CN108486282A - 一种用于检测甲型、乙型流感病毒的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒及其使用方法，该试剂盒包括检测管和阳性质控品；使用时，将样品DNA/RNA共提取模板、无RNase水、阳性质控品各25µL分别加入不同的检测管中，进行荧光PCR检测，再进行结果判读。综上所述，本发明与普通荧光PCR法、免疫法和细菌培养法等相比，具有以下优势：1.特异性强：本发明的引物探针针对甲型/乙型流感病毒的特异性保守区域序列设计，特异性强。2.敏感性高：本发明能检测到10copies/μL浓度的目的基因序列。3.易于保存：本发明的检测管内预装单管的干粉试剂，保存方便。4.单管分型：在一个检测管内根据荧光信号的不同来区分两种病毒。

Description

一种用于检测甲型、乙型流感病毒的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒及其使用方法。

背景技术

流行性感冒病毒(influenza virus，Flu)，简称流感病毒，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，近年来才发现的牛流感病毒将归为丁(D)型。流感病毒可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病，是人流感、禽流感、猪流感、马流感等人与动物疫病的病原。人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的，主要引起上呼吸道感染，也可以引起儿童与成人的下呼吸道感染，主要为肺炎，婴幼儿的重症流感常伴有支气管炎、高热，偶尔伴有脑炎、中耳炎、心肌炎等并发症。流感病毒主要经空气飞沫传播，甲型流感病毒常以流行形式出现，可造成世界大流行；乙型流感病毒常造成局部爆发流行。利用分子诊断技术可以快速检测流感病毒，从而进行辅助诊断，对临床治疗有一定的指导意义。

主要的甲乙丙流感病毒中，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型极少引起流行。甲型流感病毒(Flu A)感染发病程度与个人免疫相关，典型症状以畏寒、持续高热、头痛为主，同时伴有喉痛、咳嗽、鼻塞，一般会有浑身酸痛、乏力等全身症状。发病率高、病死率底，死亡通常由并发细菌性感染所致。潜伏期1～7 天，甲型流感常引起大流行，每年均有一个高峰，病毒型别表现为交替流行的规律。文献报道流行期阳性检出率为20％～40％，而在非流行季节的阳性率为2％～20％。

乙型流感病毒(FluB)感染起病迅速，患者畏寒、发热，体温在数小时至 24小时内升达高峰，39～40℃甚至更高。伴有头痛，全身酸痛，乏力，食欲减退。呼吸道症状较轻，咽干喉痛，干咳，可有腹泻。颜面潮红，眼结膜外眦充血，咽部充血，软腭有滤泡等。潜伏期3～7天，乙型病毒常引起局限性流行，流感患者中，乙型流感病毒感染约占10％～40％。文献报道流行期间阳性率为10％～30％，在非流行季节阳性率2％～10％。

目前市场上针对甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测方法主要有荧光PCR 法、免疫法和细菌培养法。荧光PCR法是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时监测，定性或定量检测目的基因；免疫法是通过抗原抗体发生特异性结合来检测目的蛋白；培养法是把病原体在特定培养基上进行培养，再对产生的结果进行观察分析。

目前市场上针对甲型流感病毒和乙型流感病毒的荧光定量PCR检测试剂盒有很多，针对甲型流感病毒和乙型流感病毒最为常见的一些亚型设计引物探针进行检测。其组成一般包括盐离子缓冲液、酶、引物、探针、质控品，以液态形式分管保存在-20℃下，使用时需要将多管试剂融化，按照一定的比例进行混合，配制成检测反应液，然后加入样本核酸，放入荧光定量PCR仪中进行检测，最后根据扩增曲线分析检测结果。

免疫法检测试剂针对的是样本中的抗原或者抗体，且抗体检测有窗口期，在发病初期容易漏诊；免疫法检测灵敏度、特异性较低，样本易污染且干扰物质较多，浓度过高或者过低时都容易造成结果错判，需要重复检测、复查才能确诊，检测的可信度较差；采用培养法检测耗时较长，培养效果差，很多病原体无法培养，延误最佳治疗时机。

