CN112410467A

CN112410467A - 一种检测甲型和乙型流感病毒的冻干型荧光rt-pcr试剂及方法

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Publication number: CN112410467A
Application number: CN202011306529.8A
Authority: CN
Inventors: 黎绍基; 林镜中; 朱碧莹; 刘钰涵; 黄俊辉
Original assignee: Signaldt Biotechnologies (sz) Inc
Current assignee: Signaldt Biotechnologies (sz) Inc
Priority date: 2020-11-23
Filing date: 2020-11-23
Publication date: 2021-02-26

Abstract

本发明提供一种用于检测甲型和乙型流感病毒的冻干型荧光RT‑PCR试剂及其使用方法。本发明提供的甲型和乙型流感病毒荧光RT‑PCR检测试剂所用的引物探针是基于核酸序列数据库最新的核酸序列信息设计、筛选而得出，具有良好的特异性、反应性能及包容性。此外，本发明通过冷冻干燥技术将甲型和乙型流感病毒荧光RT‑PCR检测试剂制成可常温保存的冻干型试剂，避免了常规液体荧光PCR检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险及降低运输和管理成本。

Description

一种检测甲型和乙型流感病毒的冻干型荧光RT-PCR试剂及方法

技术领域

本发明涉及病原微生物检测技术，具体涉及甲型和乙型流感病毒的核酸检测。

背景技术

流行性感冒(简称“流感”)是由流行性感冒病毒(简称“流感病毒”)引起的急性呼吸道感染疾病，常引起患者发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。流感病毒主要经空气飞沫传播，具有传染性强、传播速度快的特点。流感病毒属正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，分为甲型流感病毒(Influenza virus A)、乙型流感病毒(Influenza virus B)和丙型流感病毒(Influenza virus C)和2016年首次发现的丁型流感病毒(Influenza virus D)四个种，每个种单独组成一个属。流感病毒的基因组由七或八条负链RNA节段构成，每条RNA编码一或两个蛋白。其中甲型流感病毒根据病毒颗粒外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同，可分为16个H亚型(H1-H16)和9个N亚型(N1-N9)。由于编码HA和NA的核苷酸序列容易发生突变，令HA和NA的抗原表位发生改变，致使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模的流行。乙型流感病毒主要分成Victoria系与Yamagata系，抗原变异较小，可引起流感的局部爆发。总的来说，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型极少引起流行，丁型暂未见流行报道。在医疗卫生领域，对甲型和乙型流感病毒的诊断和监测最为重要。

基于荧光RT-PCR技术的核酸检测是流感病毒检测的重要手段。荧光RT-PCR技术结合了普通PCR的高敏感性、DNA杂交技术的高特异性和光谱技术的高精确性，且取材简单，操作方便，检测快速，完全封闭式操作避免了检测时的标本被污染和对环境的污染。但是，与大多数生物试剂一样，现有的甲型和乙型流感病毒荧光RT-PCR检测试剂均为液体试剂，需要在-20℃以下保存才能保持检测活性，保存、运输和使用过程中的温度升高、反复冻融都会降低试剂的检测性能。长途运输时一旦遇到交通受阻，试剂失效的风险及冷链管理成本大大增加，可见液体试剂不能适应国际长途运输中及冷链条件较差的基层检测机构的应用。另外，作为RNA病毒的流感病毒(特别是甲型流感病毒)容易因基因突变而产生新的病毒株，随着新病毒株的不断出现，基于旧的核酸信息设计的现有检测试剂面临着越来越大的漏检风险。市场需要一种更加准确可靠，且可常温保存的甲型和乙型流感病毒荧光RT-PCR检测试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确可靠，且可常温保存的甲型和乙型流感病毒冻干型荧光RT-PCR检测试剂及方法。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：

1.引物、探针设计及反应体系建立

本发明所述的甲型和乙型流感病毒荧光RT-PCR检测试剂所用的引物探针分别基于基因序列数据库最新的甲型和乙型流感病毒序列信息设计、筛选而得出，其中：

检测甲型流感病毒的特异性正向引物的序列为5’-CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC-3’，反向引物的序列为5’-CATTTTGGACAAAGCGTCTACG-3’，探针的序列为5’-CAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3’。探针的5’端用荧光报告基团FAM标记，还可选用JOE、HEX、VIC、TET、ROX和CY5中的任意一种；3’端用荧光淬灭基团BHQ1标记，还可以选用BHQ2、BHQ3、TAMRA和Eclipse中的任意一种。该引物、探针的序列在已知甲型流感病毒核酸序列中高度保守，且对其它生物具有排他性。

