杂交液（2×SSC/0.1%SDS）0.5 mL，混合后加入杂交仪的反应孔中，应用于制得的基因芯片；45℃杂交15分钟，然后用溶液WB1（0.5×SSC/0.1%SDS，42℃温浴）清洗3～4遍；加入0.5 mL封阻液（0.25%脱脂奶粉，0.05%硫柳汞），25℃封闭5分钟；抽干后加入0.5 mL的酶标液（TBS中溶解的带有链霉亲和素标记的AP酶），酶标5分钟；用0.8mL溶液A（TBS，0.1% Tween20及0.05%叠氮钠）清洗4遍，然后加入0.5 mL的显色液（NBT/BCIP），避光显色5分钟；最后用溶液B冲洗3遍，晾干，分析显色情况。

（4）结果判读；

若基因芯片上，内标探针（IC）和探针均呈现深蓝色斑点且无非特异结果出现，则表明探针已检出提取样本中所含有的特异性序列，表示其对应病原体的检测结果为阳性。

实施例4 灵敏度和准确性测试

本发明利用甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人副流感病毒（I型、II型、III型）、肠道病毒、登革病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒的假病毒，对本发明所述引物和探针组合的检测灵敏度和准确性进行了测试。

其中，甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒（I型、II型、III型）、肠道病毒和登革病毒假病毒采购自广州邦德盛生物科技有限公司。

另通过上海捷瑞生物工程有限公司合成含鼻病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒的目的片段的质粒，同时合成人类内参B2M目的片段质粒，用于制备假病毒颗粒。

假病毒颗粒的制备：

用内切酶BamH I和Hind III分别对pET-MS质粒、含靶基因和内参基因目的片段的质粒进行双酶切，37℃酶切过夜；酶切后利用T4连接酶使pET-MS载体大片段分别与靶基因和内参基因目的片段进行连接；连接产物转化至大肠杆菌BL21中，并加入终浓度为0.05mmol/L的IPTG，28℃，180～200转/分钟过夜诱导表达，之后通过离心收集菌体沉淀，用TE缓冲液洗涤并重新悬于TSM缓冲液中，进行超声破碎；将破碎完全的表达产物离心收集上清液，即为含假病毒颗粒的表达产物。

1、灵敏度测试

（1）核酸抽提

将18种待测假病毒的混合阴性样本作为人工模拟样本，使用RNA抽提试剂盒进行RNA抽提，具体步骤参照生工生物工程（上海）股份有限公司病毒RNA快速抽提试剂盒说明书进行。

（2）核酸稀释

将上述提取的样本RNA分别进行倍比稀释，使检测浓度依次为1000 copies/反应、500 copies/反应和250 copies/反应。

（3）RT-PCR扩增

参照实施例3所述反应体系和反应程序进行RT-PCR扩增。

（4）杂交

将杂交液先预热到45℃，把点入与待测病原体相应的寡核苷酸探针的尼龙膜（基因芯片）放入杂交仪中，加入杂交液；将获得的扩增产物在95℃下变性5～10分钟，迅速转移到冰水混合物中放置2分钟，加入杂交仪的反应孔中与基因芯片反应，于45℃杂交15分钟；然后用溶液WB1（0.5×SSC/0.1%SDS，42℃温浴）清洗3～4遍，加入0.5 mL封阻液，25℃封闭5分钟；抽干后加入0.5 mL的酶标液酶标5分钟；用0.8 mL溶液A清洗4遍，然后加入0.5 mL的显色液，避光显色5分钟；最后用溶液B冲洗3遍，晾干，分析显色情况，通过化学显色对结果进行判读。

（5）结果判读

若尼龙膜上，IC内标探针和对应探针均呈现深蓝色斑点且无非特异结果出现，则表明探针已检出提取样本中所含有的特异性序列，表示其对应病原体的检测结果为阳性。

18种样本梯度稀释后的灵敏度检测结果依次如图2～5所示，其中，图2为Flu-A、Flu-B、RSV和HRV样本的灵敏度检测结果，图3为EV、HPIV I、HPIV II和HPIV III样本的灵敏度检测结果，图4为DV、EEEV、WEEV、VEEV和TBEV样本的灵敏度检测结果，图5为SLEV、WNV、YFV、NIV和HeV样本的灵敏度检测结果，图2～5中，从上至下的检测浓度依次为1000、500和250 copies/反应。由图2～5所示结果可知，利用本发明所述引物和探针检测18种人工模拟样本的结果准确性良好，从核酸倍比稀释检测浓度结果可知，其最低检出限为500 copies/反应。