普通的荧光PCR检测试剂虽然具有较好的灵敏度和特异性，但是试剂盒一般为多管液态试剂构成，平时需要保存在-20℃环境中，在操作时需要将各管试剂按照比例混合使用，对于运输和保存条件、操作方法等方面有较高的要求，容易因保存不当和操作失误引起检测结果不可信。同时由于甲型流感病毒和乙型流感病毒的亚型种类很多，检测试剂盒一般针对的是甲型流感病毒和乙型流感病毒最为常见的亚型，有时因为病毒毒株的变异，可能会产生漏检的情况。

发明内容

为了解决现有技术中的上述缺陷，本发明提供一种对甲型流感病毒和乙型流感病毒进行快速准确检测，且能在各种环境中简便易用的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的特异性检测试剂盒和方法，且保证检测的时效性、特异性和灵敏度。

本发明针对甲型流感病毒和乙型流感病毒各自的保守序列M基因上设计特异性引物探针，能检出已知的各亚型流感病毒，并在探针上标记不同的荧光信号，可以同时检测并区分出甲型流感病毒和乙型流感病毒。为了解决低温保存和使用操作繁琐的问题，本发明的试剂盒中检测试剂为单管干粉，可在4℃低温或常温下保存，使用时仅需加入提取好的核酸样本即可上机检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒，该试剂盒包括若干检测管和阳性质控品；其中检测管内包括：PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、 dCTP、dGTP，MgCl₂、HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶、甲型流感病毒(Influenza A virus)和乙型流感病毒(Influenza B virus)的特异性保守序列的引物及 Taqman荧光探针；

单个检测管内，含有特异性保守序列的引物序列SEQ ID NO.1～2和特异性Taqman荧光探针序列SEQ ID NO.3；以及特异性保守序列的引物序列SEQ ID NO.4～5和特异性Taqman荧光探针序列SEQ ID NO.6。单个检测管内，还含有PCR 缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl₂、HotStart Taq 酶、逆转录酶、UNG酶。

两条特异性Taqman荧光探针5’端采用不同的荧光报告基团R标记修饰，所述的探针为5’端荧光标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团 R和荧光淬灭基团Q的寡核苷酸。

所述检测管内混合试剂经过干燥工艺制成干粉形态，每个检测管检测一个核酸样本；所述检测管内混合试剂经过干燥工艺制成干粉形态；将所有试剂组分混成一管再制成干粉，且采用特殊的干粉干燥工艺：

1、将配制好的混合试剂溶液以单人份分装到PCR管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；

2、将冻好的混合试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为

-50℃，1h，1大气压；

-40℃，5h，＜10Pa；

-10℃，2h，＜10Pa；

0℃，2h，＜10Pa；

30℃，5h，＜10Pa；

3、干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态；干粉干燥工艺能尽可能保持干粉成分的活性，提高干燥效率，同时试剂混合后再制成干粉以方便后续的检测操作。这种干粉形态的单管PCR检测试剂盒，现有技术中无相应的试剂盒产品。

所述特异性引物序列为：甲型流感病毒(Influenza A virus)，SEQ ID NO.1～2；乙型流感病毒(Influenza B virus)，SEQ ID NO.4～5.

所述特异性Taqman探针序列为：甲型流感病毒(Influenza A virus)，SEQ IDNO.3；乙型流感病毒(Influenza B virus)，SEQ ID NO.6；

所述两条特异性Taqman荧光探针采用不同的荧光标记修饰；引物和探针序列见表1。

表1引物和探针序列

所述各引物在扩增体系中的终浓度为100～1000nM；所述各探针在扩增体系中的终浓度为50～500nM。所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％～10％；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.1％～5％；海藻糖和牛血清白蛋白属于额外添加的，可以提高扩增效率，保持试剂的稳定性；所述HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度为0.5U～5U；所述dATP、dUTP、dCTP、 dGTP在扩增体系中的终浓度为0.1mM～2mM；所述MgCl₂在扩增体系中的终浓度为1.5mM～10mM。

所述阳性质控品中含有甲型/乙型流感病毒的扩增基因序列的质粒；

进一步的，本发明还提供了基于前述荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：

(1)将样品DNA/RNA共提取模板(从人的痰液、鼻咽拭子等样本中提取)、无RNase水、阳性质控品各25μL分别加入不同的检测管中，盖好管盖，进行荧光PCR检测。