检测乙型流感病毒的两条特异性正向引物的序列为5’-TTCGAGCGTCTTAATGAAGGACA-3’和5’-CGAGCGTCTCAATGAAGGACA-3’(两条正向引物是针对该位置的单核苷酸多态性而设计，可按一定比例混合后使用)，反向引物的序列为5’-TGGTGATAATCGGTGCTCTTGAC-3’，探针的序列为5’-CAAAGCCAATTCGAGCAGCTGAAACTG-3’。探针的5’端用荧光报告基团HEX标记，还可选用FAM、JOE、VIC、TET、ROX和CY5中的任意一种；3’端用荧光淬灭基团BHQ1标记，还可以选用BHQ2、BHQ3、TAMRA和Eclipse中的任意一种。该引物、探针的序列在已知乙型流感病毒核酸序列中高度保守，且对其它生物具有排他性。

2.反应体系的建立

本发明所述的甲型和乙型流感病毒荧光RT-PCR检测试剂包含了对甲型和乙型流感病毒的荧光RT-PCR检测所需的除样本核酸外的所有反应组分(见表1)，反应体积为25μl。使用时，加入待测样本核酸和无核酸酶水至25μl的反应体积即可上机检测。

表1.甲型和乙型流感病毒荧光RT-PCR检测试剂成分

成分	每反应含量
		200mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)	2.50μl
氯化钾	1.55μmol
		氯化镁	0.075μmol
dNTPs	5nmol
		热启动Taq DNA聚合酶	2U
M-MLV逆转录酶	200U
		甲型流感病毒正向引物	10pmol
甲型流感病毒反向引物	10pmol
		甲型流感病毒探针	5pmol
乙型流感病毒正向引物(两条正向引物的1:1混合物)	10pmol
		乙型流感病毒反向引物	10pmol
乙型流感病毒探针	5pmol
		冻干赋形剂(仅用于试剂冻干)	2.25mg

3.试剂冻干

本发明通过冷冻干燥技术将甲型和乙型流感病毒荧光RT-PCR检测试剂制成常温下稳定的冻干型试剂，从而避免了常规液体荧光PCR检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险。

本发明所述的甲型和乙型流感病毒冻干型荧光RT-PCR检测试剂是由表1的成分冻干而成，可将单份或多份试剂冻干在容器中，优选地，可按1份/管冻干在可直接上机的PCR管或由PCR管组合成的多连管或反应板中。冻干所得的甲型和乙型流感病毒冻干型荧光RT-PCR检测试剂为白色颗粒剂，可在遮光、防潮条件下常温保存。单份试剂所含干物质的体积约为2μl，使用时直接加总体积为23μl的水和待测核酸样本即可配成25μl的反应体系，优选地，所加的水和核酸样本的体积分别为18μl和5μl。作为另一优选，在样本核酸提取的最后洗脱步骤中，适当增加洗脱液的量(如100μl)即可得到合适浓度的样本核酸，该样本核酸可直接取23μl加至单份冻干试剂中。试剂加水和核酸样本后经慢速震荡使试剂溶解，短暂离心后即可上机检测。

4.反应程序及结果判定

本发明所述的甲型和乙型流感病毒荧光RT-PCR检测试剂的反应程序按表2设置，根据探针的荧光报告基团设置荧光信号。反应后甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测结果分别根据以下条件进行判定：

a)阴性对照品(无核酸酶水)的Ct≥40或无Ct，且阳性对照的Ct≤30，为有效结果。否则结果无效，须排除错误因素后重检。

b)检测样品Ct≤35，可报告为该病原体阳性。

c)检测样品35＜Ct＜40，报告为该病原体疑似阳性，需重复实验或通过独立方法进行确定。

d)检测样品Ct≥40或无Ct，则报告为该病原体阴性。

表2.甲型和乙型流感病毒荧光RT-PCR检测试剂反应程序

本发明的有益效果：

本发明的甲型和乙型流感病毒冻干型荧光RT-PCR检测试剂所用的引物、探针序列是基于最新的甲型和乙型流感病毒核酸序列信息设计筛选所得，具有良好的包容性、特异性和反应性能，能保证检测的准确性。另外，本发明运用冷冻干燥技术将甲型和乙型流感病毒荧光RT-PCR检测试剂制成冻干型试剂，避免了常规液体荧光PCR检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险，适应长途运输和冷链条件差的地区的使用需要。