本发明同时对上述18种未稀释核酸的人工模拟混合样本进行了检测，以验证检测结果的特异性和准确性，结果如图6所示。由图6所示结果可知，检测结果正常，未出现非特异性结果，表明利用本发明所述引物和探针检测18种病原体的检测特异性好，检测结果准确。

实施例5 试剂盒混检测试

本发明还利用实施例2所述试剂盒对未稀释核酸的不同病毒的混合人工模拟样本进行了检测，以测试其混检效果。此实施例中以甲流病毒/乙流病毒、鼻病毒/肠道病毒、登革热病毒/森林脑炎病毒、东部马脑炎/西部马脑炎/委内瑞拉马脑炎病毒和尼帕病毒/亨德拉病毒的混合样本为例，展示混检效果，结果如图7所示；图中第一行第一幅图为甲流病毒/乙流病毒混合样本的检测结果，第一行第二幅图为鼻病毒/肠道病毒混合样本的检测结果，第一行第三幅图为登革热病毒/森林脑炎病毒混合样本的检测结果，第二行第一幅图为东部马脑炎/西部马脑炎/委内瑞拉马脑炎病毒混合样本的检测结果，第二行第二幅图为尼帕病毒/亨德拉病毒混合样本的检测结果。由图7所示结果可知，利用本发明所述试剂盒对混合样本进行检测的检测结果正常，未出现非特异性结果，表明本发明所述试剂盒可用于同时对不同病毒进行检测，且对混合样本的检测结果也准确。

实施例6 同种病毒的不同分型或分类的检测

本发明设计的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肠道病毒、登革病毒引物探针为相应病毒的通用型引物探针；其中，甲型流感病毒引物探针可检测H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2；乙型流感病毒引物探针可检测Yamagata和Victoria；呼吸道合胞病毒引物探针可检测呼吸道合胞病毒A型和B型；鼻病毒引物探针可检测鼻病毒A、B、C型；肠道病毒引物探针可检测柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型；登革热病毒引物探针可检测登革热病毒1、2、3、4型。

本发明利用所述试剂盒对上述病毒也进行了检测，鼻病毒分型假病毒的构建过程同实施例4，其余已知浓度的分型假病毒采购自广州邦德盛生物科技有限公司。检测结果如图8～13所示；其中，图8从左至右依次甲流H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2的检测结果；图9从左至右依次为Yamagata和Victoria的检测结果；图10从左至右依次为呼吸道合胞病毒A型和B型的检测结果；图11从左至右依次为鼻病毒A、B和C型的检测结果；图12从左至右依次为肠道柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型的检测结果；图13从左至右依次为登革热病毒1、2、3和4型的检测结果。由8～13所示结果可知，本发明所述试剂盒对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肠道病毒和登革病毒的不同分型或分类也可以准确检测，可用于分型病毒的鉴定验证。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 潮州凯普生物化学有限公司

广东凯普生物科技股份有限公司

广州凯普医药科技有限公司

<120> 一种用于检测18种病原体的多重PCR引物和探针组合及其应用

<160> 50

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagacaagac aatgctgaca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taacggcaat ttggacaagc 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtaactcag tcatcgt 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggataagact gccagcga 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagcattaa tgaccaatga 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catcaagtga tagatcattg tc 22

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cacttctgtt tccccgg 17

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aacacggaca cccaaagt 18

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttagggtta aagacaatcc ag 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tagccagatg tgtgtccttc 20

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggactatgaa aaccatttac ctaag 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcttctttct cagatcttgt agc 23

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cagggagcat tgtgtcat 18

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgtgtaatgc agcttgttgt tgta 24

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cctgaatgcg gctaatcc 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acrggatggc raatccaa 18

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gactagaggt tagaggagac 20

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tctgtgcctg gawtgatg 18

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tggytgaaca tggaagt 17

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

attyaggtya gccgtagag 19

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gaagaattca wagcaaargt g 21

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccacatgtac caratggc 18

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggactgggtt aacaaaggca 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccaggtgtca atatgctgtt 20

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtctggtcgt aaagctcag 19

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aaatccttga acacctcttg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aagacatacg gacgatcaag 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ggtccagttg tatgtcatct g 21