(2)PCR扩增反应的条件为：50℃逆转录15～30min；92～97℃预变性 1～10min；92～97℃变性10～15s；58～62℃退火35～50s；40～45个循环。

(3)有效性判定：

无RNase水检测出的Ct值为Undet或40，且阳性质控品检测出的Ct值≤ 35，否则实验视为无效；

(4)结果判读：

样本检测管Ct值为Undet或40，该样本结果判断为阴性，样本RNA提取失败、待测样本中不含RNA或含量低于检测限；

样本检测管Ct值≤35，该样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；

样本检测管Ct值为38～40，需要复检一次，如果Ct值仍为38～40，则判断为阴性。

按照以上判读方法，结合样本检测管检出的甲型流感病毒和乙型流感病毒对应荧光通道的Ct值来判断两种病毒的检测结果。

本发明的试剂盒内检测管试剂配方经过优化调整，处理为干粉形态，能够在 4℃低温或常温下保存一年以上，不影响检测效果，使用时仅需加入样本即可上机检测，方便易用。

本发明的试剂盒采用Taqman探针荧光PCR技术，针对甲型/乙型流感病毒进行检测，设计引物和探针的序列在甲型流感病毒和乙型流感病毒的基因中都非常保守，可以检测出已知的各种亚型，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达100copies/μL。

本发明采用了UNG酶/Dutp防污染体系，能减少前次PCR反应产物带来的污染干扰。

本发明将逆转录酶与HotStart Taq酶混合在一个PCR反应管中使用，先进行逆转录过程合成出cDNA，再进行PCR扩增，没有添加随机引物，过程一步完成，无需开盖，既能减少实验操作步骤，节省时间，同时还避免了开盖操作可能带来的样本污染。

本发明所使用的探针为5’端FAM标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核昔酸。在探针完整时，即随机状态和无PCR产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在荧光PCR 扩增过程中，当特异的PCR产物与TaqMan探针发生杂交反应时HotStart Taq酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板RNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。

综上所述，本发明与普通荧光PCR法、免疫法和细菌培养法等相比，具有以下优势：

1.特异性强：本发明的引物探针针对甲型/乙型流感病毒的特异性保守区域序列设计，特异性强。各设计了一套引物探针就可以检测对应的甲型流感病毒或乙型流感病毒所有亚型。

2.敏感性高：本发明能检测到10copies/μL浓度的目的基因序列。

3.易于保存：本发明的检测管内预装单管的干粉试剂，保存方便。

4.单管分型：在一个检测管内根据荧光信号的不同来区分两种病毒。

5.检测过程为闭管反应，并将逆转录过程和PCR扩增过程结合，减少实验步骤，并大大降低了污染及结果偏差的可能性。

7.操作简单快速：无需配制检测试剂，仅需加样一次，即可上机检测，从标本送检到得出结果可在3个小时以内完成。

6.结果判读明确、客观；若需要亦可对结果进行定量分析。

7.安全：整个体系中不包含有毒有害物质，无需PCR产物的后处理，对操作员和环境都无危害。

附图说明

图1为实施例1的PCR扩增曲线图；

图2为检测甲型流感病毒、乙型流感病毒对应的质粒样本的结果示意图；

图3为检测甲型流感病毒H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2等5种亚型以及乙型流感病毒样本的结果示意图；

图4为本试剂盒检测甲型流感病毒和乙型流感病毒混合质粒的五个梯度样本的结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。

实施例1

用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒，该试剂盒由检测试剂、阳性质控品和无RNase水组成。检测试剂单管分装，为干燥工艺制成的干粉形态，包括甲型 /乙型流感病毒特异的引物探针、PCR缓冲液、dATP、dUTP、dCTP、dGTP、 HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶、MgCl₂、海藻糖和牛血清蛋白；阳性质控品中含有甲型/乙型流感病毒扩增基因序列的质粒。