附图说明

图1显示本发明所述的甲型流感病毒的检测目标序列以及特异引物和探针的位置。

图2显示本发明所述的乙型流感病毒的检测目标序列以及特异引物和探针的位置。

图3显示冻干于PCR八连管中的甲型和乙型流感病毒荧光RT-PCR检测试剂的形态，可见其形态为白色颗粒。

图4显示本发明所述的甲型和乙型流感病毒冻干型荧光RT-PCR检测试剂对甲型和乙型流感病毒核酸阳性参考品的检测结果及重复性。

图5显示本发明所述的甲型和乙型流感病毒冻干型荧光RT-PCR检测试剂对甲型流感病毒核酸阳性参考品的扩增效率和不同浓度间的线性关系。

图6显示本发明所述的甲型和乙型流感病毒冻干型荧光RT-PCR检测试剂对乙型流感病毒核酸阳性参考品的扩增效率和不同浓度间的线性关系。

具体实施方式

以下实施例仅为对本发明的进一步说明，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。

实施例1：本实施例提供一种用于检测甲型和乙型流感病毒核酸的荧光RT-PCR引物及探针的设计方案。

本发明通过分析数据库中的甲型和乙型流感病毒的基因组信息，选取了图1、2所示的核酸序列分别作为甲型和乙型流感病毒的检测目标序列。利用软件Primer ExpressV3.0设计出以下用于扩增目标序列的引物和用于检测目标序列的探针序列：

甲型流感病毒的特异正向引物的序列为5’-CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC-3’(Tm＝59.0℃),反向引物的序列为5’-CATTTTGGACAAAGCGTCTACG-3’(Tm＝58.4℃),探针的序列为5’-CAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3’(Tm＝68.2℃)。探针的5’端用荧光报告基团FAM标记，3’端用荧光淬灭基团BHQ1标记。扩增子长度为122bp,该序列通过BLAST检查确定和其它生物的核酸序列不存在相似性，即具有良好特异性，有利于防止错检。

乙型流感病毒的两条特异正向引物的序列为5’-TTCGAGCGTCTTAATGAAGGACA-3’(Tm＝59.8℃)和5’-CGAGCGTCTCAATGAAGGACA-3’(Tm＝60.0℃)，反向引物的序列为5’-TGGTGATAATCGGTGCTCTTGAC-3’(Tm＝60.0℃)，探针的序列为5’-CAAAGCCAATTCGAGCAGCTGAAACTG-3’(Tm＝68.3℃)。探针的5’端用荧光报告基团HEX标记，3’端用荧光淬灭基团BHQ1标记。扩增子长度为99bp或97bp，该序列通过BLAST检查确定和其它生物的核酸序列不存在相似性，即具有良好特异性，有利于防止错检。

上述甲型流感病毒和乙型流感病毒的正向引物、反向引物和探针的GC含量均在合理范围内；引物之间的Tm差别微小，有利于引物的同时退火；探针的Tm比引物高8℃以上，差别足够大，有利于探针早于引物完成退火。引物和探针的自身结构均维持较好，不会形成稳定的self dimer、pair dimer和hair pin结构阻碍PCR反应。较短的扩增子也有利于提高PCR反应效率。

上述的正向引物、反向引物、探针由华大基因合成，用TE缓冲液配成100uM的保存液和10uM的工作液于-20℃保存。

实施例2：本实施例演示通过冷冻干燥技术将本发明所述的甲型和乙型流感病毒荧光RT-PCR检测试剂制成冻干型试剂。

按表1中所述的成分及含量配制甲型和乙型流感病毒荧光RT-PCR液体检测试剂，按每管一个测试的分量分装于200μl PCR八连管中后进行冷冻干燥，得到的甲型和乙型流感病毒冻干型荧光RT-PCR检测试剂为白色颗粒(图3)。向一份试剂中加入23μl无核酸酶水，慢速震荡10s，试剂即完全溶解，用移液枪测得体积为25μl，可知试剂复溶前体积相当于2μl。