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ttaggatttg tgttcacg 18

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tctatgaacg acattcaag 19

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cagatgaagt gtctctcaa 19

<210> 32

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ccctgaatgy ggctaa 16

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

aacccgaaat gacaattc 18

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tgttcagtca ctgctatac 19

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

cccagtcata acttactcaa 20

<210> 36

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ctgcttatgg tgacaat 17

<210> 37

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

aaacagcata ttgacgc 17

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gtgaactacg tgtcacta 18

<210> 39

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gagatcatac tggcagg 17

<210> 40

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ggaacttcca tcatagtt 18

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

tcagatgagc aaaacaga 18

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gatccaaagt tctgggaa 18

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

gactagaggt tagaggaga 19

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

caaattggaa acagacct 18

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

cccagcatca aagatcaa 18

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

taccaaagac aggacaaga 19

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

gatgagtatg cctgccgtgt g 21

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

aaagcaagca agcagaattt g 21

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

cgtccaaggg gaaactgatc t 21

<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

tccaagggga aactgatct 19

Claims (10)

1.一种用于检测18种病原体的多重PCR引物和探针组合，其特征在于，包括如下组分：

（1）用于检测甲型流感病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，其探针序列如SEQ ID NO.29所示；

（2）用于检测乙型流感病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.3～4所示，其探针序列如SEQ ID NO.30所示；

（3）用于检测呼吸道合胞病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.5～6所示，其探针序列如SEQ ID NO.31所示；

（4）用于检测鼻病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.7～8所示，其探针序列如SEQ ID NO.32所示；

（5）用于检测人副流感病毒I型的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.9～10所示，其探针序列如SEQ ID NO.33所示；

（6）用于检测人副流感病毒II型的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.11～12所示，其探针序列如SEQ ID NO.34所示；

（7）用于检测人副流感病毒III型的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.13～14所示，其探针序列如SEQ ID NO.35所示；

（8）用于检测肠道病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.15～16所示，其探针序列如SEQ ID NO.36所示；

（9）用于检测登革病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.17～18所示，其探针序列如SEQ ID NO.37所示；

（10）用于检测东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒的引物和探针，其引物序列均如SEQ ID NO.19～20所示，用于检测东部马脑炎病毒的探针序列如SEQ IDNO.38所示，检测西部马脑炎病毒的探针序列如SEQ ID NO.39所示，检测委内瑞拉马脑炎病毒的探针序列如SEQ ID NO.40所示；

（11）用于检测森林脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒的引物和探针，其引物序列均如SEQID NO.21～22所示，用于检测森林脑炎病毒的探针序列如SEQ ID NO.41所示，检测圣路易斯脑炎病毒的探针序列如SEQ ID NO.42所示；

（12）用于检测西尼罗病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.23～24所示，其探针序列如SEQ ID NO.43所示；

（13）用于检测黄热病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.25～26所示，其探针序列如SEQ ID NO.44所示；

（14）用于检测尼帕病毒或亨德拉病毒的引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.27～28所示，其中用于检测尼帕病毒的探针序列如SEQ ID NO.45所示，检测亨德拉病毒的探针序列如SEQ ID NO.46所示。

2.根据权利要求1所述多重PCR引物和探针组合，其特征在于，还包括内标引物和内标探针，所述内标引物的序列如SEQ ID NO.47～48所示，所述内标探针的序列如SEQ IDNO.49所示。

3.权利要求1或2所述多重PCR引物和探针组合在制备用于检测病原体的产品中的应用，其特征在于，所述病原体为甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人副流感病毒I型、人副流感病毒II型、人副流感病毒III型、肠道病毒、登革病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒中的一种或几种。

4.一种用于检测权利要求1中所述18种病原体的基因芯片，其特征在于，所述芯片的固定载体上含有SEQ ID NO.29～46所示探针。

5.根据权利要求4所述基因芯片，其特征在于，所述芯片中还含有SEQ ID NO.49所示内标探针以及标记有生物素点的显色体系控制探针，所述显色体系控制探针的序列如SEQ IDNO.50所示。

6.根据权利要求4所述基因芯片，其特征在于，所述固定载体为硝酸纤维素、醋酸纤维素、玻璃片、硅胶晶片、尼龙膜、聚丙烯膜或微缩磁珠。

7.一种用于检测权利要求1中所述的18种病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有SEQ ID NO.1～28所示多重PCR引物、SEQ ID NO.47～48所示内标引物以及权利要求4～6任一所述基因芯片，所述引物的5’端均结合有标记物。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、酶混合液和灭菌注射水，所述酶混合液中含有UNG酶。

9.一种利用权利要求7或8任一所述试剂盒进行的以非疾病诊断为目的检测所述18种病原体的方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1.释放待测样本的核酸；

S2.以S1所得核酸为模板，使用SEQ ID NO.1～28所示多重PCR引物和SEQ ID NO.47～48所示内标引物进行RT-PCR；

S3.利用基因芯片对RT-PCR扩增产物进行杂交，通过化学显色对结果进行判读。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，步骤S3中所述杂交为导流杂交。

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