所述各个引物在扩增体系中的终浓度分别优选为100nM；所述各探针在扩增体系中的终浓度优选为50nM；

所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％(质量百分比)；

所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度优选为0.2％(质量百分比)；

所述HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度分别为1U；

所述dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度分别为0.5mM；

所述MgCl₂在扩增体系中的终浓度为5.5mM；

该试剂盒的反应体系为25μL，直接将提取的25μL样本核酸添加到单个检测管中。

试剂盒的操作和结果判定

(1)将样品DNA/RNA共提取模板(从人的痰液、咽拭子等中提取)、无 RNase水、阳性质控品各25μL分别加入不同的PCR反应管中，配成反应体系，盖好管盖混匀离心，放入荧光定量PCR仪中进行荧光PCR检测。

(2)设置仪器中的PCR扩增反应的条件为：50℃逆转录30min；92℃预变性 10min；94℃变性15s；58℃退火40s；重复变性退火操作(共40个循环)。

(3)反应完成后，基线设定为自动调整，根据扩增曲线图和Ct值对检测结果进行分析。

(4)有效性判定：

无RNase水检测出的Ct值为Undet或40，且阳性质控品检测出的Ct值≤35，否则实验视为无效；

(5)结果判读：

样本检测孔Ct值为Undet或40，该样本结果判断为阴性，样本RNA提取失败、待测样本中不含RNA或含量低于检测限；

样本检测孔Ct值≤35，该样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；

样本检测孔Ct值为35-40，需要复检一次，如果Ct值仍为35-40，则判断为阴性。

结合样本检测管检出的甲型流感病毒和乙型流感病毒对应荧光通道的Ct值来判断两种病毒的检测结果。

图1为本发明的PCR扩增曲线图，其中1为基线，2为阴性对照，3为阳性质控品，4为需要重新检测的样本，5为甲型流感病毒阳性结果的样本，6为乙型流感病毒阳性结果的样本。阳性质控品3检出两条扩增曲线，且Ct值都＜35，阴性对照2无扩增曲线，表明结果有效；样本4扩增曲线的Ct值＞35，建议重新检测；样本5和6均有扩增曲线，且Ct值＜35，判定为阳性结果。

实施例2

用本试剂盒分别检测甲型流感病毒、乙型流感病毒对应的质粒样本，以及两者混合质粒样本，浓度分别为10⁵copies/μL。按照与实施例1相同的方法进行检测。

检测结果表明本发明试剂盒可以在一个检测管内同时检测两种病原体，且两个荧光信号通道互不干扰，结果见图2。其中1为基线，2为阴性对照，3为两者混合质粒，4为甲型流感病毒样本，5为乙型流感病毒样本。阴性对照2无扩增曲线，混合质粒样本3检出两条扩增曲线，分别为两个通道，且Ct值都＜35，表明结果有效；样本4和5都只有一个通道有扩增曲线，且Ct值结果与浓度相同的混合质粒无明显差异。

试验结果表明本试剂盒可以同时检出甲型流感病毒、乙型流感病毒，也可以检出单项且不干扰另一项病原体的荧光信号通道。

实施例3

用本试剂盒分别检测甲型流感病毒H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2等5 种亚型以及乙型流感病毒样本。按照与实施例1相同的方法进行检测。

检测结果表明本发明试剂盒能检测出以上甲型和乙型流感病毒各亚型，结果见图3。其中1为基线，2为阴性对照，3为阳性质控品，4～9为两种病原体各亚型样本。阳性质控品3检出扩增曲线，且Ct值＜35，阴性对照2无扩增曲线，表明结果有效；样本4～9均有扩增曲线，且Ct值＜35，判定为阳性结果。

试验结果表明本试剂盒对甲型/乙型流感病毒的保守区域设计的引物探针特异性强，能够检测出各流行亚型。

实施例4

用本试剂盒检测甲型流感病毒和乙型流感病毒混合质粒的五个梯度样本，五个样本中两者的浓度分别为10⁵、10⁴、10³、10²和10copies/μL。按照与实施例1相同的方法进行检测。