为防止试剂受潮和曝光，甲型和乙型流感病毒冻干型荧光RT-PCR检测试剂先和硅胶干燥剂一起作真空处理，再包装于铝箔袋中，在常温中保存。

实施例3：本实施例演示用本发明所述的甲型和乙型流感病毒冻干型荧光RT-PCR检测试剂对甲型和乙型流感病毒核酸阳性参考品的检测效果。

对甲型和乙型流感病毒RNA阳性参考品混合液进行10倍梯度稀释，每个浓度取5μl和18μl无核酸酶水混合，然后加到1份按实施例2制备的甲型和乙型流感病毒冻干型荧光RT-PCR检测试剂中；23μl无核酸酶水作为阴性对照。得到体积为25μl的反应混合液，慢速震荡溶解、离心后在荧光PCR仪上机检测，反应程序按表2设置。每个处理做3个重复。

检测结果如图4所示，本发明所述的甲型和乙型流感病毒冻干型荧光RT-PCR检测试剂对不低于10个拷贝的甲型和乙型流感病毒核酸阳性参考品的检测结果均显阳性，重复之间Ct的差异系数(CV)＜5％，阴性对照品没有扩增信号。模板浓度的常用对数及其Ct之间呈良好的线性关系(对甲型和乙型流感病毒的R²值分别为0.999和0.998)，甲型和乙型流感病毒核酸的扩增效率分别达97.003％和98.31％(图5、6)。

可见，本发明的甲型和乙型流感病毒冻干型荧光RT-PCR检测试剂对甲型和乙型流感病毒核酸检测表现良好，同时具有多项优点：(1)可常温保存，无传统液体试剂对保存温度(-20℃)的要求；(2)使用前无需解冻，完全避免了反复冻融对试剂活性的影响；(3)已按单份分装，使用时无需配液、分装步骤，减少了试剂损耗和试剂污染的风险。

序列表

<110>

<120> 一种检测甲型和乙型流感病毒的冻干型荧光RT-PCR试剂及方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

catggartgg ctaaagacaa gacc 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

cattttggac aaagcgtcta cg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

cagtcctcgc tcactgggca cg 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

ttcgagcgtc ttaatgaagg aca 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

cgagcgtctc aatgaaggac a 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

tggtgataat cggtgctctt gac 23

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

caaagccaat tcgagcagct gaaactg 27

Claims

1.一种甲型和乙型流感病毒荧光RT-PCR检测试剂，其特征在于，为冻干型颗粒状试剂，包含了除样本核酸外所有必需的荧光RT-PCR反应组份，由Tris-HCl缓冲液、氯化钾、氯化镁、dNTPs、DNA聚合酶、逆转录酶、冻干赋形剂，以及下述甲型和乙型流感病毒的特异性正向引物、反向引物和探针的混合液冻干而成：

甲型流感病毒的特异性正向引物的序列为5’-CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC-3’，反向引物的序列为5’-CATTTTGGACAAAGCGTCTACG-3’，探针的序列为5’-CAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3’，所述探针的5’端和3’端分别用荧光报告基团标记和荧光淬灭基团标记；

乙型流感病毒的特异性正向引物之一的序列为5’-TTCGAGCGTCTTAATGAAGGA CA-3’，之二的序列为5’-CGAGCGTCTCAATGAAGGACA-3’，反向引物的序列为5’-TGGTGATAATCGGTGCTCTTGAC-3’，探针的序列为5’-CAAAGCCAATTCGAGCAGCTGAA ACTG-3’，所述探针的5’端和3’端分别用荧光报告基团标记和荧光淬灭基团标记。

2.权利要求1所述的甲型和乙型流感病毒荧光RT-PCR检测试剂，其特征在于，按1份/管冻干在可直接用于上机的PCR反应管或由其组合成的多连管中，使用时直接向冻干型试剂中加入水和待测样本核酸，短暂震荡和离心后即可上机检测。