检测结果表明本发明试剂盒可以在一个检测管内同时检测两种病原体，两个荧光信号通道互不干扰；且可以检测到浓度分别为10copies/μL的两种病原体，结果见图4。其中1为基线，2为阴性对照，3～7分别为两者混合质粒梯度样本，浓度分别为10⁵、10⁴、10³、10²和10copies/μL。阴性对照2无扩增曲线，混合质粒样本都检出两条扩增曲线，分别为两个通道，且Ct值都＜35，表明结果有效；其中样本7浓度为10copies/μL，表明两通道都可以检测到10copies/μL的病原体。

试验结果表明本试剂盒可以同时检出甲型流感病毒、乙型流感病毒，且两者浓度为10copies/μL时仍然都可以检测到。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京岚煜生物科技有限公司

<120> 一种用于检测甲型、乙型流感病毒的试剂盒及其使用方法

<130> xhx2018031402

<141> 2018-03-14

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

cctctcgtta ttgccgca 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

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<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

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<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

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<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

cggtctatgt aatgggtta 19

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

ctgctgttca atacaacgtc ctagaa 26

Claims (7)

1.一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括若干检测管和阳性质控品；其中检测管内包括：PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl₂、HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶、甲型流感病毒(Influenza A virus)和乙型流感病毒(Influenza B virus)的特异性保守序列的引物及特异性Taqman荧光探针；

所述检测管内的混合试剂经过干燥工艺制成干粉形态，每个检测管检测一个核酸样本；特异性保守序列的引物序列为：甲型流感病毒(Influenza A virus)，SEQ ID NO.1～2；乙型流感病毒(Influenza B virus)，SEQ ID NO.4～5；

所述特异性Taqman荧光探针序列为：甲型流感病毒(Influenza A virus)，SEQ IDNO.3；乙型流感病毒(Influenza B virus)，SEQ ID NO.6；

单个检测管内，含有特异性保守序列的引物序列SEQ ID NO.1～2和特异性Taqman荧光探针序列SEQ ID NO.3；以及特异性保守序列的引物序列SEQ ID NO.4～5和特异性Taqman荧光探针序列SEQ ID NO.6。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，

两条特异性Taqman荧光探针5’端采用不同的荧光报告基团R标记修饰，所述的探针为5’端荧光标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团R和荧光淬灭基团Q的寡核苷酸。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，

特异性保守序列的引物序列和Taqman荧光探针序列为：

4.根据权利要求1所述的一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述各引物在扩增体系中的终浓度为100～1000nM；所述各探针在扩增体系中的终浓度为50～500nM；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％～10％；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.1％～5％；所述HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度为0.5U～5U；所述dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度为0.1mM～2mM；所述MgCl₂在扩增体系中的终浓度为1.5mM～10mM。

5.根据权利要求1所述的一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，混合试剂经过干燥工艺制成干粉形态，即预装干粉检测试剂；干粉制备工艺为：

将配制好的混合试剂溶液分装到PCR管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；

将冻好的混合试剂放入到真空冷冻干燥机中，干燥过程为:

-50℃，1h，1大气压；

-40℃，5h，＜10Pa；

-10℃，2h，＜10Pa；

0℃，2h，＜10Pa；

30℃，5h，＜10Pa；

干燥完成后，得到干粉试剂。

6.根据权利要求1所述的一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品中含有甲型/乙型流感病毒的扩增基因序列的质粒。

7.权利要求1-6任意一项所述的用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：

(1)将样品DNA/RNA共提取模板、无RNase水、阳性质控品各25μL分别加入不同的检测管中，盖好管盖，进行荧光PCR检测；

(2)PCR扩增反应的条件为：50℃逆转录15～30min；92～97℃预变性1～10min；92～97℃变性10～15s；58～62℃退火35～50s；共40～45个循环；

(3)有效性判定：

无RNase水检测出的Ct值为Undet或40，且阳性质控品检测出的Ct值≤35时判定实验结果有效；否则实验结果视为无效；

(4)结果判读：

样本检测管Ct值为Undet或40，样本结果判断为阴性，样本RNA提取失败、待测样本中不含RNA或含量低于检测限；

样本检测管Ct值≤35，样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；

样本检测管Ct值为38～40，需要复检一次，如果Ct值仍为38～40，则判断为阴性；

按照以上判读方法，结合样本检测管检出的甲型流感病毒和乙型流感病毒对应荧光通道的Ct值来判断两种病毒的检测结果。